UNIVERSIDAD REGIONAL AUTÓNOMA DE LOS ANDES UNIANDES
FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS
PROGRAMA DE MAESTRÍA EN FARMACIA CLÍNICA Y HOSPITALARIA
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN PREVIO A LA OBTENCIÓN DEL GRADO ACADÉMICO DE MAGISTER EN FARMACIA CLÍNICA Y HOSPITALARIA
TEMA:
EVALUACIÓN DE LA ACTIVIDAD ANTIMICROBIANA “IN VITRO” DEL EXTRACTO HIDROALCOHÓLICO DE LAS HOJAS DE Melissa officinalis
(TORONJIL) EN Proteus spp.
AUTORA: BQF. LEMA AUCACAMA ADRIANA PAOLA
ASESORES: DR. ABDEL BERMUDEZ SOL Ph. D
MsC. EMILIO CARRANZA QUISPE
DEDICATORIA
Mi tesis la dedico con todo mi amor y cariño a mi amado esposo por su sacrificio y esfuerzo, por creer en mi capacidad, aunque hemos pasado momentos difíciles siempre ha estado brindándome su comprensión, cariño y amor. A mi amada hija Sofía por ser mi fuente de motivación e inspiración para poder superarme cada día más.
A mis padres y hermanas quienes con sus palabras de aliento no me dejaban decaer para que cumpla con mis ideales.
Gracias a todos
AGRADECIMIENTO
A Dios por darme la única herramienta que necesito para alcanzar mis anhelos. La vida; te agradezco por estar conmigo y escucharme en los momentos más difíciles de mi vida y nunca abandonarme. Al Dr Abdel Bermudez y Dr Emilio Carranza asesores de tesis, por su ardua dedicación y esmero, lo cual permitió llevar a cabo con éxito el presente trabajo investigativo.
A la Dra Andrea Loayza por su don de gente.
A mis papis por siempre estar junto a mí en todo momento; no me alcanzaría una vida para agradecerles.
A mis amigas por todos los grandes momentos brindados Grace, Gabriela y Paola.
RESUMEN
Los extractos de plantas proveen oportunidades ilimitadas para el desarrollo de
nuevos fármacos con potencial terapéutico, los mismos que pueden ser
utilizados para el control microbiano. El objetivo del presente trabajo fue
evaluar la actividad antimicrobiana “in vitro” del extracto hidroalcohólico de las hojas de Mellisa officinalis (Toronjil) en Proteus spp, para lo cual se realizó un
estudio etnobotánico a través de encuesta a 130 informadores clave del sector de la “Condamine” del cantón Riobamba, Provincia de Chimborazo, Ecuador.
Para la caracterización fitoquímica del extracto del vegetal seleccionado se
recolecto, identifico, se extrajo con etanol al 96%, concentro y se llevó a cabo la
identificación de sus metabolitos secundarios. La evaluación de la actividad
antimicrobiana se realizó con el extracto hidroalcoholico de las hojas usando el
método de difusión en discos (Kirby-Bauer) frente a Proteus spp. Como resultado de las encuestas se seleccionó Mellisa officinalis por tener un nivel de
uso significativo de 35.7% El tamizaje fitoquímico dio positivo para: saponinas,
compuestos fenólicos, flavonoides, chalconas, auronas, alcaloides, y quinonas
que son metabolitos con actividad antimicrobiana a diferentes concentraciones,
siendo estas 25%, 50%, 75% y 100%. El extracto presentó actividad
antimicrobiana frente a Proteus spp. Se concluye que es una planta medicinal
utilizada y conocida por la población de la ciudad de Riobamba, usada para
tratar ciertas infecciones, la misma que presenta actividad antimicrobiana “in vitro” frente a Proteus spp.
ABSTRACT
Plant extracts provide unlimited opportunities for the development of new drugs
with therapeutic potential, which can be used for microbial control. This research aims to evaluate the antimicrobial activity “in vitro” of the
hydroalcoholic extract of the leaves of Mellisa Officinalis (Toronjil) in Proteus
spp, for which an ethno-botanical study was carried out through a survey of 130 key informants from the sector of the “Condamine” of Riobamba city, Province
of Chimborazo, Ecuador. For the phytochemical characterizacion of the extract
of the selected plant, it was collected, identified, extracted with 96% ethanol,
concentrated and the identification of its secondary metabolites was carried out.
The evaluation of the antimicrobial activity was carried out through the
hydroalcoholic extract of the fresh leaves using the dic diffusion method
(Kirby-Bauer) against Proteus spp. As a result of the surveys, Mellisa Officinalis was
selected because it had a significant use level of 35,7% Phytochemical
screening was positive for saponins, phenolic compounds, flavonoids,
chaconnes, aurones, alkaloids, and quinones that are metabolites with
antimicrobial activity. The extract presented antimicrobial activity against
Proteus spp at different concentrations; being these 25%, 50%, 75% and 100%.
It is concluded that it is a medicinal plant used and known by the population of
the city of Riobamba, to treat certain infections, which presents antimicrobial activity “in vitro” against Proteus spp.
ÍNDICE GENERAL
Pág.
Introduccion ...1
Formulación del problema ...4
Delimitación del problema ...4
Objeto de investigación ...4
Línea de la investigación ...4
Objetivo general...4
Objetivos específicos ...4
Idea a defender ...5
Justificación del tema ...5
CAPÍTULO I. MARCO TEÓRICO .. ...7
1.1Uso tradicional de las plantas medicinales ...7
1.1.1. Estudios etnobotánicas y etnofarmacológicos ... 7
1.1.2. Valor del uso de las plantas medicinales ... 8
1.1.2.1 Indice de valor de uso de las especies... 9
1.1.2.2 Nivel de uso significativo (UST) ... 9
1.1.3. Principales metabolitos secundarios con actividad microbiana ... 10
1.2. Melissa officinalis (Toronjil) ...13
1.2.2. Descripcion botanica ... 14
1.2.3. Clasificación científica ... 15
1.2.4. Composición química ... 15
1.2.5. Formas de utilizarlo ... 16
1.2.6. Uso en medicina tradicional... 17
1.2.6.1. Advertencia y contraindicaciones ... 18
1.2.7. Actividad Biológica de Melissa officinalis (toronjil)... 18
1.3. Caracterización fitoquímica de los extractos de platas medicinales ...19
1.3.1 Extracción ... 20
1.3.2. Tipos de Extracción más utilizados para plantas medicinales ... 21
1.3.2.1.Maceración ………..…….……….21
1.3.2.2. Percolación o lixiviación ... 21
1.3.3. Clasificación de los extractos vegetales ... 21
1.3.3.1. Extractos blandos ... 21
1.3.3.2. Extractos firmes ... 21
1.3.3.3 Extractos secos... 21
1.3.3.4. Extractos fluidos ... 22
1.3.5. Ensayos para determinar los diferentes grupos de metabolitos presentes
en el extracto vegetal ... 22
1.3.5.1. Ensayo de Dragendorff, Wagner y Mayer ... 22
1.3.5.2. Ensayo de Lieberman-Buchard ... 23
1.3.5.3. Ensayo de Borntrager ... 23
1.3.5.4. Ensayo de Catequinas ...23
1.3.5.5. Ensayo de Espuma ... 23
1.3.5.6. Ensayo de Benedict ... 23
1.3.5.7. Ensayo de Shinoda ... 23
1.3.5.8. Fehling ... 24
1.4. Actividad Antimicrobiana y Resistencia Bacteriana ...24
