Universidad de los Andes
Facultad de Ciencias
Departamento de Ciencias Biológicas
Hormonas del estrés en lobos Italianos (Canis lupus)
Lorena Valeria Moro Jiménez
Tesis de grado presentada como último requisito para optar al
título de Biología
Director
Duccio Berzi
Codirector
Carlos Jaramillo
Bogotá D. C., febrero 2004
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AGRADECIMIENTOS
A Duccio Berzi y Carlos Jaramillo por ser el Director y el Codirector de este trabajo.
A mi papá y a mi mamá quienes me apoyaron desde el principio e hicieron posible la realización de este proyecto.
A la familia Tombarelli y Monika, que me acogieron y me brindaron su apoyo y compañía durante mi estadía en la Abadía de Moscheta.
A mi familia de aquí y de allá por su preocupación, ayuda y soporte. A Federico Botero por su comprensión, soporte y espera.
TABLA DE CONTENIDO
Pág. RESUMEN 4 OBJETIVOS 5 INTRODUCCION 6 MARCO TEORICO 8SITUACION DEL LOBO EN ITALIA 8
EL ESTRÉS 10 LA RESPUESTA AL ESTRÉS: LOS GLUCOCORTICOIDES 11 MATERIALES Y METODOS 14 AREA DE ESTUDIO 14
RECOLECCION DE LAS MUESTRAS 14
ANALISIS DE LAS MUESTRAS 18
EXTRACCION 19 RADIOINMUNOENSAYO 19 ANALISIS ESTADISTICO 21 RESULTADOS 22 DISCUSION 24 BIBLIOGRAFIA 26
4 RESUMEN
Los lobos se ven constantemente expuestos a diferentes estímulos que pueden llegar a crear momentos de gran tensión. La respuesta fisiológica al estrés se traduce en la activación del sistema hormonal, causando la liberación de glucocorticoides en el organismo. La medición del nivel de estas hormonas puede ser un buen método para monitorear el estado de los animales frente a diversos disturbios.
En este trabajo se intentó determinar si el aumento del turismo y de la actividad humana tenía relación alguna con el nivel de glucocorticoides en los lobos italianos. Diferentes muestras de heces fueron recogidas usando un método no invasivo durante tres meses y fueron analizadas mediante un radioinmunoensayo sobre microplaca.
Se encontró que no existen diferencias significativas entre los tres meses de muestreo. Sin embargo, junto con el comienzo de la actividad humana en la zona, se pudo observar un incremento en los niveles de hormonas del estrés en los lobos. Por lo que podemos decir que probablemente esto si está teniendo un efecto sobre los individuos.
OBJETIVOS
• Dar una primera aproximación en la cuantificación indirecta del nivel de glucocorticoides en lobos italianos.
• Aplicar el método de radioinmunoensayo sobre microplaca para analizar muestras de heces.
• Determinar el nivel de Cortisol a partir de las muestras.
• Determinar si existe relación entre la actividad humana y el nivel de glucocorticoides fecales.
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INTRODUCCIÓN
El lobo italiano (Canis lupus) es uno de los animales menos estudiados. Su estado taxonómico no es del todo claro ya que estudios morfológicos lo ubican como una subespecie distinta a otras poblaciones de lobos. Sin embargo, distintos estudios genéticos contradicen esta afirmación. Análisis alozímicos y estimativos de la divergencia nucleotídica entre haplotipos de ADN mitocondrial indican una baja diferenciación genética entre las distintas poblaciones (Randi et al. 1993; Randi et al. 1998). Estudios de la ecología, comportamiento y fisiología han mostrado ser de gran importancia dentro de este grupo de organismos no solo para entender la dinámica de sus poblaciones sino también para establecer cómo la acción del hombre puede afectar su supervivencia.
Hacia 1970 la caza extensiva y la fragmentación del hábitat estaban llevando a esta especie a su extinción (Ciucci y Boitani 1998). Sin embargo gracias a la protección que se consiguió tanto para la especie como para sus presas, el lobo italiano sobrevivió y actualmente extiende sus territorios a lo largo del país. Pero a pesar de esto, el hombre sigue influenciando la estabilidad de las poblaciones de lobos. Una manera novedosa de observar dicho efecto es medir las variaciones de los ciclos hormonales. Distintos estudios han mostrado que los glucocorticoides son hormonas estrechamente relacionadas con el estrés. La concentración de cortisol presenta una relación directa con la depresión del sistema inmune lo que puede causar una reducción en la tasa de apareamiento.
