UNIVERSIDAD VERACRUZANA
FACULTAD DE BIOLOGIA
Evaluación del potencial enzimático de macromicetos
lignícolas del centro del estado de Veracruz
TESIS
Trabajo de Experiencia Recepcional
Que presenta:
Betsy Antonio Revuelta
Directora:
Dra. Gabriela Patricia Heredia Abarca
Dedicatoria:
A mis padres
Mario y María del Carmen, por sus enseñanzas, consejos, esfuerzo y gran compromiso en
todo el transcurso de mi carrera.
A mis hermanos
Mario Alberto, Luis Enrique, Liliana y Giselle, por todo su amor y motivación.
A mis amigos
Especialmente a Karla Lucia por su amistad y complicidad en la vida.
Agradecimientos
A la Dra. Gabriela Patricia Heredia Abarca, quien dirigió esta tesis, por su esfuerzo, enseñanzas, dedicación y por su invaluable aportación a mi formación profesional, además de enseñarme a ver y disfrutar de forma distinta el mundo de los hongos.
A los miembros del comité tutorial: Dra. Beatriz Palmeros Sánchez, M. Yadeneyro de la Cruz Elizondo, por sus comentarios y observaciones, así como por la revisión del manuscrito.
A mi maestra de experiencia recepcional Dra. Socorro Fernández por su disposición y guía para agilizar los trámites de la tesis.
Al Laboratorio de Micromicetos saprobios (INECOL) por la oportunidad brindada para realizar mi tesis en sus instalaciones.
A la Dra. Refugio Rodríguez Vázquez, por brindarme la oportunidad de realizar una estancia en el laboratorio de Bioingeniería y Biotecnología del CINVESTAV unidad Zacatenco.
Al M. en C. Wilberth Chan Cupul, por su apoyo y asesoramiento en la valoración cuantitativa enzimática y Al Biol. Alonzo Cortés Pérez, por su ayuda en la identificación de los hongos.
A la Dra. Rosa María Arias Mota, por su ayuda y comentarios realizados para el mejoramiento del manuscrito.
Al CONACYT por la beca otorgada para la realización de esta tesis a través del proyecto: “Aplicación de las interacciones fúngicas en la restauración y fertilización del suelo” con clave 2011/169124.
ÍNDICE
1.- INTRODUCCIÓN ... 1
1.1.-Macromicetos lignícolas. ... 1
1.2.-Enzimas ligninolíticas. ... 2
1.3.-Biodegradación de la lignina. ... 4
1.4.-Importancia del estudio de las enzimas fúngicas. ... 5
2.- ANTECEDENTES ... 5 3.- JUSTIFICACIÓN ... 6 4.- HIPÓTESIS ... 7 5.- OBJETIVO GENERAL ... 8 5.1.-Objetivos particulares. ... 8 6.- MATERIALES Y MÉTODOS ... 9 6.1.-Estrategia experimental. ... 9 6.2.- Área de estudio... 10
6.3.- Colecta de macromicetos lignícolas. ... 11
6.4.- Aislamiento y desinfección de carpóforos. ... 11
6.5.- Pruebas cualitativas para la detección de las actividades enzimáticas (lacasa, MnP y LiP). .... 12
6.6.- Evaluación cualitativa de la actividad enzimática mediante el cálculo del índice de potencia (IP) de las cepas dieron positivo para lacasa. ... 12
6.7.- Inoculación de los hongos en medio líquido. ... 13
6.8.-Cuantificación de la enzima lacasa. ... 13
6.9.- Cuantificación de la enzima de MnP. ... 14
6.10.- Cuantificación de proteínas totales. ... 15
6.11.- Actividad específica (U/g-1). ... 16
6.12.- Medición del peso seco de la biomasa fúngica. ... 16
7.- RESULTADOS ... 16
7.2.- Aislamiento y obtención de cepas puras de macromicetos lignícolas colectados en el centro
del estado de Veracruz. ... 17
7.3.- Pruebas cualitativas para la detección de las actividades enzimáticas (lacasa, manganeso peroxidasa y lignina peroxidada) en las cepas aisladas. ... 17
7.4.- Evaluación cualitativa mediante el cálculo del índice de potencia (IP) de las cepas que dieron positivo para lacasa. ... 20
7.5.- Evaluación cuantitativa de la actividad enzimática de lacasa y manganeso peroxidasa de las cepas con mayor índice de potencia. ... 22
7.6.- Cuantificación de la enzima lacasa. ... 22
7.7.- Cuantificación de la enzima manganeso peroxidasa. ... 22
7.8.- Producción de biomasa fúngica total producida al final del ensayo cuantitativo y su relación con la producción de lacasa y de manganeso peroxidasa. ... 25
8.- DISCUSIÓN ... 27
9.- CONCLUSIONES ... 31
10.- PERSPECTIVAS ... 31
11.- BIBLIOGRAFÍA ... 32
Resumen
En la presente investigación se evaluó la capacidad enzimática de especies de macromicetos lignícolas nativos de la región centro del estado de Veracruz, con el objetivo de seleccionar cepas con alto potencial para producir las enzimas lacasa, manganeso peroxidasa y lignina peroxidasa. El trabajo consistió en cinco etapas, la inicial realizada en el campo y las subsecuentes en el laboratorio. En la primera etapa, como resultado de recorridos periódicos a zonas boscosas del centro del estado de Veracruz, se colectaron 93 basidiocarpos de macromicetos lignícolas. En la segunda etapa se trabajó en el aislamiento y la obtención de cepas puras de los hongos colectados. Como resultado de esta etapa, en total se obtuvieron 28 cepas, entre las cuales se determinaron taxonómicamente 15 géneros diferentes. En la tercera etapa a las 28 cepas se les detectaron las enzimas estudiadas mediante métodos cualitativos consistentes en la oxidación de colorantes en medios sólidos (ABTS para lacasa, Rojo fenol para manganeso peroxidasa y Azure B para lignina peroxidasa). con excepción del aislamiento Pycnoporus sanguineus TC-3, en las 27 cepas restantes, se encontró una respuesta positiva para lacasa, mientras que para las enzimas manganeso peroxidasa y lignina peroxidasa solamente 5 y 2 cepas dieron positivo respectivamente. En la cuarta etapa, para todas las especies que dieron positivo a lacasa se realizó un ensayo para calcular el índice de potencia (IP) para la producción de dicha enzima durante 10 días de incubación, estos resultados permitieron la selección de las cepas con mayor IP, las cuales fueron: Ganoderma sp. TL-9, Panus sp. RV-16, Panus sp. HY-13, Pycnoporus sanguineus TC-1, Trametes
villosa TL-8 y Trametes versicolor TL-10. La quinta y última etapa consistió en la evaluación
enzimática cuantitativa en medio líquido Sivakumar de las 6 cepas seleccionadas, a lo largo de 14 días de incubación, los cultivos se evaluaron cada tercer día mediante la valoración de muestras a una absorbancia de 420 y 610 nm para lacasa y manganeso peroxidasa respectivamente. De los resultados de esta etapa mostraron que la cepa Trametes villosa TL-8 produjo la mayor actividad enzimática tanto para lacasa como para manganeso peroxidada. De esta forma, con los resultados obtenidos se brindan las bases para futuras investigaciones encaminadas hacia la aplicación de macromicetos lignícolas nativos en la rehabilitación de suelos contaminados en el estado de Veracruz.
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1.- INTRODUCCIÓN
1.1.-Macromicetos lignícolas.
