ENZIMAS PECTINOLÍTICAS DE CEPAS DE Aspergillus niger (P. Micheli, 1729) EN LA FERMENTACIÓN DE RESIDUOS AGROINDUSTRIALES DE PIÑA
(Ananas comosus) Y MARACUYÁ (Passiflora edulis)
MAUREN CECILIA OSORIO DIAZ
DIRECTOR:
LUIS OVIEDO ZUMAQUÉ MSc.
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS
MAESTRÍA EN BIOTECNOLOGÍA MONTERÍA
2022
ENZIMAS PECTINOLÍTICAS DE CEPAS DE Aspergillus niger (P. Micheli, 1729) EN LA FERMENTACIÓN DE RESIDUOS AGROINDUSTRIALES DE PIÑA
(Ananas comosus) Y MARACUYÁ (Passiflora edulis)
MAUREN CECILIA OSORIO DIAZ
TRABAJO DE GRADO PARA OPTAR EL TÍTULO DE MAGISTER EN BIOTECNOLOGÍA
DIRECTOR:
LUIS OVIEDO ZUMAQUÉ MSc.
UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA FACULTAD DE CIENCIAS BÁSICAS
MAESTRÍA EN BIOTECNOLOGÍA MONTERÍA
2022
II
IV
_________________________
Firma director
_________________________
Firma Coordinador Maestría en Biotecnología
Montería, 2022.
V
DEDICATORIA
A Dios por la salud, disciplina y perseverancia.
A la memoria de mi tía - Abuela Maximiliana.
A mis padres Cesar Osorio y Mauren Díaz , por haberme dado la vida y por ayudarme a ser la persona que soy.
A mis hermanos Cesar Osorio Martínez, Marco Osorio Díaz, Marvin Osorio Pérez, Mauren Catalina Díaz y Elías Osorio Ortega.
A mis abuelos Pedro Díaz, Romelia Osorio y Yolanda López por su apoyo.
A Néstor Rodríguez por su apoyo incondicional.
A mis amigos Darío Doria, Kelly Prioló, María Cabarcas, Melissa Salgado y Aura González por todos sus consejos y por creer en mí.
A mis buenos amigos de la cohorte XIII Jorge Arrieta, Carlos Tapia y Juan Camilo Herrera por el apoyo incondicional en todo este proceso.
Al señor Jhoan Cardona por todo su apoyo y conocimientos.
A todas aquellas personas especiales en mi vida que siempre han creído en mí esto logro es para ustedes.
VI
AGRADECIMIENTOS
Agradezco a Dios por haberme ayudado en este proceso, por la oportunidad de realizar esta investigación.
A mis padres por apoyarme y por creer en mí.
A la UNIVERSIDAD DE CÓRDOBA por oportunidad de crecer a través de su personal docente y personas de gran sabiduría que sean esforzado por ayudarme a llegar al punto en el que estoy.
Al maestro Luis Oviedo Z, por apoyarme y brindarme sus conocimientos, sobre todo la oportunidad y la confianza para realizar este trabajo de investigación.
A Jhoan Cardona por su apoyo, por compartirme sus conocimientos que aportados de la mejor manera para llevar a cabo este trabajo.
A Mara Villalba y Wilson Baldovino por estar siempre para mi cuando los necesité, por brindarme sus conocimientos y por todo ese gran apoyo que recibí.
A Néstor Rodríguez por ayudarme en Aspectos importantes de este trabajo.
A mis compañeros de la cohorte XIII Jorge, Carlos y Juan por todo el apoyo, por los conocimientos, por la amistad y por confiar en mí.
A los señores Jurados Leonardo Alemán y Basilio Diaz, por el apoyo y sus conocimientos.
A mi familia, amigos y personas especiales en mi vida, porque siempre me han brindado palabras de apoyo, porque han creído, han confiado y sobre todo me han apoyado. De este nuevo logro ustedes aportaron mucho y de eso estoy plenamente agradecida.
Mauren Cecilia Osorio Diaz
VII RESUMEN
Este proyecto se enfocó en determinar la capacidad pectinolítica de las enzimas provenientes del género Aspergillus (P. Micheli, 1729), utilizando como única fuente de carbono albedo de piña, albedo de maracuyá, mezcla de albedo piña y maracuyá y pectina comercial. Se obtuvieron aislados de cultivos de piña en el corregimiento de Sarandelo del municipio de Lorica – Córdoba y cultivos de maracuyá en el municipio de Purísima. Se preseleccionaron 6 aislados de los cuales tres (M6P21, MM3 y M16P21) presentaron mayor halo de crecimiento en medio solido de pectina al 2%. En la producción enzimática los extractos fúngicos se utilizaron cuatro tratamientos: albedo de piña, albedo de maracuyá, mezcla de albedo piña y maracuyá y pectina comercial; donde los aislados Aspergillus M6P21, Aspergillus MM3 y Aspergillus M16P21 presentaron buenos resultados de la actividad enzimática analizada mediante un monitoreo de 3 días y cuyos resultados fueron expresados en concentración de azucares reductores. El aislado M6P21 presento excelentes resultados en cuanto a la producción de enzimas pectinolíticas: en albedo de piña 0,2816 g/L, en albedo de maracuyá 0,2740 g/L, en la mezcla de albedo de piña y maracuyá 0,3923 g/L y pectina comercial 0,3046 g/L. En el aislado de Aspergillus MM3: en albedo de piña 0,2856 g/L, en albedo de maracuyá 0,2694 g/L, en la mezcla de albedo de piña y maracuyá 0,2549 g/L y pectina comercial 0,3090 g/L. El aislado M16P21: en albedo de piña 0,2433 g/L, en albedo de maracuyá 0,2508 g/L, en la mezcla de albedo de piña y maracuyá 0,2625 g/L y pectina comercial 0,3175 g/L. De acuerdo a lo anterior se refleja en el anova estadístico la producción enzimática para los aislados: M6P21 con un valor-P (0,9383), MM3 con un valor-P (0,6038) y M16P21 con un valor-P (0,6723).
Se realizó un análisis de la incidencia de la variación de pH, en la producción enzimática de los tres aislados, utilizando valores de pH 4,0, 5,6 y 6,5, durante 3 días de monitoreo continuo. Se determinó el pH óptimo para la producción enzimática de origen fúngico, siendo el pH 6,5 y pH 4,0 los valores de mayor actividad enzimática.
Se realizó un ensayo enzimático para observar la clarificación en 4 jugos de frutas, piña, maracuyá, carambolo y guayaba agria; donde se lograron resultados positivos en la clarificación de estos jugos. En conclusión, las enzimas obtenidas de los aislados M6P21,
VIII
MM3 y M16P21 poseen capacidad pectinolítica, que durante un proceso de fermentación son capaces de degradar la pectina, proveniente de fuente naturales.
Palabras clave: Enzimas pectinoliticas, clarificación de jugos, actividad enzimática, Ananas comosus, Passiflora edulis.