Este trabajo pretende hacer una primera aproximación en la cuantificación indirecta del nivel de estrés de algunos de estos animales, midiendo los niveles de glucocorticoides fecales (cortisol), como respuesta a la presencia
de diferente número de visitantes y a la actividad humana en una zona del complejo Demanial Giogo-Casaglia (Florencia, Italia).
8 MARCO TEORICO.
Situación del lobo en Italia.
Históricamente el lobo ocupaba todo el hemisferio norte. Sin embargo actualmente, las poblaciones de esta especie disminuyeron considerablemente y solo se les encuentra en América del norte, en los países de la ex Unión Soviética y en Europa centro oriental (Berzi et al, 1999). En Italia se encuentran poblaciones menos significativas, las cuales han estado aisladas de las demás por casi un siglo. A comienzos de 1900, el lobo italiano fue considerado como una subespecie del lobo europeo, Canis lupus italicus (Altobello, 1921). Sin embargo, actualmente esto ya no se considera así puesto que gracias a las recientes investigaciones que se llevan a cabo a nivel de microsatélites y secuenciación de ADN mitocondrial (Randi, E.), se ha concluido que no existen razones suficientes para justificar la subespecie. Es por esto que viene siendo actualmente considerado como un ecotipo de este (C. lupus lupus) (Berzi et al, 1999).
A comienzos del siglo pasado y casi hasta los años 70, la situación del lobo en Italia era altamente alarmante, pues las poblaciones disminuían cada vez más a causa de la caza, legal en esas épocas, y sobre todo por la persecución excesiva por parte de los granjeros quienes veían en el lobo un cazador potencial de sus ganados (Tabla 1). Fue así que los lobos fueron extinguidos en los Alpes y en la isla de Sicilia. Se presumía que quedaban entre unos 80 a 100 individuos en ese entonces, distribuidos en grupos aislados en el Apenino central y meridional. Había gran incertidumbre si la pequeña población que sobrevivía podría salir del “cuello de botella” en el que había caído (Berzi y Valdrè, 2002).
Tabla 1. Población de lobos en Italia en diferentes años (Berzi y Valdrè, 2002). Fecha Estimación de la población viviente Fuentes Hasta 60´s 200 Tassi 1971 1972 100 Zimen y Boitani 1975 1977 200 Boscagli 1985 1980 100 Boitani 1981 1982 150 Boitani 1983 1983 200 Boitani y Fabbri 1983 1984 220 Boitani 1984 1985 240 Boitani 1986 1987 200 Boscagli 1997 1988 300 Boitani et al. 1989 1990 300 Ciucci y Boitani 1991 1991 400 Boscagli y Gandolfi 1992 1994 450 Boitani 1994 1998 Más de 500 Ciucci y Boitani 1998
Afortunadamente la población se restableció, su número aumentó y se han ido extendiendo por el territorio italiano. Actualmente se cuentan más de 500 individuos y su distribución va desde los Alpes Marítimos, regiones de Piamonte y Liguria (pasando por Francia) hasta la región de Calabria al sur (Figura 1).
Fig. 1. Distribución del lobo en Italia: la línea negra representa la distribución en 1973 (Zimen
y Boitani 1975); en gris la de 1998 (Corsi et al. 1998) (Ciucci, Boitani, 1998). La franja verde muestra la expansión en los últimos años.
El estrés “natural” no es tan perjudicial ni nocivo para los animales ya que no son estímulos que duren mucho tiempo, por lo que la respuesta fisiológica no es constante y permanece en un nivel bajo. Además, cierto nivel de estrés es necesario para que el organismo del individuo funcione correctamente (ver adelante).