1.4.1. Definición ... 24
1.4.2. Sustancia antimicrobiana ... 24
1.4.3. Resistencia Bacteriana ... 24
1.5.Métodos para evaluar la actividad antimicrobiana ...26
1.5.1. Método de difusión en agar ... 26
1.5.1.1. Método de dilución en caldo o agar ... 26
1.5.2. Factores que influyen en la actividad antimicrobiana ... 26
1.5.2.2 Concentración del inóculo ... 27
1.5.2.3 Temperatura de incubación ... 27
1.5.2.4 Naturaleza del borde del halo de inhibición ... 27
1.5.2.5 Composición química del medio de agar ... 27
1.5.2.6 Tiempo de incubación... 28
1.5.2.7 Volumen de la concentración del antibiótico a Utilizar ... 28
1.5.3. Medios de Cultivo ... 28
1.5.3.1. Mueller Hinton ... 28
1.5.3.2. Agar papa dextrosa ... 29
1.5.4. Cepas ... 29
1.5.4.1. Escherichia coli ... 29
1.5.4.2. Pseudomonas aeruginosa ... 30
1.5.4.3. Candida albicans ... 30
1.5.4.4. Staphylococcus aureus ...30
CAPÍTULO II. MARCO METODOLÓGICO ...32
2.1. Descripción del Proceso Metodológico ...32
2.2. Etapa 1: Estudio etnobotánico ...32
2.2.2. Procedimiento ... 34
2.3. Obtención del extracto hidroalcohólico de Melissa Officinalis (Toronjil) ...35
2.3.1. Lavado y Desinfección de la planta ... 36
2.3.2. Maceración de la muestra ... 36
2.3.3. Filtración ... 36
2.4. Análisis fitoquímico ... 36
2.4.1. Ensayo de Dragendorff (Alcaloides) ... 36
2.4.2. Ensayo de Lieberman-Buchard (Terpenos y/o Esteroides) ... 37
2.4.3. Ensayo de Espuma (Saponinas) ... 37
2.4.4. Ensayo De Shinoda (Flavonoides) ... 37
2.4.5. Ensayo de Hidróxido de sodio (Quinonas) ... 37
2.4.6. Ensayo del Cloruro Férrico (Fenoles) ... 37
2.4.7. Ensayo del Ácido Sulfúrico (Auronas y Chalconas ... 38
2.5. Métodos Físicos-Químicos Aplicados Al Análisis De Extractos ...38
2.5.1. Determinación de los Parámetros Organolépticos... 38
2.5.2. Determinación de la Densidad Relativa ... 38
2.5.3. Determinación del Índice de Refracción ... 39
2.6. Análisis Microbiológico mediante Método De Difusión En Disco (Kirby-Bauer) ...39
CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSION ...41
3.1 Inventario Etnobotánico ...41
3.1.1. Partes de la planta utilizadas para fines medicinales ... 46
3.1.2. Preparación, vía de administración ... 47
3.1.3. Enfermedades tratadas con plantas medicinales por la población del sector la Condamine Riobamba ... 48
3.1.4. Conocimiento relativo de las especies por los informantes ... 51
3.2. Determinación de las características físico – químicas del extracto hidroalcohólico de Melissa officcinalis ...53
3.3.Tamizaje fitoquímico del extracto de Melissa officinalis ...55
3.4.Análisis microbiológico mediante método de difusión en disco (Kirby-Bauer) ...56
CONCLUSIONES GENERALES ...59
RECOMENDACIONES ...60 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1
Introducción
Antecedentes de la Investigación
Las plantas son fuentes terapéuticas que pueden ser utilizadas de varias
maneras, como té u otros remedios hechos en casa. Pueden también ser
usadas como extractos crudos o fracciones concentradas en preparaciones
farmacéuticas tales como tinturas, extracto fluido, polvos, tabletas y cápsulas
cuando son consideradas como preparaciones fitofarmacéuticas omedicinas
herbolarias. Finalmente las plantas pueden ser sujetas a extracciones
sucesivas y procedimientos de purificación para aislar compuestos de interés,
los cuales pueden ser ellos mismos los activos y ser usados directamente
como fármaco. (1)
Dentro de la investigación de plantas medicinales, la selección de plantas a
estudiar, se realiza basándose en diferentes estrategias que den como
resultado una medicina herbolaria o un compuesto activo aislado. Este estudio
se realiza tomando en cuenta su uso en medicina tradicional (preparación,
parte de la planta utilizada, forma de administración) reportes de contenido
químico y toxicidad. (2)
El aprovechamiento por el hombre de las plantas aromático-medicinales hay
que buscarla en la más remota antigüedad, según consta en testimonios
históricos pertenecientes a distintas civilizaciones y culturas. El hombre las usó
inicialmente, a imitación de los animales, guiado por su instinto, después
empíricamente, y más tarde de forma más racional, conociendo sus
propiedades terapéuticas de forma progresiva, con los avances tecnológicos.
(3)
De acuerdo con cifras de la Secretaría de Salud, al menos el 90% de la
población usa las plantas medicinales; de ese 90%, la mitad usa
exclusivamente plantas medicinales para atender sus problemas de salud; el
otro 50%, además de las plantas medicinales, usa la medicina alópata. (4)
Los usos de las plantas en diferentes áreas de nuestra cultura han determinado
2
científicas que avalan los beneficios de diversas plantas medicinales en
diversas afecciones crónicas o leves. Los tratamientos con plantas medicinales,
son la forma más popular de medicina tradicional, prevaleciendo a lo largo del
tiempo. (5)
Las plantas tienen múltiples propiedades biológicas y dentro de esta se destaca
por su importancia la actividad microbiana que a sido ampliamente estudiada por muchos investigadores, es así que en un estudio publicado en la “Revista
Ciencia UNEMI” describe el “Análisis del efecto antimicrobiano de doce plantas
medicinales de uso ancestral en Ecuador realizados de algunas especies
vegetales” como: Lippia citriodora K (cedrón), Ambrosia artemisifolia L
(altamisa), Taraxacum officinale Weber (diente de león), Ageratum conyzoides
L (mastrante), Piper carpunya Ruiz & Pav (guaviduca), Borago officinalis L
(borraja), Coriandrum sativum L (cilantro), Melissa officinalis L (toronjil),
Cymbopogon citratus S (hierba luisa), Artemisia absinthium L (ajenjo),
Momordica charantia L (achochilla) y Moringa oleífera Lam (moringa) las
mismas que se recolectaron al azar en las localidades de Machala y Santa
Rosa, Ecuador en el mes de Septiembre 2016. (6)
En este estudio la parte utilizada fueron las hojas, para determinar la actividad
antimicrobiana de los extractos metanólicos obtenidos, se utilizó la técnica de
difusión en agar, mediante la cual éstos se probaron frente a cepas de
bacterias Gram positiva (Staphyloccocus aureus) y Gram negativa (Escherichia
coli y P. aeruginosa), y una cepa del hongo (Candida albicans). (6)
Todos los extractos analizados, a excepción de los de L. citriodora y A.
conyzoides, exhibieron una acción bactericida contra todas las cepas
bacterianas ensayadas, lo cual refleja la importancia de estas especies en la
producción de fitofármacos antibióticos. T. officinale y P. carpunya presentaron
un efecto antibacteriano alto contra E. coli; sin embargo, S. aureus no presentó
sensibilidad frente los extractos de L. citriodora y P. carpunya.