IX ABSTRACT
This project focused on determining the pectinolytic capacity of enzymes from the genus Aspergillus (P. Micheli, 1729), using pineapple albedo, passion fruit albedo, a mixture of pineapple and passion fruit albedo, and commercial pectin as the only carbon source. Isolates were obtained from pineapple crops in the district of Sarandelo in the municipality of Lorica - Córdoba and passion fruit crops in the municipality of Purísima. Six isolates were preselected, of which three (M6P21, MM3 and M16P21) presented a greater growth halo in solid medium of 2% pectin. In the enzymatic production of the fungal extracts, four treatments were used: pineapple albedo, passion fruit albedo, mixture of pineapple and passion fruit albedo and commercial pectin; where the isolates Aspergillus M6P21, Aspergillus MM3 and Aspergillus M16P21 presented good results of the enzymatic activity analyzed by monitoring for 3 days and whose results were expressed in reducing sugar concentration. The isolate M6P21 presented excellent results in terms of the production of pectinolytic enzymes: in pineapple albedo 0.2816 g/L, in passion fruit albedo 0.2740 g/L, in the mixture of pineapple and passion fruit albedo 0.3923 g /L and commercial pectin 0.3046 g/L. In the Aspergillus MM3 isolate: in pineapple albedo 0.2856 g/L, in passion fruit albedo 0.2694 g/L, in the mixture of pineapple and passion fruit albedo 0.2549 g/L and commercial pectin 0.3090 g/L The isolate M16P21: in pineapple albedo 0.2433 g/L, in passion fruit albedo 0.2508 g/L, in the mixture of pineapple and passion fruit albedo 0.2625 g/L and commercial pectin 0.3175 g/L . According to the above, the enzymatic production for the isolates is reflected in the statistical anova: M6P21 with a P-value (0.9383), MM3 with a P- value (0.6038) and M16P21 with a P-value (0 .6723).
An analysis of the incidence of pH variation in the enzymatic production of the three isolates was carried out, using pH values of 4.0, 5.6 and 6.5, during 3 days of continuous monitoring.
The optimal pH for fungal enzymatic production was determined, with pH 6.5 and pH 4.0 being the values with the highest enzymatic activity.
An enzymatic assay was carried out to observe the clarification in 4 fruit juices, pineapple, passion fruit, star fruit and sour guava; where positive results were achieved in the clarification of these juices. In conclusion, the enzymes obtained from the isolates M6P21,
X
MM3 and M16P21 have pectinolytic capacity, which during a fermentation process are capable of degrading pectin from natural sources.
Keywords: Pectinolytic enzymes, juice clarification, enzymatic activity, Ananas comosus, Passiflora edulis.
XI CONTENIDO
INTRODUCCION ... 15
2. OBJETIVOS ... 17
2.1. Objetivos específicos ... 17
3. MARCO TEORICO ... 18
3.1. Pectina ... 18
3.1.1. Estructura de las pectinas ... 19
3.1.2. Clasificación de las pectinas... 20
3.1.3. Fuente de obtención de las pectinas en la industria ... 21
3.2. Propiedades de las pectinas ... 22
3.3. Genero Aspergillus ... 23
3.3.1. Aspergillus niger... 24
3.3.2. Utilidad de Aspergillus en la industria ... 24
3.4. Enzimas pectinolíticas ... 25
3.4.1. Clasificación de las enzimas pécticas ... 26
3.4.2. Usos de enzimas pectinolíticas ... 27
3.5. Tecnología de las fermentaciones ... 28
3.5.1. Fermentación en estado solido... 29
3.5.2. Fermentación sumergida ... 29
3.6. Piña (Ananas comosus) ... 30
3.7. Maracuyá ( Passiflora edulis) ... 32
4. METODOLOGÍA ... 34
4.1. Localización ... 34
4.2. Caracterización de hongos del género aspergillus asociados a los frutos de piña y maracuyá. ... 34
4.2.1. Recolección de muestras ... 34
XII
4.2.2. Aislamiento de hongos Aspergillus niger ... 35
4.3. Determinación la capacidad pectinolítica de hongos seleccionados utilizando sus extractos enzimáticos en albedo: piña, maracuyá, piña/maracuyá y pectina comercial. ... 36
4.3.1. Preparación de inóculos. ... 36
4.3.2. Inducción a la producción de pectinasas. ... 37
4.3.3. Ensayo enzimático de poligalacturonasa. ... 37
4.3.4. Análisis de capacidad enzimática por el método DNS de los azucares reductores. ... 37
4.4. Evaluación de las condiciones óptimas de pH de fermentación sumergida de los aislados seleccionados para la producción y actividad de las pectinasas. ... 38
4.4.1. Variación en el pH del medio de cultivo liquido de pectina cítrica comercial. ... 38
4.5. Determinar el efecto clarificante de las enzimas pectinolíticas en jugos de frutas. ... 38
5. DISEÑO EXPERIMENTAL ... 39
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ... 40
6.1. Caracterización de aislados de hongos con propiedades pectinolíticas. ... 40
6.1.1. Aislado aspergillus M6P21 ... 42
6.1.2. Aislado Aspergillus MM3... 43
6.1.3. Aislado Aspergillus M16P21 ... 44
6.2. Determinación de la capacidad pectinolítica hongos seleccionados utilizando sus extractos enzimáticos en albedo de piña, maracuyá, piña/ maracuyá y pectina comercial. ... 47
6.3. Evaluación de las condiciones óptimas de pH en la fermentación sumergida de los aislados seleccionados para la producción y actividad de las pectinasas. ... 52
XIII
6.4. Determinar el efecto clarificante de las enzimas pectinolíticas en jugos de
frutas mediante turbidez. ... 56
CONCLUSIONES ... 60
BIBLIOGRAFÍA ... 61
RECOMENDACIONES ... 69
LISTA DE FIGURAS Figura 1. Acido D- galacturónico, forma estructural. (Ciriminna et al., 2022). ... 19
Figura 2. Cadena pectina con presencia de los residuos obtenidos de ácido galacturónico, ácido galacturónico metilado, ácido galacturónico aminado, ramnosa, galactosa, arabinosa y xilosa (Ramos Galeano, 2013)... 20
Figura 3. Morfología, estructura microscópica del género Aspergillus (Romero et al., 2021). ... 23
Figura 4. Ananas comosus A: Fruto, B: cascara. Cultivo de piña en Sarandelo - Córdoba. ... 31
Figura 5. Variedades más importantes de piña cultivadas en Colombia (DANE, 2016). ... 31
Figura 6. Passiflora Edulis A: Planta, B: fruto en el municipio de purísima - Córdoba .... 33
Figura 7. A: trampa con contenido de piña en un cultivo de piña; B: trampa con contenido de maracuyá en cultivo de maracuyá. ... 34
Figura 8. A: Sarandelo – Córdoba (SARANDELO - Google Maps, n.d.), B: Purísima – Córdoba (Purísima-Momil - Google Maps, n.d.) ... 35
Figura 9. Medio de cultico Czapek modificado con albedo de piña y albedo de maracuyá. ... 36
Figura 10. Media del hago de crecimiento para la selección de aislados del género Aspergillus. ... 41
Figura 11. Jugos naturales, Maracuyá ( Passiflora edulis) , Carambolo (Averrhoa carambola), Guayaba agria (Psidium araca) y piña ( Ananas comosus) ( Fotografía M Osorio Diaz, 2021) ... 56
XIV
Figura 12. Jugos clarificados. ... 58
LISTA DE TABLAS Tabla 1. Halo de crecimiento de aislados con características de Aspergillus ... 41
Tabla 2. Características macro y microscópicas del aislado M6P21 ... 42
Tabla 3. Características macro y microscópicas del aislado MM3 ... 43
Tabla 4.Características macro y microscópicas del aislado M16P21. ... 44
Tabla 5. Concentraciones de conidias por mL. ... 47
Tabla 6. Concentraciones de azucares reductores en albedo de piña y albedo de maracuyá. ... 47
Tabla 7.Concentraciones de azucares reductores en albedo de piña/maracuyá y pectina comercial. ... 49
Tabla 8. Efecto del pH en la producción de pectinasas ... 52
Tabla 9. Efecto clarificante del extracto enzimático del hongo M6P21 en jugos naturales.56 Tabla 10. Efecto clarificante del extracto enzimático del hongo MM3 en jugos naturales. 57 Tabla 11. Efecto clarificante del extracto enzimático del hongo M16P21 en jugos naturales. ... 57
15
INTRODUCCION
En Córdoba la comercialización de jugos constituye un factor importante en el ámbito económico, desde el año 2019 se siembran aproximadamente 4,500 hectáreas Piña (Ananas comosus) conformando el 7% de productores de piña a nivel nacional(Granado & Aguillón, 2019)(DANE, 2016), en el caso del consumo maracuyá (passiflora edulis) la siembra es de 15,000 hectáreas aproximadamente para el 2020 (MinAgricultura, 2020), estas frutas son comercializadas por sus propiedades nutricionales lo que lleva a la alta demanda de la producción por pequeños agricultores.
