FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS, FÍSICAS Y NATURALES
UNIVERSIDAD NACIONAL DE CÓRDOBA
TESIS DE DOCTORADO EN CIENCIAS BIOLÓGICAS
Análisis funcional
in situ
de módulos polarizadores proteicos
durante el desarrollo neuronal
In situ functional analysis of multiprotein polarity modules in neuronal development.
Tesista: Biólogo Iván Mestres Lascano
Dirección: Dr. Alfredo Cáceres
Co-Dirección: Dra. Cecilia Conde
Lugar de Trabajo: Instituto de Investigaciones Médicas Mercedes y Martín Ferreyra – INIMEC-CONICET – Universidad Nacional de Córdoba
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COMISION ASESORA
Dr. Guillermo Lanuza. Fundación Instituto Leloir, Buenos Aires.
Dr. Daniel Mascó. Instituto de Investigaciones Biológicas y Tecnológicas, UNC.
Dr. Alfredo Cáceres. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra, Córdoba.
Dra. Cecilia Conde. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra, Córdoba.
DEFENSA ORAL Y PUBLICA
Lugar y fecha:
Calificación:
TRIBUNAL
Firma: ……….. Aclaración: ……….
Firma: ……….. Aclaración: ……….
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INDICE
AGRADECIMIENTOS ... 5
DEDICATORIA ... 6
RESUMEN ... 7
SUMMARY ... 9
ABREVIATURAS ... 11
INTRODUCCION ... 13
Polaridad neuronal in vivo vs. in vitro ... 13
La vía secretoria ... 18
El sistema endosomal ... 23
OBJETIVOS ... 29
Objetivos específicos ... 30
MATERIALES Y METODOS ... 32
Animales ... 32
Plásmidos ... 33
Anticuerpos ... 36
Electroporación in utero... 37
Electroporación ex vivo ... 39
Inmunohistoquímica ... 40
Microscopía ... 40
Estadística ... 41
RESULTADOS ... 42
Capítulo UNO – PDK1 & BARS... 42
Sección I - PKD1 ... 42
Sección II – BARS ... 49
Sección III – Actividad de PKD1 y BARS a nivel del aparato de Golgi ... 53
4 DISCUSION ... 76
CONCLUSIONES ... 90
5
AGRADECIMIENTOS
Mi sincero y profundo agradecimiento a mi Director y Co-Directora de Tesis, Dres. Alfredo Cáceres y Cecilia Conde; quienes aportaron experiencia, fundamentos, conceptos, materiales y equipamiento; entre innumerables recursos materiales o intangibles que se volcaron en este trabajo. Su tiempo y dedicación moldearon mi formación académica y científica.
A los miembros de la Comisión Asesora de Tesis, Dres. Lanuza y Mascó; quienes fueron corrigiendo y contribuyendo a este trabajo en todas sus etapas. Junto al Dr. Casale, conforman el Tribunal Evaluador de Tesis; a los que agradezco el tiempo y las recomendaciones que ayudaron a terminar este trabajo.
Al Instituto Ferreyra, sus autoridades y personal; por abrirme las puertas y estar siempre predispuestos. A CONICET, por su apoyo estos años. Al Doctorado en Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Córdoba, sus autoridades y personal; por la dedicación y calidad.
Al personal del Bioterio, que en todo momento garantizaron asesoramiento y bienestar de los animales empleados. Al personal del Centro de Microscopia, por su experiencia y diligencia.
A mis compañeros de trabajo de los laboratorios de los Dres. Cáceres y Conde, que me enseñaron y guiaron día a día: Cristina, Gimena, Gonzalo, Ignacio, José, Laura, Mariano, Mónica.
A todos los miembros de los laboratorios de los Dres. Abate, Bollo, Cambiaso, Carrer, Diaz-Añel, Helguera, López, Lorenzo, Molina, Paglini, Pautassi, Quiroga, Ropolo, Touz, Vivas; quienes siempre estuvieron predispuestos a compartir su experiencia o algún reactivo.
A todo el equipo del laboratorio de la Dra. Ching-Hwa Sung, con quienes aprendí y crecí mucho.
A mis amigos, todos. Con su entusiasmo y contención, la vida se completa aún más.
6 Dedicado a mi Mamá, a mi Papá y a Leo,
quienes me brindaron todo lo necesario
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RESUMEN
Durante el desarrollo embrionario de la corteza cerebral las neuronas deben migrar desde su posición de origen en la zona ventricular hacia su posición final en la placa cortical, de acuerdo a un patrón de adentro hacia afuera. Durante la migración neuronal, el proceso conductor de estas células evalúa el ambiente local en búsqueda de señales quimiotácticas que le guíen hacia su capa adecuada. Al mismo tiempo, las neuronas establecen contacto con la matriz extracelular y células vecinas a través de proteínas de adhesión. Estos contactos adhesivos proveen de la tensión mecánica necesaria para mantener la forma y motilidad celular. Se ha establecido claramente que estas células altamente polarizadas, necesitan reajustar permanentemente los niveles de expresión de una variedad de receptores y proteínas de adhesión celular en su membrana para poder acoplar su programa de desarrollo con el tejido circundante.
8 conductor, a través de n-cofilina. Por otra parte, la supresión de SARA in vitro
aumenta los niveles de L1-CAM en la superficie celular. Lo mismo parece ser el caso in vivo, ya que la sobre-expresión de L1-CAM resulta en los mismos fenotipos causados por el silenciamiento de SARA. A su vez, lo contrario también resultó ser cierto: la disminución conjunta de la expresión de SARA y L1-CAM rescata la migración y orientación neuronal, a los niveles del control.
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SUMMARY
During embryonic corticogenesis neurons migrate from their place of origin at the ventricular zone to their final position in the cortical plate according to a birth-regulated inside-out pattern. To this purpose, neuron’s leading process senses its local environment for instructive chemotactic cues that help guiding these cells to reach their appropriate layer. Simultaneously, neurons establish contacts with the extracellular matrix and neighboring cells by means of adhesive proteins. Adhesive contacts provide neurons with the mechanical tension needed to maintain cell shape and motility. It is well established that these highly polarized cells need to continuously adjust the expression levels of a variety of receptor and cell adhesion proteins at their edge to promptly couple their developmental program to the surrounding tissue.
In this work we studied three proteins engaged in membrane proteins cell surface expression control through their activity on the secretory delivery (PKD1 and BARS) or membrane removal/insertion (SARA). Knock-down of any of them in intact embryonic cortex leads to failures in: neuronal migration, multipolar to bipolar morphology transition or radial orientation. As for the phenotypes observed after PKD1 or BARS silencing we point that Reelin receptor ApoER2 is retained in clusters at the soma, instead of being delivered to the neuron’s leading process. It is plausible that lack of Reeling signaling
10 obtained by SARA knock-down. The other way around holds true as well: SARA and L1-CAM silenced together rescues neuron orientation and migration to control extent.
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ABREVIATURAS
AG: aparato de Golgi.
CP: placa cortical (del Inglés, Cortical Plate). Comprende las capas II a VI de la corteza.
E: día embrionario o gestacional. En ratas y ratones es de 21-22 días. El mediodía del día en que aparece el tapón vaginal se considera día E 0.5.
IUE: electroporación in utero (del Inglés, In Utero Electroporation). Técnica de manipulación genética en células del cerebro embrionario durante su desarrollo dentro del útero.
IZ: zona intermedia (del Inglés, Intermediate Zone). Área poco densa en núcleos celulares, se ubica entre SVZ y CP. Aloja los tractos axonales que descienden desde la CP.