El bioensayo de actividad antifúngica realizado a los extractos de las especies
estudiadas contra C. albicans, mostró que todos tienen acción fungicida alta, a
3
fúngico. Se puede inferir que estas plantas constituyen una fuente promisoria
de compuestos químicos antimicrobianos de gran valor farmacológico. (6)
Según la Organización Mundial de la Salud (OMS), los antibióticos son
medicamentos utilizados para prevenir y tratar las infecciones bacterianas y por
lo tanto son fármacos muy utilizados por la población a nivel mundial, y con
frecuencia se hace un uso irracional de los mismos (7)
En Latinoamérica es común que sus habitantes consigan antibióticos sin una
prescripción médica, debido a la carencia de leyes reguladoras que permiten su
venta libre. La Organización Panamericana de la Salud realizó una
investigación en cuatro países entre los años 2005 y 2008 donde se constató
que la automedicación se encuentra entre el 35 y 40 %, dentro de este
porcentaje los antibióticos ocupan entre el 14 y 60 %. La prevalencia de
consumo de antibióticos fue del 15% en Paraguay, 17% en Honduras, 22% en Nicaragua y 27% en Perú”, estas cifras demuestran que el consumo existe, y
es bastante elevado. (8)
La resistencia a los antibióticos se produce cuando las bacterias mutan en
respuesta al uso irracional de los antibióticos, lo que incrementa los costos
médicos, que se prolonguen las estancias hospitalarias y que aumente la
mortalidad. (9)
El estudio científico de las plantas medicinales es una fuente relevante para el
descubrimiento de nuevos fármacos que luego se sintetizan, pero también
permite un conocimiento más profundo de los vegetales que conduce a que
muchos productos naturales sean reconocidos como fitofármacos, es decir,
compuestos que igualan el nivel de los fármacos de síntesis.(14) Actualmente,
uno de los problemas más comunes es que existen plantas medicinales que
tienen una actividad antimicrobiana conocida por la población, sin embargo no
han sido analizadas a fondo, para determinar cuáles son sus beneficios,
pasando muchas veces desapercibidas. (10)
Existe una gran variedad de plantas medicinales que crecen y son recolectadas
en Ecuador, entre ellas el toronjil, y que ha sido estudiada, encontrando que
4
antimicrobiana, sin embargo, no se le ha realizado un estudio profundo para
conocer las grandes propiedades curativas que posee frente a otros
microorganismos. (11)
Formulación del problema
¿Tiene efecto antimicrobiano “in vitro” el extracto hidroalcohólico de las hojas
de Melissa officinalis (Toronjil) en Proteus spp?
Delimitación del problema
Con la identificación de los metabolitos secundarios presentes en las hojas de
Melissa officinalis (Toronjil) se espera dar a conocer su actividad antimicrobiana frente a “Proteus spp” que no han sido estudiado en investigaciones anteriores
y de esta manera implementarla en la fitoterapia y terapia alternativa y por ende
en el sistema de salud, al ser vegetales útiles para la elaboración de
fitomedicamentos, permitiendo así descubrir nuevas alternativas terapéuticas.
Objeto de investigación Actividad antimicrobiana
Campo de acción
Extracto hidroalcohólico de las hojas de Melissa officinalis (Toronjil).
Línea de la investigación Estudios Microbiológicos.
Objetivo general
Evaluar la actividad antimicrobiana “in vitro” del extracto hidroalcohólico de las
hojas de Melissa officinalis (Toronjil) en Proteus spp.
Objetivos específicos
5
2. Obtener el extracto hidroalcohólico de las hojas de Melissa officinalis (Toronjil).
3. Determinar la composición fitoquímica del extracto hidroalcohólico.
4. Determinar el efecto antimicrobiano “in vitro” del extracto hidroalcohólico de las hojas a diferentes concentraciones en Proteus spp.
Idea a defender
El extracto hidroalcohólico de las hojas de Melissa officinalis (Toronjil) tiene efecto antimicrobiano “in vitro” en Proteus spp.
Justificación del tema
Las infecciones microbianas han marcado importantes períodos de la
historia humana, por su alta mortalidad; desde el punto de vista biológico las
bacterias y el ser humano son dos especies totalmente diferentes y por
ende siempre existirán interacciones no deseables entre los mismos; resulta
por tal motivo de gran importancia la investigación de nuevos fitofármacos
con características citostáticas o citotóxica que contribuyan a combatir a
determinados patógenos. (12)
La medicina tradicional como parte importante de la cultura de los pueblos, ha
sido durante siglos, el único sistema utilizado en la restauración de la
salud de las generaciones pasadas, donde las plantas medicinales han
cumplido un rol fundamental como medio para curar enfermedades en las
personas. Su uso no sólo está extendido entre los curanderos e indígenas,
sino también entre los habitantes de las grandes ciudades modernas del
país que aprecian sus propiedades curativas. En la actualidad muchos de
esos conocimientos se están perdiendo por la implementación de nuevas
tecnologías que facilitan la síntesis química de nuevos fármacos. (13)
En nuestro país las plantas son utilizadas en la medicina tradicional para el
tratamiento de diversas enfermedades. Las enfermedades infecciosas, la falta
de acceso a la atención médica y los antibióticos es un problema común, que
ha abierto las puertas al uso de las plantas medicinales como una alternativa.
6
Ecuador se han estado realizando estudios que evalúen estos aspectos, así
como la actividad microbiológica de las mismas. (14)
El propósito de la presente investigación es evaluar la actividad antimicrobiana
in vitro del extracto hidroalcohólico de las hojas de Melissa officinalis (Toronjil) en Proteus spp que no han sido estudiado en investigaciones anteriores. Ya que en la actualidad se está implementando la fitoterapia y terapia alternativa
en el sistema de salud, al ser vegetales útiles para la elaboración de
7
CAPITULO I. MARCO TEÓRICO
1.1 USO TRADICIONAL DE LAS PLANTAS MEDICINALES
El origen que se conoce de las plantas medicinales y que han formado parte
importante de la historia y de la cultura de los pueblos indígenas, se refiere a su
uso y aplicación como remedio de enfermedades, pues constituye un
conocimiento que se transmite de generación en generación. Algunas de las
ventajas que se tienen en utilizarlas son: se pueden conservar por mucho
tiempo y la variedad en las que se puede aplicar como productos en forma de
pomadas, jarabes, té, jabones, shampoo, entre otros. (15)
Según la OMS, una planta medicinal es definida como cualquier especie
vegetal que contiene sustancias que pueden ser empleadas para propósitos
terapéuticos o cuyos principios activos pueden servir de precursores para la
síntesis de nuevos fármacos. Se ha estimado que más del 80% de la
población mundial utiliza, rutinariamente, la medicina tradicional para satisfacer
sus necesidades de atención primaria en salud, y que gran parte de los
tratamientos tradicionales implica el uso de extractos de plantas o sus
principios activos. (16)
Para que una planta medicinal pueda considerarse tradicional, además de sus
elementos teórico-prácticos, debe cumplir con el requisito de tener arraigo
histórico, cultural y social, en el entramado de la tradición de un pueblo, así, la
medicina tradicional se define en concordancia con la tradición del pueblo que
la utilice. (17)