La pectina es una polisacárido con estructura compleja que hace parte de las pared vegetal de los frutos y plantas, por su alta complejidad la degradación de esta estructura depende de enzimas producidas por microorganismos filamentosos (Neves Junior et al., 2021); el proceso de elaboración de jugos naturales con alta turbiedad la pectina es causante de la cantidad de solidos que se encuentran en suspensión trae como consecuencia una alta viscosidad (García-Rujano et al., 2015), esta característica es propensa a descomposición por parte de microorganismos productores de enzimas degradadoras de pectinas (Cavalieri de Alencar Guimarães et al., 2022).
Las enzimas son herramientas biotecnológicas muy valiosas en la elaboración de alimentos, particularmente las pectinasas se emplean en la industria alimenticia para aumentar la eficiencia de procesos extractivos, estabilización de productos y mejoramiento del sabor, y la producción a bajo costo proveniente de hongos filamentosos se logra utilizando sustratos agroindustriales afines con el microorganismo, como este caso sustratos ricos en pectina (Adedeji & Ezekiel, 2019) (Mahmoodi et al., 2017).
El microrganismo más usado por la industria es el Aspergillus niger ofreciendo la ventaja de secretar 70% de estas sustancias con la intención de utilizar varias fuentes de carbono para determinar la capacidad pectinolítica es implementar el uso de enzimas secretadas por hongos
16
del género Aspergillus para un análisis cualitativo de jugos naturales de baja concentración para demostrar la capacidad clarificante que estas enzimas poseen (Kirimura & Yoshioka, 2019) (Adedeji & Ezekiel, 2019).
Para contribuir con la obtención de enzimas pectinolíticas esta investigación se realizó, con el objetivo de determinar mediante un análisis la producción enzimática de hongos del género Aspergillus nativos de la región del bajo Sinú, los cuales fueron sometido a diversos tratamientos, variaciones de pH y empleando como sustratos el albedo de piña y albedo de maracuyá.
17
2. OBJETIVOS
Determinar la capacidad pectinolítica de las enzimas provenientes del género Aspergillus niger (P. Micheli, 1729), utilizando como única fuente de carbono los albedos de piña, maracuyá, su mezcla y pectina comercial; para evaluar la mejora en la clarificación de los jugos.
2.1. Objetivos específicos
• Caracterizar morfológica y molecularmente los aislados de hongos con propiedades pectinolíticas.
• Determinar la capacidad pectinolítica de hongos seleccionados utilizando sus extractos enzimáticos en albedo: piña, maracuyá, piña/maracuyá y pectina comercial.
• Evaluar las condiciones óptimas de pH en la fermentación sumergida de los aislados seleccionados para la producción y actividad de las pectinasas.
• Determinar cualitativamente el efecto clarificante de las enzimas pectinolíticas en jugos de frutas.
18
3. MARCO TEORICO
3.1. Pectina
La Pectina es un polímero de alto peso molecular que comprende al menos 17 tipos de monosacáridos, proveniente de ácido galacturónico que comprende regiones de homogalacturonano (HG), ramnogalacturonano-I (RG-I), ramnogalacturonano-II (RG- II), arabinogalacturonano (AG) y xilogalacturonano (XGA), es el polisacárido estructuralmente más complejo de la naturaleza y se encuentran en los tejidos vegetales sobre todo en los tejidos blandos como en las frutas (Ciriminna et al., 2022) (Zhong et al., 2021).
El polímero está constituido de unidades repetitivas de residuos (1 → 4)-α-D-GalA (ácido galactopiranosilurónico), parcialmente esterificado con metilo en la posición O-6 (y en menor medida también esterificado con acetilo en O-2 u O -3), por regiones ramificadas compuestas por (1 → 2)-α-Unidades de l- ramnosa (regiones RG-I) que unen azúcares neutros, como galactosa, arabinosa, xilosa y fructosa(Ciriminna et al., 2022).
En sus orígenes la pectina fue descubierta cuando se encontró una sustancia soluble en el zumo proveniente de frutas en año 1790 por Vauquelin y para el año 1825 el científico francés Braconnot encontró una sustancia con propiedades gelificantes cuando se le añadía acido a la solución, fue nombrada como la que hoy se conoce como pectina acida, está ampliamente disponible en los tejidos vegetales, entonces su nombre nace del griego
“pectos” que significa sólido denso coagulado (Avila, 2019).
Por otra parte, con el paso de los años este polímero fue definido por Kertesz (1951) como ácidos pectínicos que son capaces de solubilizarse en presencia de agua con un grado de metilación variado y pueden formar geles con azúcar y ácido bajo condiciones determinadas. Por esta razón definición engloba todos los ácidos poligalacturónicos coloidales aislados del tejido de las plantas o también es conocido como ácido péctico (Ramos Galeano, 2013).
19 3.1.1. Estructura de las pectinas
La figura 1, presenta la estructura del ácido D- galacturónico con L- Ramnosa que conforma la estructura de la pectina
Las sustancias pécticas están asociadas con las materias estructurales de los tejidos blandos y por eso estas tiene la capacidad de absorber grandes cantidades de agua y realizar sus proceso vitales (Avila, 2019), el azúcar base es el ácido galacturónico y se encuentra metilado en su grupo carboxilo(Zhong et al., 2021).
En la figura 2, se logra apreciar los carbohidratos que conforman la estructura de las pectinas, la ramnosa es la responsable de provocar el doblamiento del polímero de ácido galacturónico y es por eso que en presencia de este azúcar ocurre este proceso en cada zona lisa de las cadenas lineales (Fernandez Sevilla, 2005).
Figura 1. Acido D- galacturónico, forma estructural. (Ciriminna et al., 2022).
20 3.1.2. Clasificación de las pectinas
Debido a que el gran peso molecular, la pectina tiene la particularidad de favorecer o no según su biodisponibilidad en la naturaleza (G. Li et al., 2022a), esta se divide en varios grupos en los que se clasifica de acuerdo a su grado de metilación (Satapathy et al., 2020).
3.1.2.1. Protopectina
Son sustancias responsables de la formación de sustancias pécticas a partir de procesos hidrolíticos, se encuentran en los tejidos vegetales y son insolubles en agua (Avila, 2019).
3.1.2.2. Ácidos pectínicos
Poseen la capacidad de formar geles con azucares, ácidos y según su contenido metilo cuando estos tienen niveles bajos, tienden a formar geles con sales de calcio, son ácidos poligalacturónicos unidos a variables de grupos metilos esterificados en el carbono C6 (Avila, 2019). Poseen el 50% de unidades esterificadas del ácido poligalacturónico para este Figura 2. Cadena pectina con presencia de los residuos obtenidos de ácido galacturónico, ácido galacturónico metilado, ácido galacturónico aminado, ramnosa, galactosa, arabinosa y xilosa (Ramos Galeano, 2013).
21
tipo de sustancias, el pH es pieza fundamental para el proceso de Gelación en conjunto con la concentración de iones calcio, lo cual influye en la textura de la gelatina formada (Osorio Martinez, 2010). No suelen ser térmicamente reversibles y normalmente suelen ser utilizadas para elaborar mermeladas, confituras y jaleas con muy poco porcentaje de azúcar o sin azúcar(Pineda, 2012).
