Dr. Antonio-manual Practico de Micro 2016-17

(1)

Universidad técnica de Manabí

Facultad ciencias de la Salud

Escuela de medicina

MANUAL DE PRACTICA LABORATORIO

DE

MICROBIOLOGÍA

Ms.Dr. ANTONIO GONZÁLEZ VELÁZQUEZ

(2)

FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA

Antonio González Velázquez. Dr en Medicina

Especialista en Medicina General Integral

Especialista en Medicina Intensiva y Emergencias Pediátricas

Master en Infectología y Enfermedades Tropicales Roman Camba July

Doctorado en MEDICINA y CIRUGIA.

DIPLOMADO SUPERIOR EN ENFERMEDADES ZOONOSICAS. ESPECIALISTA EN MEDICINA INTERNA

COLABORADORES:

Estudiantes de la Facultad Ciencias de la Salud, Escuela de Medicina. Universidad Técnica de Manabí

UNIVERSIDAD TÉCNICA DE MANABÍ Av. Urbina y Che Guevara

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UNIVERSIDAD TECNICA DE MANABI

FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA INDICE

PRÓLOGO 1

INDICE 2

INTRODUCCIÓN 4

INSTRUCCIONES GENERALES 5

SEGURIDAD DEL LABORATORIO MICROBIOLÓGICO. 7

NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO DE BACTERIOLOGÍA. 10 Normativas especificas del estudiante de Medicina.

Protocolos de BIOSEGURIDAD.

UNIDAD I: MICROBIOLOGÍA GENERALIDADES 12

PRACTICA N° 01

INTRODUCCION A LA MICROBIOLOGIA.

Normas de bioseguridad especifica en Bacteriología Acondicionamiento de MATERIALES.

MICROSCOPIO OPTICO

MICROSCOPIO ELECTRONICO

PRACTICA N° 02 26

MORFOLOGIA DE LOS MICROORGANISMOS. Estructuras Bacterianas.

PRACTICA N° 03

DESINFECCION y ESTERILIZACION DE MATERIALES 34

Métodos de esterilización. Mecanismos de Acción.

MEDIOS DE CULTIVOS

Clasificación de los medios de cultivos.

Constituyentes principales de los medios de cultivos. PREPARACION.

AISLAMIENTO Y SIEMBRA DE BACTERIAS, AEROBIAS Y ANAEROBIAS Análisis Cualitativo y Cuantitativo Bacteriano.

Toma de muestras. INOCULO. SIEMBRA y AISLAMIENTO.

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FACULTAD CIENCIAS DE LA

SALUD. MEDICINAESCUELA

LOS COLORANTES.

Técnicas de TINCION. Tinción simple.

Tinción compuesta y diferencial.

CLASIFICACION DE LAS BACTERIAS. TINCION DE GRAM.

Estructuras de las células EUCARIOTAS Preparación y Fijación de Frotis

IDENTIFICACION – CLASIFICACION Y TIPIFICACION BACTERIANA. CULTIVOS PUROS

PCR.

ANTIBIOGRAMAS. Técnicas y Procedimientos estandarizados. Sensibilidad y Resistencia. METODO DE KYRBY BAUR.

PRUEBAS BIOQUIMICAS BACTERIOLOGICAS.

Hemólisis, Catalasa, Coagulasa, Bacitracina, Oxidasa, Lactosa, Metabolismo azucares.

PROTOCOLO DE TOMA DE MUESTRAS.

LAS MICROBACTERIAS. BAAR. Tinción de ZIEHL NEELSEN.

PARASITOLOGIA.

IDENTIFICACION DE LOS PARASITOS

Examen macroscópico Examen microscópico.

ESTUDIO MORFOLOGICO DE LOS PARASITOS. Taxonomía PARASITARIA. MICROSCOPIA.

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FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD.

PROLOGO

A los estudiantes y profesores:

El presente Manual de Prácticas del Laboratorio de Salud e Infección Microbiología y Parasitología, se ha realizado para ser un material didáctico del laboratorio, el cual será utilizado en la Universidad Técnica De Manabí (UTM) en el marco referencial de los cambios significativos de la sociedad del conocimiento y contemporánea.

Se presentará las normas y procedimiento básicos de trabajo en el Laboratorio de Microbiología, para comprender la importancia de realizar un buen manejo y el reconocimiento del objeto de estudio, desarrollando habilidades y destrezas, que orientará a la lectura independiente continua.

De antemano se inicia con la introducción a las Normas de Bioseguridad dentro del Laboratorio, para un mejor manejo de los diferentes materiales, instrumentos, equipos, y reactivos químicos.

La guía cuenta con catorce prácticas explicadas de forma sencilla y ordenada, para realizar el adecuado procedimiento. Los estudiantes deben leer detenidamente cada uno de los procedimientos, antes de realizar la práctica respectiva, obteniendo una mejor comprensión en la observación del fenómeno biológico de cada uno de los seres microscópicos en estudio.

Las prácticas detalladas abordan temas sobre el manejo de bacterias, parásitos, medios de cultivo, y pruebas bioquímicas, siendo los pilares básicos y fundamentales para el aprendizaje de los alumnos en su futura vida profesional. La Guía cuenta con una práctica específica estructurada de la siguiente manera, en: Objetivos y Marco Teórico para realizar una conceptualización del tema a abordar, seguidamente se indican los materiales que se utilizarán y su respectivo procedimiento a manera de pasos enumerados complementados con gráficos de fácil entendimiento.

En la sección final de la práctica, se redacta la Conclusión en base en los objetivos planteados, y los resultados propuestos.

De igual manera, se encontrarán las instrucciones para llevar a cabo los procedimientos de preparación de soluciones y medios de cultivos comunes utilizados en el Laboratorio.

Sugerimos este manual para que les pueda servir como una guía y así utilizar los experimentos propuestos con un gran entusiasmo y perseverancia hacia el éxito de la misma, cumpliendo así con el proceso de enseñanza aprendizaje a los futuros profesionales competentes en su formación científica académica y satisfacer todas sus necesidades, bajo estrictos criterios de estándares de calidad y pertinencia.

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El autor agradece anticipadamente la(s) crítica(s) o sugerencia(s) que puedan tenerlos lectores que sirvan para mejorar el presente trabajo.

(8)

INTRODUCCIÓN.

El conocimiento del mundo bacteriano y su organización de acuerdo a un modelo de estirpe filogenético es un anhelo tan antiguo como la propia bacteriología.Con la llegada delas técnicas de secuenciación molecular se pudo disponer de las herramientasadecuadas para construir un modelo taxonómico fundamentado en una auténticafilogenia estructura en evolución.

La Microbiología es la ciencia encargada del estudio de los organismos microscópicos, deriva de 3 palabras griegas: mikros(pequeño), bios(vida) y logos (ciencia) que conjuntamente significan el estudio de la vida microscópica. Son estudiados identificados y considerados Microbios todos los seres vivos microscópicos consistentes en una sola célula, es decir unicelulares.

Los microorganismos pueden ser Eucariotas (Las células poseen núcleo), tales como los hongos y los protistas, o Procariotas (células carentes de núcleo), como las

Bacterias y los Virus (Aunque los virus no son considerados seres vivos estrictamente hablando).

Las infecciones intrahospitalarias cada vez más constituyen un serio problema de salud pública, ya sea por su efecto sobre la salud de los pacientes, como por los costos que este problema implica. Esto hace, que en el país se estén aunando esfuerzos para implementar sistemas de vigilancia, prevención y control, orientados a enfrentar este problema. Por lo que el Medico debe basar su diagnóstico en evidencias disponibles, como son los aspectos epidemiológicos, y la importante contribución del Laboratorio de Microbiología, que además de permitir el diagnóstico etiológico, orienta el manejo clínico terapéutico del paciente.