LP: proceso conductor (del Inglés, Leading Process). Neurita inmadura dirigida hacia la pía que guía la migración neuronal. Posteriormente formará la arborización dendrítica.
12 P: día postnatal.
RGC: célula de glía radial (del Inglés, Radial Glia Cell). Célula de tipo progenitor que produce un amplio espectro de tipos celulares: otras RGCs, neuronas, progenitores intermedios, etc. Tempranamente generan un epitelio pseudo-estratificado rodeando el ventrículo (VZ).
SVZ: zona sub-ventricular (del Inglés, Sub-Ventricular Zone). Se ubica por encima de la VZ.
TGN: red de trans-Golgi (del Inglés, Trans-Golgi Network); últimas cisternas del AG desde donde emergen las vesículas secretorias hacia la membrana plasmática.
TP: proceso de arrastre (del Inglés, Trailing Process). Neurita inmadura dirigida hacia el ventrículo. Se alarga durante la migración neuronal formando el axón prospectivo.
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INTRODUCCION
Polaridad neuronal in vivo vs. in vitro
La integración y el flujo de información requieren que los circuitos neuronales sean establecidos correctamente. El telencéfalo es la estructura embrionaria que dará origen al cerebro anterior. A su vez, la corteza cerebral se desarrolla en la región dorsal del telencéfalo (Fishell et al., 1993). Durante su formación (Figura 1), existen una serie de etapas consecutivas y continuas que aseguran su correcta formación; entre estas se incluyen: I) neurogénesis, II) migración neuronal y III) polaridad neuronal. Temporalmente, la formación neocortical ocurre desde el día embrionario 11 (E11) hasta el día postnatal 21 (P21) (Barnes & Polleux, 2009).
Figura 1. Esquema descriptivo de los principales componentes celulares involucrados en la
cortico-génesis y la escala temporal respectiva. RG: células de Glia Radial, IP: progenitor
14 I) Neurogénesis (E11-E17). La mayor parte de las células de la neocorteza, incluidas las neuronas, se originan a partir de Células de Glía Radial (RGC) que en conjunto forman un neuroepitelio germinativo (Noctor et al., 2004). Estas son células bipolares, cuyo extremo interno está fuertemente adherido a la zona ventricular (VZ) y el externo, a la zona marginal (MZ); mientras que su soma sufre migración nuclear interkinetica (INM) (Sauer, 1935). La INM es el movimiento ascendente/descendente del núcleo que acompaña el ciclo celular. Al ascender el soma, la célula se encuentra en fase S; mientras que al descender y tocar la zona ventricular la RGC se divide mitóticamente (Figura 2 B, 1). Tempranamente en el desarrollo se observan divisiones simétricas que originan otras RGCs y amplían el consorcio de células germinativas; mientras que luego se evidencian divisiones asimétricas que darán lugar a neuronas (Noctor et al., 2004). A su vez, existen otras poblaciones de células progenitoras que incluyen: Glia Radial externa (oRG; Wang et al., 2011) y progenitores intermedios (Noctor et al., 2007). Estas poblaciones se agrupan en la zona subventricular (SVZ). Dichos tipos celulares también pueden dividirse asimétricamente, auto-renovándose y originando una neurona; o inclusive dividirse simétricamente generando dos neuronas. La simetría/asimetría durante la mitosis refiere a los determinantes diferenciales que heredará cada célula hija (Gözt & Huttnner, 2005).
15 sentido radial (Figura 2 B, 3), similar al de sus células progenitoras, con una de sus neuritas extendida hacia la pía (constituyendo el proceso conductor o en Inglés: leading process, LP) y la otra hacia el ventrículo (proceso de arrastre o
trailing process, TP) (Noctor et al., 2004). El proceso conductor va examinando el microambiente en busca de señales que le indiquen la dirección hacia donde la célula debe dirigirse. La misma RGC que dio origen a una neurona es el sustrato sobre el cual ésta se desplaza hasta alcanzar su posición final (Kriegstein & Noctor, 2004). Esta forma de movimiento sobre RGC corresponde a lo que conocemos como migración radial y es la responsable de la organización en capas de la corteza cerebral compuesta mayormente por neuronas de proyección excitatorias. Hay otras formas de migración, como la tangencial, propia de las interneuronas inhibitorias, que es perpendicular a la radial (Parnavelas, 2000); pero que no serán tratadas aquí. La primer cohorte de neuronas migrando radialmente forma la zona marginal (MZ) o capa I cerca de la pía; mientras que las siguientes capas II a VI se establecen en un patrón “de adentro hacia afuera”, donde las neuronas generadas tempranamente se
17 (estadio 4). Finalmente las neuronas madurarán adquiriendo botones sinápticos y espinas dendríticas (estadio 5) (Dotti et al., 1988).
Sin embargo, es importante notar que las observaciones in vitro corresponden con fenómenos de repolarización de neuronas previamente polarizadas in vivo. Así, estas células cultivadas pueden retener ciertos aspectos de polaridad que pueden resultar críticos al momento de interpretar resultados.
Figura 2. Comparación de la secuencia de eventos que derivan en la polarización neuronal in vitro (A) e in vivo (B). Tomado de Polleux & Snider, 2010.
18 también en su función (Craig & Banker, 1994; Arimura & Kaibuchi, 2005, 2007, Conde & Cáceres, 2009). La distribución e inserción de proteínas y lípidos en los distintos compartimentos neuronales le confieren a estos una identidad y funcionalidad que le son propias. Dada la alta complejidad de las células neuronales es natural que existan diversos mecanismos que aseguren, espacial y temporalmente, una correcta (I) expresión proteica y (II) adición de membrana. A continuación se describen las dos maquinarias más relevantes encargadas de ejecutar estas funciones: la vía secretoria y el sistema endosomal.
La vía secretoria
19 Por su parte, distintos cargos tienen secuencias de señalización para su correcto transporte.
La maquinaria de envío de cargos somato-dendríticos (o basolaterales)
reconoce secuencias de aminoácidos que normalmente se encuentran sus regiones citoplasmáticas. Por ejemplo, receptores típicos del compartimento somatodendrítico como el Receptor de Transferrina (TfR) y el Receptor de Lipoproteína de Baja Densidad (LDLR) contienen la secuencia específica YXXF (donde, Y= tirosina, X representa a cualquier aminoácido y F corresponde a un residuo hidrofóbico) que les permite insertarse correctamente en la membrana dendrítica. Otro dominio proteico, caracterizado en el Receptor de Factor de Crecimiento Epidermico (EGFR), está compuesto por dos residuos de Leucina consecutivos que facilitan su envío a las dendritas en neuronas en cultivo (Silverman et al., 2005). Sin embargo, estos dominios de señalización no están universalmente conservados y continuamente se reportan nuevas secuencias que sirven de indicadores para el envío de proteínas a la membrana dendrítica (Lasiecka & Winckler, 2011).
Por otro lado, las señales que permiten el target axonal (o apical) están
20 han detallado como promotores de envío apical en miembros de la familia de receptores de LDL (Low-Density Lipoprotein) (Marzolo et al., 2003). Algunas señales de envío axonal han sido reportadas como señales que inducen la endocitosis (Lasiecka & Winckler, 2011). Como ejemplo de este mecanismo, se ha demostrado que la secuencia que señaliza el transporte de Proteína de Membrana Asociada a Vesiculas 2 (VAMP2) hacia el dominio axonal es, a su vez, necesaria para la endocitosis de VAMP2 (Sampo et al., 2003). Esto último sugiere que varias proteínas destinadas a la membrana axonal llegarían mediante transcitosis o por retención selectiva.