1.1.1 Estudios etnobotánicas y etnofarmacológicos.
La etnobotánica tiene como objetivo la búsqueda del conocimiento y rescate
del saber botánico tradicional, particularmente relacionado al uso de la flora, lo
que tiene real importancia; ya que un gran porcentaje de la población mundial,
en particular en países en desarrollo, emplean plantas para afrontar las
necesidades primarias de asistencia médica. (18)
Las plantas medicinales tienen una contribución importante en el sistema de
8
mayoría de poblaciones rurales. Ecuador por su alta diversidad biológica y
cultural se ha constituido en uno de los países con un gran potencial en lo
referente a la medicina tradicional, por lo que es importante establecer
diferentes aspectos de importancia, como las formas de uso de cada planta y
los beneficios curativos que brinda la medicina tradicional en las diferentes
comunidades del país. (19)
De esta manera la etnobotánica es una herramienta útil para el rescate del
conocimiento sobre el uso del recurso vegetal y es el campo científico que
estudia las interacciones que se establecen entre el hombre y las plantas a
través del tiempo y en diferentes ambientes. (18) (19)
La etnofarmacología, en cambio es el estudio de los sistemas tradicionales de medicina, la química y la farmacología que pueden explicar los procedimientos
tradicionales; y en el caso en que se estén estudiando drogas de origen vegetal
se analizan las sustancias que son responsables de la actividad biológica. En
otras palabras lo que hace la etnofarmacología es dar un sustento científico y
una explicación a los sistemas tradicionales de medicina. (20)
1.1.2 Valor del uso de las plantas medicinales.
El manejo tradicional de los recursos vegetales, ha originado un gran
conocimiento empírico, que ha permitido el descubrimiento de cualidades
comestibles, medicinales, tóxicas y religiosas en las plantas. La gente ha hecho
uso de las plantas a lo largo de toda su historia, generando conocimiento de la
flora en general, el cual ha aportado posibilidades diversas, para mantener y
mejorar las condiciones de vida de la sociedad. (21)
Actualmente, se han incorporado herramientas tanto cualitativas como
cuantitativas para recabar y analizar los datos que se obtienen en una
investigación etnobotánica; una de las más importantes es la entrevista. La
entrevista permite establecer un vínculo directo entre el investigador y el
informante, quien accede a compartir sus puntos de vista y sobre todo, los
conocimientos que han sido adquiridos de generación en generación acerca del
uso de las plantas para obtener un beneficio o bien, cómo han incorporado el uso
9
Para la determinación del uso de las plantas medicinales se utilizan dos
variantes:
1.1.2.1 Indice de valor de uso de las especies.- este valor expresa la importancia o valor cultural de una especie determinada para todos los
informantes entrevistados. (22)
Para estimar el valor de uso general de cada especie para todos los informantes
se utiliza la siguiente fórmula:
Donde:
UVis = número de usos mencionados por cada informante (i) para cada especie (s).
ns = número de informantes entrevistados.
1.1.2.2 Nivel de uso significativo (UST).- : Este índice expresa que los usos medicinales citados con una frecuencia superior o igual al 20%, por las personas
encuestadas que usan plantas como primer recurso para un determinado
problema de salud, pueden considerarse significativos desde el punto de vista de
su aceptación cultural. Por lo tanto merecen su evaluación y validación científica.
Se calcula con la siguiente ecuación. (22)
Dónde:
10
nis = número de informantes encuestados.
La relación valor de uso de las plantas,-saber tradicional indígena, hace parte de
ese complejo de relaciones ecosistema-cultura, que en este caso poseen gran
valoración ambiental y son a su vez fuentes valiosas que evidencian las
relaciones que han existido y continúan existiendo entre los lazos culturales y la
naturaleza, en donde la conservación de los elementos culturales dependen
directamente de la conservación de los elementos naturales, como las plantas
medicinales, mágicas, y viceversa. (23)
1.1.3 Principales Metabolitos Secundarios con Actividad Microbiana
Las plantas son fuentes de un gran número de productos metabólicos; los
metabolitos primarios que desempeñan un papel esencial en el metabolismo
básico de la planta son las proteínas, los acido nucleicos, hidratos de carbono,
lípidos. Por otro lado en la planta hay una gran cantidad de compuestos
orgánicos que no están implicados directamente en el desarrollo, denominados
metabolitos secundarios, su producción depende de los ciclos fundamentales de
la planta, es decir del metabolismo primario y están relacionados con sistemas
defensivos o de excresión, generalmente son responsables del olor, sabor, color
de la planta asi como de sus propiedades medicinales. (24)
Los metabolitos secundarios se sintetizan en pequeñas cantidades y su
producción esta restringida a un determinado género de plantas, a una familia e
incluso pueden presentarse en una especie o en especies a fines. (25) La
formación de estos productos comienza con la fotosíntesis a partir de
precursonas en determinadas rutas biosítenticas. (26) En elgráfico N. 1 se
observan las rutas metabólicas más comunes.
Los compuestos fitoquímicos antimicrobianos, son los siguientes:
a).- Fenoles y Polifenoles: El ácido cafeico y el cinámico son representantes de estos grupos, ambos con acción antimicrobiana, antiviral y
11
b). Quinonas: Son anillos aromáticos con dos sustituciones cetónicas. Se encuentran en amplia distribución en la naturaleza y son altamente reactivos
en reacciones de óxido-reducción. Producen radicales libres y generan
complejos irreversibles con aminoácidos nucleofílicos de las proteínas,
generando su inactivación. (26)
El rango de la actividad antimicrobiana de las quinonas es amplio, actuando
posiblemente sobre las adhesinas expuestas en la superficie de las bacterias,
sobre los polipéptidos de la pared celular y sobre las enzimas unidas a
membranas. Por ejemplo, una antraquinona proveniente de Cassia italica, un
árbol de Paquistán, tiene acción bacteriostática sobre Bacillus anthracis, Corynebacterium pseudodiphthericum y Pseudomonas aeruginosa, y tiene acción bactericida sobre Pseudomonas pseudomalliae. (27) (28)
c). Flavonas, flavonoides y flavonoles: Son estructuras fenólicas que contienen un solo grupo carbonilo. Estos compuestos son sintetizados por las
plantas en respuesta a la infección antimicrobiana, y su actividad sobre las
bacterias probablemente se deba a su capacidad de generar complejos con
proteínas extracelulares y proteínas solubles. Los flavonoides lipofílicos
pueden perturbar la integridad estructural de la membrana celular. (28)
d). Taninos: Conforman un grupo de sustancias capaces de precipitar gelatina en solución, una propiedad conocida como astringente. Están divididas en dos
grupos: hidrolizables y condensados. Los taninos hidrolizables están basados
en el ácido gálico, usualmente como ésteres múltiples con la D- glucosa,
mientras que los taninos condensados más importantes (a veces llamadas
proantocianidinas) son derivados de monómeros flavonoides. (27)
La actividad antimicrobiana de estos compuestos se debe a su interacción
sobre las proteínas de la pared celular, y a su capacidad de unirse a
polisacáridos. (27)
e). Cumarinas: Son compuestos de los cuales se ha visto que tiene acción antiviral, y actividad antimicrobiana sobre Candida albicans.. (37)
12
activos contra bacterias, virus, hongos y protozoarios. Se ha reportado que los
terpenoides actúan contra Listeria monocytogenes. Se cree que esta actividad
antimicrobiana se debe a una perturbación de la estructura de la membrana
celular por su naturaleza lipofílica. La capsaicina tiene actividad bactericida
sobre Helicobacter pylori. (28)
El ácido betulínico es un triterpenoide que muestra actividad inhibitoria del
virus VIH. El petalostemumol presenta una actividad excelente contra Bacillus
subtilis y Staphylococcus aureus, aunque tiene una menor actividad sobre bacterias Gram negativas y Candida albicans. Por otro lado, los terpenos previenen la formación de úlceras gástricas y disminuyen la severidad de las
úlceras existentes, aunque no se sabe a ciencia cierta si esta actividad se
debe o no a su acción antimicrobiana (38).