Los hongos son organismos comunes en la naturaleza, se encuentran colonizando sustratos orgánicos e inertes como hojas, ramas y troncos en descomposición, presentan una gran diversidad y amplia distribución, su papel es esencial para el funcionamiento, estructura y equilibrio de los ecosistemas (Dighton, 2003). De acuerdo a la fuente de donde obtienen sus alimentos, crecen como saprobios, parásitos o simbiontes; como saprobios se nutren de restos vegetales o animales, lo que realizan mediante la liberación de enzimas que les permiten descomponer los sustratos orgánicos que colonizan. Para ello, a lo largo de su evolución han desarrollado sistemas enzimáticos capaces de degradar moléculas complejas. Estas enzimas presentan distinto grado de efectividad en la degradación de los materiales orgánicos inertes, condicionando su especialización a diferentes tipos de sustratos en la naturaleza, de esta forma mientras algunos aprovechan indistintamente materia orgánica de origen diverso, otros prefieren sustratos más específicos (Martínez et al., 2005).
Dentro de los hongos saprobios se encuentran las especies que colonizan los restos maderables, a estas especies se les denomina hongos lignícolas y son los responsables de la degradación de la lignocelulosa. Dependiendo de los cambios químicos y estructurales que ocasionan a la madera, pueden clasificarse como hongos de la pudrición o podredumbre café, suave y blanca. La pudrición café es causada principalmente por hongos Basidiomycetes, los cuales degradan hemicelulosa y celulosa despolimerizada presentes en la madera, esta adquiere un color café-rojizo y una consistencia quebradiza, causan algunas alteraciones en la lignina hasta cierto límite, principalmente desmetilaciones y oxidaciones atacando la fracción de polisacáridos. En hongos de la pudrición suave o blanda el daño causado es muy superficial, la madera pierde fuerza mecánica y se torna húmeda y esponjosa, es causada por Ascomycetes y Deuteromycetes (Martínez et al., 2005).
Los hongos de la pudrición blanca (HPB) en su mayoría pertenecen al grupo de los Basidiomycetes, son los microorganismos más eficientes en la degradación de la lignina que es el polímero natural más complejo que existe y cuya función es proteger la madera del
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ataque enzimático microbiano (Saha, 2004). Los HPB degradan la lignina en un proceso oxidativo que no les proporciona energía neta para poder acceder a la hemicelulosa y celulosa a partir de las cuales obtienen su energía (Pointing, 2001).
1.2.- Enzimas ligninolíticas.
Los HBP han desarrollado un sistema enzimático único y no especifico extracelular, que permite la degradación total de los componentes químicos y estructurales de la madera. Las enzimas principales que actúan directa o indirectamente sobre la lignina son lacasa, manganeso peroxidasa y lignina peroxidasa (Martínez et al., 2005). Estos organismos son aerobios obligados, su nutrición es por medio de la combustión biológica de la madera y materiales asociados, utilizan el oxígeno molecular como aceptor final de electrones. La vía metabólica de producción de energía interna es a partir de la glucólisis en el citoplasma y ciclo de Krebs en la mitocondria que es la misma de la mayoría de los organismos aeróbicos (Kirk y Cullen, 1998).
La enzima lacasa (p-difenol: oxígeno oxirreductasa) es una oxidasa que contiene cobre y cataliza la reducción del oxígeno molecular a agua, es el componente más importante del complejo enzimático de los hongos destructores de la madera; cataliza la oxidación de una amplia variedad de compuestos orgánicos, especialmente aromáticos y compuestos inorgánicos (Morozova et al., 2007). En su mayoría las enzimas lacasas son extracelulares aunque se ha detectado actividad intracelular en hongos destructores de madera. Se cree desempeñan una variedad de funciones, como son la morfogénesis y la patogénesis y la degradación de la lignina (Arora y Sharma, 2010).
La lacasa contiene cuatro átomos de cobre que se unen en diferentes sitios de la molécula, los cuales son esenciales para su actividad catalítica y están clasificados en tres tipos: ion mononuclear cobre uno (sitio T1) y un grupo de tres cobres nucleares (sitio T2 y T3) que consisten en un ion de cobre T2 y dos iones de cobre T3 en función de sus propiedades espectroscópicas (espectroscopia UV/Vis) y Resonancia Electrónica Paramagnética o EPR, por sus siglas en inglés. El átomo de cobre del sitio T1 confiere la coloración azul de las enzimas a 610 nm y puede detectarse por ERS; el de sitio T2 es incoloro, pero detectable por EPR y los de sitio T3 tienen una leve absorbancia a 330 nm (espectro fluorescencia) y no son
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detectables por EPR. Los átomos de cobre de sitio T2 Y T3 forman un centro trinuclear indispensable para el mecanismo catalítico. Se ha demostrado que una especie fúngica puede producir varias isoenzimas de lacasa con diferentes propiedades enzimáticas y fisicoquímicas (Morozova et al., 2007).
El mecanismo catalítico de la lacasa comienza con la unión del sustrato a la enzima en una pequeña cavidad cargada negativamente, cercana al átomo de cobre tipo 1; este es el aceptor primario de electrones y está conectado al centro trinucleado conformado por los átomos de cobre tipos 2 y 3 por medio de un tripéptido (His, Cys, His) altamente conservado. Los sustratos son oxidados en el sitio mononuclear y los electrones son transferidos al sitio trinuclear, donde el oxígeno molecular se reduce a agua (Castillo, 2010). La actividad de la enzima lacasa se puede detectar utilizando (ácido 2,2'-[3-etil benzotiazolin-6-sulfónico]) como sustrato, el cual es un compuesto aromático sintético con substituciones nitrogenadas. El ABTS es oxidado por la lacasa a un catión radical estable, que actúa como un co-oxidante de la enzima.
Para determinar la actividad catalítica de la enzima lacasa los mediadores más ampliamente estudiados como sustratos son el ABTS, 2, 6 dimetoxifenol y guayacol. La lacasa puede convertir ortofenoles, parafenoles, aminofenoles, polifenoles, poliaminas y lignina. Inicialmente se consideraba que los sustratos de las lacasas estaban restringidos a compuestos fenólicos, pues su potencial redox podría no ser lo suficientemente alto como para producir la oxidación de estructuras no fenólicas. (Dávila y Vázques-Dualt, 2006).
La lignina peroxidasa (LiP) cataliza la oxidación de la lignina, pero en presencia de H2O2
oxida compuestos fenólicos iniciando con la abstracción de un electrón del anillo aromático del sustrato donador (lignina), resultando un catión radical aril que entonces reacciona como radical y como catión, formando una amplia variedad de fragmentos degradados (Kirk y Cullen, 1998). Las interacciones de LiP con algún sustrato ocurren mediante un mecanismo de ping pong, donde el H2O2 oxida la enzima a través de dos electrones para obtener LiP I,
posteriormente LiP I oxida sustratos aromáticos, por un electrón para obtener LiP II, la que es oxidada nuevamente por el sustrato aromático para llegar a su estado original (Kirk y Cullens, 1998).
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La enzima manganeso peroxidasa (MnP) también requiere de H2O2 para su actividad, cataliza
la oxidación de Mn+2 a Mn+3. El potencial redox de MnP es más bajo que el de LiP, y normalmente no oxida compuestos no fenólicos. La enzima es oxidada por H2O2 para generar
un intermediario deficiente de un par de electrones, conocido como componente I, que puede ser oxidado por Mn2+ o por sustratos fenólicos, generando el componente II. Los HPB que no producen LiP, pero que presentan MnP pueden degradar estructuras no fenólicas de lignina (Kirk y Cullen, 1998). La enzima MnP se encuentra con mayor frecuencia en hongos ligninolíticos que la enzima LiP (Hofrichter, 2002).
1.3.- Biodegradación de la lignina.