De esta manera, componentes proteicos de la membrana somato-dendrítica, como el receptor de Transferrina (TfR), son transportados preferencialmente a este domino de forma directa excluyéndolos del axón. Mientras que proteínas de membrana características del axón como las moléculas de adhesión celular L1-CAM/NgCAM, experimentan transcitosis; es decir, inicialmente son insertadas preferencialmente en la membrana somato-dendrítica para luego ser rápidamente endocitadas desde este compartimento y transportadas a la membrana axonal (Wisco et al., 2003; Yap et al., 2008). Otro mecanismo de transporte hacia el axón, reportado para VAMP2 y algunos canales iónicos, es la retención selectiva, proceso por el cual el envío desde el TGN es indiscriminado hacia toda la célula pero luego el cargo es endocitado de los dominios inapropiados (soma y dendritas) para su posterior degradación en lisosomas y retenido esencialmente en la membrana axonal (Lai & Jan, 2006).
21 distribución de proteínas a través del control de la fisión, transporte y fusión de vesículas transportadoras (o carriers). Estos incluyen: las familias de GTPasas pequeñas Arf y Rabs (Myers & Casanova, 2008), proteínas adaptadoras (por ejemplo: familia APs; Robinson & Bonifacino, 2001), de acercamiento (o
tethering, por ejemplo: complejo exocisto; Hsu et al., 2004) y anclaje (por ejemplo: SNAREs; Salaun et al., 2004), reguladores del citoesqueleto de actina (por ejemplo: dinamina, LIMK1, cofilina; Salvarezza et al., 2009), motores inteligentes (como: kinesinas y dineínas; Kreitzer et al., 2000) y otros (revisado extensamente en Lasiecka et al., 2009).
En este sentido, particular atención requiere la salida de cargos desde el TGN; eventos extensamente estudiados en trabajos previos de nuestro laboratorio (Bisbal et al., 2008; Gastaldi & Caceres, no publicado) y los desarrollados en esta Tesis. Hasta el presente, la maquinaria involucrada en la salida de carriers
vesiculares post Golgi comprende dos alternativas:
Dinamina dependiente: esta vía es requerida para el transporte apical en
22 del AG y una disminución del largo axonal (Rosso et al., 2004).
Dinamina independiente: vía identificada en la fisión de transportadores
(carriers) con destino baso-lateral y reportada para el envío de VSVG, n-CAM y TfR. Involucra el reclutamiento y activación secuencial en AG de: subunidad βγ de proteína G, fosfolipasa C-β (la cual produce di-acil glicerol, DAG), proteína kinasa C-η (PKCη) y proteína kinasa D (PKD) (De Matteis & Luini,
2008). Recientemente, se reportó la relevancia de PKD1 en la polaridad neuronal tanto estructural como funcionalmente (Bisbal et al., 2008). PKD presenta 3 isoformas, siendo PKD1 la más abundante en neuronas en cultivo y cuya localización está enriquecida en el aparato de Golgi donde se une fuertemente a DAG; ubicación que refleja su función en el control del tráfico post Golgi. Luego del silenciamiento o inactivación de esta proteína se observó que cargos normalmente distribuidos en dendritas como TfR y LRP (del Inglés, Low-density Receptor-related Protein), eran transportados en vesículas positivas para el cargo axonal VAMP2 y fueron retenidos selectivamente en la membrana axonal. Posteriormente, esta alteración en el empaquetamiento y tráfico de cargos en vesículas post Golgi se vio reflejado en la disminución del largo y ramificación del árbol dendrítico.
También se ha identificado en líneas celulares que dímeros de 14-3-3γ unen a BARS (Brefeldin A Ribosilation Substrate) con PI4K-IIIβ (fosfatidil-inositol 4 kinasa-IIIβ), complejo multiproteico que sería regulador de la salida de cargos
23 nuestro laboratorio en neuronas en cultivo muestran que la supresión de la expresión de BARS endógena tiene un efecto inhibidor sobre el árbol dendrítico (menor largo e índice de ramificación), demostrando además un AG alargado o tubulado. En esta línea se demostró que TfR presenta salida retrasada o disminuida desde el AG hacia el domino somato-dendrítico (Gastaldi & Cáceres, datos no publicados). A su vez, ensayos de inmuno-precipitación revelan que PKD1 y BARS formarían parte del mismo complejo (Tesis Dra. Gastaldi, 2011; Valente et al., 2012). En este trabajo buscaremos evidencias que fundamenten la relevancia de PKD1 y BARS en la regulación de la salida de vesículas somato-dendríticas y su implicancia en la homeostasis celular durante el desarrollo de la corteza.
24 El sistema endosomal
25 de adhesión en el frente celular, lo cual reacopla las fuerzas de tracción necesarias para mantener la morfología celular y los patrones migratorios.
Las células son capaces de incorporar moléculas del ambiente extracelular mediante un proceso llamado endocitosis mediante el cual la membrana plasmática se invagina y luego escinde en el interior celular, llevándose moléculas externas, membrana y también aquellas proteínas de membrana allí alojadas. La endocitosis mediada por clatrina es la más conocida, pero también se ha reportado endocitosis independiente de clatrina (Conner & Schmid, 2003). Las moléculas cargo así removidas, son luego transportadas a un sistema altamente regulado para su degradación, almacenamiento o clasificación y reciclado a la membrana plasmática. De esta manera, proteínas ubicadas en dominios incorrectos pueden ser escindidas y degradadas en lisosomas o redireccionadas a su destino correcto.
La complejidad de los compartimentos de la maquinaria endosomal puede simplificarse señalando sus principales componentes: endosomas tempranos (EE, del Inglés Early Endosomes), endosomas de reciclado (RE, del Inglés
26 plasmática mediante reciclado rápido (Lasiecka et al., 2009). El reciclado hacia la superficie celular también puede originarse en REs, pero en este caso se trata de un reciclado tardío o lento y está relacionado con el transporte de cargos desde un dominio celular a otro distinto; tal como se observa durante la transcitosis (Lasiecka et al., 2009). Eventos de maduración de los EEs, a través del cual se acidifican, le confieren identidad de LE o lisosomas donde ocurre la degradación proteica. Este compartimento ha sido destacado como regulador del cese de señalización, ya que requiere la remoción de la superficie y consecuente degradación de proteínas (Katzmann et al. 2002). De esta manera, la célula no responderá a señales externas hasta que nuevos péptidos sean sintetizados e insertados en la membrana plasmática.
27 De esta manera, los tres dominios más importantes del sistema endosomal: EE, RE y LE, se clasifican funcionalmente. A su vez, también pueden identificarse mediante marcadores moleculares como los miembros de la familia de GTPasas pequeñas Rabs (Zerial & McBride, 2001). Los EEs están asociados a Rab5, la cual crea un ambiente de anclado (docking) para la fusión de transportadores vesiculares. Rab4 también se asocia con EEs y estaría regulando la formación de sitios de salida de cargos. En el proceso de maduración endosomal, Rab5 es rápidamente removida del EE y reemplazada por Rab7 confiriéndole identidad de LE o lisosoma (Rink et al., 2005). A su vez, los LEs también presentan reactividad contra Rab9. Por otro lado, los REs son característicamente positivos para Rab11, encontrándose micro-dominios marcados con Rab4. Así, distintas moléculas efectoras incluyendo proteínas adaptadoras, factores de acercamiento y anclado vesicular (tethering &
29
OBJETIVOS
30 receptores de guías quimio-tácticas y proteínas de adhesión celular.
Esperamos aportar nuevas evidencias que pongan relevancia cómo las regulaciones intracelulares de proteínas de interés inciden directamente en la homeostasis celular y la formación general del cerebro.