El siguiente grupo de estrés, el provocado, no es tan inofensivo como el anterior. Por el contrario puede llegar a ser letal incluso para una especie. Este tipo de estrés es el causado por el hombre, debido al aumento y desplazamiento de las poblaciones humanas hacia los territorios del lobo. Esto ha generado una exclusión competitiva entre estas dos especies. La competición con el hombre no solo ha logrado una reducción en número de individuos por muerte directa, sino que las técnicas utilizadas para erradicar las poblaciones de lobos de estas zonas generan estrés por persecución (Mech, 1970). Además crea tensión por la disminución del hábitat lo que va haciendo que tengan menos espacio para delimitar sus territorios. Adicionalmente, la intromisión del turismo en los pocos territorios que les queda se convierte en un factor más de estrés que poco a poco amenaza el futuro de la especie.
La respuesta al estrés: los glucocorticoides.
La respuesta fisiológica a los diferentes estímulos externos que provocan estrés se ve reflejada en la activación del eje hipotálamico-pituitario-adrenal cuya consecuencia es la liberación en el organismo de glucocorticoides (GCs). Los GCs son hormonas esteroideas con influencias muy diversas sobre las funciones del cuerpo. Dichas influencias consisten en ayudar al cuerpo a combatir condiciones adversas duraderas en el medio (Romer, 1981). Estas hormonas son sintetizadas en la corteza adrenal y el cortisol (o hidrocortisona) es la principal hormona glucocorticoide ya que es
12 responsable de cerca el 95% de toda la actividad glucocorticoide suprarrenal (Guyton, 1995).
El control de la secreción de los GCs esta regulado por la hormona adrenocorticotrópica o más comúnmente corticotropina (ACTH) la cual es secretada por la hipófisis anterior. Esta a su vez es controlada por el hipotálamo gracias a la secreción de la hormona liberadora de la corticotropina (CRH) (Figura 2).
Fig. 2. Mecanismo de regulación de la secreción de los glucocorticoides (Guyton, 1995)
Los efectos de los GCs se ejercen sobre el metabolismo de los carbohidratos, de las proteínas y de los ácidos grasos. Las elevaciones de los niveles de GCs redirigen las reservas para movilizar energía que puede ser utilizada para resolver la situación estresante, (Sapolsky en Creel, 2001), pero también resulta muy útil para el mejoramiento de la aptitud de los individuos.
Si el estímulo estresante es duradero, es decir, si los niveles de GCs son demasiado elevados y esto persiste por un largo periodo de tiempo, las consecuencias patológicas pueden llegar a ser letales. El suministro de fuertes dosis de cortisol determina una relevante atrofia de todo el tejido linfoide del organismo, lo que, a su vez, hace disminuir la formación de linfocitos T y de anticuerpos por parte del mismo (Guyton, 1995). Así, el sistema inmunitario del individuo sufre una baja considerable, sus músculos se ven desgastados e incluso se presenta una supresión en la reproducción, por lo que la aptitud decae. Es por esto que, a causa de estos efectos potenciales en el estatus fisiológico, la medición de los glucocorticoides puede ser valiosa en estudios de ecología evolutiva, biología de conservación y en el bienestar animal (Goymann, 1999).
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MATERIALES Y MÉTODOS
Área de estudio.
El área donde se realizó la recolección de muestras forma parte de un gran complejo natural conocido como COMPLESSO DEMANIALE GIOGO-CASAGLIA. La zona de Moscheta está ubicada a aproximadamente 50 Km. de Florencia sobre la cadena Apenínica, entre las regiones Toscana y Emilia Romagna (Apenino Tosco-Romagnolo).
El área cuenta con una extensión de aproximadamente unos 300 km2 y elevaciones que oscilan entre los 500 y los 1200 metros sobre el nivel del mar.
Es probablemente uno de los mejores ambientes para el lobo pues posee montañas poco elevadas, bosques extensos y alimento abundante.
Recolección de las muestras.
La recolección de muestras se basó principalmente en la recuperación de heces debido a que la toma de estas en sangre implica la presencia humana y el proceso de captura del individuo generaría un factor de estrés el cual podría interferir en los resultados finales. Se utilizó el método de Snow tracking el cual consiste en el seguimiento de los individuos a partir de las huellas dejadas sobre la nieve (Berzi y Valdrè, 2002). Esto sugiere tanto un buen conocimiento del área en la cual se está trabajando como de las rutas o lugares más frecuentados por los lobos. Para determinar si las huellas encontradas en el barro o nieve pertenecen a un lobo o a un perro debido a su gran similitud, se utilizó la variación en el tamaño y la disposición de las mismas sobre su andar. En general las huellas del lobo miden alrededor de 10 a 11 cm. de largo y de 9 a 10 cm. de ancho (Figura 3). Además las huellas de lobo están dispuestas a lo largo de una línea recta y siguen
recorridos mucho más rectilíneos que las de los perros (Berzi, Valdré. 2002) (Figura 4).