3.1.2.3. Ácidos pécticos
En este caso estas sustancias pécticas no contienen grupo metilo, son conocidas como pectatos, ácido poligalacturónicos o poligalacturonatos (Avila, 2019). Son producidos en el proceso de maduración por acción de enzimas que acción sobre los ácidos pécticos. Están formados por ácidos poligalacturónicos 26 coloidales con sus grupos carboxilos libre sin esterificar con valores del 0,4 al 0,7. Sus sales se denominan pectatos. Estos compuestos no poseen grupos carboxilos esterificados (Osorio Martinez, 2010).
3.1.2.4. Pectinas
Están constituidas por ácidos pécticos que son solubles en agua, con grado de neutralización y composición variable, enlaces metoxilos; estas características aportan a la capacidad de formar geles con azucares y ácidos en condiciones óptimas (Avila, 2019).
3.1.3. Fuente de obtención de las pectinas en la industria
Las sustancias pécticas poseen propiedades bioquímicas, como un mecanismo catalítico y la fuerte interrelación entre estas moléculas, podría mejorar enormemente su aplicabilidad en las industrias (Satapathy et al., 2020). La pectina es utilizada por la industria alimentaria como gelificante, espesante, estabilizante y emulsificante; de la misma manera es aplicada
22
en la industria farmacéutica y el área de biotecnología para la formulación de fármacos y cosméticos(Barreto et al., 2017).
De este modo la pectina juega un papel fundamental en la determinación de las propiedades físicas, químicas y nutricionales de los productos a base de frutas y verduras (Zhong et al., 2021), la pectina comercializada es producida a partir de las cascaras de frutos, en su mayoría de frutos cítricos como el limón, naranja, mandarina, entre otros. Es por ello que muchas de estas especies cítricas son cultivadas en el mundo como fuente de obtención de pectina (G.
Li et al., 2022b).
La pectina es producida de cáscaras cítricos en un 85 % y pulpa de manzana en un 14 %, La producción mundial de pectina supera las 60.000 toneladas anuales (Zhong et al., 2021), esta manera de reciclar los subproductos para mitigar los problemas asociados al manejo de residuos sólidos relacionados con actividades agroindustriales intensivas (Medini et al., 2021).
3.2. Propiedades de las pectinas
La pectina también ejerce actividad antibacteriana, una propiedad muy importante (Ciriminna et al., 2022) donde se logró demostrar recientemente que posee actividad antibacteriana de amplio alcance contra bacterias dañinas Gram-positivas y Gram-negativas, la cual fue obtenida de residuos de limón y pomelo. La solubilidad de las sustancias pécticas depende de las condiciones y los enlaces metílicos que causan ruptura entre las cadenas de polipéptidos lo que las hace más solubles. La solubilidad de una pectina en agua es de 2-3%.
En cuanto a la viscosidad depende del peso molecular, grado de esterificación, pH y concentración electrolítica. Los ácidos pépticos y pectinas son insolubles en agua. En cuanto al pH, varía entre 2.8 y 3.4 que va relacionado con el grado de esterificación (Durán &
Honores, 2012).
23 3.3. Genero Aspergillus
Este género pertenece a la división Deuteromycota de la clase Hyphomycetes, forman micelios, pero carecen de esporocarpio, son excelentes productores de hifas especializadas, denominadas conidióforos unidos con esporas en forma de rosario, sobre los que se encuentran las células conidiógenas que originarán las esporas asexuales o conidios, de manera simple, son conidióforos erectos que terminan en una vesícula cubierta con capas de células conidiógenas en forma de empalizada (Viniegra Gonzales, 2003)(Abarca, 2000), son considerados como anamorfos, es decir, que aspergillus es un género asexual (Romero et al., 2021).
A continuación, la Figura 3, presenta la estructura morfológica del género Aspergillus, se aprecia cada parte señalada.
Los hongos filamentosos han sido pieza importante para muchos de los procesos que ocurren en la naturaleza día a día, debido a su amplia actividad enzimática en los diferentes sustratos en los que reposan, hace que estos sean de mucho interés en la investigación (Romero et al., 2021), para el año 1729, el sacerdote-micólogo florentino Micheli, logró dar describir las características de un hongo del género Aspergillus, debido a que presentar estructuras que Figura 3. Morfología, estructura microscópica del género Aspergillus (Romero et
al., 2021).
24
poseen esporas dando la forma de Aspergillum, un dispositivo utilizado por la iglesia católica; estas especies se encuentran distribuidas en toda la naturaleza donde permanecen en contacto con los seres humanos y demás animales, pueden crecer en casi todos los sustratos húmedos principalmente de origen vegetal y en algunos casos en material inerte presentando casos de peligrosidad como una amenaza, volviéndose un problema de salud (Navale et al., 2021) (Romero et al., 2021).
3.3.1. Aspergillus niger
Aspergillus niger es un hongo que posee características que, al comprarlas con otros microrganismos, se vuelve muy interesante. Es un hongo que se encuentra disperso en el aire al igual que mucho otros, pero principalmente, A. niger reposa en bodegas de frutas, en campos frutales y en muchos lugares húmedos (Navale et al., 2021). Este hongo es fácil de manejar debido a su crecimiento rápido y a su capacidad de fermentar cualquier materia prima barata y también ofrece rendimientos constantes cuando es utilizado (Chergui et al., 2021). Este hongo es sembrado en medios solidos ricos en pectina, celulosa y otros azucares que son fuentes de carbono primordial, que proporciona los nutrientes ideales para el desarrollo de este microrganismo, su morfología se caracteriza por un color marrón fuerte a negro, una textura aterciopelo, puede crecer en medios ligeramente ácidos, preferiblemente en espacios oscuros y ventilados (Q. Li et al., 2020)(Abarca, 2000). Sin embargo A. niger es un hongo resistente que es capaz de infectar la floración y la fructificación temprana de muchas frutas, introducirse dentro de los frutos (Zheng et al., 2022) (Santos et al., 2022).
3.3.2. Utilidad de Aspergillus en la industria
Los hongos filamentosos son la mejor opción para la producción comercial de enzimas son más altas que las enzimas que son producidas de las levaduras y bacterias (Siva et al., 2022).
Aspergillus niger se ha convertido en uno de los hongos más utilizados en el área agroindustrial, por su capacidad de producir enzimas alimentarias como las pectinasas,
25
glucoamilasas, celulasas entre otras; posee características de seguridad alimentaria y excelente sistema de secreción proteicas, lo que resulta provechoso para aplicar la producción de mejora de enzimas fúngicas(C. Li et al., 2020). Otra aplicación que se debe resaltar de este hongo es la utilización en los procesos de producción de ácido cítrico, este proceso lleva unas condiciones netamente ambientales, partiendo del establecimiento de los nutrientes que se le aportan al crecimiento de este para el desarrollo adecuado de la producción de ácido (Chergui et al., 2021).
3.4. Enzimas pectinolíticas
Las pectinasas son biomoléculas de vital importancia en el sector biotecnológico debido a que estas presentan una amplia evocación aplicativa a diferentes sectores, como la agroindustria la farmacia, entre otros. Estas tienen la capacidad de degradar sustratos, es decir, la pectina. Las enzimas actúan como un catalizador biológico donde acelera las de recciones químicas sin formar parte de los productos finales(Avilés & Tapia, 2016), cabe anotar que esta no se consume durante la reacción y está relacionada a las reacciones metabólicas de todos los seres vivos, por su grado de especificidad resulta ser punto de investigación para explorar un poco más de sus características (Avilés & Tapia, 2016), estas son producidas principalmente por microorganismos donde se encuentran bacterias, levaduras y hongos filamentosos, hoy en día esta enzima juega un papel importante en las actividades metabólicas de casi todos los organismos vivos(Satapathy et al., 2020); entre las bacterias que la producen: Bacillus y Clostridium, las levaduras que son productoras de pectinasas: Saccharomyces y Rhodoturulla, y hongos filamentosos del género Aspergillus, Penicillium, Fusarium y Verticilium(Lozano & López, 2001).