Objetivos específicos
1. Caracterizar la función de PKD1, BARS y SARA durante el
desarrollo cortical. Se evaluarán distintos parámetros del desarrollo neuronal, incluidos: migración, morfología, orientación; así como también se analizarán cambios en algunas organelas sub-celulares (aparato de Golgi, endosomas). Hipotetizamos que alteraciones en sitios clave para la regulación del tráfico de membranas (empaquetamiento de cargos y fisión de vesículas desde el TGN y dinámica de la maquinaria endosomal) produzcan cambios en la dinámica (migración, orientación) como en la estructura (establecimiento y mantenimiento de la polaridad) neuronal y sub-celular durante el desarrollo de la corteza cerebral.
31 homeostasis.
3. Avanzar en la comprensión de mecanismos involucrados en la generación de fenotipos relevantes luego del silenciamiento de
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MATERIALES Y METODOS
Animales
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Plásmidos
A continuación se presenta una lista con los plásmidos utilizados en esta tesis.
AporER2-GFP. Expresa la proteína de fusión entre el receptor de Reelina (ApoER2) y el gen reportero GFP. GFP está ubicado en el extremo N-terminal de ApoER2. Plásmido generosamente cedido por la Dra. Ma. Paz Marzolo (Cuitino et al., 2005).
GalT2-YFP/-mCherry. Expresan proteínas de fusión entre la enzima residente del Aparato de Golgi (AG), Galactosil Transferasa 2 (GalT2), que carece de su dominio catalítico C-Terminal; y la variante fluorescente YFP o mCherry. Sirve como marcador del AG. Plásmidos generosamente cedidos por el Dr. Hugo Maccioni (Giraudo et al., 2001).
L1-CAM-YFP. Codifica la expresión de la una proteína de fusión entre la molécula de adhesión celular L1-CAM y el gen reportero YFP, bajo el promotor de actina pCAGIG. El plásmido fue diseñado por el Dr. Jen-Zen Chuang y se generó a partir de una construcción cedida por el Dr. Kamiguchi (Nishimura et al., 2003). El plásmido original se cortó en sitios únicos NotI/EcoRI y se insertó en el vector pCAGIG cortado con las mismas enzimas de restricción.
34 cedido por el Dr. Meada (Liljedahl et al., 2001).
shBARS1-GFP/-HcRed. Codifica un RNA de interferencia (RNAi) que silencia la expresión endógena de BARS1 (Brefeldin A Ribosylation Substrate 1) bajo el promotor U6 y expresa la proteína fluorescente GFP o HcRed bajo promotor de actina (pCAG). La secuencia target de BARS1 es: 5’ GGGTCCAGAGTGTAG AGCAGA 3’. Esta construcción fue diseñada y desarrollada por la Dra. Laura
Gastaldi (Tesis Dra. Gastaldi).
shL1-CAM-mCherry. Codifica un RNA de interferencia (RNAi) que silencia la expresión endógena de L1-CAM (Molécula de Adhesión Celular L1) bajo el promotor U6 y expresa la proteína fluorescente mCherry bajo promotor de actina (pCAG). La secuencia target de L1-CAM es: 5’ GGGTCTCTGATCTTGA
GTAACGCCATGGCGTTACTCAAGATCAGAGACCC 3’. Esta construcción fue diseñada por el Dr. Jen-Zen Chuang.
shPKD1-GFP/-HcRed. Codifica un RNA de interferencia (RNAi) que silencia la expresión endógena de PKD1 bajo el promotor U6 y expresa la proteína fluorescente GFP o HcRed bajo promotor de actina (pCAG). La secuencia target de PKD1 tanto en rata como en ratón es: 5’ GGGCAGGTTGCCAGAACA
CAT 3’. Esta construcción fue diseñada y desarrollada por la Dra. Laura Gastaldi (Tesis Dra. Masseroni).
35 expresa la proteína fluorescente GFP bajo promotor de actina (pCAG). La secuencia target de PKD1 de rata es: 5’ GGGTTCTGGACAGTTCGGAAT 3’. Esta construcción fue diseñada y desarrollada por el Dr. Mariano Bisbal (Bisbal et al., 2008).
shSARA-HcRed/-GFP. Codifica un RNA de interferencia (RNAi) que silencia la expresión endógena de SARA, bajo el promotor U6 y expresa la proteína fluorescente HcRed o GFP bajo promotor de actina (pCAG). Las secuencias target de SARA son: 5’ GGAGAACATGATGAGTGCCTCCATGGA GGCACTCATCATGTTCTCCCTTTTA 3’ y 5’ AGCTTAAAAGGGAGAACATGAT GAGTGCCTCCATGGAGGCACTCATCATGTTCTCC 3’. Esta construcción fue
diseñada y desarrollada por el Dr. Jen-Zen Chuang (Chuang et al., 2007).
shSARA-SARAresistant-GFP. Esta construcción codifica un RNAi contra SARA (descripto anteriormente), un cDNA de SARA resistente al RNAi y el reportero fluorescente GFP. Para generar la versión resistente, se generaron mutaciones silentes en el sitio target del RNAi mediante mutagénesis sitio-dirigidas según instrucciones del fabricante (Stratagene). El plásmido resultante se compone de: promotor U6, shSARA, promotor CAG, SARAresistant, sitio IRES, GFP. Esta construcción fue diseñada y desarrollada por el Dr. Jen-Zen Chuang (Chuang et al., 2007).
36 células especificadas en neuronas. El vector fue generosamente cedido por el Dr. Ulrich Müller (Franco et al., 2011).
Anticuerpos
La siguiente tabla comprende todos los anticuerpos primarios utilizados en el presente trabajo.
Abs 1° Huesped Dilución Revela Marca
anti GFP pollo 1/1000 proteína fluorescente GFP Abcam anti HcRed cabra 1/300 proteína fluorescente HcRed Santa Cruz anti L1CAM ratón 1/400 molécula de adhesión celular L1 Abcam
anti Pax6 conejo 1/400
factor de transcripción, se expresa en
núcleos de progenitores apicales Covance anti PH3 conejo 1/400 histona 3 fosforilada, marcador de mitosis Millipore
anti SARA conejo 1/400
especifico contra SARA, enriquecida en
endosomas tempranos Santa Cruz
anti Tbr2 conejo 1/400
factor de transcripción, se expresa en
núcleos de progenitores basales Abcam
anti Tuj1 ratón 1/400
sub-unidad β-III de tubulina, enriquecida en
neuronas diferenciadas Promega
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Electroporación in utero
Actualmente, existen novedosas técnicas de manipulación genética para el estudio del desarrollo neuronal in situ, como la electroporación in utero (IUE) (Saito & Nakatsuji, 2001; Saito, 2006), que constituyen una plataforma ideal para (I) regular la expresión génica en células progenitoras (antes que la neurona se genere y polarice), (II) seguir el curso de la polaridad neuronal en un contexto local, (III) evitar el gasto y el tiempo en generar ratones transgénicos, (IV) permitir el estudio de mutaciones génicas que serían letales en el embrión entero.
38 plásmido así transfectado. Finalmente se reposicionan los cuernos uterinos en la cavidad abdominal y se suturan músculo y piel. La recuperación postquirúrgica del animal se lleva a cabo en una cámara tibia que mantiene la temperatura corporal hasta que se recupera la consciencia.
Figura 5. Electroporación in utero. (A) Esquema del protocolo. (B) Detalle de inyección de DNA en uno de los ventrículos laterales de un embrión. La flecha señala la micropipeta utilizada. (C) Par de electrodos (flechas) colocados alrededor de la cabeza del embrión, con los cuales se descargan pulsos cuadrados de corriente eléctrica que permitirán la introducción del DNA en las células corticales. Barra de escala 5mm. Tomado de Saito & Nakatsuji, 2001.