La lignina es un polímero de cadena larga, aromático, heterogéneo, tridimensional y de baja viscosidad, estas características hacen que sea muy resistente a la degradación enzimática, debido a su tamaño molecular (600-1000 kDa) es imposible que la lignina sea absorbida y degradada intracelularmente (Pointing, 2001). Además, por el tipo de enlaces covalentes que presenta (aril-éter, aril-aril y carbono-carbono) y su heterogeneidad no puede ser degradada por mecanismos típicos de hidrolisis. Por lo tanto, cualquier enzima o grupo de enzimas hidrolíticas capaces de atacar inicialmente la lignina, deben ser extracelulares, no hidrolíticas y bastante inespecíficas (Dávila y Vázquez-Duhalt, 2006).
La degradación de la lignina incluye una serie de cambios oxidativos que provocan la progresiva despolimerización y la liberación de compuestos de masa molecular baja, que son metabolizados en algunos casos hasta CO2 y H2O (Kirk y Farrell, 1987). El principal efecto
que provocan las enzimas ligninolíticas en la degradación de la lignina o bien durante la degradación de contaminantes es la formación de radicales libres intermedios que se forman cuando un electrón es removido o agregado de una estructura química en su estado más estable (Pointing, 2001). Los radicales libres formados son altamente reactivos y tienden a aceptar o ceder un electrón de otro compuesto, lo que genera la oxidación o la reducción de compuestos alternos (Pointing, 2001).
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1.4.- Importancia del estudio de las enzimas fúngicas.
Los hongos ligninolíticos son de fundamental importancia en los procesos naturales para la eficiente biodegradación de los residuos vegetales, son los únicos que poseen la habilidad para degradar completamente los compuestos lignocelulósicos, gracias a su capacidad para sintetizar enzimas como lacasa, MnP y LiP (Elisashvili y Kachlishvili, 2009).
En las últimas décadas se ha investigado el uso de enzimas fúngicas para la transformación de compuestos contaminantes en moléculas simples e inocuas. Uno de los grandes retos de la humanidad es convertir los desechos y productos contaminantes derivados de los procesos productivos en insumos limpios y eficientes energéticamente (Dávila y Vázques-Dualt, 2006).
El mecanismo del sistema degradador de lignina está basado en la producción de radicales libres, que permite que estas enzimas sean catalíticamente activas sobre una gran variedad de sustratos orgánicos. Debido a la enorme diversidad estructural de contaminantes que son degradados por estos hongos, se les confiere un uso potencial en biorremediación. Estos hongos han sido efectivos para la degradación de una gran variedad de contaminantes ambientales peligrosos tales como: bifenoles policlorinados, explosivos aromáticos, plaguicidas clorados y plaguicidas organofosforados (Dávila y Vázques-Dualt, 2006). Así mismo, son de importancia económica por sus aplicaciones biotecnológicas en el Bio-blanqueo del papel, la decoloración de efluentes, en la industria de textiles, cosmetológica, de bioquímica analítica, de biosensores, de alimentos y en aplicaciones agrícolas (Morozova et
al., 2007).
2.- ANTECEDENTES
La lacasa fue la primera enzima del complejo ligninolítico en ser descubierta. En 1883 Yoshida la descubrió y caracterizó a partir de exudados del árbol japonés Lacca, (Rhus
vernicifera). Posteriormente, Bertrand en (1885) demostró por primera vez la actividad de
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enzima LiP en Phanerochaete chrysosporium, posteriormente, Kuwahara (1984), descubrió en la misma especie la enzima MnP (Ruiz, 1998).
En las últimas décadas se ha demostrado el potencial de los hongos ligninolíticos para transformar compuestos contaminantes a moléculas más simples e inocuas, así como su potencial para ser empleados en procesos biotecnológicos (Dávila y Vázquez-Duhalt, 2006). Un número considerable de investigaciones se han dirigido hacia la búsqueda y estudio de especies nuevas de hongos Basidiomycetos con capacidad alta de producir enzimas ligninolíticas (Hernández-Luna et al., 2008; Elisashvili y Kachlishvili, 2009; Dhouib et al., 2005; Saparrat et al. 2002; Okino et al., 2000; Baldrian, 2007).
Los macromicetos pertenecientes al género Trametes son los más estudiados para la producción de enzimas ligninolíticas, siendo T. versicolor el organismo modelo. Otras especies fúngicas productoras de enzimas incluyen: Pycnoporus sanguineus, Pleorotus
ostreatus, P. djamour, Ganoderma sp. entre otros (Baldarían, 2004; Pointing, 2000). Así
mismo, se ha incrementado el interés por conocer los mecanismos de catálisis y condiciones de cultivo ideales para lograr la máxima expresión enzimática, se tiene conocimiento que la actividad enzimática está influenciada por algunos factores como: especie, cepa, nutrientes, tipo de cultivo, agitación, aeración, pH, temperatura, estrés químico y el tiempo de cultivo. Sin embargo, se considera que los más críticos son las fuentes de nitrógeno y de carbono y la naturaleza y concentración de los inductores (Nivadeli, 2007; Dhonouib et al., 2005; Sivakumar et al., 2010).
Para México, pese a que es uno de los países con mayor biodiversidad, se han hecho pocos trabajos de bioprospección enzimática, entre los autores que han publicado estudios sobre hongos que producen enzimas ligninolíticas están: Torres y Duarte (2009), Rodríguez-Cruz et
al. (2006), Dzul-Puc et al., (2005), Camero et al. (2005) y Rodríguez (1999).
3.- JUSTIFICACIÓN
Debido al deterioro ambiental que el planeta ha sufrido en los últimos años, la preocupación por la conservación y restauración de ambientes naturales se ha incrementado. Un método
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alternativo ecológico y viable es la biorremediación mediante organismos fúngicos, aprovechando la capacidad metabólica principalmente de hongos ligninolíticos, por su capacidad de transformar o mineralizar contaminantes orgánicos y compuestos recalcitrantes en sustancias menos peligrosas o nocivas, las cuales son integradas en los ciclos biogeoquímicos naturales (Marganesin y Schinner, 2001).
El estado de Veracruz posee una enorme diversidad biológica fúngica, se tienen registradas aproximadamente 1,500 especies de hongos. A pesar de que se cuenta con numerosos trabajos que tratan sobre los hongos macroscópicos, la mayoría de estos estudios tienen un enfoque principalmente taxonómico y los aspectos ecológicos de estos organismos son tratados de manera superficial (Guzmán et al., 2003). Bajo estas circunstancias en el estado de Veracruz es de esperar que exista un gran cantidad de especies fúngicas que aún no se conocen y que podrían tener un gran potencial enzimático para ser utilizadas en futuros trabajos que valoren su potencial biotecnológico.
Por otra parte uno de los problemas principales para la conservación de áreas naturales en el estado Veracruz es la transformación del uso de suelo y la actividad pecuaria, agrícola y agroforestal que se practican de forma extensiva, causando una continua deforestación de selvas y bosques (Ellis y Martínez, 2010). Lo anterior conlleva a un exterminio preocupante de la riqueza fúngica de la zona, y en consecuencia la pérdida del germoplasma nativo, así como del conocimiento de sus posibles aplicaciones biotecnológicas. Esta problemática no es exclusiva de nuestro país, puesto que a nivel mundial existen pocos trabajos que consideran a los hongos en los programas de conservación, pese a su importancia en los ecosistemas y a su potencial biotecnológico.
4.- HIPÓTESIS
Veracruz es uno de los estados con mayor diversidad biológica en el territorio nacional, por lo que es de esperar que posea una amplia riqueza de especies fúngicas. Puesto que los hongos son los principales degradadores de los restos vegetales gracias a su capacidad enzimática es factible encontrar especies que sinteticen moléculas con potencial biotecnológico.
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Los hongos macromicetos ligninolíticos producen principalmente enzimas lacasa, manganeso peroxidasa y lignina peroxidasa, por tal motivo se espera encontrar cepas con un alto potencial ligninolítico que produzcan estas tres enzimas.