26 3.4.1. Clasificación de las enzimas pécticas
Conocidas comúnmente como enzimas pectinolíticas, caracterizadas por tener la capacidad de degradar diferentes fuentes de carbono con alto contenido péctico. Son clasificadas según su función en tres tipos: Protopectinasas, esterasas y des polimerasas (Satapathy et al., 2020).
3.4.1.1. Protopectinasas: son un grupo de enzimas que se encargan de la hidrólisis del sustrato protopectina y su conversión en pectina soluble. Pueden catalizar la protopectina en sitios que posean más de tres moléculas de ácido galacturónico estando no metilado.
3.4.1.2. La esterasa: es una clase de enzimas que elimina los ésteres metoxilo y acetílico de la pectina, lo que da como resultado la formación de ácido poligalacturónico.
Estas al contrario de la protopectina, cumplen la función de separar los residuos metoxilo y acetilo provenientes de la pectina, lo que da como resultado la formación de ácido poligalacturónico.
Si son provenientes de fuentes fúngicas, funcionan con mecanismos múltiples cadenas en el proceso de eliminación de grupos metoxilos, si provienen de una fuente vegetal funcionan de manera única, sea que se dirigen al grupo a la terminal no reductora o al grupo terminal libre (Satapathy et al., 2020). Las pectinesterasas se clasifican en dos tipos según los grupos funcionales de destino, que se denominan pectina metilesterasa o pectinesterasa y pectina acetilesterasa.
3.4.1.3. Las Despolimerasas: también contribuyen a la descomposición de las sustancias pépticas mediante la escisión de los enlaces glucosídicos α-(1 → 4) en las unidades de ácido D- galacturónico por hidrólisis.
27 3.4.1.3.1. Poligalacturonasa
Las poligalacturonasas (PGasas) son las enzimas más investigadas y con más aplicadas en la industria, su principal característica es la despolimerización a través del proceso de hidrólisis, interactúan específicamente a través de la hidrólisis y dividen el enlace glucosídico en presencia de moléculas de agua a través del puente de oxígeno (Satapathy et al., 2020).
Durante la interacción con los sustratos, la viscosidad de la solución se reduce en mayor medida con un aumento de los grupos terminales reductores.
Las poligalacturonasas se clasifican en tres tipos según su punto de acción.:
exopoligalacturonasa, endopoligalacturonasa y ramnopoligalacturonasa
• La exopoligalacturonasa: su función principal es dirigirse a los grupos terminales de la péctica, provocando una disminución gradual de la longitud de la cadena(Lozano & López, 2001)(Satapathy et al., 2020).
• La endopoligalacturonasa: como función principal es atacar arbitrariamente todos los eslabones de la cadena, lo que da como resultado consecuencias más rápidas e incisivas(Lozano & López, 2001)(Satapathy et al., 2020).
• La ramnopoligalacturonasa tiene como función cataliza al azar dentro o en los terminales no reductores de las cadenas centrales de ramnogalacturonano(Lozano & López, 2001)(Satapathy et al., 2020).
3.4.2. Usos de enzimas pectinolíticas
Las enzimas pectinolíticas son las enzimas más importantes en la industria, principalmente en el sector de los alimentos para clarificación eliminando la turbidez, conservación y obtención de volúmenes considerables de los productos, aumentando en un 25% en cada tonelada tratada de materia prima (frutas)(Satapathy et al., 2020). Son empleadas en los
28
procesos de producción de jugos, néctares, puré, cócteles y en la producción de vinos principalmente en los mostos de la uva. A este proceso de le conoce como pectólisis en donde se obtiene más volumen de producto con excelente calidad de brillo y mejor aroma. Por estas y más características es que muchos acuden al uso de estas enzimas debido a sus beneficiosos (Ramos Galeano, 2013).
Las enzimas debido a sus crecientes aplicaciones en diferentes procesos biotecnológicos, se ha logrado considerar las mejores herramientas biológicas por sus propiedades catalíticas ajustables y específicas, a continuación, algunos de las partes donde son aplicadas: en el área alimenticia para el tratamiento de fibra que se les proporciona a los bovinos, existe un tratamiento para la anemia, se trata de un complejo formado por pectina degradada junto con hierro. Por otra parte, la utilización de las enzimas pécticas en los procesos de extracción con el fin de desnaturalizar las propiedades emulsionantes de la pectina y promover la licuefacción de los componentes de la pared celular, lo que finalmente produce un mejor volumen de productos. En otros casos son importantes en los procesos de formación de tabletas, para reducir el colesterol en la sangre y reducir la glucosa (Satapathy et al., 2020).
3.5. Tecnología de las fermentaciones
Para obtener sustancias secretadas por un microrganismo y principalmente de un hongo radica en la utilización de medios de cultivos con las condiciones óptimas como variaciones de pH, temperatura y humedad, que contenga los nutrientes ideales los cuales pueden ser medios sólido o líquido (Taragano & Pilosof, 2000) pueden ser llevadas a cabo sobre una gran diversidad de residuos agroindustriales (sustrato).
29 3.5.1. Fermentación en estado solido
La fermentación en estado sólido es una tecnología potencial consiste en un medio que carece de agua, prácticamente son sustratos solidos húmedos que poseen un componente que absorbe toda el agua. Estos sustratos no se encuentran ni disueltos ni en suspensión, pero tiene la capacidad de brindar nutrientes, entre estos sustratos se utilizan generalmente residuos agroindustriales que son asequibles (Ramos Galeano, 2013). Es un sistema que contienen material solidas con una fase liquida y gaseosas adheridas a las partículas resulta provechoso este sistema porque se puede obtener todos los nutrientes que tiene el sustrato empleado y así el microrganismo toma todo lo esencial (Suprayogi et al., 2021).
Las propiedades que se deben resaltar de este sistema son la retención de agua, la concentración de sustratos y de nutrientes donde se aporta una concentración energética. El uso de los sistemas de fermentación sólida para la producción de metabolitos por parte de microorganismos principalmente en hongos no debe ser ignorado, debido a que estos medios son fuente de proteína y nutrientes, contribuyendo al buen manejo de residuos sólidos acumulados por el procesamiento de materias primas, al obtener alimentos y con ello evitar la contaminación, cualquier bio residuos es utilizado para ser aplicado en estos sistemas, de acuerdo a lo que el microrganismo requiera (Tuly et al., 2021)(Ramos Galeano, 2013).
3.5.2. Fermentación sumergida
Una de las técnicas más utilizadas en el medio industrial es la fermentación sumergida, por sus ventajas de obtención de sustancias bioquímicas como enzimas y demás metabolitos secundarios, poseen una facilidad en el control de muchas de las varíales aptas para el crecimiento del microrganismo empleado, variables como el pH, aireación, temperatura.
Cabe anotar que esta técnica tiene la facilidad de utilizar altos volumen en los procesos fermentativos con la ayuda de equipos especializados como biorreactores (Kapri et al., 2020).
30
En esta técnica fermentativa el medio es completamente líquido y el producto que se origina también es obtenido en estado líquido con una agitación controlada, estas especies pueden fluir libremente, son conocidos como caldos (Ravichandran & R, 2012).
En el caso de los hongos filamentosos tiene la capacidad de crecer en medios líquidos y en constante agitación controlada, como también lo es la temperatura, disponibilidad de nutrientes por parte del sustrato, oxigenación, pH. Estos pueden realizarse en cultivos discontinuo (Batch) o continuos según el hongo y lo que se quiere obtener (Robinson et al., 2002), es reducida la viscosidad del medio, lo que la hace una técnica más utilizada en la industria porque se adapta a los procesos donde se obtienen productos a mayor escala (Taragano & Pilosof, 2000).
3.6. Piña (Ananas comosus)
La piña ( Ananas comosus ) está clasificada entre la familia de las bromeliáceas es una fruta perenne herbácea y tiene un altura de 1,0 m a 1,5 m aproximadamente, una de sus características es su tallo bastante corto y hojas cerosas con espinas muy pequeñas en los bordes (Unanma et al., 2021).