39 organelas internas (Aparato de Golgi, endosomas), etc.).
Figura 6. Expresión de YFP en determinadas regiones del cerebro. (A-C) Cerebros del día E15,5 electroporados en el día E13,5. Hay 48hs de expresión del plásmido así trasnfectado. Tomado de Saito & Nakatsuji, 2001.
Electroporación ex vivo
Una metodología alternativa a la IUE es la electroporación ex vivo, que combina la electroporación y el cultivo organotípico de rodajas de cerebro. En la misma, se retiran los embriones del útero y rápidamente se inyecta el ventrículo y electropora tal como está indicado más arriba. Inmediatamente se retiran los cerebros embrionarios en medio de disección en frío, el cual contiene: Hank’s, 4.3mM bicarbonato de sodio y Penicilina/Estreptomicina.
40 recortadas de la membrana y procesadas para inmunotinción y microscopía.
Inmunohistoquímica
Primeramente, los cortes histológicos son bloqueados por al menos 1 hora en agitación a temperatura ambiente (RT). La solución de bloqueo contiene: 5% suero normal de burro (NDS) en 0.1M PBT (0.1M PBS + 0.1% Tritón X-100). Posteriormente, los cortes son transferidos a un pequeño tubo con 300ul de solución con anticuerpo primario: Ab (concentración ajustada para cada anticuerpo), 5% NDS y 0.1M PBT. Se incuban los cortes en esta solución 3 noches en agitación a 4°C. Luego los cortes son enjuagados en 0.1M PBT 2 veces y se lavan 3 veces durante 30’ en cada ronda. A continuación, se
incuban con los anticuerpos secundarios correspondientes en solución similar a la utilizada para Abs primarios, durante 1 noche en agitación a 4°C. Los cortes son luego enjuagados y lavados como en el paso anterior. Seguidamente, se incuban con DAPI 10X en 0.1M PBT durante 10’ en agitación, se enjuagan los
cortes brevemente y son montados con FluorSave (Calbiochem). En algunos casos se procedió a desenmascarar epítopes incubando los cortes en 1mM EDTA por 10 minutos a 37°C, antes del bloqueo.
Microscopía
41 Olympus Fluoview 300. La resolución de las imágenes fue de 1024X1024 pixeles. El haz de luz de excitación siempre se mantuvo por debajo de niveles de saturación. Las imágenes obtenidas fueron cuantificadas mediante las herramientas morfométricas en ImageJ (ángulo de orientación celular, longitud de procesos, intensidad de fluorescencia, posición somática, etc.) y procesadas para su visualización en ImageJ y Photoshop.
Estadística
42
RESULTADOS
Capítulo UNO – PDK1 & BARS
Sección I - PKD1
En neuronas en cultivo, tras el silenciamiento o inactivación de PKD1 se observó que cargos propios del dominio somato-dendrítico como TfR y LRP son transportados junto con cargos clásicos del compartimiento axonal como VAMP2. A su vez, TfR y LRP se observaron retenidos en la membrana axonal luego de inactivar PKD1 en estas células. La participación de PKD1 en el mantenimiento de la identidad de los compartimentos somato-dendrítico y axonal, nos condujo a evaluar su rol in situ. A este fin decidimos electroporar la forma dominante negativa de PKD1 (PKD1-KD; Bisbal et al., 2008), que presenta su función kinasa deficiente o inactiva, en cerebros de ratón del día embrionario 14 (E14) y se los analizó 1, 2 y 4 días después. Entre los días E11 y E17 se produce la mayor cantidad de divisiones neurogénicas. La electroporación al día E14 introducirá nuestros plásmidos de interés en RGCs. Tras una ronda de división asimétrica, las neuronas hijas habrán incorporado el plásmido.
45 Figura 8. Secciones de corteza que expresan GFP o PKD1-KD y observadas por microscopia confocal 2d después de la electroporación. (A) En GFP, se indican procesos conductores (flechas blancas) y procesos de arrastre (flechas vacías). En PKD1-KD, se señalan varios procesos de una neurona en estadio multipolar (*); similar a lo observado anteriormente (Figura 6). (B) Gráfico de barras que muestra el porcentaje de células en cada uno de 10 bines igualmente divididos sobre toda la corteza. t-test; * p<0.05, ** p<0.01; n, GFP= 3 cerebros, 495 células; PKD1-KD= 3 cerebros, 406 células. (C) Reconstrucciones 3-D, tipo cámara lucida, de neuronas en transición entre la zona intermedia y la placa cortical, 2d después de haber sido transfectadas con GFP o PKD1-KD. En algunos casos, la inhibición de PKD1 genera procesos alargados y ramificados en extremo. Barra de escala= 25µm.
Cuatro días después de electroporar con GFP, la primera cohorte de neuronas ha alcanzado su posición final cerca de la pía y otro grupo le sigue. Sin embargo, las neuronas transfectadas con PKD1-KD quedan en posiciones intermedias; muchas de ellas exhibiendo ramificaciones en el proceso conductor (Figura 9). La cuantificación del avance migratorio (Figura 9 B) indica que mientras el 60% de las neuronas control se ubica en los bines superiores (8 y 9), más del 50% de células que expresan PKD1-KD continúan en los bines 3 y 4; del mismo modo que a los dos días post-electroporación (Figura 8 B). A su vez, la expresión de la mutante negativa de PKD1 conduce a que más del 60% de las neuronas presenten una morfología multipolar; a diferencia de la morfología bipolar observada en ~90% de las neuronas control (Figura 9 C).
46 Figura 9. (A) Secciones de cerebros electroporados con GFP o PKD1-KD a E14 y observados por microscopía confocal 4 días después. Nótese como las neuronas que expresan solamente GFP se posicionan correctamente hacia la superficie de la CP, mientras que aquellas que expresan PKD1-KD quedan retrasadas en capas intermedias, inclusive en la IZ. Las flechas señalan neuronas con LP ramificado. (B) Cuantificación del patrón migratorio expresado en porcentaje de células en cada bin respecto del total de células; n, GFP= 4 cerebros, 827 células, PKD1-KD= 4 cerebros, 1363 células. (C) Porcentaje de neuronas bipolares o multipolares, respecto del total; n, GFP= 3 cerebros, 202 neuronas, PKD1-KD= 3 cerebros, 325 neuronas. t-test; * p<0.05, ** p<0.01, *** p<0.001. Barra de escala 50µm.
47 proceso conductor dirigido hacia la pía y un proceso de arrastre dirigido hacia el ventrículo. Por el contrario, solo el 45% de las células electroporadas con shPDK1 presentan esta morfología, observándose en el 55% restante una forma de tipo multipolar (Figura 10 C, D).
48 A los fines de corroborar que nuestro sistema de silenciamiento génico no está activando de manera inespecífica el sistema de RNA de interferencia endógeno, se electroporó un plásmido validado anteriormente por nuestro laboratorio (Bisbal et al., 2008), que codifica un shRNA diseñado específicamente contra la secuencia de PKD1 de rata (shPKD1rat), siendo la secuencia de ratón excluida de su efecto silenciador. Como esperábamos, la expresión de shPKD1rat no presentó diferencias en los patrones de migración, orientación y morfología respecto de la expresión de GFP sólo (Figura 11).
Figura 11. Secciones cerebrales que expresan GFP o shPKD1rat. Su evaluación 4 días después muestra que en ambas condiciones el desarrollo neuronal es virtualmente idéntico. Barra de escala= 50µm.