De las tres enzimas evaluadas la que se encontrará con mayor frecuencia y con mayor potencial enzimático en los aislados será lacasa, dado que está reportado en diversos trabajos que en su mayoría los hongos ligninolíticos producen esta enzima.
5.- OBJETIVO GENERAL
Evaluar mediante métodos cualitativos y cuantitativos la producción de enzimas ligninolíticas de macromicetos lignícolas del centro del estado Veracruz y seleccionar las cepas con mayor potencial enzimático.
5.1.- Objetivos particulares.
a. Realizar un estudio bioprospectivo mediante recorridos en zonas boscosas del centro del
estado de Veracruz, para colectar, aislar y purificar cepas nativas de macromicetos lignícolas.
b. Detectar cualitativamente en las cepas aisladas las actividades enzimáticas de lacasa,
lignina peroxidasa y manganeso peroxidasa.
c. Evaluar cualitativamente mediante el índice de potencia las cepas que dieron positivo para
lacasa.
d. Evaluar cuantitativamente en cultivos líquidos de las cepas con mayor índice de potencia la
producción de lacasa y manganeso peroxidasa.
e. Determinar la biomasa fúngica total producida al final del ensayo cuantitativo y analizar su
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6.- MATERIALES Y MÉTODOS 6.1.- Estrategia experimental.
Figura 1. Estrategia experimental utilizada para la evaluación enzimática.
Etapa 1. Colecta de macromicetos lignícolas de
zonas boscosas del centro del estado de Veracruz
LiP
Etapa 4. Evaluación cualitativa mediante el
cálculo del índice de potencia (IP
)
Etapa 2. Aislamiento y obtención de cepas
puras de macromicetos lignícolas
Lacasa MnP
Cuantificación de proteínas
Determinación de la biomasa fúngica total
Etapa 5. Evaluación cuantitativa de la
actividad enzimática de lacasa y MnP de las cepas con mayor IP
Identificación taxonómica
Selección de cepas con mayor IP
(6 cepas)
Etapa 3. Detección cualitativa de la
actividad enzimática de las cepas aisladas
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Etapa 1. Colecta de macromicetos lignícolas de zonas boscosas del centro del estado de Veracruz.
6.2.- Área de estudio.
Las colectas fueron realizadas en localidades del centro del estado de Veracruz (Figura 2) en los municipios de San Andrés Tlalnelhuayocan (San Andrés Tlalnelhuayocan, Rancho Viejo), Xalapa (El Haya, Santuario del bosque de niebla, Jardín botánico Francisco Javier Clavijero) y Tlacotepec de Mejía (Tlacotepec de Mejía).
Figura 2. Ubicación geográfica de los sitios de colecta. A) Parque ecológico el Haya B) Santuario del Bosque de
Neblina, INECOL y Jardín Botánico Francisco Javier Clavijero C) Tlacotepec de Mejía D) San Andrés Tlalnelhuayocan E) Rancho Viejo. Imagen tomada de Google earth.
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6.3.- Colecta de macromicetos lignícolas.
La colecta de cuerpos fructíferos o carpóforos se realizó mediante recorridos en campo durante el periodo abril-agosto de 2012. Se colectaron cuerpos fructíferos que se encontraban sobre madera muerta o en árboles viejos y moribundos. Los ejemplares se describieron morfológicamente en fresco (Guzmán, 1977). Para cada ejemplar se tomó una imagen digital, posteriormente fueron trasportados al laboratorio de hongos microscópicos del INECOL A. C. ubicado en la ciudad de Xalapa, Ver, México.
Etapa 2. Aislamiento y obtención de cepas puras de macromicetos lignícolas colectados en el centro del estado de Veracruz.
6.4.- Aislamiento y desinfección de carpóforos.
En un principio el aislamiento y desinfección de los hongos fue basado en el método descrito por Luigi, (1995). La técnica consistió en lavados de los cuerpos fructíferos, los cuales se cortaron longitudinalmente en fragmentos pequeños entre 0.5-1 cm. aproximadamente, a los trozos se les dio un baño con etanol al 70 % durante 1 minuto, posteriormente se lavaron con hipoclorito de sodio (cloro al 5 %) durante otro minuto y finalmente se les realizaron 7 lavados seriados con agua esterilizada, cada lavado fue de 30 segundos aproximadamente. Una vez esterilizados los trozos se colocaron en cajas Petri con papel filtro para retirarles el agua sobrante. La siembra de los fragmentos ya desinfectados se realizó en medio de cultivo papa dextrosa agar (PDA) con Benomyl (Muller et al., 2004) (Anexo 1.1).
Para su conservación, las cepas se almacenaron en viales con semillas de sorgo estériles, una vez que el micelio colonizó las semillas se guardaron en a una temperatura de 5°C.
La identificación taxonómica del material fúngico se realizó de acuerdo a las características morfológicas, para lo cual se consultaron claves y literatura especializada, además de las colecciones del herbario (XAL) de hongos del Instituto de Ecología A.C. Los ejemplares se determinaron a nivel género y algunos a nivel especie, cabe señalar que solo se prosiguió a la identificación de los macromicetos lignícolas que se lograron purificar.
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Etapa 3. Detección cualitativa de la actividad enzimática de las cepas aisladas.
6.5.- Pruebas cualitativas para la detección de las actividades enzimáticas (lacasa, MnP y LiP).
Para la evaluación cualitativa de las actividad enzimática se empleó el medio de cultivo sólido Rubilar, (2007) (Anexo 1.2). Para la detección de la actividad oxidante extracelular tipo lacasa se empleó ABTS que produjo un cambio de coloración de incoloro a verde esmeralda. Para detectar la actividad de LiP se utilizó como colorante del medio Azure B (Metileno Azur B trimethiltionina clorido) que al ser oxidado por LiP, produjo una decoloración de azul violeta a incoloro y para la detección de MnP se empleó Rojo fenol, la oxidación de este por la acción de la enzima MnP produjo una reacción colorida, el medio de cultivo cambio de amarillo a naranja (Castillo, 2010).
Las cajas con medio fueron inoculadas con discos de micelio de 5 mm de diámetro de un cultivo previamente reactivado en Papa Dextrosa Agar (PDA) durante 7 días e incubadas a 25°C por un periodo de diez días. Como testigo positivo se empleó una cepa de Pleurotus
djamor de la cual se tiene conocimiento de su producción enzimática y fue facilitada por la
colección de hongos comestibles del INECOL A. C.
Etapa 4. Cálculo del índice de potencia (IP)
6.6.- Evaluación cualitativa de la actividad enzimática mediante el cálculo del índice de potencia (IP) de las cepas dieron positivo para lacasa.
Las cepas que mostraron actividad de la enzima lacasa, fueron evaluadas para la selecciónar los mejores aislamientos productores de la enzima. Se utilizó como parámetro de selección los valores obtenidos en el cálculo del IP, definido como la razón entre el área del crecimiento del halo de oxidación y el área de crecimiento de la colonia (Castillo, 2010). El área de oxidación y de la colonia se obtuvo mediante el software ImageJ ® 1.44 (Figura 3) en donde se introdujo la imagen fotográfica de los cultivos (escala de 1 cm2).
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Figura 3. Software ImageJ ® 1.44, con imagen
fotográfica, para el cálculo del índice de potencia. En cuadro de resultados: 1. Área del halo de oxidación. 2. Área de crecimiento de la colonia.
Etapa 5. Evaluación cuantitativa de la actividad enzimática de lacasa y manganeso peroxidasa de las cepas con los valores más altos de índice de potencia.
6.7.- Inoculación de los hongos en medio líquido.