El estudiante de Microbiología de la Facultad de Ciencias de la Salud, Escuela de Medicina de la Universidad Técnica de Manabí será el profesional, quien con los conocimientos presentes en este manual estará en la capacidad de poder afrontar y resolver con criterio los problemas presentados ya sea en el desenvolvimiento de sus competencias basados en evidencias, como realizando medicina preventiva.

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FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA

INSTRUCCIONES GENERALES

NORMAS GENERALES PARA EL ESTUDIANTE DE

MICROBIOLOGIA MEDICA

1) El estudiante deberá previamente conocer su ubicación de grupo y el local asignado para las prácticas respectivas de laboratorio de Microbiología.

2)Todo estudiante debe de tener la competencia objetiva y la destreza necesaria con cada uno de los equipos de trabajo que va a tener a su cargo y responsabilizarse durante las prácticas de laboratorio en el nivel respectivo. Debe cuidar que los equipos e instrumentos de trabajo no sufran daño, deterioro, ni destrucción alguna, cuidando el patrimonio institucional universitario.

3)Antes de iniciar actividad o práctica en el laboratorio de microbiología, cada uno de los estudiantes deberá realizar las consultas con su profesor o ayudante asignado y en equipo reunir la información necesaria y pertinente. 4)El estudiante deberá revisar el contenido de cada una de los temas en la guía

y cumplir con cada paso del manual de instrucciones para realizar la prácticarespectiva, deberá conocer los fundamentos teóricos-científicos en cada proceso y solicitar información respectiva, fundamentada y pertinente. 5)Cada uno de los alumnos deberá anotar con precisión, detalles de cada uno

de los procedimientos de cada practica y los resultados obtenidos en cada práctica, responder adecuadamente en la revisión y evaluación de cada uno los conceptos tratados, revisados y aprendidos,

6)En cada una de las observaciones microscópicas, debe cumplir con la tarea de la limpieza y controlar el buen funcionamiento del microscopio, la fuente de iluminación los lentes oculares y los lentes objetivos, anotar y dibujar los caracteres fundamentales desarrollados en cada práctica.

7)El alumno podrá ser requerido para efectuar trabajos de investigación sobre temas específicos en microbiología, intra o extra aula, que será entregado y calificado por el profesor en un plazo determinado como lo indica el silabo respectivo.

8)Todo estudiante deberá conservar el buen estado y funcionamiento de cada equipo y del material de cada práctica que se le hay confiado, evitando causar daño total o parcial, deterioro o pérdida del mismo.

9)El acceso al laboratorio de prácticas sólo se permite a los alumnos que estén realizando las prácticas. No se admiten visitas por razones de seguridad. 10) Los laboratorios de investigación son de acceso restringido al personal

del Departamento.

11) Es obligatorio utilizar batas abrochadas siempre que se esté trabajando en el laboratorio. Durante el periodo de prácticas, la bata no debe utilizarse fuera del laboratorio.

(10)

(bolígrafos...) o tocarse los ojos y nariz.

13) En la superficie de trabajo no deben depositarse en ningún momento ropa u objetos personales.

(11)

14) Cada alumno es responsable de la limpieza de su lugar de trabajo y del material asignado, así como de los microscopios que haya usado.

15) Se deben usar los mecheros Bunsen con precaución, no dejando material inflamable cerca y evitando el posible contacto con pelo y ropas. Se comprobará que se ha apagado el gas al finalizar el experimento y al abandonar el laboratorio.

16) Está prohibido pipetear con la boca.

17) Ante un vertido accidental de material microbiológico debe informarse inmediatamente al profesor encargado del grupo.

18) No se debe forzar un tubo de vidrio o la apertura de un frasco sin tener protegidas las manos.

19) No se manejarán los autoclaves o el material recién esterilizado si no se dispone de guantes apropiados.

20) La eliminación de residuos, material desechable y material reciclable se realizará siguiendo las pautas de la práctica 1, utilizando los contenedores dispuestos a tal efecto.

21) Se deben lavar las manos con jabón antiséptico ante cualquier sospecha de contaminación y siempre antes de marcharse del laboratorio.

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Seguridad En El Laboratorio

Antecedentes

La Organización Mundial de La Salud (OMS), publicó en 1983 el primer Manual de Bioseguridad en el Laboratorio, detallando los principios básicos en cuanto a seguridad biológica, en el año 2005 se publica la tercera

edición de este manual explicando de una manera más amplia y extensiva la materia de Bioseguridad, en cuanto a una mala manipulación de agentes infecciosos.

Al realizar trabajos con cualquier microorganismo hay que tomar en cuenta que: “Toda muestra biológica debe ser considerada como infecciosa”, no se puede establecer opiniones personales ante toda manipulación, por tal motivo es importante conocer los peligros que implica el manejo de estos agentes, de acuerdo a su capacidad de riesgo.

Tabla 1. Microorganismos clasificados según su riesgo.

Microorganismos clasificados según su riesgo Grupo de riesgo 1 Microorganismos que tienen pocas probabilidades (riesgo individual y de provocar enfermedades en el ser humano o los poblacional escaso o

nulo) animales.

Grupo de riesgo 2

Agentes patógenos que pueden provocar

enfermedades humanas o animales pero que

tienen pocas probabilidades de entrañar un riesgo

grave para el personal de laboratorio, la

(riesgo individual moderado,

población, animales o el medio ambiente. La

exposición en el laboratorio puede provocar una

riesgo poblacional bajo) infección grave, pero existen medidas preventivas

y terapéuticas eficaces y el riesgo de propagación

(13)

Grupo de riesgo 3 Agentes patógenos que suelen provocar enfermedades humanas o animales graves, pero

(riesgo individual elevado,

que de ordinario no se propagan de un individuo a

riesgo poblacional bajo)

otro. Existen medidas preventivas y terapéuticas

eficaces. Grupo de riesgo 4

Agentes patógenos que suelen provocar

enfermedades graves en el ser humano o los

(riesgo individual y

animales y que se transmiten con facilidad de un

individuo a otro, directa o indirectamente. Por lo poblacional elevado) _{regular no existen}

medidas preventivas y terapéuticas eficaces

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Tabla 2. Relación de los grupos de riesgo con los niveles de bioseguridad, las práctica y equipo

Relación de los grupos de riesgo con los niveles de bioseguridad, las práctica y equipo

GRUPOS DE NIVEL DE TIPO DE PRÁCTICAS DE EQUIPO DE RIESGO BIOSEGURIDAD LBORATORIO LABORTAORIO SEGURIDAD

1 Básico Nivel 1 Enseñanza TMA Ninguno;

Básica, trabajo en Investigació n. mesa de laboratorio al descubierto 2 Básico Nivel 2 Servicios de TMA y Ropa Trabajo en

Atención protectora; Mesa al Primaria;

señal de riesgo

descubierto y

Diagnóstico, biológico CSB para Investigació

n. posibles

aerosoles 3 Contención Diagnóstico Prácticas de CSB además

Nivel 3 especial, Nivel 2 más de otros investigació n. ropa especial, medios de acceso contención controlado y primaria para

flujo todas las

direccional

del actividades

aire

4 Contención Unidades de Prácticas de CSB de claseIII Máxima Nivel

4 Patógenos Nivel 3 más o trajes peligrosos Cámara de presurizados

Entrada con junto con CSB cierre de Clase II, hermético, autoclave de

(15)

salida con doble puerta ducha y

(a través de la

eliminación pared), aire especial de filtrado. residuos

TMA: Técnicas Microbiológicas apropiadas. CBS: Cámara de Seguridad Biológica

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Tabla 3. Clasificación de los laboratorios según el nivel de riesgo de los microorganismos

Clasificación de los Laboratorios Nivel de Se trabaja con organismos reconocidos como patógenos. Bioseguri

dad

Lugar utilizado para enseñanza, no se manejan especímenes

1

clínicos por lo tanto no se requieren barreras primarias

(BS-1) importantes y solo se necesitan mesas de laboratorio. Equipo de bioseguridad como cámaras de flujo laminar,

recipientes apropiados anti-aerosoles, guantes, anteojos,

cubiertas faciales, respiradoras, mandil.