49 Sección II – BARS
El silenciamiento de BARS, mediante RNAi, en neuronas en cultivo produce la tubulación del AG e impide o retrasa la salida de TfR, un cargo típico del dominio somato-dendrítico. A su vez, se observa un menor largo e índice de ramificación del árbol dendrítico en estas neuronas (Gastaldi & Caceres, no publicado). Con el propósito de evaluar los efectos de BARS in situ durante el desarrollo neocortical; al día E14 se electroporaron cerebros solamente con GFP (control) o con un RNAi (shBARS) que silenció la expresión de BARS endógena. Los cerebros electroporados se recolectaron 2 y 4 días después para su análisis y comparación. A los dos días de electroporar shBARS se observan diferencias en la migración celular a lo largo de la corteza cerebral. Las neuronas que expresan solamente GFP comienzan a desplazarse a través de la CP, mientras que las neuronas electroporadas con el RNAi contra BARS quedan retenidas en la IZ de la corteza (Figura 12 A & B). Si bien a esta escala temporal, no es significativa la diferencia en el patrón migratorio (Figura 12 B); se trata del comienzo de un fenómeno que se acentuará a tiempos
50 dirección a la pía. La cuantificación indica que en neuronas control sólo el 10% de las neuronas bipolares se encuentran invertidas, pero al silenciar BARS este número asciende a ~35% (Figura 12 E).
52 Transcurridos cuatro días post electroporación, la mayoría de las neuronas (61%) que expresan sólo GFP han avanzado hacia capas superiores de la CP (bines 8 y 9); por el contrario aquellas que expresan shBARS permanecen en posiciones profundas de la corteza (bines 2, 3 y 4), (Figura 13).
Los resultados de esta sección sugieren que BARS estaría regulando tanto la morfología como la orientación neuronal en la corteza en desarrollo. Así mismo, el silenciamiento de esta proteína produce un arresto migratorio alrededor de la IZ.
53 Sección III – Actividad de PKD1 y BARS a nivel del aparato de Golgi
Actualmente se debate el rol del AG como organela con funciones instructivas en el establecimiento de la polaridad neuronal (de Anda et al., 2010; Gartner et al., 2012). Sin embargo, varios autores demuestran que se localiza recurrentemente en la base del proceso conductor (LP), lo que sugeriría una función importante durante la migración neuronal y el desarrollo del árbol dendrítico (Horton et al., 2005; Solecki et al., 2009). Reforzando estos conceptos, se ha demostrado recientemente que la disrupción de su localización típica produce alteraciones en la orientación y extensión de la dendrita apical o primaria (Huang et al., 2014). Así, teniendo en cuenta las observaciones previas de nuestro grupo de investigación sobre la función de PKD1 y BARS a nivel del AG, y con la intención de evaluar el rol de estas proteínas en la organela durante el desarrollo in vivo, co-electroporamos GFP sólo, PKD1-KD o shBARS junto con GalT2-mCherry (Galactosil Transferasa 2, proteína residente del AG; fusionada a mCherry). Esta última construcción nos permite identificar el AG neuronal; por lo tanto, reportará cualquier modificación en su localización en neuronas en diferenciación. Pudimos comprobar (Figura 14) que 2 días después de co-transfectar GFP y GalT2, en el 75% de los casos
54 AG fue más exagerado luego de la co-electroporación de shBARS y GalT2 (Figura 14 B). Solo el 20% de estas neuronas presenta localización del AG en la base del LP, 32% de ellas presenta el AG debajo del LP y también cerca de otras neuritas y el 48% tiene esta organela ubicada en la base de procesos distintos del LP (Figura 14 C).
55 Seguidamente, decidimos analizar el rol de PKD1 y BARS sobre la morfología del AG. Trabajos en líneas celulares han propuesto que el rol de PKD1 en el tráfico de membranas post Golgi sería el de fisionar los túbulos que emanan del AG en el proceso de formación de vesículas con cargo baso-lateral (Liljedahl et al., 2001). En este caso, PKD1 ejercería su acción sobre un complejo multiproteico del cual BARS también forma parte (Valente et al., 2012). Estos autores han demostrado que dada una disminución o inactivación de PKD1 en células no neuronales se inhibe la fisión de vesículas post Golgi, lo que da origen a largos túbulos originados en el AG que se extienden para eventualmente contraerse (Yeaman et al., 2004; Diaz-Añel & Malhotra, 2005). Esta formación del AG en estructuras tubulares ha recibido el término de
56 La morfología del AG, revelada por la expresión de la proteína residente en esta organela: GalT2-YFP, fue clasificada en una de tres categorías:
1. Sin deployment: el AG se encuentra condensado dentro del soma. 2. Deployment: AG tubulado o alargado, penetra en una o varias neuritas. 3. Deployment con fragmentación: AG en túbulos cortos que entran en una
o varias dendritas.
Dada esta categorización, realizamos un análisis cualitativo (Figura 15 D) y encontramos que la mayoría de las neuronas control (66%) presentan un AG compacto sin deployment, mientras que solo el 13% exhibe la organela con deployment y el restante 20%, deployment con fragmentación. Por el contrario, en aquellas neuronas con expresión de PKD1 disminuida no se observan aumentos importantes en el deployment (20%). Sin embargo, hay un marcado incremento en la fracción de AG tubulado en segmentos que ingresa en una o varias neuritas (60%), en detrimento de la porción de AG compacto (20%). En el caso del silenciamiento de BARS, solamente el 40% de las neuronas presenta un AG sin deployment, mientras que el AG se encuentra tubulado ingresando en neuritas en el 40% de los casos y el remanente 20% muestra un AG tubulado en fragmentos.
59 usada con éxito en otros sistemas (Hong et al., 2010), aunque no en el nuestro. Esto nos condujo a concentrarnos en el otro receptor para Reelina, ApoER2. Este receptor, ApoER2, se expresó correctamente en nuestro sistema; y en co-electroporación con HcRed sólo, corroboramos su distribución típica reportada previamente (Perez-Garcia et al., 2004) en el soma y a lo largo del proceso conductor (LP) (Figura 16 A), con un patrón puntillado lo que revela su distribución en vesículas (Willnow et al., 1996). Sin embargo, en co-expresión con shPKD1 o shBARS encontramos que ApoER2 forma grandes agregados o
clusters en el soma neuronal; a veces en posición opuesta al LP (Figura 16 B, C). La cuantificación de este fenómeno indica que en las células control solo el
60 neuronas control, se comparó la IF total de ApoER2 en todas las neuronas. Primeramente se calculó la IF promedio en toda la célula y se tomó el valor encontrado en neuronas que co-expresan HcRed sólo como el 100%, sobre el cual se ponderó la IF total promedio en las demás condiciones. Dada la cuantificación, no se observan cambios significativos entre las distintas co-electroporaciones (Figura 16 F), por lo que se puede asumir que el receptor está siendo expresado en similar intensidad independientemente del plásmido co-expresado y que las acumulaciones encontradas en los somas neuronales corresponden a un fenotipo propio del silenciamiento de PKD1 o BARS.
Los resultados de esta sección, sugieren que tanto PKD1 como BARS actuarían en el AG regulando su morfología. El silenciamiento de estas proteínas favorece la tubulación o deployment, con o sin fragmentación, del AG; en detrimento de su estructura compacta observada en los controles. Aún más, uno de los receptores para la guía quimiotáctica Reelina, ApoER2, aparece retenido en agregados celulares cuando se inhibe la expresión endógena de PKD1 o BARS. La disminución de la distribución de ApoER2 sobre el LP comparada con los controles, podría explicar el arresto migratorio que presentan estas neuronas in situ.