g). Alcaloides: Los Glicoalcaloides de especies de Solanum podrían ser útiles contra la infección por VIH y también contra las infecciones intestinales
relacionadas con el SIDA. Otros alcaloides tienen efecto contra parásitos como
Giardia y Entamoeba. La berberina es un alcaloide representativo por su actividad potencialmente efectiva contra Tripanosoma y Plasmodium. Se ha descrito que tiene actividad microbiana (por ejemplo, sobre Giardia y Entamoeba),. (27) (28)
h. Lectinas y Polipéptidos: Su mecanismo de acción principalmente se explica como la formación de canales iónicos en la membrana del
microorganismo o la inhibición competitiva de la adhesión de proteínas a los
receptores polisacáridos del hospedero. (29)
Un reciente interés se ha enfocado en estudiar la actividad anti–VIH de
péptidos y lectinas. Las tioninas son péptidos tóxicos para levaduras y
bacterias Gram positivas y Gram negativas, como por ejemplo las Fabatinas
13
Fuente: DewiNn 2001
Gráfico N.1 Vías biosinteticas de obtención de los meatbolitos secundarios 1.2 Melissa officinalis (Toronjil)
1.2.1 Origen y distribución geográfica
Melissa officinalis es originaria de la cuenca del mar Mediterráneo. Difundida por el cultivo, se ha naturalizado en toda la Europa templada. Crece de forma
silvestre en prados húmedos, claros de bosque, a la vera de los ríos o en setos
14
Requiere suelos arenosos, bien drenados, y no es exigente en materia de sol.
Salvo en climas cálidos, pierde el ramaje en invierno, volviendo a brotar a
comienzos de primavera. (30)
1.2.2 Descripción botánica
Melissa officinalis es una hierba perenne, hemicriptófita:
Los tallos; herbáceos rastreros, ligeramente lignificados en la base, de sección
cuadrangular y hasta casi 1 metro de altura. (30)
Presenta hojas opuestas, claramente pecioladas, de hasta 9 × 7 cm, con el
limbo ovado y el margen dentado, de color verde intenso, con la superficie
pilosa. (30)
En verano florece, dando lugar a flores primeras, pedunculadas, dispuestas en
verticilastros, con el cáliz de hasta 1,2 cm, bilabiado, tubular, y la corola
blanquecina, también en tubo abierto con dos labios cortos. Los estambres son
cuatro, didínamos, fusionados con la corola. El ovario es súpero. Son ricas en
néctar, atrayendo polinizadores himenópteros, a lo que deben su nombre (melissa significa “abeja melífera” en griego). El fruto es una legumbre
tetraseminada. (31)
Fuente: DewiNn 2001
15
1.2.3 Clasificación científica
Nombre común: toronjil, melisa u hoja de limón Nombre Científico: Melissa officinalis
Familia: Lamiáceas, Género: Melissa Especie: M. offinalis Clase: Magnoliopsida
Nombres Comunes: abejera, abeyera, albedarumbre, apiastro, bedaranji, cidronela, citraria, hierba cidra, hierba huerto, hierba limonera, hierba luna, hoja
de limón, limoncillo, limonera, limonera borde, melisa, melisa oficional, te de
calzo, toronjil, toronjilla, torongina, hierba cidrera. (32)
1.2.4 Composición química
El aceite volátil (0,1-0,2%) de la planta se compone principalmente de neral y
geranial, junto con pequeñas cantidades de terpenos y óxido de cariofileno. La
planta también contiene flavonoides, incluyendo cimarósido, cosmosiina,
ramnocitrina e isoquecitrina, ácidos triterpénicos, incluyendo ácido ursólico,
ácido rosmarico y glucósidos de los componentes fenólicos o alcohólicos. (32)
La melisa es rica en derivados polifenólicos, lo que le confiere una alta
capacidad antioxidante. La concentración de derivados polifenólicos alcanza el
9% de la planta, expresado en ácido caféico. Se han identificado6 compuestos
polifenólicos:los ácidos caftárico, cafeíco, p-curarínico y ferúlico, ademas de
luteolina y apigenina. (33)
La concentración de flavonoides alcanza, según algunos estudios publicados el
0,64 %. El flavonoide de mayor concentración es el
luteolin-3'-O-beta-glucorónido. (33)
16
El toronjil se puede usar de distintas maneras, pero dependiendo de lo que se
quiera tratar, su manera de preparación cambia.
Infusiones: Una de las maneras más comunes de consumir el toronjil es mediante infusiones. La manera de prepararlo. es colocar una parte de la
planta en una taza de agua hirviendo, dejar reposar por 10 minutos. Tomado de
esta manera se podrá calmar la ansiedad y el malestar estomacal. Se la toma
dos veces al día por un tiempo de 5 días. (34)
Agua del carmen: El Agua del Carmen es una preparación usada para calmar los nervios y algunos males estomacales. Se debe macerar 200 gramos de
toronjil junto a cinco ramas de canela, una cascara de limón y 10 gramos de
nuez moscada, en un litro de alcohol, vino o pisco, por un lapso de dos
semanas, removiendo cada tres días, posterior se procede a filtrar la mezcla
que ya está lista para ser usada. Se recomienda tomar una cucharada pequeña
al día para los adultos. (34)
Aceite esencial de toronjil: Un producto ya más elaborado es el aceite esencial de toronjil, el cual es usado principalmente con fines de aromaterapia.
Se puede usar también para calmar dolores de cabeza aplicando unas gotas
de este aceite diluidas en agua, en las sienes mediante un suave masaje
circular para ir a descansar. (34)
Condimento: El toronjil también se puede emplear en la cocina para darle un sabor diferente a las comidas. Se puede usar las hojas frescas del toronjil para
acompañar algunas carnes rojas y darles un sabor y aroma especial. Las hojas
pueden formar parte de una ensalada de verduras frescas. Las hojas secas
molidas al igual que el orégano, para darle un olor particular a los platos de
comida. (34)
1.2.6 Usos en Medicina Tradicional
Analgésico: Una de las más grandes propiedades del toronjil es su poder analgésico. El cual le permite calmar cierto tipo de dolores, tanto estomacales
como musculares o de cabeza. Esto se debe a su alto contenido en eugenol,
17
impidiendo que se conduzca el impulso nervioso del dolor a ciertos tejidos del
cuerpo. Asimismo, a este se le suma la acción del timol y otros compuestos
como el ácido ursólico, clorogénico y cafeíco. (35)
Digestivo: El toronjil tiene compuestos que lo vuelven un gran antiespasmódico. Esta propiedad no solo actúa en los músculos externos, sino
también en los del estómago, ayudando a reducir los espasmos estomacales.
De esta manera ayuda considerablemente a relajar el aparato digestivo
ayudando a una mejor digestión. (36)
Sedante: Gracias a su alto contenido en antioxidantes fenólicos y ácido rosmarínico, el toronjil constituye un gran calmante, por los compuestos
químicos ya que son capaces de inhibir la enzima encargada de la degradación
del ácido gamma-aminobutírico (GABA). El GABA es el principal
neurotransmisor inhibidor del sistema nervioso, por lo que al evitar que se
degrade, se impide con mayor facilidad la actividad en el cerebro. De esta
manera ayuda al tratamiento de problemas como la ansiedad, depresión y
nerviosismo, entre otros. Asimismo, el toronjil tiene la propiedad de calmar el
músculo cardiaco, restableciendo el ritmo cardíaco, contribuyendo así a la
calma del individuo. (37)
Favorece la secreción de bilis: El toronjil es capaz de incrementar la secreción de bilis en el hígado y la vesícula biliar. De esta manera sirve como
tratamiento para quienes sufren de insuficiencia biliar. Asimismo, la mayor
producción de bilis favorece a la digestión y al adelgazamiento. (38)
1.2.6.1 Advertencia y Contraindicaciones
Las mujeres embarazadas o madres lactantes deben controlar la ingesta de
toronjil. Consumido de manera natural no presenta ningún riesgo para la salud.