Nivel de Los agentes son de riesgo moderado como pueden ser: Virus de Bioseguri

dad

la hepatitis B, Salmonella, Toxoplasma, manipulación de sangre y

2

muestras clínicas para diagnóstico clínico y prácticas de

(BS-2) laboratorio, en la cual una buena técnica de manipulación,

apegada a las normas de bioseguridad, garantiza la seguridad del

trabajador. Además de vacunación contra la hepatitis B, el

tétano, la tuberculosis, y otros.

Uso de barreras primarias de bioseguridad, mandil, guantes.

Debe haber sistemas de descontaminación de utensilios y

autoclave.

Nivel de Manejo de agentes transmisibles por aerosoles o porcontacto Bioseguri

dad

con piel y mucosa, incluye diagnóstico e investigación. Entre los

3

agentes están: el Mycobacterium tuberculosis, Coxiella, Virus de

(BS-2) la Encefalitis de San Luis.

Los residuos deben descontaminarse antes de desecharse, la ropa

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lavandería.

Facilidad de las instalaciones, corredores de acceso, puertas con

cierres automáticos, presión negativa, el aire no recirculará y

saldrá expelido por un sistema removedor de partículas HEPA o

tipo N95.

Manejo de muestras siempre con guantes, mandil, protectores

faciales.

Nivel de Manejo de microorganismos muy peligrosos o causantes de Bioseguri

dad enfermedades.

4 Uso obligatorio de cabinas de Bioseguridad tipo III. (BS-4) El personal debe ducharse, y cambiarse de ropa antes de entrar y

salir del área de trabajo.

El edificio debe estar alejado de otras instalaciones y el aire de

salida debe esterilizarse lo mismo que todos los desechos.

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Mantener la seguridad y la integridad del personal que labora dentro de las instalaciones del laboratorio es primordial el uso de medidas de protección sin llevarlas a cabo no deberá realizarse ninguna práctica o proceso experimental sin cumplir con las disposiciones anteriores. Por lo que se detallan a continuación las siguientes reglas a seguir dentro del Laboratorio.

NORMAS DE BIOSEGURIDAD EN EL LABORATORIO. 1. El acceso al laboratorio de prácticas sólo se permite a los alumnos que

estén realizando las prácticas. No se admiten visitas por razones de seguridad.

2. Los Laboratorios de investigación son de acceso restringido al personal del departamento.

3. Es obligatorio utilizar batas o mandil abrochados siempre que se esté trabajando en el laboratorio. Durante el periodo de prácticas, la bata no debe utilizarse fuera del laboratorio.

4. Debe respetarse la prohibición de beber, comer, masticar chicle o fumar en el laboratorio y se debe evitar llevarse a la boca ningún objeto (bolígrafos…) o tocarse los ojos y la nariz.

5. En la superficie de trabajo no deben depositarse en ningún momento ropa u objetos personales.

6. Cada alumno es responsable de la limpieza de su lugar de trabajo y del material asignado, así como de los microscopios que haya usado.

7. Se deben usar los mecheros o lámparas de alcohol con precaución, no dejando material inflamable cerca y evitando el posible contacto con pelo y ropas. Se comprobará que se ha apagado el gas al finalizar el experimento y al abandonar el laboratorio.

8. Está prohibido pipetear con la boca.

9. Ante un vertido accidental de material microbiológico debe informarse inmediatamente al profesor encargado del grupo.

10. No se debe forzar un tubo de vidrio o la apertura de un frasco sin tener protegidas las manos.

11. No se manejarán los autoclaves o el material recién esterilizado si no se dispone de guantes apropiados.

12. La eliminación de residuos, material desechable y material reciclable se realizará siguiendo las pautas de la Práctica N°1, utilizando los contenedores dispuestos a tal efecto.

13. Se deben lavar las manos con jabón antiséptico ante cualquier sospecha de contaminación y siempre antes de marcharse del laboratorio. El trabajo en el laboratorio de microbiología requiere de unas normas básicas en el manejo, orden, y cuidado del material de las personas que laboran allí. Las anteriores normas deben ser empleadas en todo momento. Las siguientes indicaciones generales, son necesarias para llevar a cabo la práctica de laboratorio.

(19)

1. ORGANIZACIÓN

Conforme a grupos de 8 personas en cada mesa de trabajo cada una deberá estar coordinado y organizado por un líder, ya que de todos los miembros dependerá el resultado de la práctica. Se delegará una función a cada integrante del grupo.

(20)

FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. 2. EL ÁREA DE TRABAJO

El laboratorio de microbiología dispone de mesas de trabajo, cada una de ellas equipadas con microscopios, asas, aceite de inmersión, soluciones, gradilla de tinción, colorantes, lámparas de alcohol industrial.

3. UNIDADES DE SERVICIO

El laboratorio dispone de servicio de agua o lavadero que se encuentra al costado del laboratorio, lavarse las manos antes y después de cada práctica es primordial.

4. EQUIPO PERSONAL

Cada alumno debe traer a la práctica: una bata de laboratorio, un lápiz vidriografo, una toallita de manos y una libreta de apuntes. Las personas de pelo largo deben sujetárselo o usar un grupo debe disponer de cinta de enmascarar de media pulgada, jabón de manos y las muestras para cada sesión de trabajo.

5. MATERIALES Y EQUIPOS

Los materiales utilizados para cada práctica serán repartidos por el profesor o líder de cada grupo antes de comenzar. Rotúlelos adecuadamente, indicando su número de grupo, mesa, fecha, número de muestra. Después de que haya realizado la siembra lleve el material a la incubadora – al final de la sesión-. Encienda el microscopio solo el tiempo que lo utilice, guarde la funda y aléjelo de las lámparas de alcohol.

6. LECTURA DE LOS RESULTADOS

Muchas prácticas están dedicadas a observar el crecimiento de los microbios, este solo es visible al cabo de varias horas o días de realizar las siembras, por tal motivo cada laboratorio conlleva una sesión de lectura de los resultados, esta se realiza durante todo el semestre, las lecturas serán semanales y corresponderán al laboratorio inmediatamente anterior, el material no leído también será desechado semanalmente. Una vez tomados los datos de los resultados entregue los cultivos para su eliminación.

7. PRECAUCIÓN DE ACCIDENTES

Informe cualquier accidente o lesión sufrida, en el laboratorio al profesor. Si llega a romper algo no lo recoja con las manos e informe inmediatamente del accidente (RECUERDE QUE TODO MATERIAL ES INFECCIOSO SEA CUIDADOSO). No se debe usar el pelo suelto, use sujetadores para el cabello. Si tiene lesiones en las manos evite el contacto con el material contaminado, utilice guantes.

8. RECOMENDACIONES ACADÉMICAS

Antes de cada sesión entérese sobre el tema de la práctica, lea las instrucciones y consiga el material solicitado. En el transcurso del laboratorio

(21)

tome apuntes constantemente, realice dibujos esquemas de lo observado. Periódicamente el profesor revisará el manual de laboratorio, el cual se llevará de forma individual.