El fruto posee forma de cilindro que está formada por una agrupación de puntos conocido como que se le denomina infrutescencia, es caracterizado por su contenido carnoso y termina en una agrupación de hojas a lo que se le llama corona, la pulpa que es la parte comestible es amarilla de diferentes tonalidades que depende principalmente de la variedad, posee un buen aroma (DANE, 2016). Como se logra apreciar en la figura 4, la forma del fruto por dentro y por fuera.
31
En Colombia son empleadas distintas variedades de piña dentro de las más importantes están:
Cayena Lisa, Perolera, Manzana, y Gold MD2 (oro miel), como se muestra en la figura 5. En Colombia se estima que en Colombia existen alrededor de 32.700 hectáreas de piña sembradas (Granado & Aguillón, 2019).
Figura 5. Variedades más importantes de piña cultivadas en Colombia (DANE, 2016).
Es una fruta tropical cuyas propiedades sensoriales son destacadas por su sabor dulces y sus propiedades, como la cantidad de antioxidantes que contiene, posee características para el mejoramiento de la salud, la gran utilidad de este fruto en jugo genera una gran cantidad de residuos, como la cascara, la corona y el corazón, son los principales desechos de conserva
Figura 4. Ananas comosus A: Fruto, B: cascara. Cultivo de piña en Sarandelo - Córdoba.
A A
A B
32
en la industria. Es producido en muchos países Tailandia, Costa Rica, Filipinas, Brasil, India y Colombia (Ajayi et al., 2022).
Para el año 2019 y 2020 en córdoba se produce de 2.426 a 4,500 hectáreas junto con los departamentos de Antioquia y sucre que conforman un 7% de producido de piña a nivel nacional, el precio de este fruto puede verse afectado por la demanda de este mismo al momento de cultivar, debido a que todo agricultor que se dedica a producir piña, prefiere no realizar otro tipo de actividad agronómica, todos los días se debe cultivar y cada cultivo se obtiene cosechas de 12 a 18 meses aproximadamente (Granado & Aguillón, 2019)(Campo, 2020).
3.7. Maracuyá ( Passiflora edulis)
El fruto de maracuyá ( Passiflora edulis f.) posee una planta perenne, denominada trepadora, leñosa, vigorosa; con características de sabor acido y aroma, es originario de Brasil directamente de la zona amazónica (De Faveri et al., 2020). La maracuyá es una fruta netamente redonda, cuando se madura la piel se arruga, la pulpa posee aroma y color fuerte en un tono naranja dependiendo la especie y contiene pequeñas semillas negras comestibles (Guidi & Arandia Quiroga, 2010). Este género posee aproximadamente 500 especies y se distribuyen en regiones templadas, cálidas y tropicales. Varias de estas especies se cultivan en los trópicos por sus frutos comestibles, siendo la Passiflora edulis (fruta de la pasión, granadilla morada) la más cultivada, las demás son cultivadas en la intemperie en lugares un poco más cálidos como plantas exóticas (Dhawan et al., 2004) (Pareja Marín, 2015).
En la figura 6, se muestra como es un cultivo y la forma del fruto. Este fruto es fuente de proteínas, minerales, vitaminas, carbohidratos y grasa, se consume como fruta fresca, o en jugo. Hoy en día la difusión de las semillas se ha ampliado en regiones que poseen características similares al valle del cauca como Huila que actualmente es uno de los que más
33
produce esta fruta, caldas, Quindío, Córdoba y otros departamentos que la producen (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, 2020) (Amaya Robles, 2010).
Figura 6. Passiflora Edulis A: Planta, B: fruto en el municipio de purísima - Córdoba
En Colombia los cultivos de maracuyá se hacen presente en 24 departamentos, con la representación de más de 15.000 hectáreas, a nivel nacional los departamentos que la producen mayormente Antioquia, Valle, Huila, Boyacá y Meta, para el año 2020 (Ministerio de Agricultura y Desarrollo Rural, 2020).
A B
34
4. METODOLOGÍA 4.1. Localización
La investigación se realizó en el corregimiento Sarandelo -Lorica y en el municipio de Purísima pertenecientes al departamento de Córdoba, Colombia. El trabajo de laboratorio fue desarrollado en las instalaciones del laboratorio de investigación de Biotecnología (GRUBIODEQ), en la Universidad de Córdoba.
4.2. Caracterización de hongos del género aspergillus asociados a los frutos de piña y maracuyá.
4.2.1. Recolección de muestras
Se prepararon trampas con contenido de frutos fisiológicamente maduros de piña y maracuyá; en un recipiente con un contenido de 10 g aproximadamente de residuos humedecidos con solución de sales Czapek, cada trampa fue ubicada dentro del cultivo correspondiente durante 1 hora aproximadamente. En la figura 7 se muestra la forma como se ubicaron las trampas dentro del cultivo de piña y el cultivo de maracuyá.
Figura 7. A: trampa con contenido de piña en un cultivo de piña; B: trampa con contenido de maracuyá en cultivo de maracuyá.
A B
35
La recolecta de aislados de cultivos de piña fue realizada en el corregimiento de Sarandelo y los aislados provenientes del cultivo de maracuyá fue realizada en el municipio de Purísima, en el departamento de Córdoba. Las muestras fueron recogidas y procesadas en el laboratorio de biotecnología GRUBIODEQ de la Universidad de Córdoba. En la figura 8 se muestra la foto en satélite de la ubicación de cada sitio de muestreo.
Figura 8. A: Sarandelo – Córdoba (SARANDELO - Google Maps, n.d.), B: Purísima – Córdoba (Purísima-Momil - Google Maps, n.d.)
4.2.2. Aislamiento de hongos Aspergillus niger
Las trampas que fueron expuestas en los cultivos frutales se les proporciono una incubación a 30 ±2°C de 3 a 8 días para inducir crecimiento de los hongos. Luego de esto, desde el día 3 y hasta el día 8 se hicieron observaciones y aislamiento de microorganismos, estos fueron creciendo en la superficie de la cascara de cada fruta; al obtener el crecimiento, fueron sembrados en Agar czapek modificado a 30 ±2°C por 8 días; en el caso de que los microorganismo no se encontrara puro se realizaban repicas hasta obtenerlos puros para después identificarlos por sus características morfológicas (Arauz Cavallini, 1998) (Ramos Galeano, 2013).
A B
36
Cada aislado se sembró sobre medios de cultivo agar Czapek modificado con albedo de piña y albedo de maracuyá respectivamente como única fuente de carbono. Se llevaron a cabo metodologías: siembra en placas, dilución, y siembra directa, para identificar sus características morfológicas (Q. Li et al., 2020) (Madigan et al., 2003). Como se muestra en la figura 9.
Figura 9. Medio de cultico Czapek modificado con albedo de piña y albedo de maracuyá.
4.3. Determinación la capacidad pectinolítica de hongos seleccionados utilizando sus extractos enzimáticos en albedo: piña, maracuyá, piña/maracuyá y pectina comercial.
4.3.1. Preparación de inóculos.
La preparación de inóculos partió de la recolección de esporas de los aislados seleccionados, los cuales presentaron mayor capacidad de crecimientos en medio de agar Sabouraud ( hasta la esporulación), con 10 mL de solución salina (NaCl 0.85%
+ Twen 20 al 0.1%) y se realizó un conteo de esporas por el método de dilución seriada usando cámara de Neubauer, para obtener las concentraciones de conidias por mL (Ramos Galeano, 2013)(Osorio & Cando, 2017).
A B
37
4.3.2. Inducción a la producción de pectinasas.
En este proceso, se utilizó la técnica de fermentación sumergida al 10% de sustrato modificado de Oviedo y Ramos en el 2013 (Ramos Galeano, 2013).