Previo a la evaluación cuantitativa, las cepas seleccionadas fueron reactivadas por 7 días en medio de cultivo PDA. En la evaluación se empleó el medio de cultivo líquido descrito por Sivakumar et al. (2010) (Anexo 1.3). Para cada cepa se inocularon 4 discos de micelio con agar (6 mm cada uno) en Matraces Erlenmeyer de 250 ml con 120 ml del medio de cultivo. Para cada cepa y para el testigo se incluyeron cuatro repeticiones. Todos los cultivos se incubaron durante 14 días en un agitador orbital a 125 rpm y a 25°C. Cada tercer día, bajo condiciones asépticas se tomaron alícuotas de 3 ml del sobrenadante de cada cultivo para posteriormente valorar con el espectrofotómetro la concentración de unidades enzimáticas.
6.8.- Cuantificación de la enzima lacasa.
La determinación de la actividad enzimática de lacasa, se evaluó siguiendo el método descrito por Dhouib et al., (2005) a través de la oxidación del ABTS. Se cuantificó en mezcla de reacción de 1 ml para lo cual se agregó 100 µL de Buffer acetato de sodio 0.1 M pH 4.5., 800 µL de muestra y se adicionó de manera in situ 100 µL de ABTS 0.5 mM, inmediatamente se
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agitó e hizo el seguimiento de la reacción durante 3 min., la absorbancia se midió a una longitud de onda de 420 nm en espectrofotómetro UV-1800, tomando la lectura delta de absorbancia entre el inicio y final de la reacción mediante el software UV Probe (Kinetics). Se utilizó como blanco de reactivos 100 µL de buffer y 900 µl de muestra. La temperatura de reacción fue de 30ºC.
Una unidad de lacasa se define como la cantidad de enzima capaz de oxidar 1 mol de ABTS por minuto por litro bajo las condiciones estándar de la prueba. El coeficiente de extinción del ABTS a una absorbancia de 420 nm sensibilidad alta es de 36 M-1 cm -1.
Para la determinación de las unidades enzimáticas de lacasa se utilizó la siguiente ecuación Chaparro y Rosas, 2006; (Páez, 2012).
Lacasa = Vm t Vt ΔAbs ξ (1000000) Donde:
t = Tiempo de reacción de tres minutos
ξ = Valor del coeficiente de extinción mol del ABTS oxidado a 420 nm: 36 M-1 cm-1 Vt = Volumen total de reacción de 1 ml
Vm = Volumen de muestra de 0.8 ml
λ= Haz de luz = 1 cm
Δabs = Abs final – Abs inicial. Corresponde al valor de la pendiente de la recta.
6.9.- Cuantificación de la enzima de MnP.
Para la cuantificación de MnP se utilizó el método descrito por Rubilar (2007). En un tubo ependorf se adicionaron, en el orden indicado 50µL de cada uno de los siguientes reactivos: Rojo de fenol 0.01%(p/v), lactato de sodio 25 mM, MnSO4 100 M, albúmina de huevo
0.1%(p/v), succinato de sodio 20 mM pH 4.5, posteriormente se adicionaron 700 µL de muestra y 50 µL de H2O2 100 M y se agitó la mezcla de reacción, consecutivamente los
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tiempo de reacción, esta se detuvo por la adición de 40 L de NaOH 2N y se leyó a una absorbancia a una longitud de onda de 610 nm, utilizando como blanco de reactivos todos los componentes de la mezcla excepto los 50 µL de H2O2 que se remplazaron por 50 µL de agua
desionizada.
Una unidad de MnP se define como la cantidad de enzima capaz de oxidar 1µmol de Rojo de fenol por minuto bajo las condiciones de la prueba (Saparrat et al., 2002). Para calcular las unidades de actividad enzimática, se utilizó un coeficiente de extinción de 4.460 M-1. cm-1 reportado por Michel et al. (1991).
UMnP = Vm t Vt Abs ξ Donde:
U MnP = Unidades de manganeso peroxidasa
A = Absorbancia de la muestra a 610 nm. Vt = Volumen total de reacción (1ml) Vm = Volumen de muestra (0.7 ml) t = Tiempo de reacción (5 min)
ξ = Coeficiente de extinción (4,460M-1cm-1)
λ = Paso de haz de luz (1 cm)
6.10.- Cuantificación de proteínas totales.
La cantidad de proteínas contenida en los extractos enzimáticos se determinó mediante la técnica descrita por Bradford (1976). Para lo cual se adicionó en tubos eppendorf de 1 ml de capacidad, 500 µl del extracto de cada muestra y 500 µL de reactivo Bradford. Posteriormente, se agitaron y después de 5 minutos se tomaron las lecturas en el espectrofotómetro a una absorbancia 595 nm. Para ajustar el espectrofotómetro a cero se utilizó como blanco 500 µL de agua desionizada y 500 µL del reactivo Bradford. La cantidad
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de proteína se calculó, interpolando la densidad óptica obtenida en una curva patrón de proteína (Anexo 3).
6.11.- Actividad específica (U/g-1).
La actividad específica es el número de unidades de enzima por miligramo de proteína (U/mg proteína) o por mililitro de disolución (U/ml). Esté se calculó obteniendo el cociente de la actividad enzimática de lacasa (U) entre el contenido de proteína (g).
6.12.- Medición del peso seco de la biomasa fúngica.
Al finalizar el ensayo (día 14) los cultivos se filtraron a través de papel filtro con una bomba de vacío, posteriormente las cepas se colocaron dentro de una estufa a 45°C y se tomaron mediciones hasta peso constante, una vez obtenido el peso seco final se le resto el valor del peso del papel filtro (Figura 4).
Figura 4. Obtención de la biomasa fúngica total al finalizar el ensayo.
7.- RESULTADOS
Etapa 1:
7.1.- Colecta de macromicetos lignícolas de zonas boscosas del centro del estado de Veracruz.
Durante los meses de abril-agosto se realizaron seis colectas en zonas boscosas de los municipios San Andrés Tlalnelhuayocan (San Andrés Tlalnelhuayocan, Rancho Viejo),
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Xalapa (El Haya, Santuario del Bosque de Niebla, Jardín Botánico Francisco Javier Clavijero) y Tlacotepec de Mejía (Tlacotepec de Mejía) (Figura 2), de las cuales se obtuvieron 93 cuerpos fructíferos de macromicetos lignícolas.
Etapa 2:
7.2.- Aislamiento y obtención de cepas puras de macromicetos lignícolas colectados en el centro del estado de Veracruz.
De los 93 carpoforos, se obtuvieron 28 cepas que representan el 31 % del total de los macromicetos colectados. Esto debido a que algunos carpóforos no crecieron y a que en ocasiones se presentaron organismos contaminantes.
De todos los hongos se realizaron descripciones morfológicas en fresco y se tomaron fotografías para su posterior identificación. Solamente se identificó el material que creció en medio de cultivo. De las 28 cepas purificadas, se identificaron los siguientes 15 géneros:
Corticium, Entonaema, Ganoderma, Hexagonia, Lenzites, Panus, Pleurotus, Polyporus, Pycnoporus, Schizophyllum, Stereum, Trametes, Tremela, Trichaptum y Xeromphalina. A
nivel de especie se identificaron los siguientes 8 taxones Entonaema pallidum, Polyporus
abietinus, Pleurotus djamor, Pycnoporus sanguineus, Schizophyllum comune, Trametes versicolor y Trametes villosa (Tabla 1). Los géneros con mayor representatividad de especies
fueron Trametes (7 especies) y Lenzites (3 especies).
Etapa 3:
7.3.- Pruebas cualitativas para la detección de las actividades enzimáticas (lacasa, manganeso peroxidasa y lignina peroxidada) en las cepas aisladas.