Es muy beneficios; no obstante, se debe tener cuidado con otras
presentaciones en las que se puede consumir. El aceite esencial de toronjil, su
estado puro puede resultar muy tóxico. Se recomienda no ingerirlo y solo usarlo
de manera externa, ya que debido a sus componentes puede ser usado como
18
1.2.7 Actividad Biológica de Melissa officinalis L (toronjil)
Un estudio publicado en la “Revista Ciencia UNEMI”, se describe el “Análisis
del efecto antimicrobiano de plantas medicinales de algunas especies vegetales de uso ancestral en Ecuador”; entre ellas Melissa officinalis L (toronjil), la misma que fue recolectada en las localidades de Machala y Santa
Rosa, en el mes de Septiembre del 2016. (40)
La parte utilizada fueron las hojas, para determinar la actividad antimicrobiana
de los extractos metanólicos obtenidos, se utilizó la técnica de difusión en agar,
mediante la cual éstos se probaron frente a cepas de bacterias Gram positiva
(Staphyloccocus aureus) y Gram negativa (Escherichia coli y P. aeruginosa), y
una cepa del hongo (Candida albicans).
Los metabolitos secundarios (principios activos), que se encontraron en
Melissa officinalis fueron: glicósidos cardiotónicos, cumarinas y metilencetonas, esteroles y triterpenos y mucilagos, esteroles y triterpenos, fenilpropanoides,
catequinas y mucilagos. Compuestos orgánicos: taninos, compuestos fenólicos,
flavonoides, glicósidos, alcaloides y esteroides. (40)
1.3 Caracterización fitoquímica de los extractos de platas medicinales Los extractos vegetales se han definido como un concentrado obtenido por
tratamiento de productos vegetales con solventes apropiados, tales como agua,
etanol o éter, de elementos solubles, constituidos por una mezcla de principios
activos y sustancias inertes que se producen de la totalidad o de partes de una
planta fresca o seca. (41)
Para la obtención del extracto se sigue minuciosamente los siguientes pasos:
a).-Recolección del material vegetal
Durante la recolección del material se debe tener en cuenta:
Que la planta recolectada no tenga infecciones microbianas dado que las mismas pueden inducir cambios en los metabolitos producidos por la
19
Recolectarse en lugares alejados de fuentes de contaminación o fumigadas con compuestos químicos.
Asegurarse de que se trata de la especie con la que se va a trabajar. (41)
b).- Muestreo
El objetivo es obtener una muestra representativa, para realizar el análisis y
determinar los niveles de los diversos componentes de la materia vegetal,
como minerales, macro y micronutrientes, en los vegetales. (41)
c).- Fragmentación
Proceso mecánico donde se reducen sustancias sólidas a porciones menores o
partículas. El objetivo es aumentar la superficie de contacto de un solvente
adecuado con el material a extraer para facilitar la mejor y mayor disolución de
principios activos. (41)
d).- Transporte y conservación
La muestra se mantendrá en las condiciones más parecidas a las de campo.
Pueden ser refrigeradas, conservadas en bolsas de papel o de plástico, pero
en estas el tiempo de permanencia ha de ser el mínimo posible, ya que las
reacciones enzimáticas pueden llevar a cambios en la estructura química. (41)
e).- Limpieza y descontaminación
Es necesaria para eliminar sustancias del tejido foliar que está cubierto de
polvo o de materiales de fumigación. Se utiliza solución de hipoclorito de sodio
a 10 ppm/ o 2 gotas de cualquier hipoclorito por cada litro de agua. No maltratar
a la planta durante este proceso. (41)
1.3.1 Extracción
Antes de empezar un proceso extractivo en una escala piloto o industrial, se
debe definir la selectividad del solvente a ser usado en el proceso.
Dependiendo del propósito al que se destine se puede obtener un extracto
20
químicos de la planta o un extracto que contiene solamente constituyentes
químicos con una determinada característica. (42)
En el primer caso, normalmente se usa un solvente de naturaleza general, de
alta polaridad, como el alcohol etílico o el metanol. En el segundo caso se
emplea un solvente selectivo de menor polaridad, como el hexano que solo
extrae de la planta las grasas vegetales y otros componentes apolares. (43)
La selección del solvente de extracción, así como la composición química de la
materia vegetal, representan dos aspectos de suma importancia en cualquier
proceso de fabricación, bien sea de productos fitoterapéuticos o bien sea de
sustancias naturales aisladas. (43)
1.3.2 Tipos de Extracción más utilizados para plantas medicinales 1.3.2.1 Maceración
Es un proceso que consiste en poner en contacto la droga y el solvente,
durante varios días que da como resultado un equilibrio de concentración entre
la droga y el solvente, depende de factores que estén unidos a la droga, como
por ejemplo, su naturaleza, el tamaño de partícula, su contenido de humedad y
cantidad y factores que están relacionados con el solvente como la selectividad
y la cantidad. (44)
1.3.2.2 Percolación o lixiviación
Consiste en hacer pasar el solvente a través de la droga, hasta su extracción
exhaustiva completa. La percolación simple, comprende la extracción
exhaustiva de la droga con el solvente siempre renovado, de modo continuo
manteniéndose un gradiente de concentración, el disolvente puro desplaza al
que contiene la sustancia extraída sin ser necesario aplicar presión. La droga
residual es prensada y el fluido obtenido es combinado con el percolado para
concentrar el extracto. (44)
21
De acuerdo con este aspecto comúnmente los extractos se clasifican en cuatro
grupos: blandos, firmes, secos y fluidos. (44)
1.3.3.1 Extractos blandos
Tienen la consistencia semisólida, algunas veces, debido a la absorción de la
humedad atmosférica, presentan una consistencia semilíquida. (44)
1.3.3.2 Extractos firmes
Como su nombre lo indica deben tener una estrecha semejanza con la masa
con la cual se fabrican o manufacturan las píldoras, deben tener la
característica especial de no adherirse a los dedos. (45)
1.3.3.3 Extractos secos
Son extractos en los cuales el disolvente ha sido casi completamente
eliminado. Contiene tan solo del 5 al 8% de agua. Se reducen fácilmente a
polvo y facilitan su manipulación y dosificación. (45)
1.3.3.4 Extractos fluidos
Los extractos fluidos son preparaciones líquidas tal que una parte por masa o
volumen es equivalente a una parte por masa o droga vegetal o tejido animal
seco.
