Membranas biológicas

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Introducción

Probablemente la primera célula se originó a partir de la formación de una membrana, separando un pequeño volumen de solución acuosa del resto del universo, definiendo de esta manera los límites de la célula y regulando, a través de esta barrera, el tráfico de moléculas desde y hacia el interior de la célula.

En las células eucariontes, las membranas biológicas forman los límites de las células y sus orgánulos, compartimentando los procesos biológicos, y organizando sus funciones. Así mismo actúa como barrera permitiendo el flujo selectivo de nutrientes, productos de desechos, iones, etc., aun en contra del gradiente. Así mismo pueden retener y almacenar diferentes compuestos e iones. En Las membranas ocurren diversos procesos bioquímicos; secuencias complejas de reacciones químicas, procesos de regulación y de comunicación intercelular.

La flexibilidad de las membranas permite su cambio de forma, acompañando el crecimiento y movimiento de la célula.

Podemos resumir sus funciones en los siguientes ítems: • Participan en el crecimiento, desarrollo y funcionamiento celular. • Cumplen función estructural

• Forman una barrera de permeabilidad selectiva • Reciben y general señales

• Constituyen un soporte de enzimas y receptores

• Papel de reconocimiento entre células y los tejidos conectivos circulantes • Participan en la motilidad celular

• Intervienen en procesos de translocación de energía

Composición y estructura de las membranas: • Lípidos: a) Fosfolípidos b) Colesterol c) Glicolípidos • Proteínas: a) Intrínsecas o integrales

b) Unidas covalentemente a lípidos c) Extrínsecas o periféricas

• Glúcidos:

a) Asociados a lípidos o proteínas

Glicerofosfolípidos Esfingolípidos

Glicolípidos Glicoproteínas

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Figura 1: Composición y estructura de las membranas biológicas.

Las membranas biológicas son una bicapa lipídica sobre la que se asocian proteínas e hidratos de carbono. Esto es, glicerofosfolípidos y esfingolípidos (Figura 2) que tienden espontáneamente a formar láminas dobles, de forma tal que las cabezas polares (hidrofílicas) se encuentran en contacto con los medios acuosos a ambos lados de la bicapa y las 2 colas hidrocarbonadas no polares (hidrofóbicas) de estos lípidos, se orientan hacia el interior de la membrana (Figura 1).

Figura 2: Lípidos de membrana

El desplazamiento de un lípido de un lado al otro de la bicapa (difusión transversa o flip-flop) es un acontecimiento desfavorable energéticamente y que en consecuencia ocurre muy esporádicamente. Eso se debe a que un flip-flop requiere que la cabeza polar del lípido atraviese el centro hidrocarbonado de la bicapa. Este tipo de movimientos ocurren muy lentamente en las condiciones fisiológicas, por lo que, de ser necesaria la difusión transversa de lípidos, ocurre por acción de una enzima: la flipasa. (Figura 3)

En cambio los lípidos presentan una gran movilidad en el plano de la bicapa, de forma que actúan como líquidos bidimensionales, cuya fluidez depende en gran medida de la movilidad de las cadenas hidrocarbonadas. (Figura 3) Si se enfría la bicapa por debajo de una dada temperatura,

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denominada temperatura de transición orden-desorden, se produce un cambio de fase en la bicapa, en la que se comporta como un gel. Esta temperatura depende de la longitud de las cadenas y del grado de insaturaciones, así mientras más largas son las cadenas carbonadas y menos insaturaciones presentan, mayor es la temperatura de transición, es decir, la bicapa es menos fluida. Una forma de de mantener la fluidez de la membrana de aquellas especies que viven a bajas temperaturas es aumentar el número de insaturacioes de sus ácidos grasos.

Figura 3: Movimientos de los fosfolípidos en una bicapa lipídica.

El colesterol, al ser una estructura plana y rígida, al incorporarse en la membrana, la rigidiza, ya que impide el libre desplazamiento de las cadenas carbonadas en su entorno (Figura 4). Sin embargo, amplia el rango de la temperatura de transición orden desorden y hasta puede llegar a eliminarla, ya que inhibe la segregación y cristalización de las cadenas carbonadas.