En la detección de la actividad de lacasa se empleó ABTS que al ser oxidado produjo un cambio de coloración de incoloro a verde esmeralda. La reacción positiva de lignina peroxidasa produjo una decoloración de azul violeta a incoloro y en la detección de manganeso peroxidasa se produjo una reacción colorida, el medio de cultivo cambio de amarillo a naranja (Figura 5).
Todos los aislamientos dieron positivo a al menos un tipo de actividad enzimática, con excepción de una cepa Pycnoporus sanguineus TC-3, en todas las demás se detectó la
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presencia de lacasa, mientras que para MnPy LiP únicamente se encontraron 5 y 2 cepas respectivamente. En ninguna de las cepas evaluadas se detectó actividad para las tres enzimas (Tabla 1). De las 27 cepas con respuesta positiva a lacasa, Ganoderma sp.TL-5, Polyporus
abietinus TC-2, Pycnoporus sanguineus TC-1, Trametes versicolor TL-10 y Trametes villosa
TL-8, también tuvieron actividad para MnP. En lo que respecta a la enzima LiP, solamente en la cepas Xeromphalina sp. HY-14 y Pycnoporus sanguineus TC-3 se detectó actividad para dicha enzima.
Figura 5. Detecciones cualitativas. A) Rojo fenol para la detección de (MnP), B) Azure B para la detección de
(LiP) y C) ABTS para detección de (lacasa). Placas, a la derecha se muestra la actividad positiva de las enzimas.
A)
B)
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Tabla 1. Actividades enzimáticas de lacasa, manganeso peroxidasa y lignina peroxidasa de las especies
evaluadas, detectadas mediante métodos cualitativos.
Especie de macromicetos Lacasa Manganeso
peroxidasa Lignina peroxidasa Índice de potencia * (valor máximo) Corticium sp. SBN-20 + - - 10.30 (2) Entonaema pallidum RV-15 + - - 29.41 (3) Ganoderma sp. TC-7 + - - 4.51 (2) Ganoderma sp. TL-9 + + - 44.64 (8) Hexagonia sp. SBN-24 + - - 5.54 (2) Lenzites sp. TC-4 + - - 5.74 (2) Lenzites sp. SBN-26 + - - 29.23 (6) Lenzites sp. SBN-21 + - - 15.27 (3) Panus sp. HY-13 + - - 60.89 (10) Panus sp. RV-16 + - - 73.33 (10) Pleurotus djamor. TC-5 + - - 47.00 (6) Pleurotus sp. SBN-18 + - - 8.41 (2) Polyporus abietinus TC-2 + + - 31.15 (2) Polyporus sp. SBN-27 + - - 16.24 (4) Pycnoporus sanguineus TC-1 + + - 63.01 (7) Pycnoporus sanguineus TC-3 - - + -
Schizophyllum comune CE-28 + - - 3.93 (2)
Stereum sp.TC-6 + - - 27.73 (6) Stereum sp. SBN-22 + - - 14.10 (2) Trametes versicolor TL-10 + + - 44.97 (2) Trametes villosa TL-8 + + - 57.65 (6) Trametes sp. SBN-25 + - - 4.57 (39 Trametes sp.TL-11 + - - 13.71 (2) Trametes sp. TL-12 + - - 7.33 (3) Trametes sp. Aff. SBN-23 + - - 7.17 (3) Tremela sp. JB-17 + - - 14.07 (4) Trichaptum sp. SBN-19 + - - 21.38 (4) Xeromphalina sp. HY-14 + - + 9.21 (7)
(+) Detección de la enzima. *Datos del máximo valor del índice de potencia para cada especie, entre paréntesis se indica el día en que se presentó la máxima actividad. Clave localidades: SBN: Santuario del Bosque de Neblina, INECOL, RV: Tlacotepec de Mejía, TL: San Andrés Tlalnelhuayocan, RV: Rancho Viejo, HY: Parque Ecológico el Haya y JB: Jardín Botánico Francisco Javier Clavijero.
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Etapa 4:
7.4.- Evaluación cualitativa mediante el cálculo del índice de potencia (IP) de las cepas que dieron positivo para lacasa.
Las cepas fúngicas con actividad de lacasa detectadas en el ensayo anterior (Tabla 1), fueron evaluadas para la selección de los hongos con mayor potencial enzimático, utilizando como criterio de selección el cálculo IP. El máximo valor del IP fue de 73.33 para la cepa Panus sp. RV16 y el mínimo de 3.93 para Schizophyllum commune CE-28. El tiempo de incubación en el que cada una de las cepas evaluadas obtuvo el valor máximo del IP fue variable (Figura 6).
Después del quinto día de incubación fueron detectados los valores más altos del IP; las cepas
Pleurotus djamor TC-5 (47.006 ± 0.84, día 6); Trametes villosa TL-8 (57.65 ± 3.02, día 6), Trametes versicolor TL-10 (44.97± 0.07, día 2), Pycnoporus sanguineus TC- 1(63.01± 1.82,
día 7), Ganodema sp. (44.64 ± 0.56, día 9), Panus sp. HY-13 (60.89 ± 0.60, día 10) y Panus sp. RV-16 (73.33 ± 2.83, día 10) destacaron por presentar un alto IP.
Figura 6. Valores máximos del índice de potencia y tiempo en el que cada una de las cepas estudiadas lo obtuvo.
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A) B)
C) D)
Figura 7. Cepas con valores altos de índice de potencia. A) Panus sp. RV-16, B) Panus sp. HY-13, C)
Pycnoporus sanguineus TC- 1, D) Trametes villosa TL-8, E) Trametes versicolor TL-10 y F) Ganoderma
sp.TL-9.
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Etapa 5:
7.5.- Evaluación cuantitativa de la actividad enzimática de lacasa y manganeso peroxidasa de las cepas con mayor índice de potencia.
De acuerdo a los resultados del índice de potencia, las cepas seleccionadas para la evaluación cuantitativa fueron: Pycnoporus sanguineus TC- 1, Trametes villosa TL-8, Ganoderma sp.TL-9, Trametes versicolor TL-10, Panus sp. HY-13 y Panus sp. RV-16 (Figura 7).
7.6.- Cuantificación de la enzima lacasa.
La habilidad de los hongos para producir lacasa varió entre especies y aun entre cepas de la misma especie (Figura 8). La máxima producción de lacasa se observó en los cultivos de
Trametes villosa TL-8 y Trametes versicolor TL-10, ambos al día 12 de incubación, con
2418.5759 UI mg-1 y 549.24 Ul mg-1 respectivamente. El resto de las cepas evaluadas registraron valores mucho más bajos, Ganoderma sp. TL-9 (7.98 UI mg-1), Panus sp. HY-13 (73.47 UI mg-1), Panus sp. RV-16 (6.520 UI mg-1) y Pycnoporus sanguineus TC- 1 (84.03 UI mg-1).
Las dos especies de Trametes tuvieron un comportamiento similar, en las primeras etapas de desarrollo presentaron una actividad notoriamente baja y después del pico máximo a los 12 días su actividad declinó (Figura 8 E y F). Por el contrario en los cultivos de Ganoderma y de las dos especies de Panus la mayor actividad enzimática se detectó en la fase inicial de crecimiento (Figura 8 A, B y C).
7.7.- Cuantificación de la enzima manganeso peroxidasa.
La dinámica de producción enzimática tuvo un comportamiento muy variable en todas las cepas (Figura 9). En todas ellas se encontró una baja actividad de la enzima MnP. La máxima producción de MnP se detectó en los cultivos de Trametes villosa TL-8 al día 14 de incubación con 8.5 UI mg-1 (Figura 9-E), con excepción de este cultivo y de Panus sp. HY-13, en las demás cepas la actividad enzimática disminuyó notoriamente al final del
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experimento. La segunda cepa con mayor actividad enzimática correspondió a Panus sp. HY-13 (6.7 UI mg-1) (Figura 9-C), la cual no produjo la enzima sino hasta el décimo día de incubación mostrando un aumento paulatino hacia el final del experimento.