Estas preparaciones son ajustadas, si fuera necesario, de manera tal que
satisfagan los requerimientos para el contenido de solvente y donde sea
aplicable, de constituyentes. (46)
1.3.4 Tamizaje fitoquímico
Se basa en pruebas preliminares sencillas y rápidas que permiten detectar
cualitativamente la presencia de determinados grupos de compuestos. Se
ayudan de la micro química para evidenciar estos grupos de constituyentes
22
Estas reacciones se caracterizan por ser selectivas para las clases o grupos de
compuestos que se investigan, son simples y rápidas, detectan la mínima
cantidad posible de metabolitos presentes en el extracto vegetal. (48)
Comprende los siguientes ensayos:
1.3.5 Ensayos para determinar los diferentes grupos de metabolitos presentes en el extracto vegetal.
1.3.5.1 Ensayo de Dragendorff, Wagner y Mayer
Permiten identificar alcaloides, en el caso de alcaloides cuaternarios y/o
aminoácidos libres, estos sólo se encontrarán en el extracto acuoso y para
considerar su presencia debe observarse la aparición de turbidez definida o
precipitado en todos los casos, ya que la aparición de opalescencia puede dar
un resultado falso, pues puede provenir de una extracción incompleta de bases
primarias, secundarias o terciarias. (49)
1.3.5.2 Ensayo de Lieberman-Buchard
Permite reconocer en un extracto la presencia de triterpenos y/o esteroide,
ambos tipos de productos deben poseer un núcleo de androstrano,
generalmente insaturado en el anillo B y la posición 5-6.
Utilizada también para diferenciar las estructuras esteroles de esteroidales, las
primeras producen coloraciones azul o azul verdoso, mientras que para las
segundas se observa rojo, rosado o púrpura.
Estas coloraciones pueden variar por interferencias producidas por carotenos,
xantofilas y esteroides saturados que puedan estar presentes. (49)
1.3.5.3 Ensayo de Borntrager
Es útil para detectar la presencia de quinonas. Si la fase acuosa alcalina se
colorea de rosado a rojo, el ensayo se considera positivo. (49)
23
La aparición de una mancha verde carmelita a la luz UV, indica positiva la
prueba, al reaccionar con el 4 etilamino. (50)
1.3.5.5 Ensayo de Espuma
Permite reconocer en un extracto la presencia de saponinas, tanto del tipo
esteroidal como triterpérnica. El ensayo se considera positivo si aparece
espuma en la superficie del líquido de más de 2 mm de altura y es persistente
por más de 2 minutos. (50)
1.3.5.6 Ensayo de Benedict
Permite reconocer la presencia de compuestos fenólicos y/o taninos de un
extracto vegetal. (50)
1.3.5.7 Ensayo de Shinoda
Permite reconocer la presencia de flavonoides en el extracto de un vegetal. El
ensayo se considera positivo, cuando el alcohol amílico se colorea de amarillo,
naranja, carmelita o rojo; intenso en todos los casos. (50)
1.3.5.8 Fehling
Permite reconocer en los extractos la presencia de azúcares reductores. El
ensayo se considera positivo si la solución se colorea de rojo o aparece
precipitado rojo. (50)
1.4 Actividad Antimicrobiana y Resistencia Bacteriana 1.4.1. Definición
La actividad antibacteriana se define como, la habilidad especifica o capacidad
de una sustancia de lograr su efecto planeado; se basa en la medición de su
efecto inhibitorio frente a un determinado microorganismo (halo de inhibición)
que se determina por el método analítico más adecuado, normalmente
métodos de análisis microbiológicos.
Los productos naturales tales como los extractos de plantas y/o sus
24
nuevas drogas que puedan ser utilizadas para el control microbiano. Existen
pruebas estandarizadas in vitro conocidas como bioensayos de suceptibilidad antimicrobiana, las cuales son técnicas escenciales en la búsqueda de
actividades biólogicas de nuevos compuestos naturales. (51)
1.4.2. Sustancia antimicrobiana
Se define como aquella sustancia producida natural o sintéticamente, para
inhibir la supervivencia de microorganismos.(51)
1.4.3 Resistencia Bacteriana
Es la capacidad mecánica que la bacteria tiene para poder reducir o inactivar
los efectos de los agentes antimicrobianos, los cuales pueden ser, de forma
natural cuando es una propiedad específica de alguna bacteria o adquirida
cuando la bacteria logra un plásmido de resistencia por una mutación
cromosómica específicamente en un fragmento extracromosómico de ADN
portador de genes que modifican la resistencia al antibiótico. Este efecto
colateral es debido al mal uso o abuso de los antibióticos y las bacterias se
vuelven resistentes a sus efectos. (52)
La resistencia a antibióticos ocurre por uno de cuatro posibles mecanismos:
• Alteración de la ruta metabólica inhibida por el antibiótico. • La inactivación o modificación del medicamento.
• Alteración del sitio diana del antibiótico.
• Producción de mecanismos que diluyen o reducen la acumulación del
antibiótico.
El uso inadecuado de los antibióticos es uno de los factores más importantes
por los que se ha llegado a la alarmante situación actual: empleo de
antibióticos sin prescripción médica, tiempo inapropiado de consumo,
incumplimiento de los horarios de administración e infra dosificación. Por otro
lado, muchos de nuestros médicos los prescriben innecesariamente,
especialmente en patologías de vía aérea superior, de etiología viral en la
25
consumo de antibióticos, los cuadros de vía aérea superior son las patologías
en las que se emplean antibióticos innecesarios con mayor frecuencia.(53)
Otro punto muy preocupante en nuestro país es la deficiencia de programas de
prevención y control de infecciones, fundamentalmente de las de origen
nosocomial. En los centros hospitalarios, especialmente en los públicos es
fundamental concientizar sobre la importancia y también vigilar el cumplimiento
de una medida simple, fácil y barata, el lavado frecuente de manos, que puede
reducir en gran medida la frecuencia de infecciones hospitalarias, y así
contribuir a disminuir el uso de antibióticos en los hospitales. (53)
El incremento de la resistencia bacteriana por la presión selectiva que
representa la utilización de antibióticos a gran escala, sobre todo en nuestros
hospitales, ha permitido la diseminación de cepas con mecanismos de
resistencia que, en muchas ocasiones, nos dejan prácticamente sin alternativas
para el tratamiento de las infecciones bacterianas. La resistencia a los
antimicrobianos reduce las posibilidades de tratamiento eficaz de
enfermedades, prolonga el tiempo de agonía de los enfermos y los obliga a
utilizar medicamentos costosos, además de alargar el tiempo de hospitalización
y aumentar el riesgo de mortalidad. (54)
1.5 Métodos para evaluar la actividad antimicrobiana
Los métodos más utilizados para determinar la sensibilidad de una bacteria,
con agentes microbianos son la difusión en agar y la dilución en caldo o agar.
La evaluación de esta sensibilidad servirá para la selección del compuesto más
adecuado en el tratamiento de una determinada infección bacteriana. (55)
1.5.1 Método de difusión en agar
Se fundamenta en lo siguiente: el medio de cultivo se siembra con la
correspondiente cepa microbiana de ensayo mediante vertido en cajas, sobre
el medio de cultivo, en puntos adecuadamente distanciados entre sí, se
colocan cantidades definidas del antibiótico a ensayar y del antibiótico estándar
26
Se caracteriza por ser fácilmente estandarizable y estar indicado para
microorganismos no exigentes de crecimiento rápido.
1.5.1.1.1 Método de dilución en caldo o agar
Consiste en exponer a las cepas a estudiar a diferentes concentraciones de
antimicrobiano, y observar el crecimiento de los microorganismos para luego
definir la concentración mínima inhibitoria (CIM). (56)
Se realiza para sustancias antimicrobianas que se evalúen con
microorganismos de rápido crecimiento, se mide la turbidez del caldo de cultivo
por medio del método espectrofotométrico o colorimétricos, se realiza una
curva de cantidad de microorganismos que ha crecido, contra las
concentraciones de las respectivas diluciones de antibiótico.(57)
1.5.2 Factores que influyen en la actividad antimicrobiana
Las variables de mayor importancia se deben considerar, para evitar las
posibles variaciones en los resultados esperados.