Se realizó un conteo de esporas y estas soluciones se inocularon en un volumen de 25 mL de Medio líquido modificado Czapek al 2 % de piña, maracuyá, piña/ maracuyá y de pectina cítrica comercial a un pH 5.6 con 0.5 mL de suspensión de esporas e incubados por un periodo de 3 días( 24, 48 ,72) a 150 rpm a 30°C respectivamente.
4.3.3. Ensayo enzimático de poligalacturonasa.
Los extractos que se obtuvieron de la fermentación sumergida fueron utilizados para evaluar la actividad enzimática de cada aislado, se utilizó un buffer citrato fosfato pH:
5.6 medio estéril con pectina y se incubó por 1 hora a 35°C para cada prueba.
4.3.4. Análisis de capacidad enzimática por el método DNS de los azucares reductores.
En tubos de cristal de 10 mL o 20 mL, se tomaron alícuotas homogéneas (0,5ml) de cada extracto incubado en buffer con pectina y se aplica el reactivo DNS (ácido dinitrosalicílico). Luego los tubos se colocaron en baño de maría a 100ºC por 5 minutos. Se dejaron enfriar en baño de hielo por 15 minutos y se le añadieron 5 mL de agua destilada.
Luego se agitaron para homogenizar y se les tomo lectura a 540 nm en un espectrofotómetro UV- VIS. Estos resultados se compararon con una curva patrón para obtener las concentraciones en g/L de azucares reductores.
38
4.4. Evaluación de las condiciones óptimas de pH de fermentación sumergida de los aislados seleccionados para la producción y actividad de las pectinasas.
Luego de evaluar la actividad pectinolítica de los diferentes hongos, son sometidos a una evaluación de optimización de pH 4.0, 5.6 y 6.5 mediante un monitoreo continuo de 18 horas durante 3 días, para seleccionar el que muestra mejor resultado en la liberación de azucares reductores a partir de medios con variedad pH.
El procedimiento a seguir es el siguiente:
4.4.1. Variación en el pH del medio de cultivo liquido de pectina cítrica comercial.
25 ml de Medio líquido Czapek al 2% de pectina comercial pH (4.0±0.2; 5.6±0.2;
6.5±0.2) estéril se inoculó con 0.5 mL de suspensión de esporas y se incubó por 24,48 y 72 horas a 150 rpm y 30 ±2°C.
Luego de la formación de los micelios se tomó el sobrenadante obtenido (extracto enzimático crudo) y se evaluó la actividad enzimática como se describe en los incisos 4.3.3 y 4.3.4 de la metodología. Se realizo la incubación directamente con el extracto enzimático cada 18 horas y se tomó lectura durante 3 días.
4.5. Determinar el efecto clarificante de las enzimas pectinolíticas en jugos de frutas.
Para la validez de esta actividad se realizó un análisis cualitativo en donde se midió turbidez inicial a cada jugo de fruta al 10%: maracuyá (Passiflora edulis), carambolo (Averrhoa carambola), guayaba agria (Psidium araca), piña (Ananas comosus) y turbidez final después de haber aplicado el extracto enzimático a un periodo de incubación a 35 ±2°C, por 4 horas (Mendívez Vásquez & Minchón Benites, 2010)(García-Rujano et al., 2015).
39
5. DISEÑO EXPERIMENTAL
Para los datos obtenidos en cada ensayo, se llevó a cabo un análisis aplicando un diseño completamente aleatorio (DCA), con 4 repeticiones. A los datos se les aplicó análisis de varianza y prueba de Tukey, usando software estadístico STATGRAPHICS Centurión XVI.I con un nivel de significancia de 0.05. Seleccionando de esta forma el mejor tratamiento que favoreciera la producción de enzimas pectinolíticas en cada tratamiento aplicado (Ramos Galeano, 2013).
40
6. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1. Caracterización de aislados de hongos con propiedades pectinolíticas.
Para la caracterización de todas las especies aisladas de los cultivos de piña y maracuyá, se tuvo en cuenta los aspectos de las colonias y el análisis de la morfología microscópica, especialmente en la cabeza que contiene las esporas muy características de este género.
Se aislaron 22 microorganismos de manera aleatoria de cultivos de piña y cultivos de maracuyá, el análisis estructural de cada microorganismo fue posible siguiendo las claves descritas por Barmett & Hunter para su identificación (Barnett & Hunter, 1998).
Se realizó una preselección de 6 aislados con las características tanto macroscópicas como microscópicas del género Aspergillus, mediante la medida del halo de crecimiento sobre medio de cultivo de pectina comercial al 2%, utilizando como indicador revelador rojo Congo.
En la figura 10, se muestra cómo se realizó la medición del halo del crecimiento del aislado y en la tabla 1, se presenta la cuantificación del halo de crecimiento denotado mm de los aislados donde M6P21, MM3 y M16P21 presentan mejor halo de crecimiento.
41
Figura 10. Media del hago de crecimiento para la selección de aislados del género Aspergillus.
Tabla 1. Halo de crecimiento de aislados con características de Aspergillus niger.
AISLADOS DE HONGOS EN CULTIVOS
CULTIVO AISLADOS HALO (Cm)
PIÑA
M6P21 3,6
M6P21 3,5
M6P213 3,4
M12P21 3,4
M17P21 3,3
MARACUYÁ MM3 3,5
Nota: los aislados de cultivo de piña recibieron el código MP21 y los aislados de cultivo maracuyá recibieron el código MM.
En la tabla 2 se puede observar las características macroscópicas, como las texturas, colores y crecimiento. Características microscópicas, como la forma de las cabezas, esporas en medio de estado sólido del aislado M6P21, este aislado fue obtenido de cultivos de piña.
42 6.1.1. Aislado aspergillus M6P21
Tabla 2. Características macro y microscópicas del aislado M6P21
AISLADO MACROSCOPIA MICROSCOPIA
M6P21
• Características macroscópicas: Colonias planas abundantes con hifas de color café a negro y textura pulverulenta. Por la presencia en la superficie del micelio con puntos negros similares a la pimienta, se observa la producción de conidias;
que con él tiempo de crecimiento pueden ser tan abundantes que se logra apreciar una manta café oscura a negro.
• Características microscópicas: Se observa abundancia de esporas de color negro oscuro, en algunas cabezas dispersas en la imagen se logra observar la formación de una vesícula esférica globosa, hifas tabicadas, conidióforos largos y lisos.
En la tabla 3 se presentan las características macroscópicas y microscópicas del aislado MM3, su crecimiento y forma de las esporas en medio de estado sólido, este aislado es obtenido de cultivos de maracuyá.
43 6.1.2. Aislado Aspergillus MM3
Tabla 3. Características macro y microscópicas del aislado MM3
AISLADO MACROSCOPIA MICROSCOPIA
MM3
• Características macroscópicas: Hifas de color café a negro y textura pulverulenta, el micelio en la superficie se nota como puntos negros similares a la pimienta, se observa la producción de conidias; se logra apreciar una manta café oscura a negro.
• Características microscópicas: se logra apreciar la formación definida de vesícula unidas a métulas, fiálides y conidias, conidióforos largos y lisos de manera definidas, abundancia de esporas de color oscuro característico de este género.
En la tabla 4 se presentan las características Macroscópicas y Microscópicas del aislado M16P21, este aislado es obtenido de cultivos de piña.
44 6.1.3. Aislado Aspergillus M16P21
Tabla 4.Características macro y microscópicas del aislado M16P21.
AISLADO MACROSCOPIA MICROSCOPIA
M16P21
• Características macroscópicas: Se observa la producción de conidios como puntos negros muy parecidos al aspecto de la pimienta con un color café oscuro con pliegues de textura algodonosa.
• Características microscópicas: Se observa abundancia de esporas características de este género, se logra ver vesícula esférica globosa la cual da origen a métulas, conidias de color negro oscuro que oscurecen las superficies de la vesícula con hifas tabicadas, conidióforos largos y lisos.