Figura 4: Colesterol el membranas biológicas.

La fluidez de la membrana es un atributo fisiológico importante ya que permite que las proteínas asociadas a membrana se desplacen libremente, interactúen y cumplan su función. El modelo del mosaico fluido se refiere a que los lípidos y las proteínas inmersas en la membrana forman un patrón análogo a un mosaico, pero que a diferencia de un mosaico de cerámica, es libre de desplazarse, ya que los lípidos y proteínas individuales están ligados por interacciones no covalente que permiten su movimiento lateral en el plano de la membrana. Como ya vimos, los factores que afectan la fluidez de la membrana son: la presencia de colesterol (rigidiza la membrana) y las insaturaciones en las cadenas hidrocarbonadas (aportan fluidez).

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Estas proteínas llevan a cabo los procesos dinámicos asociados con las membranas. La proporción proteína/lípido depende de cada membrana y su función, pero salvo excepciones, esta relación es superior al 50%. Un ejemplo donde no se cumple esta relación es en las membranas de mielina, que actúan como aislantes en células neuronales. Estas membranas son ricas en lípidos. Por el contrario, aquellas membranas donde ocurren muchos procesos catalizados por encimas, por ejemplo las membranas de bacterias, mitocondriales y de cloroplastos, presentan un mayor porcentaje de proteínas. (Tabla 1)

Tabla 1: Composición % p/p de membranas % p/p Membrana

Proteínas Lípidos Carbohidratos Membrana plasmática de Eritrocito 49 43 8

Membrana externa mitocondrial 52 48 - Membrana interna mitocondrial 76 24 -

Mielina 18 79 3

Bacterias Grampisitivas 75 25 -

Las proteínas de membrana las podemos clasificar en 3 grupos según su grado de asociación con la membrana (Figura 5):

Figura 5: Tipo de proteínas según su asociación a membrana.

• Proteínas integrales o intrínsecas: se encuentra ligadas fuertemente a las membranas por fuerzas hidrófobas y solo puede separarse de esta por acción de agentes fuerte que alteran la membrana (solventes, detergentes, etc.). Fuera de la membrana, estas proteínas son insolubles en medio acuoso.

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Este tipo de proteínas, insertadas en la membrana siempre se ven expuestas al medio acuso ya sea de uno u otro lado de la membrana (no existe proteína de membrana que este únicamente inmersa en la fase no polar). Es decir, que las proteínas de membrana intrínsecas presentan un comportamiento anfifílico, con residuos preferentemente no polares en la región interna de la membrana (Isoleucina, Lucina, Valina y fenilalanina) y residuos polares en las regiones que estarán en contacto con el medio acuoso. Aquellas proteínas que están expuestas a ambos lados de la membrana se denominan proteínas transmembrana.

Las proteínas transmembrana pueden atravesar la bicapa una sola vez (unipaso) (Figura 6). Esto implica que el extremo N-terminal de la proteína queda a un lado de la membrana, y el extremo C-terminal al otro. Un ejemplo muy estudiado es la glucoforina A de la membrana del eritrocito. Los dominios de estas proteínas se caracterizan por presentar una estructura secundaria en α-hélice, con residuos laterales hidrofóbicos para poder interaccionar con el interior de la bicapa. En los extremos de la hélice, se presentan residuos con carga, que interaccionan con la cabeza polar de los fosfolípidos de la bicapa. Por fuera de la membrana los dominios son hidrofílicos y globulares, y se halla unida a oligosacáridos en el lado no citosólico.

Figura 6: Proteínas transmembrana: 1- Unipaso de α-hélice, 2- Multipaso α-hélices, 3- multipaso β-laminas.

Las proteínas transmembrana pueden ser multipaso, (Figura 6) esto es, atraviesan la bicapa lipídica en dos o más ocasiones, normalmente mediante varias α-hélice, o de β-lámina. En el primer caso estas proteínas tienen tantas α-hélices como veces atraviesan la membrana. Estas hélices se unen mediante bucles en sus dominios citosólico y extracitosólico. Las α-hélices pueden servir únicamente como mero medio de anclaje a la bicapa (como en la Glucoforina A), o pueden formar un canal por el que puedan pasar diversas sustancias. En este último caso, las hélices tienen residuos hidrofóbicos que dan por fuera del canal, para interaccionar con la bicapa; mientras que los residuos que dan hacia el canal interno son hidrofílicos. De esta forma, muchas sustancias polares, que en ausencia de proteínas no podían cruzar la membrana, ahora sí pueden hacerlo. Las α-hélice pueden desplazarse, resbalando unas sobre otras, para producir un cambio conformacional. Esto sirve para regular la abertura de canales.