(22)

PRACTICA #1

INTRODUCCIÓN A LA MICROBIOLOGÍA OBJETIVOS

 Aprender la rutina y las técnicas de seguridad en el laboratorio de microbiología.

 Conocer los principales instrumentos utilizados en el laboratorio de microbiología.

 Aprender Técnicas en el manejo de microorganismos.

 Montar correctamente una muestra al microscopio, en seco y húmedo. INTRODUCCION

Células Eucariotas y Procariotas

Los hombres poseemos una idea intuitiva de los seres vivos, a los que reconocemos por su capacidad de crecer, reproducirse y morir, y los identificamos como vegetales o animales.

Los seres vivos están formados por células; algunos son pluricelulares, como las plantas y los animales, pero otros y, por tanto invisibles, por lo que no pudieron ser observados hasta la introducción del microscopio. Existen dos clases de células: las procariotas y las eucariotas.

Tabla 4. Características de los tipos de Células

Características de las Células

Característic

as Célula Eucariota Célula Procariota

Ejemplo Célula Epitelial EscherichiaColi

Cuerpo

nuclear Verdadero Núcleo, membrana No hay membrana nuclear; No

nuclear, mitosis. hay mitosis

ADN Varios o muchos cromosomas, Molécula simple, no acomplejada habitualmente acomplejados

con con histonas

histonas Composición

(23)

las membranas

Sistema Presente en orgánulos con El sistema respiratorio es parte de respiratorio membranas los cloroplastos la membrana plasmática o del

mesosoma; no hay mitocondrias

Aparato Presente en orgánulos con Aparato fotosintético en Fotosintético membranas los cloroplastos membranas internas organizadas;

(24)

FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. La Microbiología

La Microbiología estudia los organismos que son demasiados pequeños para ser claramente percibidos a simple vista, y que se denominan microorganismos, entre ellos bacterias, virus, algas y hongos.

Normas De Bioseguridad Del Laboratorio

Como objetivo principal de esta guía práctica es enseñar a manipular los microorganismos adecuadamente. Aunque los microorganismos deben ser manejados con precaución. Por ello, nunca debe olvidarse la necesidad de cumplir estos dos requisitos básicos.

1. Restringir la presencia de los microorganismos en estudio a sus recipientes y medios de cultivo para evitar el riesgo de contaminación.

2. Evitar que los microorganismos ambientales presentes en la piel, pelo, aire, ropa, etc. Contaminen nuestras muestras.

Para realizar una buena práctica en el laboratorio de Microbiología, se debe tomar en cuenta entre las siguientes reglas de seguridad e indicaciones:

1. Trabajar con calma y concentración. 2. Uso de bata de laboratorio.

3. Lavarse las manos con agua y jabón.

4. El lugar de trabajo debe estar siempre limpio y ordenado.

5. Como cualquier laboratorio, está prohibido comer, beber, y fumar. 6. No se debe nunca pipetear con la boca.

7. Uno de los riesgos principales en un laboratorio de microbiología en la generación de aerosoles que contengan microorganismos, ya que son fácilmente inhalados. Los microorganismos deben manejarse siempre alrededor de la llama del mechero o en una campana de seguridad biológica.

8. El transporte y almacenamiento de placas y recipientes que contienen cultivos representan un riesgo evidente.

9. Bajo ningún concepto debe sacarse ninguna muestra contaminada del laboratorio.

10. Nunca se usará una fregadera, papelera o basura común para

deshacerse del material contaminado. Los desechos contaminados deben ser esterilizados en el laboratorio antes de procesarlos como residuos. 11. En el laboratorio de microbiología debe estar siempre presente y

disponible un botiquín básico de primeros auxilios.

12. En caso de accidente se debe avisar inmediatamente al responsable del laboratorio, dejando a una persona que vigile para evitar que otros se contaminen, y se deberá cubrir el derrame con un desinfectante.

(25)

Un laboratorio de microbiología es un lugar convenientemente habilitado donde se pueden manejar y examinar microorganismos. Este tipo de trabajo se lleva a cabo con una buena técnica aséptica y por tanto se requiere un ambiente limpio y ordenado.

(26)

Tabla 5. Clasificación de los agentes infecciosos según su riesgo biológico

Clasificación de Microorganismos según su riesgo biológico Riesgo de _{Profilaxis o} Grupo de Riesgo Riesgo Infeccioso Propagació n a tratamiento_eficaz la Colectivida d 1 Poco probable que

causen una No Innecesario

enfermedad Pueden causar una

2

enfermedad y _Generalmente

constituir un probablePoco

posible peligro para los

manipuladores Pueden provocar una enfermedad 3 grave y

constituir _Probable Generalmente

un serio peligro posible

para los manipuladores Provocan una 4 enfermedad grave No conocido en_la

y constituyen un Elevado _actualidad serio peligro

para los

manipuladores

Materiales De Laboratorio (Generalidades)

En el laboratorio encontramos distintos tipos de materiales: vidrio, plástico, porcelana…Ninguno de ellos, cumple todas las exigencias de laboratorio; así pues debemos elegir entre ellos, la elección va a depender de la aplicación, del tipo de producto y de la economía.

(27)

El Vidrio

Uno de los requisitos más importantes que debe cumplir el material de vidrio es poseer una gran resistencia química al agua, ácido, bases, y temperatura. Entre ellos:

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SALUD. ESCUELA MEDICINA

Tabla 6. Materiales de Vidrio más usados en el Laboratorio de Microbiología. Materiales de Vidrio más usados en el Laboratorio de Microbiología

Material Descripción Gráfico

Vaso Recipientes calibrado aproximado o no precipitad

o calibrado, usados habitualmente para contener soluciones, realización de mezclas.

Matraz Al igual que los vasos precipitados se trata de Erlenmeye

r material de calibración aproximada, no precisa, pero que permite agitar de manera

circular mezclas sin que estas se re rieguen.

Varillas de Generalmente se trata de un tubo de vidrio agitación hueco y cerrado en los extremos. Se emplea

para agitar soluciones.

Agitador Pequeña barra magnética cubierta poruna Magnético capa de plástico (teflón) y una placa debajo de

la cual se tiene un magneto rotatorio a fin de

(28)

Portaobjet

os Es una lámina de vidrio, generalmente de

forma rectangular, empleado para depositar

muestras que han de ser observadas al

microscopio. Cubreobje

tos Son láminas de vidrio que se colocan sobre muestras que se han de mirar al microscopio

Pipetas de

Permiten la succión de pequeñas cantidades

Pasteur de sustancia. No están calibradas, permiten dispensar el líquido gota a gota.

Tubo de Pequeño tubo cilíndrico de vidrio con un ensayo extremo abierto (que puede poseer una tapa)

y el otro cerrado y redondeado, que se utiliza

en los laboratorios para contener pequeñas

(29)

Caja Petri

Recipiente redondo, de cristal o plástico, con

una cubierta de la misma forma que la placa.

Gradilla

Se

emplea para colocar tubos de ensayo y mantenerlos en posición

vertical.

Pinza hecha de platino y un filamento de Asa nicromo que termina en un arito de 5 mm o

en punta. Se emplea para transportar o

Bacteriológi

ca arrastrar o trasvasar inóculo (pequeño volumen que contiene

microorganismos en suspensión).

Hisopo

Instrumento de plástico o de madera con los extremos

rodeados de algodón utilizado para recoger muestras y

hacer extendidos en medios de cultivo.