Para corroborar los resultados del aislamiento de hongos nativos como Aspegillus niger con características y condiciones similares a las de este trabajo se comparó con trabajos recientes como en trabajo realizado por (Saif et al., 2021) que lograron aislar varias especies fúngicas directamente de las frutas y se lograron encontrar 15 especies del género Aspergillus siendo el género más dominante de estos aislamientos, los cuales fueron sembrados en medio de agar patata dextrosa (PDA) lo que sería caso contrario a este trabajo donde los medios de crecimiento era a base de cascara de frutas. En cuanto al estudio de la morfología se realizó una metodología similar mediante técnica microscópica y macroscópica, cabe resaltar que
45
las frutas desde el momento que se encuentran en el cultivo hasta el punto de maduración están expuestas al crecimiento de hongos, debido a que son la principal fuente de alimentos de hongos del género Aspergillus.
Por otro lado (Cavalieri de Alencar Guimarães et al., 2022) lograron aislar un cepa de Aspergillus para producción de enzimas pectinolíticas y utilizan como fuente de carbono residuos de maracuyá en solución salida para producir enzimas pectinoliticas, son resultados muy similares a los de este trabajo realizado porque también se utilizan residuos de maracuyá para el aislamiento y purificación de los hongos nativos para realizar ensayos de producción de enzimas pectinoliticas.
Así mismo (Mahmoodi et al., 2017) obtienen aisladosde la cascara de naranja del género Aspergillus niger de tipo salvaje, para producción de enzimas pectinolíticas aplicables en zumo de naranja, son resultados que al ser comparados con los resultados obtenidos son muy parecidos. Sin embargo, El género Aspergillus es un hongo común que se encuentra en el medio ambiente, desde cualquier fuente de alimento en descomposición y más que todo en las especies frutales en su proceso de maduración o putrefacción, por lo que (Krusong et al., 2019) logran obtener Aspergillus de un pan contaminado sin conservante, de una especie no frutal, Aspegillus niger es el hongo más común del género porque se encuentra en el medio ambiente, es utilizado en potencia para aspectos ambientales y alimenticios.
Adicional a lo anterior en esta investigación, realizó un estudio molecular para los aislados M6P21 y MM3 donde se logró obtención de una nueva secuencia del género Aspegillus, Ver anexos 1 y 2.
Con el objetivo lograr la identificación molecular de los aislados de piña y maracuyá, secuencias obtenidas de los fragmentos se logró establecer una correspondencia en secuencia y tamaño, con la secuencia original de Aspegillus niger, para cada aislado es esta relacionado
46
con las funciones y características nuevas de Aspegillus niger, por lo que se puede afirmar que los aislados obtenidos, han sufrido procesos de adaptación de acuerdo a las condiciones en el medio donde habitan dando como resultado la obtención de dos nuevas secuencias del hongo Aspegillus niger definidas como nuevas cepas del mismo. Definidos como:
• Aspergillus sp. aislado GRUBIODEQ M6P21 gen 5.8S ARN ribosomal y espaciador transcrito interno 2, secuencia parcial.
Origen: 1 agtgaatcat cgagtctttg aacgcacatt gcgccccctg gtattccggg gggcatgcct 61 gtccgagcgt cattgctgcc ctcaagcccg gcttgkgkgy t
(Ver anexo 1 )
• Aspergillus sp. cepa MM3 5.8S gen de ARN ribosomal, parcial secuencia; espaciador interno transcrito 2, secuencia completa; y Gen de ARN ribosomal de subunidad grande, secuencia parcial.
Origen: 1 atcatcgagt ctttgaacgc acattgcgcc ccctggtatt ccggggggca tgcctgtccg 61 agcgtcattt ctcccctcca gccccgctgg ttgttgggcc gcgccccccc gggggcgggc 121 ctcgagagaa acggcggcac cgtccggtcc tcgagcgtat ggggctctgt cacccgctct 181 atgggcccgg ccggggcttg cctcgacccc caatcttctc agattgacct cggatcaggt 241 agggataccc gctgaactta agcatatcaa taagcggagg aa
(Ver anexo 2)
47
6.2. Determinación de la capacidad pectinolítica hongos seleccionados utilizando sus extractos enzimáticos en albedo de piña, maracuyá, piña/ maracuyá y pectina comercial.
Cada hongo fue sembrado en medios de cultivo de sustrato modificado de albedos de piña y maracuyá como única fuente de carbono, cuyo resultado de cantidad de conidias por mL se presentan en la tabla 5.
Tabla 5. Concentraciones de conidias por mL de Aspergillus en medios de cultivo mezcla de albedo de piña y albedo de maracuyá.
AISLADO Conidias/mL
M6P21 5,30E+07
MM3 5,20E+07
M16P21 4,40E+07
Se realizó la evaluación de 3 aislados de Aspergillus niger (M6P21, MM3, M16P21) en sustrato de albedos de: piña, maracuyá, Mezcla de ambos y pectina comercial 2%.
A continuación, la tabla 6 presenta los valores de azucares reductores obtenidos en los tratamientos uno y dos, utilizando el método DNS como método indirecto para determinar la actividad pectinolítica de los hongos. El primer tratamiento es el de albedo de piña y el segundo es el tratamiento de albedo de maracuyá, durante un monitoreo de tres días, dando como resultado la cuantificación de la capacidad pectinolíticas de los tres aislados.
Tabla 6. Concentraciones de azucares reductores en albedo de piña y albedo de maracuyá.
48
HONGOS
NATIVOS tiempos
Piña Maracuyá
Azucares Reductores
(AR) g/L
Unidad Enzimática (UE) Mole/Litro/minuto
Azucares Reductores
(AR) g/L
Unidad Enzimática (UE) Mole/Litro/minuto
M6P21
24 0,2592 2,400E-05 0,2055 1,902E-05
48 0,2028 1,878E-05 0,1949 1,804E-05
0,2137 1,979E-05 0,2264 2,097E-05
72 0,2411 2,233E-05 0,2119 1,962E-05
0,2816 2,608E-05 0,2740 2,537E-05
MM3
24 0,1980 1,834E-05 0,2185 2,023E-05
48 0,2119 1,962E-05 0,1868 1,730E-05
0,2856 2,644E-05 0,2352 2,178E-05
72 0,1410 1,306E-05 0,2127 1,970E-05
0,2487 2,303E-05 0,2694 2,494E-05
M16P21
24 0,2251 2,084E-05 0,2283 2,113E-05
48 0,2433 2,253E-05 0,1696 1,570E-05
0,2228 2,063E-05 0,2443 2,262E-05
72 0,1939 1,795E-05 0,2055 1,902E-05
0,2717 2,516E-05 0,2608 2,415E-05
Acerca de los resultados obtenidos en el tratamiento 1 (Piña) se pueden observar en la tabla 6 que la producción de enzimas pectinolíticas expresadas en concentraciones de azucares reductores, son valores muy similares, con relación a los aislados M6P21 y MM3, el resultado de las concentraciones de azucares reductores es obtenido en 2 tiempos diferentes, donde el aislado M6P21 obtiene la mayor producción enzimas a las 72 horas con una concentración de 0,2816 g/L, mientras que para el aislado MM3 ocurre en la última medición de las 48 horas con una concentración de 0,2856 g/L. Por otra parte, el aislado M16P21 obtiene una concentración de 0,2433 g/L a las 48 horas.
Con respecto a los resultados obtenidos del tratamiento 2 ( Maracuyá) también se pueden observar en la tabla 6, de la misma forma el MM3 obtuvo una concentración de 0,2694 g/L a las 72 horas, mientras que el aislado M16P21 obtuvo una concentración de 0,2608 g/L a las 72 horas y el aislado M6P21 una concentración 0,2740 g/L, para este tratamiento, los