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Las proteínas multipaso en β-lámina son menos frecuentes. En este tipo de proteínas sólo requiere unos 10 aminoácidos para atravesar la bicapa (en las α-hélice se requieren 25 residuos). Normalmente forman canales por los cuales atraviesan diferentes solutos. Es el caso de los poros de porina, por los que pasan sustancias con un peso molecular inferior a 800 Da por difusión simple. La porina cruza la membrana con 16 β-lámina anti paralelas, que simulan un barril. Estas láminas alternan aminoácidos polares y apolares, los polares están orientados a la luz del canal, y los apolares contactan con la parte hidrófoba de la bicapa lipídica. Los bucles entre las β-lámina se proyectan hacia el lumen del canal, lo que les confiere especificidad. A diferencia de las α-hélice, las β-lámina se unen entre sí de una forma más rígida, impidiendo los cambios conformacionales, limitándose así su versatilidad. Un ejemplo de este tipo de proteínas son las Aquaporinas, canales para la difusión facilitada del agua a través de la memebrana.

• Proteínas periféricas o extrínsecas. La característica general de este grupo de proteínas es que pueden ser liberadas de la membrana si producir daños en esta y que son estables en solución acuosa. Podemos distinguir 2 sub grupos:

o Proteínas unidas covalentemente: Son proteínas que se encuentran unidas a lípidos (Ácidos grasos, isoprenoides, esteroles o fosofatidilinositoles glicosidados (GPI)) por uno o más enlaces covalentes. Estos enlaces proveen un anclaje hidrofóbico insertado en la bicapa lipídica que mantiene a la proteína en la superficie de la membrana.

o Proteínas unidas no covalentemente: Estas proteínas se asocian a la membrana por fijación en la superficie por medio de interacciones electrostáticas y puentes hidrogeno a las proteínas integrales o a los lípidos. Fuera de la membrana, estas proteínas pueden actuar como proteínas globulares hidrosoluble.

Las proteínas de membrana poseen varias funciones, podemos destacar las siguientes: o Estructurales: estas proteínas hacen de "eslabón clave" uniéndose al citoesqueleto

y la matriz extracelular.

o Receptores de membrana: que se encargan de la recepción y captura de mensajes químicos del medio y transducción de señales químicas, que desencadenan respuestas intracelulares.

o Transportadoras a través de membrana: mantienen un gradiente electroquímico mediante el transporte de membrana de diversos iones. Encargadas de permitir y regular el paso de sustancias a través de la membrana

Dentro de los componentes de las membranas biológicas (Tabla 1) se observa la presencia de entre un 2-10% de hidratos de carbono. Estos se asocian covalentemente a los lípidos (glicolípidos) y a las proteínas (glicoproteínas).

Los glicolípidos presentes en las membranas son los gangliósidos y cerebrósidos (Figura 2). Los gangliósidos se forman por la unión de un oligosacárido con la ceramida. La estructura de los cerebrósidos es similar, sólo que el hidrato de carbono no es un oligosacárido sino una galactosa o una glucosa.

Los hidratos de carbono de los glicolípidos y las glicoproteínas, en su mayoría oligosacáridos, suelen ubicarse en la cara no citosólica de la membrana plasmática formando una estructura llamada glicocálix, que recubren la superficie celular. Sus funciones son:

• Protección: amortigua la membrana citoplasmática y la protege contra lesiones físicas y químicas.

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• Inmunidad a la infección: permite al sistema inmunitario reconocer y atacar selectivamente a organismos extraños.

• Defensa contra el cáncer: los cambios en el glucocálix de las células cancerosas permiten al sistema inmunitario reconocerlas y destruirlas.