A) B)
C) D)
E) F)
Figura 8. Valoración cuantitativa de la actividad enzimática específica de lacasa de las especies seleccionadas: A) Ganoderma sp. TL-9, B) Panus sp. RV-16, C) Panus sp. HY-13, D) Pycnoporus sanguineus TC-1, E)
Trametes villosa TL-8 y F) Trametes versicolor TL-10.
24 A) B) C) D) E) F)
Figura 9. Valoración cuantitativa de la actividad enzimática específica de manganeso peroxidasa de las especies
seleccionadas: A) Ganoderma sp. TL-9, B) Panus sp. RV-16, C) Panus sp. HY-13, D) Pycnoporus sanguineus TC-1, E) Trametes villosa TL-8 y F) Trametes versicolor TL-10.
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7.8.- Producción de biomasa fúngica total producida al final del ensayo cuantitativo y su relación con la producción de lacasa y de manganeso peroxidasa.
La producción de biomasa se muestra en la figura 10 y 11, todas las cepas evaluadas desarrollaron pellets de distintas dimensiones en respuesta a la agitación de los cultivos. La cepa con mayor biomasa en el día 14 de crecimiento fue Trametes villosa TL-8, seguida por
Panus sp. RV-16, Panus sp. HY-1, Ganoderma sp. TL-9, Trametes versicolor TL-10 y por
último Pycnoporus sanguineus TC-1.
La relación entre la producción de biomasa y la actividad enzimática fue variable entre las cepas estudiadas (Figuras 10 y 11) sin que se detectara un patrón definido. En Trametes
villosa TL-8 y Panus sp. RV-16, las cuales fueron las dos cepas con la mayor producción de
biomasa, la actividad enzimática tuvo un comportamiento opuesto; mientras que en la primera se detectó la mayor actividad enzimática, por el contrario en la segunda la actividad enzimática fue notoriamente baja.
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Figura 10. Producción de biomasa y actividad enzimática de la enzima lacasa en Pycnoporus sanguineus
(TC-1), Trametes villosa (TL-8), Ganoderma sp. (TL-9), Trametes versicolor (TL-10), Panus sp. (RV-16) y Panus sp. (HY-13), a los 14 días de crecimiento en medio líquido de Sivakumar. Los datos corresponden al promedio de cuatro repeticiones.
La línea roja indica la producción enzimática.
Figura 11. Producción de biomasa y actividad enzimática de la enzima manganeso peroxidasa en
Pycnoporus sanguineus (TC-1), Trametes villosa 8), Ganoderma sp. 9), Trametes versicolor
(TL-10), Panus sp. (RV-16 ) y Panus sp. (HY-13), a los 14 días de crecimiento en medio líquido de Sivakumar. Los datos corresponden al promedio de cuatro repeticiones.
La línea roja indica la producción enzimática.
B iom asa gr s/m ice li o sec o) . Ac ti vidad e nz im áti ca d e lac asa (UI mg -1 ) B iom asa ( gr s/m ice li o sec o) . Ac ti vidad e nz im áti ca d e MnP (UI mg -1 ) Cepas evaluadas Cepas evaluadas
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8.- DISCUSIÓN
No obstante que el porcentaje de cepas que se logró purificar a partir del material colectado fue bajo (31%), fue posible contar con una muestra diversa y representativa de algunos de los géneros que en la literatura se mencionan como importantes productores de enzimas lignolíticas. La etapa del aislamiento y purificación de las cepas a partir de los carpóforos es la base para el desarrollo de este tipo de trabajos. Por la consistencia y la forma de los cuerpos fructíferos de los hongos lignícolas se encontró que no es posible generalizar el tiempo y tipo de desinfección. De acuerdo a los múltiples ensayos realizados en este trabajo, el tiempo de la desinfección con hipoclorito de sodio para las especies con tejidos carnosos o gelatinosos no debe superar al minuto de exposición y es necesaria la realización de al menos 5 lavados de agua destilada esterilizada para eliminar el resto del desinfectante. Para los hongos con consistencia blanda o gelatinosa es recomendable efectuar únicamente lavados seriados (5-10) con agua estéril, para no afectar los tejidos y eliminar bacterias y esporas contaminantes. Otra manera viable de realizar los aislamientos es mediante la extracción del tejido fúngico directamente del contexto del pileo o del estípite.
Así mismo, en el campo es importante colectar especímenes que no se encuentren en estados avanzados de maduración, para evitar la presencia de poblaciones bacterianas, huevos y larvas de artrópodos y de hongos filamentosos contaminantes que inhiben el desarrollo del micelio de los basidiomicetos lignícolas debido a que su tasa de crecimiento es mucho mayor que la de los basidiomicetos. Para futuros estudios es recomendable que se prueben diferentes tipos de medios de cultivo, ya que probablemente este factor fue una limitante e influyó en el bajo número de cepas obtenidas. Otro aspecto a contemplar es la realización de colectas en diferentes épocas del año para captar una mayor diversidad de especies.
Todas las cepas que se aislaron comprenden géneros que prosperan comúnmente en la región (Chacón et al., 1995). El género que se aisló con mayor frecuencia fue Trametes, mismo que se caracteriza por formar conjuntos de cuerpos fructíferos en forma de repisas que se sobreponen a lo largo de las ramas o troncos muertos (Guzmán, 2008).
Con respecto a las técnicas empleadas para la detección enzimática en forma cualitativa, el uso de compuestos oxidantes como colorantes reveladores resultó ser un buen método que permitió distinguir de manera relativamente sencilla y rápida las especies con respuesta
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positiva a las enzimas estudiadas. No obstante para tener una panorámica completa es recomendable evaluar las cepas con distintos tipos de sustratos o compuestos oxidantes como la siringaldazina, el guayacol y el dimetoxifenol, ya que se ha reportado variación en las respuestas de las cepas (Tinoco et al., 2001; Datan et al., 2008) según el compuesto oxidante que se emplee.
Los resultados cualitativos corroboran que la producción de enzimas tipo lacasa está ampliamente distribuida en los hongos lignícolas y que pocas especies tienen la capacidad de sintetizar manganeso peroxidasa y un aún menor número de especies sintetizan la lignina peroxidasa (Elisashvili et al., 2009).
Especies de los géneros Trametes sp., Pycnoporus sp. y Pleurotus sp. son reportadas en la literatura con mayor frecuencia que las demás, debido a su alta capacidad para producir enzimas ligninolíticas (Baldrian, 2004). Por su parte, existe un menor número de trabajos para los géneros Ganoderma sp. (Sivakumar et al., 2010), Panus sp., Polyporus sp., Schizophyllum sp. (Arora y kumar, 2010), Stereum sp., Trichaptum sp., (Okino et al., 2010), Corticium sp., (Lucas et al., 2008), Hexagonia sp. (Sánchez, 2011), Lenzites sp. (Alberts, 2009) y Tremella sp. (Seshikala, 2012). Para Entonaema pallidum y Xeromphalina sp. no se encontró información por lo que se considera que el presente estudio podría ser la primera aportación en donde se detecta la producción de lacasa para estas especies.
Es interesante señalar que cepas de la misma especie pueden presentar una respuesta enzimática diferente, tal fue el caso de las cepas Pycnoporus sanguineus TC-1 y Pycnoporus
sanguineus TC3, en donde la primera fue positiva a lignina peroxidasa y manganeso
peroxidasa, mientras que en la segunda únicamente se encontró respuesta positiva para lignina peroxidasa. Lo anterior muestra la variación fisiológica que puede existir a nivel de especie. Algunos estudios (Pointing, 2000) reportan exclusivamente la producción de lacasa en P.
sanguineus y otros mencionan cepas de esta especie que también producen lignina peroxidasa
(Okino et al., 2000). Lo anterior evidencia las variaciones en la expresión enzimática, probablemente por el hábitat en donde se colectaron los ejemplares o bien las condiciones bajo las que el material fue evaluado.