1.5.2.1.1 Profundidad del agar
Se debe procurar estandarizar el volumen medido de agar fundido antes de
depositarlo en las cajas, dado que existe una relación inversamente
proporcional entre el diámetro del halo formado y el grosor de la placa de agar
solidificado ya que la profundidad de la capa de agar afecta los resultados. (58)
1.5.2.1.2 Concentración del inóculo
Variable importante, con capacidad de modificar la respuesta (halo de
inhibición), es la concentración de suspensión del microorganismo
seleccionado (inoculo). La magnitud del diámetro del halo que se obtiene es
inversamente proporcional a la concentración del inoculo con las demás
concentraciones constantes. (58)
1.5.2.1.3 Temperatura de incubación
27
adecuada para el microorganismo inoculado, de esta forma, se incuba el
microorganismo a su temperatura óptima de crecimiento para que sea la
sustancia antimicrobiana (antibiótico) quien ejerza su efecto inhibidor del
crecimiento. La uniformidad de la temperatura de incubación es indispensable.
(58)
1.5.2.1.4 Naturaleza del borde del halo de inhibición
Las pruebas de difusión en gel para determinar la actividad inhibitoria de un
antibiótico, depende de los halos de inhibición medidos, se deben determinar de
tal modo que el valor tomado, sea lo más aproximado posible al borde real del
halo. En la práctica se observan diferentes halos con bordes difusos, indefinidos,
dobles, difíciles de medir; esto se debe a que el organismo inoculado en el medio
de agar se enfrenta a un gradiente de concentración del antibiótico. (59)
1.5.2.1.5 Composición química del medio de agar
Es necesario buscar un medio que llene los requerimientos nutricionales del
modelo microbiológico seleccionado, del tal modo que ofrezca las condiciones
óptimas para su crecimiento. (59)
En el medio seleccionado; se debe de verificar el contenido de ciertas
sustancias, especialmente electrolitos, que pueden afectar la difusión de la
sustancia antimicrobiana cuando ésta sufre algún tipo de interacción por
cargas, lo que finalmente obstaculiza el efecto inhibitorio del antibiótico frente al
microorganismo ya que el mismo no difunde libremente a través del centro del
líquido por sus repulsiones de naturaleza. (60)
1.5.2.1.6 Tiempo de incubación
El halo de inhibición formado, depende del tiempo de incubación, se debe tener
un tiempo de lectura fijo, para evitar errores en las determinaciones de los
diámetros de los halos formados, ya que después de pasado el tiempo
adecuado de lectura se presentan problemas como sobrecrecimiento. (60)
28
El volumen de la concentración del antibiótico a utilizar en el pozuelo debe ser
siempre el mismo, para que actúe como un reservorio de concentración
constante. Se emplean volúmenes estándar, normalmente se aplica en cada
reservorio un volumen de 100 µl, de las diferentes concentraciones de las
diluciones del antibiótico. (61)
1.5.3 Medios de Cultivo
Uno de los sistemas más importantes para la identificación de microorganismos
es observar su crecimiento en sustancias alimenticias artificiales preparadas en
el laboratorio. El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es
el Medio de Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo.
Para que las bacterias crezcan adecuadamente en un medio de cultivo artificial
debe de reunir una serie de condiciones como son: temperatura, grado de
humedad y presión de oxigeno adecuada, así como un grado correcto de
acidez o alcalinidad. Un medio de cultivo debe contener los nutrientes y
factores de crecimiento necesarios y debe estar excento de todo
microorganismo contaminante. (62)
1.5.3.1.1 Mueller Hinton
Se emplea para ensayos de sensibilidad de los microorganismos frente a
antibióticos y sulfonamidas. También para aislamiento primario de Gonococos y
Meningococos.
Mueller y Hinton tomaron como punto de partida de sus estudios el medio de
Gordon y Hine con el fin de encontrar un medio de capaz de resistir el
autoclavado. El primer paso fue sustituir la harina por el almidón que a su vez
protegía el medio de las toxinas que puedan estar presentes. Después
sustituyeron la peptona de carne por la de caseína hidrolizada, que por ser más
fragmentada favorecía más los crecimientos. Finalmente ha sido reconocido
como el más indicado para los ensayos de sensibilidad a antibióticos y
sulfamidas por el procedimiento de los discos. (63)
29
El agar de Papa Dextrosa es un medio comúnmente utilizado para cultivar
hongos y levaduras; a este medio se le puede añadir antibióticos para evitar el
crecimiento de bacterias. El PDA es utilizado por varios investigadores para el
aislamiento de especie Fusarium. (63)
1.5.4 Cepas
Son microorganismos del tipo fenotípico que representan una proporción
derivada de un organismo mayor, como una muestra de estudio. Contienen
información biológica que es de interés científico. Obtenidas por lo general a
través del procedimiento de la clonación. (64)
1.5.4.1 Escherichia coli
Es una de las especies bacterianas más minuciosamente estudiadas y no
solamente por sus capacidades patogénicas sino también como sustrato y
modelo de investigaciones metabólicas, genéticas, poblacionales y de diversa
índole (Neidhardt, 1999). E. coli puede ser causa de una enfermedad endógena en pacientes debilitados o en situación de alteración de la pared
intestinal como peritonitis, sepsis entre otras, pero las infecciones entéricas
provocadas por este germen no son causadas por las cepas que habitan
normalmente en el intestino, sino por las líneas especialmente patógenas en
esta localización. (64)
1.5.4.2 Pseudomonas aeruginosa
Es el principal patógeno de la familia Pseudomonadaceae y se identifica por
ser un bacilo gramnegativo ligeramente curvado que crece mejor en aerobiosis
es muy versátil nutritivamente y no fermenta hidratos de Carbono pero
produce ácido a partir de azúcares como la glucosa, fructosa y lactosa o
sacarosa. (65)
En relación a la morfología de las colonias puede ser variada y generalmente
pigmentadas se encuentran las típicas colonias que se extienden en la placa
con un brillo metálico y con un aspecto gelatinoso, viscoso especialmente en
30
coliforme y muciode frecuentes de observar en las vías respiratorias y en
pacientes con fibrosis quística. (66)
1.5.4.3 Candida albicans
Es un microorganismo muy versátil por su capacidad para sobrevivir como
comensal en varios sitios anatómicamente distintos como el intestino, cavidad
oral y vagina, y puede causar la enfermedad cuando se le presenta la
oportunidad. (65)
Candida albicans tiene varios atributos de virulencia para colonizar el huésped
y ocasiona daño de forma directa, al activar, resistir o desviar los mecanismos
de defensa del mismo. Los factores de virulencia expresados o requeridos por
el microorganismo para causar infección pueden variar según el tipo, el sitio y
la naturaleza de las defensas del huésped. (65)
1.5.4.4 Staphylococcus aureus
Es la especie más patógena y virulenta para el hombre, pero también puede
encontrarse colonizando la piel y las mucosas. Las colonias de S. aureus presentan un color amarillo dorado característico debido a la producción de
carotenoides durante su crecimiento; sin embargo muchas cepas presentan
variantes no pigmentadas S. aureus crece bien a altas concentraciones de NaCl, es coagulasa, DNAsa y catalasa positivo y fermenta el manitol, lo que
permite diferenciarlo del resto de especies del género Staphylococcus.(66).
La infección por S. auerus se produce tras lesiones cutáneas, traumáticas o
quirúrgicas que favorecen la penetración del microorganismo desde la piel
hasta los tejidos profundos. Desde estos puntos puede producir bacteriemia y
cuadros metastásicos. Las infecciones causadas por S. aureus generalmente