• Compatibilidad de los trasplantes: forma la base para la compatibilidad de las transfusiones de sangre, del tejido injertado y de los trasplantes de órganos, ya que es el que responde y hace posible el reconocimiento de las células compatibles para adicionar un tejido, órgano, etc al cuerpo de algún ser vivo.

• Adherencia celular: fija a las células que forman parte de los tejidos.

• Desarrollo embrionario: guía las células embrionarias a sus destinos en el organismo Asimetría de la membrana:

Las membranas biológicas son asimétricas, es decir presentan diferente composición en ambas monocapas. Por ejemplo en las membranas plasmáticas de eritrocitos, encontramos lípidos que contienen colina (fosfatidilcolina y esfingomielinas) en la monocapa externa, mientras que en la membrana interna predominan la fosfatidilserina, fosfatidiletanolamida y fosfatidilonositol. En varios tipos de células, la presencia de fosfatidilserina en la cara externa de la membrana es un marcador para la muerte programada de las células. Esta asimetría se mantiene gracias a la NO translocación de los lípidos, proteínas y carbohidratos

Las proteínas intrínsecas presentan una dada direccionalidad para el cumplimiento de sus funciones, tal que, aun en el caso de proteínas transmenbranas, se manifiesta esta asimetría, con dominios que están siempre en la cara externa y dominios propios del interior de la membrana.

Como ya vimos los hidratos de carbono unidos a membrana lo hacen preferentemente en la cara externa de la membrana plasmática, aportando otro componente de asimetría.

La asimetría, obviamente también está dada por la presencia de proteínas periféricas que solo están a uno u otro lado de la bicapa según su función.

Esta asimetría conformacional se manifiesta en una asimetría funcional. Esto significa que las funciones presentes en la cara citosólica no son las mismas que aparecen en la cara no citosólica. Por ejemplo, en el caso de la membrana plasmática, las moléculas que intervienen en el reconocimiento celular se ubican casi exclusivamente en la cara externa hacia el medio extracelular, pues no tendría mucho sentido que dichas moléculas estuviesen expuestas hacia el citoplasma.

Mecanismos de Transporte de Membrana

Las membranas biológicas son impermeables a la mayoría de los compuestos polares y/o cargados, y permeables a algunos pocos compuestos no polares que se disuelven en ella y la atraviesan por difusión (Figura 7). Las necesidades de nutrientes para la biosíntesis y obtención de energía, y la liberación al medio de bioproductos del metabolismo hacen necesario encontrar formas alternas de transporte transmembrana aun en contra gradiente. Con muy pocas excepciones, el transporte de moléculas pequeñas a través de la membrana plasmática esta mediado por proteínas, ya sea canales transmembranas; trasportadoras o carriers; o bombas.

Los mecanismos de transportes podemos agruparlos en tres categorías: • Trasporte Pasivo,

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• Trasporte activo, y • Exocitosis y Endocitosis

Figura 7: Permeabilidad de la membrana a los diferentes solutos. 1. Transporte Pasivo:

Este tipo de transporte se da cuando a ambos lados de la membrana se presentan soluciones acuosas con diferentes concentraciones de un analito (gradiente de concentraciones) o iones de carga opuesta, generando un gradiente eléctrico (potencial de membrana). En estas condiciones, el sistema evoluciona espontáneamente a un estado de menor energía y mayor desorden, esto es, tiende a igualar las cargas y a eliminar el gradiente de concentraciones. Al ser mecanismos que se originan espontáneamente no requiere el consumo de energía (ATP).

Dentro del transporte pasivo podemos diferenciar 3 mecanismos:

o Difusión Simple: El movimiento de moléculas se da a través de la membrana de fosfolípidos, para ello se requiere que los analitos que difunden sean moléculas pequeñas capaces a atravesar la bicapa, como H2O, CO2 y O2; o solubles en lípidos, como etanol. En estos casos las moléculas difundirán desde la zona de más alta concentración a la de más baja concentración. Mientras no intervengan otros procesos, la difusión continuará hasta eliminar dicho gradiente. La velocidad con la que ocurre este proceso es directamente proporcional al gradiente. Dicha constante de proporcionalidad está dada por el coeficiente de permeabilidad, el cual es un indicativo de la tendencia de un soluto de pasar del solvente acuoso al centro no polar de la membrana

o Osmosis: Este mecanismo es un caso particular de difusión simple, en donde, es en particular el agua la que se transporta a través de la membrana, desde un área de