62 Capítulo DOS – SARA
El estudios llevados a cabo en nuestro laboratorio en neuronas in vitro, reveló que la supresión de SARA conduce a la formación de procesos neuronales, axones y dendritas, más largos; como así también a una mayor inserción en membrana de proteínas clásicas para los dominios somato-dendrítico y axonal: TfR y L1-CAM, respectivamente (Arias et al., en preparación). Estas observaciones previas, nos condujeron a evaluar el rol de SARA in vivo. A este fin, se electroporaron cerebros embrionarios del día E13.5 con una construcción control (HcRed o GFP) y un shRNA (shSARA) que silenció la expresión endógena de SARA; y se analizaron 40 horas, 3 y 5 días después.
Después de 40hs de haber electroporado se recolectaron cerebros de ambas condiciones, sobre cuyas secciones se realizaron inmunotinciones contra Tuj1, Pax6, Tbr2 y PH3. Todos estos, son marcadores clásicos y han sido reportados previamente (Enguld et al, 2005): Tuj1 (o tubulina-βIII) es un marcador de
63 en algunos casos pueden observarse por desbalances en la proporción de divisiones simétricas y asimétricas (Gözt & Huttnner, 2005). La tinción contra el marcador mitótico PH3, se presenta en patrones similares bajo ambas condiciones: control y SARA-silenciada (Figura 17 C).
64 Sin embargo, al evaluar 3 días posteriores a la electroporación hallamos importantes diferencias: mientras las neuronas control que expresan sólo GFP se encuentran con una orientación dirigida hacia la pía y migrando sobre la CP; las neuronas electoporadas con shSARA presentan una orientación sesgada respecto del eje radial y su migración queda retenida alrededor de la IZ (Figura 18 A). Inclusive, aquellas pocas neuronas que adquieren una orientación radial
apropiada (en ángulo recto) cuando se silencia la expresión de SARA, presentan ramificaciones tanto en el LP como en el TP que no son típicas de neuronas con migración radial normal (Figura 18 B). La cuantificación de estas observaciones confirma que la mayoría de las neuronas control (~75%) se ubica en la CP; y por el contrario, casi la misma proporción de neuronas que expresan shSARA se encuentran en la IZ (Figura 18 C). A su vez, al medir el grado de orientación celular tomando el borde ventricular como ángulo horizontal (0°) pudimos determinar que las neuronas silenciadas contra SARA presentan mayormente (>80%) una orientación entre los 0° y 45°; en contraste con las células GFP positivas que se orientan verticalmente (45° a 90°) casi en su totalidad (>95%) (Figura 18 D).
65 Figura 18. (A-B) Electropora-ción de cerebros embrionarios con GFP o shSARA y análisis 3 días después. (B) Mayor aumento de los recuadros en (A): (a) neurona orientada hacia la pía con ramificaciones en su LP (flechas) y TP (*); (b) neuronas inclinadas. (C) Porcentaje de células en cada área de la corteza para ambos plásmidos.
66 neuronas mostraron una orientación y un patrón migratorio similar a las células control (Figura 19), localizándose mayormente sobre la CP de la misma manera que las neuronas electroporadas con GFP sólo (Figura 19 B).
Figura 19. (A) Electroporación de corteza con un RNAi contra SARA junto con el DNA codificante para una versión de SARA resistente al shRNA; y GFP. La expresión de esta construcción no genera el fenotipo observado para el silenciamiento de SARA. (B) El análisis cuantitativo del patrón migratorio revela que la capacidad de avance sobre la CP luego de la expresión de shResistant es similar a la de GFP sólo y significativamente distinta de shSARA. ANAVA; *** p<0.0001; n GFP= 3 cerebros, 1058 células; shSARA= 4 cerebros, 618 células y shResistant= 3 cerebros, 1231 células. Barra de escala 50µm.
68 dirección a la pía y se ubican mayormente sobre la CP en posición migratoria (Figura 20 E). Al cuantificar estas observaciones, encontramos que la co-expresión de shSARA + shL1-CAM genera un patrón migratorio similar a la expresión de GFP y significativamente diferente de aquel producido por el silenciamiento de SARA (shSARA sólo) (Figura 20 F).
Sugestivamente, luego de la sobre-expresión de L1-CAM encontramos varias neuronas que parecen adherirse a otros procesos neuronales también positivos para L1-CAM (Figura 21 A). Tales procesos parecen corresponder a axones que descienden sobre la IZ provenientes de neuronas posicionadas más superficialmente en la CP. La reconstrucción tridimensional de la misma imagen, permite observar en detalle los sitios de contacto entre una neurona y los procesos que la circundan (Figura 21 B). Dadas estas observaciones, es tentador especular que aquellas neuronas con expresión disminuida para SARA, y que por lo tanto tendrían mayores niveles de L1-CAM en su superficie, experimentarían de manera similar fenómenos de adherencia a axones procedentes de neuronas originadas previamente.
70 Figura 21. (A) Neurona alrededor de la IZ que sobre-expresa HcRed y L1-CAM. Se observan puntos de contacto, y posiblemente también de adhesión, con otros procesos celulares que a su vez expresan L1-CAM (flechas). Estas adherencias podrían explicar la inclinación horizontal alrededor de la IZ en neuronas con alta expresión de L1-CAM en su superficie. (B) Reconstrucción 3D de la imagen anterior. La neurona se observa en verde, mientras que los demás procesos, también positivos para L1-CAM, están en distintos colores para su identificación. Se muestran diferentes planos de rotación donde se señalan los sitios de adhesión (flechas). Barra de escala A= 10µm, B= 8µm.
73 Figura 22. (A) Electroporación de GFP o shSARA en cerebros embionarios, evaluados 5 días después. Nótese que en ambas condiciones las neuronas alcanzan la MZ con su LP. Sin embargo, en la condición control las neuronas translocan su núcleo a capas profundas de la corteza; mientras que aquellas neuronas silenciadas contra SARA no muestran que su soma descienda correspondientemente. Los corchetes señalan la región de la CP donde se concentra la mayor cantidad de somas para cada condición. (B) Imágenes a mayor aumento para analizar la morfología neuronal. Las cabezas de flecha señalan los LPs, mientras que las flechas apuntan a los TPs. Nótese el recorrido zigzagueante del LP y TP en la neurona silenciada contra SARA. A la derecha de la imagen se muestran las mismas neuronas reconstruidas a modo de cámara lucida para contrastar sus estructuras. (C) Análisis cuantitativo de la migración sobre los bines superiores de la corteza en ambas condiciones. t-test; * p<0.05; n GFP= 3 cerebros, 1249 neuronas; shSARA= 3 cerebros, 667 neuronas. (D) No se encuentran diferencias en la longitud total del LP en ambas condiciones. (E) Indice de linealidad. Cuando la neurona expresa shSARA, su LP presenta mayor cantidad de curvas en su recorrido. t-test; *** p<0.0001; n GFP= 3 cerebros, 22 neuronas, shSARA= 3 cerebros, 19 neuronas. Barra de escala: A= 50µm y B=10µm.
74 patrón de migración (Figura 23 A). De la misma manera, la morfología neuronal tampoco parece afectada (Figura 23 B). Ya que la supresión génica ocurre una vez que la célula alcanza la identidad neuronal (alrededor de la IZ), estos resultados refuerzan la idea de que la regulación de los niveles superficiales de L1-CAM, mediado por SARA, sería crucial para el tránsito sobre un área rica en L1-CAM, como la IZ, para continuar su migración sobre la CP.