Palillo de

Pequeño

s trozos de madera redondeadacon extremos puntiagudos, para tomar muestra s y

diente _{emulsiones en los} portaobjetos.

Resistente al agua, al alcohol y a la formalina,

Rotulador

ciertos pueden ser a base de ceras. Sirven para

detallar la fecha, nombre, procedencia de la

(30)

Lámpara de

Es un recipiente ovalado de vidrio resistente al calor,

que almacena alcohol industrial que empapa un

alcohol cordón de algodón hacia el exterior. Sirve para calentar y esterilizar pequeños

materiales. El plástico

Cada vez son más útiles de laboratorio que se fabrican en material de este tipo. Generalmente se trata de material desechable, en los que se debe evitar de forma especial las contaminaciones.

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LA SALUD. ESCUELA MEDICINA

Tabla 7. Equipos Básicos de Laboratorio de Microbiología

Equipos Básicos del Laboratorio de Microbiología

Material Descripción Gráfico

Balanzas Es un sistema de análisis que se usan para medir la

masa.

Centrífuga Aparato que pone en rotación una muestra para acelerar la

decantación o la sedimentación

de sus componentes o fases,

según su densidad por medio

de la fuerza centrífuga.

(31)

Autoclave Recipiente de presión metálico de paredes gruesas con un

cierre hermético que permite

trabajar a alta presión para

realizar una reacción industrial,

una cocción o una esterilización

con vapor de agua.

Incubador

a Dispositivo que sirve para manten er y hacer crecer cultivos microbiológico s o cultivos celulares.

Plato Aparato con el de poder Calentador calentar y mezclar fluidos

contenido s en recipientes de laboratori o como Erlenmeye r, tubos de ensayo y tubos de

precipita do.

Cronómetr

(32)

El Microscopio

Los microscopios ópticos comúnmente usados en microbiología comprenden varios tipos: de campo claro, de contraste de fases, de campo oscuro, y de

florescencia. El microscopio corriente se denomina de campo claro, porque

forma una imagen oscura frente a un fondo claro; en el de contraste de fases las pequeñas diferencias en el índice de refracción y densidad de la muestra se convierten en variaciones de intensidad de luz; en el de campo oscuro, el campo oscuro rodea la muestra aparece negro y el objeto intensamente iluminado; en el de fluorescencia, la imagen se forma cuando la muestra marcada con flúocromos emite luz.

Microscopio de

Campo Claro

En esta sección se dará a conocer el manejo del microscopio de campo

claro. Todos los microscopios son de alto costo, fácilmente dañables, por lo

cual su cuidado es indispensable para mantenerlo en buenas condiciones. Para ellos es necesario la familiaridad con sus partes y tener los conocimientos teóricos de la función de cada una. Así mismo, deben seguirse instrucciones para su transporte, limpieza, encendido, y apagado y enfoque de la preparación que se indican posteriormente.

El microscopio de campo claro está formado por un cuerpo metálico compacto que incluye una base o soporte y un brazo, donde se fijan el resto de las partes. En la base se encuentra la fuente de luz; en la parte inferior del brazo se encuentra la platina, donde se coloca el portaobjetos o revólver, que sostiene 4 o 5 objetivos de diferentes magnificaciones y en el extremo, la cabeza portaoculares y los oculares.

Los microorganismos son seres microscópicos. Su tamaño se mide en micras (micrómetro: µm), nanómetro (nm) y el angstrom (Ǻ)

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Sistema de Lentes

Presenta tres lentes colocados a partir de una fuente de luz en el siguiente orden: un condensador, un juego de objetivos instalado en un soporte denominado revólver y uno, dos o tres oculares, según se trate de un cabeza monocular, binocular o triocular; en este último caso el tercer lente está dispuesto para un equipo fotográfico u otro aditamento óptico.

Objetivos. Usualmente los microscopios de luz tienen 4 - 5 objetivos. El de menor aumento es opcional (mal llamado lupa) y generalmente es de 2,5 o 4X; luego se incluyen objetivos de 10X, 20X, 40X, 100X, ese último también denominado lente de inmersión, por requerir aceite de inmersión. Los objetivos de menor aumento son más cortos que los de mayor aumento. A la vez, los primeros tienen valores pequeños de abertura numérica (AN); por lo tanto, el lente de inmersión tienen el máximo valor de AN, que generalmente oscila entre 1.2 a 1.3.

Condensador. El condensador está localizado bajo la platina, tiene la función de condensar la luz en el objeto.

Diafragma Iris. Permite cerrar y abrir regulando el AN del condensador Oculares. Están colocados en una cabeza de portaoculares. El aumento final de la imagen está dado por la combinación del poder magnificante del objetivo y el ocular.

Sistema de Iluminación

Los dos sistemas más comunes son el bombillo de filamento y la lámpara de halógeno. En ambos casos la fuente de luz está localizada en un espejo parabólico que produce un haz de luz dirigido hacia el condensador.

Limpieza

Asegurarse de dejar el microscopio siempre limpio, teniendo especial cuidado con el objetivo de inmersión. Cubrir el microscopio con un protector para el polvo, que en nuestro medio debería ser de tela.

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FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA

El microscopio electrónico (1934) 1. Mayor número de aumentos

2. Acceso a ultraestructura 3. El primero, 1931

4. Los microscopios

electrónicos utilizan rayos de electrones en lugar de la luz, lo que les permite tener un poder de resolución muy elevado. La longitud de onda de los rayos de electrones es de 0,005 - 0,0003 nm, muy corta comparada con la de la luz visible (426 - 750 nm; violeta - rojo).

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FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. Microscopio de barrido: 1965

Microscopía de criofractura 1979

Las dos caras de fractura de la membrana nuclear

Otras técnicas

Reconstrucción tridimensional a partir de imágenes de Microscopia Electrónica

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FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA MATERIALES

Para el reconocimiento de materiales de Laboratorio 1. Vaso Precipitado. 2. Pipeta de Pasteur. 3. Tubos de ensayo. 4. Cajas Petri. 5. Portaobjetos. 6. Cubreobjetos. 7. Varilla de Vidrio. 8. Matraz Erlenmeyer. 9. Asa Bacteriológica.

Para el reconocimiento de Equipo Básico de Laboratorio 1. Incubadora.

2. Autoclave Horizontal, Vertical. 3. Centrífuga. 4. Balanza. 5. Calentador. 6. Cronómetro. 7. Microscopio. MEDIOS Y REACTIVOS 1. Aceite de Inmersión. PROCEDIMIENTOS

1. Con las descripciones anteriores de los materiales que se requieren en el laboratorio, se procederá a identificarlos y reconocerlos, en cada una de los grupos de trabajo en sus respectivas mesas correspondientes.

2. Para realizar el enfoque de las placas de los frotis se realizan los siguientes pasos:

2.1. Colocar el portaobjetos sobre la platina; con el material a examinar hacia arriba, Escoger el lente objetivo de bajo poder (10X si se van a observar bacterias). Cerciorarse que el condensador esté colocado arriba y el diafragma cerrado, para luego regular paulatinamente la cantidad de luz. Encender el microscopio; si se tiene un regulador de intensidad de luz, girar progresivamente el control desde cero hasta el punto deseado, sin sobrepasar el límite indicado en el regulador.

2.2. Iniciar el enfoque con el control macrométrico y ajustar con el micrométrico. Mantener ambos ojos abiertos, aun cuando el microscopio sea monocular; si es binocular, ajustar la distancia entre los de acuerdo con la distancia entre los ojos. Examinar siempre la preparación en bajo poder; esto permitirá obtener una visión panorámica, evaluar la calidad de la preparación en bajo poder; esto

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2.3. Regular la cantidad de luz con el diafragma; notar que cuando se cierra se reduce la intensidad de la luz, mejora el contraste y aumenta la profundidad de campo; sin embargo, pierde poder de resolución, por lo que debe manejarse cuidadosamente.