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baja concentración de soluto, a un área de mayor concentración, para disminuirla hasta lograr sustancias isotónicas (misma omolaridad). En los sistemas biológicos, si el medio es hipertónico, la célula pierde el agua y se deshidrata, por el contrario en medios hipotónicos la célula absorbe el agua hasta producir su lisis. Es entonces esencial para la célula mantenerse en un ambiente isotónico, de forma de no ganar ni perder agua; o generar mecanismos que le permitan la subsistencia en estos medios (osmorregulación). Por ejemplo en bacterias y células vegetales, la presencia de una pared celular soporta la presión osmótica e impide el daño a la célula. En los animales multicelulares, el plasma y los fluidos intersticiales poseen una osmolaridad similar a la del citosol. En caso de presentarse algún desbalance, la célula posee además bombas de Na+ para mantener su equilibrio con el medio.

o Difusión Facilitada: Algunas moléculas por su tamaño (por ejemplo los azucares); o por su carga (iones K+, Na+, Cl-) no difunden libremente a través de la membrana. Este tipo de sustancias emplean canales formados por proteínas de membrana (por ejemplo ya mencionamos como proteína transmembrana a las porinas, como un ejemplo de estos canales) para moverse hacia adentro y afuera de la célula. Podemos diferenciar la difusión simple de la facilitada ya que en esta observamos 4 características:

a- Velocidad y especificidad por un dado sustrato.

b- Cinética de saturación análoga a la vista en cinética enzimática. (ecuación de Michelis-Menten)

c- Susceptibilidad a la inhibición competitiva. d- Susceptibilidad a la inactivación química

Pese a que es un proceso mediado por proteínas, es importante recordar que se trata de un mecanismo de transporte pasivo, es decir que ocurrirá espontáneamente, a favor del gradiente, y sin requerir consumo energético. Tenemos 2 tipos de proteínas que permiten la difusión facilitada:

 Proteínas canal o canales iónicos: son “poros” o “túneles” formados por una o varias proteínas transmembrana. En general, son de tipo multipaso, con un interior hidrofílico. La mayoría de los canales no permanecen abiertos permanentemente, sino que se abren en respuesta a estímulos.  Proteínas “carrier” o permeasas: Este tipo de proteínas fijan una única

molécula de sustrato (o unas pocas) a la vez, y a continuación sufren un cambio conformacional reversible que les permite transportar el soluto de un lado al otro de la membrana. La velocidad de transporte es muy inferior al de los canales iónicos. (Figura 8)

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Figura 8: Mecanismo de transporte de proteínas carrier o permesas.

Existen 3 tipos de permeasas (Figura 9).

Figura 9: Tipos de transporte mediados por proteínas carriers.

a- Monotransportadora o uniporte: Transfieren un solo tipo de soluto de un lado al otro de la membrana. (ej.: transporte de glucosa en la mayoría de las células animales, desde el medio extracelular, la sangre, donde la concentración es mayor, hacia el interior de las mismas donde es menor) b- Cotransportadora o simporte: Transfieren dos tipos de solutos, ambos en el

mismo sentido.

c- Contratransportadora o antiporte: Transfiere dos tipos distintos de solutos en sentidos contrarios. Es decir, uno ingresa al citoplasma si, y solo si, simultáneamente el otro sale.

2. Transporte Activo:

Este tipo de transporte es de gran importancia ya que permite la acumulación de solutos por encima del punto de equilibrio. Por ello es un mecanismo desfavorable termodinámicamente y para que tenga lugar se requiere aportar energía, ATP.

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AL igual que las proteínas que interviene en la difusión facilitada, se observan las mismas 4 características:

a- Velocidad y especificidad por un dado sustrato.

b- Cinética de saturación análoga a la vista en cinética enzimática. (Ecuación de Michelis-Menten)

c- Susceptibilidad a la inhibición competitiva. d- Susceptibilidad a la inactivación química

Y se las puede clasificar en canales y permeasas, así como en uniporte, simporte y antiporte.