76
DISCUSION
Los resultados obtenidos hasta el momento dan cuenta del importante papel que cumple el control del tráfico de membranas durante la diferenciación neuronal y la estructuración de la neocorteza cerebral en distintas capas neuronales. Estudios previos de nuestro laboratorio han demostrado el papel tanto de proteínas reguladoras del ensamblado y envío direccionado de vesículas somato-dendríticas (PKD1, BARS; Bisbal et al., 2008; Gastaldi & Cáceres, resultados no publicados), como de proteínas involucradas en el control de la endo- y exo-citosis (SARA; Arias et al., en preparación) durante el establecimiento de la polaridad neuronal. Lo significativo del trabajo que aquí presentamos, es que comenzamos a dilucidar el rol de estas proteínas in situ y cómo su desregulación conduce a alternaciones en la fisiología celular que impiden el normal desarrollo de un órgano tan importante como el cerebro.
La inactivación de PKD1 in vivo reduce la diferenciación y migración
neuronal
77 membrana a nivel del TGN en una vía de transporte de cargos con señales de envío basolaterales: Sec6, E-Cadherina y β1-integrina. (Yeaman et al., 2004).
78 disminución en la migración dirigida en fibroblastos (Prigozhina & Waterman-Storer, 2004).
La supresión de PKD1 afecta la morfología del AG
79 expuestos: PKD1 actúa a nivel del AG y cuyo desbalance tiene efectos en el establecimiento y/o mantenimiento de la polaridad neuronal. Seguramente, futuros trabajos que aclaren los mecanismos moleculares a través de los cuales actúa PKD1, esclarecerán algunos de estos resultados encontrados.
80
El silenciamiento de BARS en neuronas in vivo disminuye su migración y
altera su morfología y la del AG
82
Los efectos regulatorios de PKD1 y BARS estarían mediados por la
distribución del receptor ApoER2
83 ambos receptores de Reelina: mientras VLDLR tendría una función primordial en el cese de la migración; ApoER2 sería más importante en la migración per se, respondiendo al gradiente atrayente de Reelina (Perez-Garcia et al. 2004; Chai et al., 2009; Hack et al., 2007). En situaciones control (HcRed), encontramos que ApoER2 localiza en vesículas en el soma y a lo largo del LP; tal como ha sido descripto previamente (Hack et al., 2007). Sin embargo, al silenciar PKD1 o BARS independientemente, observamos la formación de cúmulos somáticos, en detrimento de su expresión en el LP neuronal (Figura 15 D). Nuestra evaluación cuantitativa de este fenómeno indica que si bien no
84 axonal (Bisbal et al., 2008). Con esto se ha sugerido, que en neuronas, PKD1 tendría un rol preponderante en el armado de vesículas que salen del AG, más que en la fisión de vesículas con cargos baso-laterales. Aun así, otro estudio usando células epiteliales polarizadas (MDCK) detalla que el control de PKD1 sobre la salida de proteínas con destino baso-lateral puede ser dependiente del cargo (Yeaman et al., 2004). Estos autores muestran que VSVG, una proteína de origen viral que normalmente localiza en la membrana baso-lateral, se expresa también en el dominio apical luego de la expresión de una mutante de PKD1 con su función kinasa abolida (PKD1-KD). Sin embargo, esta mutante induce la acumulación perinuclear de otras proteínas baso-laterales: Sec6, E-Cadherina y β1-Integrina. En este sentido, sería importante determinar si en nuestro sistema in situ, las proteínas de membrana estudiadas anteriormente en nuestro laboratorio, TfR y LRP se distribuyen de la misma manera que in vitro y corroborar (o no) lo propuesto por Yeaman et al. (2004) sobre la regulación cargo-dependiente de PKD1 en el envío de proteínas somato-dendríticas.
86
SARA regula la orientación y migración neuronal a través de L1-CAM
87 con MAP2 en neuronas corticales durante el desarrollo cerebral embrionario (Demyanenko et al., 1999; Chung et al., 1991). Más tarde en el desarrollo, L1-CAM aparece restringida a la IZ (Fushiki & Schachner, 1986), lo que corresponde con los tractos axonales de neuronas post-migratorias (Chung et al., 1991). Por lo cual, predecimos que luego del silenciamiento in situ de SARA, se produciría un aumento superficial de L1-CAM similar al observado in vitro, que conduciría a acrecentar las propiedades adhesivas de estas neuronas. En esta línea, se ha reportado que incrementos en la formación de complejos adhesivos conduce a orientación y migración neuronal incorrectos (Kawauchi et al., 2010). Lo cual nos condujo a evaluar la sobre-expresión de L1-CAM en la corteza embrionaria; e interesantemente, encontramos que esto mimetiza los defectos encontrados para la supresión de SARA (Figura 19 C-D). Aun más, en estos experimentos encontramos varios casos de neuronas
88 Sugestivamente, observamos que luego de 5 días post-electroporación, las neuronas que expresan shSARA han alcanzado áreas superiores de la corteza, aunque su translocación somática a la capa correspondiente se ha visto largamente interrumpida (Figura 21 A, C). Esto no es de sorprender, ya que estudios in vitro, han señalado que luego de 5 DIV en cultivo, los somas y dendritas neuronales se sueltan de su sustrato cuando se siembran sobre NgCAM (proteína homóloga de L1-CAM en pollos), debido a que L1-CAM es excluida del dominio somato-dendrítico y enriquecida en el axón a medida que la neurona madura (Esch et al., 2000). Estas observaciones indican que el retraso migratorio observado a los 3 días de haber silenciado la expresión de SARA puede ser superado posteriormente, 5 días post-electroporación. Queda por ser determinado si a esta escala temporal (5d), la ausencia de translocación somática en neuronas que expresan shSARA, también puede recuperarse más tarde en el desarrollo. Futuros experimentos, podrán aclarar este punto.
90
CONCLUSIONES
A lo largo de esta Tesis hemos intentado dar un paso más profundo en el estudio de proteínas cuya función sobre el mantenimiento de la polaridad neuronal y el envío de proteínas de membrana ha sido analizada anteriormente en nuestro laboratorio a través del cultivo primario de neuronas (Bisbal et al., 2008; Gastaldi & Caceres, no publicado; Arias et al., en preparación). A este fin, introdujimos diferentes RNAi contra PKD1, BARS o SARA en cerebros embrionarios intactos, implementando una novedosa y útil herramienta como la electroporación in utero (IUE).
91 neuronas que se desarrollan en su contexto natural, nos exige intentar comprender los desajustes homeostáticos derivados del silenciamiento o inactividad de PKD1 y BARS. En esta línea, presentamos cómo uno de los receptores de Reelina, ApoER2 queda retenido en cúmulos somáticos luego de la supresión de PKD1 o BARS; en detrimento de lo observado en neuronas control, donde este receptor se expresa a lo largo del LP (Capitulo UNO, Sección III).
Por otro lado, también examinamos el papel de SARA durante el desarrollo cerebral. Interesantemente, encontramos una correlación entre los estudios previos realizados in vitro y lo que aquí reportamos in situ, respecto al rol de SARA en cuanto regulador de la inserción de proteínas de membrana; entre las que destacamos a L1-CAM. La supresión de SARA conduce a elevados niveles de L1-CAM en la superficie axonal de neuronas en cultivo (Arias et al., en preparación). A su vez, la sobre-expresión de L1-CAM in vivo conduce a los mismos defectos observados para el silenciamiento de SARA: orientación neuronal sesgada respecto del eje radial y retención alrededor de la IZ. Un escenario donde la disminución de la expresión endógena de SARA concluye en aumentos de L1-CAM en la superficie celular in situ, que explique los fenotipos observados resulta factible, ya que cuando se silencian ambas proteínas (SARA y L1-CAM) conjuntamente, se logra recuperar tanto la orientación como la migración neuronal (Capitulo DOS).
93
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