2.4. Mover la preparación al girar los tornillos del carro mecánico, colocadas a un lado de la platina. Cuando se haya localizado el sitio que se desea examinar, proceder a aumentar la magnificación. Para la observación de bacterias usualmente se pasa del objetivo que se está utilizando (10X) al de 4X para colocar fácilmente el aceite de inmersión y luego se gira el portaobjetivos hasta el objetivo de 100X (o de inmersión). Abrir el diafragma iris; si no se hace, perderá poder de resolución y en esta magnificación esto es crítico.

2.5. Nuevamente cerciorarse que el condensador esté colocado “arriba”. Si el enfoque previo en 10X ha sido correcto, únicamente se necesitará ajustar el enfoque girando suavemente el micrométrico. Si el microscopio es de buena calidad estará parfolizado, (manteniendo la imagen en foco aunque cambie de objetivo) y no será necesario hacer ajustes groseros con el macrométrico para enfocar.

GRÁFICOS

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FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. CONCLUSIÓN

 Los individuos que trabajan en el laboratorio, corren el riesgo de infección, por lo que se debe adoptar un conjunto de normas de seguridad que sirven para reducir a un nivel aceptablemente bajo el riesgo inherente a la manipulación de todo el material peligroso, sea físico o químico o biológico.

 Entre los materiales de laboratorio más importantes y que serán utilizados en el laboratorio son: portaobjetos, asa bacteriológica, lámpara de alcohol; equipo de laboratorio: autoclave, cronómetro, incubadora y microscopio.  Las Normas de Bioseguridad tiene en consideración la protección de la

integridad del individuo con el fin de mantener seguro las instalaciones disponibles, el equipo, las prácticas y los procedimientos necesarios en contra de la exposición de posibles microorganismos o agentes patógenos.

 Los elementos mínimos que componen el microscopio óptico son una lente objetivo y otra ocular que produce imágenes ampliadas. Además del sistema óptico de lentes, los microscopios ópticos poseen un sistema de soporte, un sistema mecánico de ajuste y un sistema de iluminación. El principio de funcionamiento del microscopio óptico es el de

utilizar dos juegos de lentes convergentes que se encuentran situados en los extremos de un tubo para amplificar una imagen.

CONCEPTOS BÁSICOS Asepsia: Ausencia de microorganismos patógenos.

Microorganismos Patógenos: Es causante de enfermedad.

Contaminación: Presencia de agentes infecciosos vivos en la superficie del cuerpo, prendas de vestir o artículos sucios (no constituye infección).

Infección: penetración y desarrollo o multiplicación de un agente infecciosos en el organismo de una persona o animal.

Enfermedad infecciosa: Enfermedad clínicamente manifiesta del hombre resultados de una infección.

Asepsia médica: Normas ideadas para reducir el número de transmisión de microorganismos patógenos, ej.: lavado de manos.

Desinfección: proceso por el que se da muerte a microorganismos

patógenos pero no necesariamente a sus esporas, aplicado sobre un objeto inanimado (inerte).

Desinfectante: Sustancia empleada para la desinfección, ej.: alcohol yodado, sablón. Antisepsia: Proceso de lisis o inhibición del crecimiento bacteriano sobre la superficie de tejidos vivos.

Antiséptico: Sustancia empleada para la antisepsia. Por lo general su uso es inocuo en las personas ej.: alcohol 70°, agua oxigenada.

Espora: Microorganismos que en determinadas circunstancias producen una especie de cápsula que le permite pasar por una fase de inactividad, que

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más tardeen situaciones adecuadas recuperan su actividad, ej.: Clostridium tetan, causante del tétanos.

Limpieza: Es la remoción mecánica de toda materia extraña en el ambiente, en superficies y objetos utilizando para ello el lavado manual o mecánico. Normalmente se usa agua y

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detergente para este proceso. El propósito de la limpieza es disminuir el número de microorganismos a través de arrastre mecánico y no asegura la destrucción de éstos. Bactericida: Sustancia química que elimina todas las bacterias, patógenas y no patógenas, pero no necesariamente las esporas bacterianas.

Bacteriostático: Sustancia química que previene el crecimiento de bacterias, pero no necesariamente las destruye. En muchas ocasiones la diferencia entre bactericida y bacteriostático únicamente depende de las condiciones de aplicación: tiempo, temperatura, pH.

CUESTIONARIO.

1. Cite 5 normas de bioseguridad de mayor importancia en el laboratorio de microbiología.

2. Verdadero o Falso

Entre los materiales y quipos más utilizados de microbiología tenemos:

Cucharón, espátula, asa bacteriológica. ( ) Lámpara de alcohol, autoclave, incubadora. ( )

Varilla, cucharón y portaobjetos. ( )

Portaobjetos, asa bacteriológica, microscopio. ( )

3. Observar al Microscopio asignado y rotular adecuadamente el gráfico siguiente:

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PRACTICA #2

MORFOLOGÍA DE LOS MICROORGANISMOS OBJETIVOS

 Definir las características de las formas bacterianas, describiendo sus respectivas agrupaciones, microscópicamente.

 Identificar los aspectos fundamentales de la morfología bacteriana macroscópicamente.

INTRODUCCION

Entre las principales características de las bacterias se encuentran, su tamaño, forma, estructura, y tipo o modo de agrupación. Todas estas características van a constituir la morfología propia de las células bacterianas.

Las bacterias son de pequeño tamaño, por lo que para su observación es preciso utilizar el microscopio óptico. Su tamaño se mide en µm (0.000001) y oscila entre 0,2 y 2 µm.

La morfología nos da una información primaria sobre el tipo de bacteria, pero no de forma concluyente.

Las formas básicas son: esférica (coco), bastoncillo o cilíndrica (bacilo), helicoidal (espirilo), en forma de coma (Vibrio), espiral (espiroqueta), estrella y cuadrangular.

Tabla 8. Morfología Bacteriana

Morfología Bacteriana

Formas Descripción Gráfico

Micrococcus

Dispuestos de manera individual y

separados de unos de los otros. Diplococos

Cocos Forma

Esférica _{Son cocos dispuestos en parejas.} Esferoides, _{Ejemplo: Neisseria meningitidis}

ovoides, lanceolados

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Son cocos dispuestos en cadenas. Ejemplo: Streptococcus pyogenes

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FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA Son cuatro cocos agrupados

Sarcina

Es la Agrupación de 8 cocos en forma de cubo. Ejemplo:

Micrococcus.

Estafilococos

Son agrupaciones de cocos en racimos irregulares. Ejemplo:

Staphylococcus aureus. Diplobacilos Bacilos en parejas Estreptobacilos Bacilos en cadenas Bacilos Forma alargada Rectos, Empalizada. ahusados, ramificados , Cocobacilos. curvos, espirales. Extremos en Maza. Extremos Redondos. Extremos Cuadrados. Fusiformes.

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FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA Espirilo. Vibriones. Helicoidale s _Borrelia. También llamadas espirales, son las Treponema. espiroquet as que tienen espiras flexibles y ondulantes . _Leptospira.

Estructuras Externas de las Bacterias

Una célula bacteriana típica presenta una serie de estructuras fuera y dentro de su pared celular. No todas las estructuras se encuentran en todas las bacterias, pero alguna si son comunes.