Un ejemplo de importancia fundamental de este tipo de transporte es la Bomba de Sodio (Na) y Potasio (K), (Na+K+-ATPasa). Es una proteína presente en todas las membranas plasmáticas de las células animales, cuyo objetivo es eliminar sodio de la célula e introducir potasio en el citoplasma. El mecanismo consiste en la fosforilacion reversible de la enzima por ATP, para dar ADP + Pi. Esto induce un cambio conformacional en la enzima que bombea tres Na+ hacia fuera del citosol y dos K+ hacia el interior.

3. Exocitosis y Endocitosis

Como ya se menciono las membranas biológicas no son sistemas estables, esto implica que están en constante reorganización y que poseen la particularidad de poder fusionarse con otras membranas sin perder su integridad. Para que 2 membranas se fundan se requiere que: a) las 2 membranas se reconozcan, b) se aproximen lo suficiente, c) su bicapa resulte localmente deslocada produciéndose una hemifusión de las 2 capas externas, d) las bicapas se fusionen en una única bicapa continua. Este tipo de procesos requiere ser mediadas por proteínas de fusión con consumo de ATP.

Figura 10: Fusión de dos membranas

La fusión de membrana da lugar a 2 procesos que permiten el transporte transmembrana de sustancias más grandes como polisacáridos, proteínas y otras células. El proceso que permite la incorporación de material extracelular se denomina endocitosis; el proceso que permite segregar macromolecular hacia el exterior de la célula lo denominamos exocitosis.

Exocitosis: Una vesícula membranosa se desplaza hasta la membrana, se fusiona con la

membrana y el contenido se vacía fuera de la célula. Las moléculas segregadas pueden pasar a formar parte de la cubierta celular, incorporarse a la matriz extracelular, Incorporarse al medio interno, sirviendo como nutriente o señal para otras celular, o difundirse hacia el exterior, como por ejemplo las enzimas digestivas.

La membrana de las vesículas secretoras se incorpora a la membrana plasmática y luego se recupera por endocitosis. Es decir existe continuamente un equilibrio entre ambos procesos que

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Endocitosis: la célula incorpora macromoléculas u otras partículas mediante la

invaginación de la membrana plasmática, dando lugar a la formación de vesículas o vacuolas. En la mayoría de los casos estas vesículas se fusionan con lisosomas (contenedores de enzimas hidrolíticas), para dar lugar a la digestión de las macromolecular y su posterior liberación al citosol. Existen 3 procesos diferenciados de endocitosis:

o Fagocitosis: Consiste en la incorporación de una molécula de gran tamaño (o incluso otra celula) al medio intracelular. La membrana plasmática forma prolongaciones celulares (denominados pseudópodos) que envuelven la partícula sólida, englobándola en una vacuola denominada fagosoma. Este mecanismo se da en determinados tipos de células, como los macrofagos del sistema inmunológico.

o Pinocitosis: La membrana celular se invagina, formando una vesícula alrededor del líquido del medio externo que será incorporado a la célula. El tamaño de estas vesículas endocíticas en mucho menor que el de los fagosomas.

o Endocitosis mediada por receptor: Las sustancias que serán transportadas al interior deben primero acoplarse a las moléculas receptoras específicas, que se encuentras concentrados en zonas particulares de la membrana (depresiones). Cuando los receptores están unidos con sus moléculas específicas, se ahuecan y se cierran formando una vesícula. La invaginación de la membrana se denomina en este caso fosita revestida. Esto se debe a que las vesículas presentan en su cara citosolica un revestimiento de proteínas características. Es un tipo muy selectivo de endositosis.

Un ejemplo importante de este proceso es la captación de colesterol por las células animales. El colesterol, debido a su carácter hidrofóbico, es transportado formando complejos llamados lipoproteínas de baja densidad (LDL). Estas LDL se unen a receptores ubicados en la superficie celular y los complejos LDL-receptor son internalizados en vesículas revestidas y luego transferidas a los endosomas, previa liberación de la cubierta de clatrina. En el interior de los endosomas, el LDL se disocia del receptor y este es reciclado nuevamente a la membrana plasmática para captar nuevamente LDL.

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