Las cepas que fueron seleccionadas por su alto índice de potencia fueron: Ganoderma sp. TL-9, Panus sp. RV-16, Panus sp, HY-13, Pycnoporus sanguineus TC-1, Trametes villosa TL-8
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y Trametes versicolor TL-10 (Figura 5). Entre estas, los valores más altos pertenecen al género Panus Rv-16 y Pycnoporus sanguineus TC-1, con un IP de 60.89 y 73.33 respectivamente. Similares resultados han sido reportados por Cruz et al. (2012) para
Pycnoporus sanguineus y por Querantino et al., (2008) para especies del género Panus.
En las pruebas cualitativas, la especie Pycnoporus sanguineus fue la única en la que se detectaron las tres enzimas estudiadas, lo que corrobora su alto potencial biotecnológico. Esta especie crece exitosamente sobre la mayoría de los medios de cultivo por lo que se facilita su manejo en el laboratorio. Dantán-González et al. (2008) purificaron dos nuevas isoformas de lacasa extraídas de una cepa termo-tolerante de P. sanguineus, aislada de material colectado en una localidad del estado de Veracruz contaminada con hidrocarburos. Dado que P.
sanguineus se encuentra ampliamente distribuida en las áreas tropicales y semitropicales del
estado de Veracruz (Chacón et al., 1995), es recomendable continuar con su estudio ampliando las áreas de colecta.
Cabe señalar que para las cepas seleccionadas los resultados cualitativos no coincidieron con la evaluación cualitativa. Esto quizás se deba a que la composición química del medio es muy diferente, así como las condiciones de pH y el movimiento al que fueron sometidos los cultivos en la evaluación cuantitativa. El tiempo de incubación es un factor muy importante a considerar en los ensayos cuantitativos ya que existe una notoria variación en los días de máxima expresión enzimática entre las especies, por lo que los experimentos deben efectuarse por periodos que permitan la expresión de las cepas con crecimiento lento, las cuales en este estudio fueron las que presentaron los valores más altos.
En los resultados cuantitativos la cepa de Trametes villosa TL-8 fue la que obtuvo la máxima producción enzimática con 2418.57 UI mg-1. Dentro del género Trametes cepas de las especies T. versicolor y T. villosa destacan por producir concentraciones altas de lacasa (Preussler et al., 2009; Revelo et al., 2007).
De la misma forma que en el presente estudio, Okino et al. (2000) reportan la actividad de la enzima manganeso peroxidasa en los géneros Trametes sp., Pycnoporus sp. y Polyporus sp. La producción de manganeso peroxidasa, aunque en muy baja concentración, también fue detectada en las cepas Ganoderma sp. TC7, Polyporus abietinus TC-2, Trametes versicolor y
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enzima se encuentra restringida a unas cuantas especies de distintos grupos taxonómicos de basidiomicetes, los cuales generalmente son hongos típicos colonizadores de madera y algunos habitantes de la hojarasca. Hasta el año 2002 se reportaban 56 especies fúngicas que sintetizan esta enzima (Hofrichter, 2002), entre las cuales, con excepción de Polyporus
abietinus, están incluidas las especies de las cepas aisladas en el presente trabajo.
Con respecto a la evaluación de la enzima lignino peroxidasa, igual que en el trabajo de Saparrat et al. (2002), no se detectó esta actividad en ninguna de las cepas seleccionadas. Se sabe que para algunos hongos como Phanerochaete chrysosporium, la producción de esta enzima requiere condiciones específicas, como son concentraciones determinadas de nitrógeno (Tien y Kirk, 1988). Por lo que es posible que en el presente estudio las condiciones empleadas no favorecieron la producción de esta enzima.
Con respecto a la posible relación entre la producción de biomasa fúngica total y las actividades enzimáticas, de la misma forma que lo reportado por Rubilar (2007) se encontró que bajo las condiciones en que se llevaron a acabo los ensayos no se aprecia ningún patrón definido entre ambos parámetros.
Por su amplia distribución en el estado de Veracruz y por su capacidad para crecer en medios artificiales en el laboratorio las cepas nativas evaluadas en el presente trabajo correspondientes a los géneros Trametes y Pycnoporus son consideradas como promisorias para continuar con investigaciones dirigidas hacia la biorremediación de sustratos contaminados con productos xenobióticos en ambientes terrestres y acuáticos.
En México se han realizado pocos estudios enfocados al conocimiento de la riqueza de los hongos lignícolas y su actividad metabólica. Este trabajo muestra que entre los hongos nativos recolectados existen especies que tienen potencial en la producción de enzimas que se considera son capaces de desintegrar moléculas complejas.
De esta forma con los resultados obtenidos se cumplen los objetivos planteados y se brindan las bases para futuras investigaciones que evalúen posibles aplicaciones en la biorremediación de suelos contaminados con productos químicos mediante cepas fúngicas.
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9.- CONCLUSIONES
En la región central del estado de Veracruz, existe una considerable diversidad de macromicetos lignícolas. Entre los cuales destacan especies promisorias para ser empleadas biotecnológicamente.
No existe una técnica universal que permita aislar los diferentes tipos de hongos lignícolas. El tiempo y tipo de desinfección se debe ajustar según el tamaño y consistencia de los hongos.
En total se aislaron 28 cepas, entre las que se distinguieron 15 géneros. Trametes fue el género mejor representado.
Todos los aislamientos dieron positivo al menos a algún tipo de actividad enzimática, con excepción de una cepa en todas las demás se detectó la presencia de lacasa, mientras que para manganeso peroxidasa y lignina peroxidasa únicamente se encontraron 5 y 2 cepas respectivamente.
De las 28 cepas evaluadas Pycnoporus sanguineus TC- 1, Trametes villosa TL-8,
Ganoderma sp.TL-9, Trametes versicolor TL-10, Panus sp. HY-13 y Panus sp.
RV-16, obtuvieron los valores del IP más altos en la evaluación cualitativa.
En la evaluación cuantitativa para lacasa y manganeso peroxidasa la cepa Trametes
villosa TL-8 presentó los valores más altos para ambas enzimas.
En ninguna de las cepas seleccionadas se encontró una relación entre la producción de biomasa y la concentración de la enzima Lacasa.
10.- P
ERSPECTIVASLos resultados obtenidos dan la base para la realización de futuros estudios en la búsqueda de tecnologías limpias que restauren sitios contaminados. Para complementar la información recabada tanto en la valoración cualitativa como cuantitativa es conveniente el empleo de otros sustratos químicos como la siringaldazina, el guayacol y el dimetoxifenol.
Así mismo es de gran importancia conocer los requerimientos nutricionales de las especies con mejor respuesta enzimática para potencializar su capacidad para producir enzimas. Una vez definidas las mejores condiciones fisico-químicas es necesario probar diferentes tipos de
32
sustratos como son el bagazo de caña, paja y pulpa de café con el fin de seleccionar un método de propagación de los hongos promisorios.
Para contar con un complejo enzimático con alta capacidad degradadora se recomienda la experimentación con diferentes especies que conlleven a la formulación de consorcios fúngicos.
Ante la magnitud de la diversidad de los hongos lignícolas en los diferentes ecosistemas del estado de Veracruz, se recomienda el planteamiento de proyectos a largo plazo que contemplen exploraciones continuas durante diferentes épocas del año.
11.- BIBLIOGRAFÍA
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