En el exterior de una célula bacteriana pueden encontrarse tres tipos de estructuras: los flagelos, los cuales permiten la movilidad o locomoción, los Pili también llamados fimbrias, pequeños “pelos” con funciones diversas y la cápsula, que es una capa mucoide que rodea a la célula.

Flagelos

Una bacteria puede tener uno o más flagelos, y la localización de este último en la célula puede varias, dependiendo de la especie bacteriana. Si los flagelos se localizan en un extremo o en ambos extremos de la bacteria, reciben el nombre de flagelos polares. Si se presentan un solo flagelo, la bacteria se denomina monotrica; si posee dos o más flagelos en solo uno de los extremos, se llaman lofotrica; si posee dos o más flagelos en ambos extremos, reciben el nombre de anfitricas; y si posee flagelos en toda la superficie se denominan peritricas.

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FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. Tabla 9. Disposición de los Flagelos.

Disposición de los Flagelos

Monotric

as Lofotricas

Anfitricas Peritricas

Pilis o Fimbrias

Apéndices diminutos, también filamentosos, rectos y cortos, distribuidos por toda la superficie, y le permiten a la bacteria la transferir material genético (Pili sexual), otros sirven para adherirse a las superficies.

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FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA Cápsula

La Cápsula está formada por una sustancia viscosa, en sí polisacáridos segregados por la célula bacteriana, sirven para proteger a la bacteria de la desecación, la protege de virus bacterianos y de los efectos de metales pesados que le son tóxicos.

Colonias Bacterianas.

Una colonia es una agrupación de bacterias, que se desarrollan en un medio propicio con nutrientes.

Forma de las Colonias

Según el espesor, se dividen en: planas, elevadas, semiconvexas, cóncavas, semicóncavas, semiesféricas, en meseta.

Según los bordes, se dividen en: lobuladas, onduladas, rizoides, redondeadas, filamentosas, espiculadas.

Superficie de Colonia

Corresponde al aspecto de la colonia y se dividen en:

– Lisa, rugosa, acuminada, mucosa, seca, es importante diferenciarlas, ya que éstas suelen presentar cápsulas según su superficie lisas o rugosas, donde las segundas suelen presentar cápsulas u otros componentes superficiales que proporcionan un aspecto más compacto o rugoso, relacionando este tipo de bacterias con una mayor virulencia. Consistencia de la Colonia

Las colonias pueden ser duras, viscosas, mucosas, secas, muy secas, cremosas, etc. Las colonias mucosas, son muy típicas de levaduras y menos frecuentes en bacterias. En general, la mayor parte de las bacterias producen colonias de consistencia más o menos mantecosa, aunque existen excepciones.

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FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. MATERIALES  Portaobjetos.  Cubreobjetos.  Palillos.  Lámpara de alcohol.  Guantes.  Mascarilla.  Mandil. Equipo Microscopio. MEDIOS Y REACTIVOS  Aceite de Inmersión.  Suero Fisiológico.  Muestra de Heces. PROCEDIMIENTOS

Para poder realizar diferenciar la morfología bacteriana, es necesario realiza un frotis en fresco, el cual es un método de observación in vivo de bacterias, el cual se realiza de la siguiente manera.

1. Utilizar los guantes, mascarilla, mandil.

2. Encender la lámpara de alcohol, disponer la muestra de heces atrás de la lámpara encendida.

3. Disponer el portaobjetos delante de la lámpara de alcohol, colocando una pequeña gota de suero fisiológico.

4. Con ayuda de un palillo sacar una pequeña muestra de heces detrás de la lámpara de alcohol, y extender encima de la gota de suero fisiológico, emulsionando la muestra.

5. Colocar un portaobjetos encima del frotis en fresco, y llevar a observar al microscopio, y dibujar en una hoja bond las bacterias.

6. Si se requiere observar con mayor detenimiento amplificando más la imagen usar el aceite de inmersión.

GRÁFICOS

Realización del frotis en fresco. Emulsión de la muestra de heces con la gota de suero fisiológico.

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FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA Tabla 10. Ejemplos de la Morfología y Agrupaciones de las bacterias en la Observación al Microscopio

Morfología y Agrupaciones de las Bacterias

Cocos Grampositivos

Staphylococcus Micrococcus Streptococcus

Neumococo Peptococcus Peptostreptococcus

Cocos Negativos

Neisseria Moraxella Acinetobacter

Bacilos Grampositivos

Corynebacterium Propionibacterium Listeria

Lactobacillus Bacillus Clostridium

Actynomices Nocardia Borrelia

Bacilos Gramnegativos

Gardnerella Haemophilus Brucella

Enterobacterias Pseudomonas Vibrio

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FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. CONCLUSIÓN

 Los cocos se agrupan en parejas (diplococos), en cadenas más o menos largas (estreptococos), en racimos (estafilococos), y en tétradas o paquetes cúbicos (micrococos), los bacilos se agrupan en parejas (diplobacilos), raramente en cadenas (Estreptobacilos), en empalizada, letras (X,L, V) y caracteres chinos (corinebacterias); los espirilos suelen agruparse pero pueden distinguirse formas con una sola curvatura, semejantes a una coma (vibrios), y con varias curvaturas y aspecto ondulado (campilobacterias). Algunas bacterias presentan un gran polimorfismo; otras, formas filamentosas y ramificadas semejantes a micelios de hongos (actinomicetos), unas pocas, formas largas, finas o gruesas, enrolladas en espiral (espiroquetas).

 El frotis directo obtenido por disolución de una partícula muy pequeña de heces en una gota de agua o de solución fisiológica, constituye un método sencillo y rápido de examen de parasitología (protozoarios, huevos de tenia) más no de bacteriología.

 La morfología y agrupaciones típicas de las bacterias solamente se observan cuando las células son jóvenes. En los cultivos o cuando las bacterias están sometidas a condiciones desfavorables, surgen las llamadas formas de involución: los cocos se hinchan, los bacilos se curvan o parecen ramificarse y las estructuras internas desaparecen.

CUESTIONARIO

1. Elabore un mapa conceptual acerca de la distinta morfología bacteriana de los cocos.

2. Cite ejemplos de géneros bacterianos de Cocos Grampositivos. 3. Esquematice la diferente disposición de los flagelos en una

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PRACTICA #3

DESINFECCION Y ESTERILIZACIÓN DE MATERIALES OBJETIVOS

 Conocer los principios generales de las técnicas de esterilización de vidrios de uso común en Microbiología.

 Observar el efecto de las condiciones de asepsia en el control de la contaminación microbiana en el laboratorio.

INTRODUCCION

Todo material que va a ser utilizado en el laboratorio de microbiología deberá cumplir una serie de condiciones entre ellas, y de forma esencial, una total asepsia del material que se va a utilizar, aunque no siempre es estrictamente necesario. Esto dependerá de las prácticas que se realicen en cada momento. Así pues, en todo laboratorio de microbiología se deberá tener en cuenta que:

 Todo material utilizado para la recogida de cualquier tipo de muestra que posteriormente será procesada ene laboratorio deberá estar totalmente esterilizado.

 Todo material utilizado para la realización de las pruebas oportunas (placas petri, tubos de ensayo, medios de cultivo, pipetas, asas de siembra), en un laboratorio de microbiología deberá estar estéril.

 Es fundamental que todo material que tenga que estar en contacto con un gérmen problema esté estéril.

 Antes de cualquier esterilización, el material deberá estar limpio y/o desinfectado.

 Conviene, si es económicamente viable, utilizar material desechable.  En el laboratorio de microbiología, el material de uso aséptico deberá

guardarse separadamente del de uso séptico.

 La manipulación de todo material y/o muestra deberá ser la adecuada siguiendo el protocolo de trabajo preciso, teniendo en cuenta las medidas cautelares para la prevención de accidentes laborales.

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FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. Bioseguridad

“Conjunto de procedimientos y normas para conservar la salud de las personas con actividad de riesgo para adquirir enfermedades”.

Para aislar un microorganismo de un proceso infeccioso es necesario inocularlo en un sistema estéril.

La Desinfección y la Antisepsia

Son elementos claves en cada una de las actividades en que se desarrolla un acto médico.

Esterilización

Es la condición de estar libre de microorganismos en cualquiera de sus formas puede realizarse por métodos físicos y químicos. Es un estado absoluto de pureza.

Desinfección

Es la eliminación selectiva de ciertos microorganismos indeseables a fin de impedir su transmisión por interferencia en su estructura o metabolismo.

Es selectiva y se aplica a objetos inanimados o superficies. En general se usan agentes químicos desinfectantes o germicidas.

Antisepsia

Es el uso de una sustancia química, no tóxica (antiséptico) sobre tejidos vivos, para prevenir o detener el crecimiento o la acción de los microorganismos, ya sea inhibiendo su actividad o destruyéndolos. Asepsia

Estado libre de microorganismos. Métodos de Esterilización Físicos Calor. Radiaciones. Filtración. Ultrasonido. Químicos

Distintas sustancias: como óxido de etileno, glutaraldehído y formaldehído.

Mecanismos de Acción 1.

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Alterando el ADN.

Radiaciones como UV, ionizantes.

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FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. 2. Alterando las proteínas y enzimas.

Calor, ácidos y álcalis.

Oxidantes, como el peróxido de hidrógeno y Iodo. Metales pesados, como el mercurio.

3. Alterando la membrana celular. Mediante el uso

de:

Alcoholes. Fenoles.

Agentes Tenso-activos, como amonios cuaternarios, jabones y detergentes. Factores que afectan la potencia desinfectante

1. Tiempo 2. Temperatura 3. PH

4. Concentración del agente. 5. Presencia de Materia Orgánica 6. Características del Microorganismo. Esterilización Físicos Calor Seco: Incineración. Flameado. Aire caliente. Húmedo: Vapor. Fluente. A presión. Tindalización. Aire Caliente

Horno de Pasteur o Estufas

Material de Vidrio, metales, objetos termoestables, a una temperatura de: 160°C X 2 hs 170°C X 1 hs 180°C X 3 min Calor Húmedo Autoclave Vapor Fluente:

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FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. Vapor a Presión:

Más utilizado y más seguro: Todo tipo de material de laboratorio como medios, instrumental, ropa.

121°C X 15 min 134°C X 7 min

Las temperaturas alcanzadas son: 1 at: 121°C; 1,5 at: 126°C y 2 at: 134°C. Agentes Químicos Desinfectantes: Alcohol. Fenol. Jabones. Detergentes catiónicos. Soluciones cloradas. Ácidos y Álcalis. Formaldehído. Antisépticos: Alcohol Etílico al 70%. Clorhexidina. Jabones. Detergentes. Soluciones Yodadas. Metales Pesados. Peróxido de Hidrógeno 3-6%. Fenoles y Derivados

Actúan en presencia de materia orgánica.

Al 5% excelente desinfectante para Mycobacterium tuberculosis, es de olor muy picante y tóxico.

Alcoholes

Etílico o isopropílico al 70%.

Concentraciones menores al 45% tienen una actividad incierta.

Desinfección y antisepsia 2 minutos de contacto mata casi al 90% de los microorganismos cutáneos.

Clorhexidina

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Actúa en presencia de materia orgánica.

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Detergentes catiónicos (amonios cuaternarios) Mayor actividad a PH alcalino.

No son esporicidas, ni tuberculicidas. En la actualidad las Pseudomonas son refractarias. Su acción es interferida por la presencia de materia orgánica, y son neutralizados pro jabones y detergentes aniónicos. Se usan como “desinfectantes” (saneamiento ambiental).

Cloro y Compuesto

El más usado: Hipoclorito de Na.

Se usan como “desinfectantes” de superficie de instrumentos de laboratorio, en solución acuosa, material contaminado 1/10, sino al 0.3%.

Inestable, las soluciones se deben preparar en el momento y proteger de la luz y el calor.

Iodo y Compuestos

Para antisepsia de heridas y piel. Peróxido de Hidrógeno

Se utiliza al 3-6%.

Solución madre al 30%, a partir de aquí se hace la solución final. Se debe preparar antes de usar. Guardar en frasco caramelo.

Para antisepsia de heridas y desinfección (dispositivos médico-quirúrgicos y lentes de contacto blandos)

Formaldehído

Se presenta comercialmente en solución acuosa al 40%, a partir de ella se realiza la solución final al 3 u 8 % según su uso.

Formalina al 8% esporicida, no menos de 18 hs. A

temperatura ambiente. Para “desinfección” (laboratorio, instrumental, guantes).

Preparación de vacunas al 0,2% - 0,4%.

Los materiales deben seguir el mismo tratamiento que para el óxido de etileno y glutaraldehído. MATERIALES Portaobjetos. Hisopos. Paletas o baja-lenguas. Pipetas de 10 ml. Cajas Petri. Papel de Empaque. Piola de algodón. Matraz Erlenmeyer. Vaso de Precipitación. Equipo

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FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. MEDIOS Y REACTIVOS

Hipoclorito de sodio. (NaClO). Agua destilada (H2O)

PROCEDIMIENTOS

1. Revisar que la válvula de seguridad del autoclave funcione normalmente.

2. Proceder a colocar una cantidad necesaria en el recipiente del autoclave, seguidamente colocar la rejilla base de la olla que sostendrá los materiales que se pretenden esterilizar.

3. Con ayuda de papel de empaque, y piola de algodón, proceder a envolver cada uno de los materiales a esterilizar.

4. Colocar todos los materiales envueltos en la olla del autoclave.

5. Colocar la tapa del autoclave encima de la olla que contiene los materiales.

6. Tomando en cuenta la seguridad del autoclave, cerrar las válvulas a la par, es decir cada válvula del lado contrario se cerrarán dos a la vez. 7. Encender el autoclave vertical y esperar a que comience a subir la

temperatura.

8. Revisar que la válvula de seguridad se encuentre en perfecto estado, y que el registro de presión sea de 15 libras de presión durante 30 min. 9. Colocar los materiales dentro del autoclave horizontal, y abrir la

compuerta.

10. Guardar los materiales en el autoclave horizontal y cerrar la puerta.

11. Encender el autoclave y revisar que la presión y la temperatura se mantengan constante.

12. Verificar que la presión del autoclave horizontal sea de 15 lb de presión por 30 min.

13. Una vez que ambos autoclaves ya llegaron a la presión y temperatura óptima de esterilización, dejar reposar y esperar a que el vapor interno se disipe. Una vez que haya toda la seguridad de haber extraído la mayor parte de vapor, abrir el autoclave y sacar los materiales empaquetados.

14. Una vez que se requiera de algún material de laboratorio se buscará en los estantes de materiales, y durante la práctica si se va a utilizar en ese momento se sacará el material del empaque y se trabaja solo con el material esterilizado.

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FACULTAD CIENCIAS DE LA SALUD. ESCUELA MEDICINA GRÁFICOS

Tabla 11. Procedimiento de esterilización de Materiales de Laboratorio. Procedimiento De Esterilización De Materiales De Laboratorio

Paso N° 1 Paso N° 2

Paso N° 3 Paso N° 4

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Paso N° 7 Paso N° 8

Paso N° 9 Paso N° 10