Fig. 3. Foto de huella de lobo sobre nieve y esquema para mostrar su tamaño.
(Berzi y Valdrè, 2002)
Fig. 4. Las diferentes formas de andar del lobo: galope ligero, galope veloz, trote lento.
(Boscagli, 1985) Galope ligero Galope veloz Trote lento
16 Por otro lado, las heces de los lobos son bastante características (Foto 1): tienen una forma cilíndrica, son gruesas (más o menos 3 cm. de diámetro) y contienen por lo general fragmentos de huesos y pelos de sus presas además de poseer un olor fuerte y penetrante
Foto 1. Heces de lobo. Foto tomada en el punto 1 del sendero 00 (Fig. 5) el 19 de marzo de
2003 por Lorena Moro.
Los excrementos fueron encontrados por lo general en lugares como cruces, pasos, ensanchamientos de las carreteras y su posición era bien visible.
La recolección se llevó a cabo en los meses de invierno, ya que la nieve hace más fácil seguir sus huellas y las bajas temperaturas ayudan a preservar las muestras. En total se realizaron 16 salidas a campo (Tabla 2), los recorridos fueron a pie utilizando los senderos y caminos forestales (Figura 5), los
cuales son también muy usados por los lobos ya que estos les facilita el desplazamiento a través de los bosques y además sirven de limites para demarcar sus territorios.
Tabla 2. Tabla de salidas y recolección de muestras.
Sendero Fecha Punto de recolección Total de muestras recogidas Moscheta - Serra 18/02/2003 Moscheta-Giogarello- Serra 22/02/2003 Moscheta-Lame-Serra 23/02/2003 Punto 6 1 Moscheta-Giogarello- Serra 08/03/2003
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Fig. 5. Mapa de los senderos recorridos para la recolección de las muestras. En negro son
representadas las carreteras principales asfaltadas, en gris las secundarias y en rojo los caminos forestales. El marcado como 00 es el sendero de recorrido principal y los puntos numerados son los lugares de recolección.
Análisis de las muestras.
El análisis de las muestras fue llevado a cabo por la Doctora Claudia Simontacchi y su equipo de colaboradores del laboratorio del departamento de ciencias experimentales veterinarias de la Universidad de Padua, Italia.
El análisis de las muestras se realizó principalmente en 2 fases: extracción e inmunoensayo. Florencia Bolonia Moscheta Serra Lame Giogarello Giogo
Extracción.
Al momento de la recolección las muestras fueron congeladas y conservadas de esta forma hasta su utilización. Se procedió entonces a realizar la extracción de los esteroides de la muestra fecal, en este caso el cortisol. Esta es la primera fase de trabajo de 7 que implica llevar a cabo el análisis radio inmunológico. Para este procedimiento las muestras fueron descongeladas a temperatura ambiente, se mezclaron para homogeneizarlas y se tomó un gramo de cada una, el cual fue congelado en nitrógeno líquido para luego ser macerado hasta obtener una muestra en polvo. A 100 mg de esta muestra se le adicionó 0,5 ml de tampón RIA (Tampón fosfato, pH 7,2) y el total fue extraído con éter di etílico, agitando por 10 minutos a temperatura ambiente en un agitador rotatorio y centrifugando a 1500 g por 5 minutos a 5°C.
Después del congelamiento de la fase acuosa a -20°C, el sobrenadante fue decantado en probetas cónicas de vidrio y fue secado bajo corriente de aire. El residuo seco fue rehidratado con 500 µl de tampón RIA y agitado por 15 minutos sobre un agitador horizontal. Para el RIA fueron utilizadas alícuotas de 20 µl.
Radioinmunoensayo.
El nivel de cortisol fecal fue medido utilizando un análisis radio inmunológico (RIA) sobre microplaca, que es una variante en fase sólida de los métodos tradicionales radioinmunológicos en fase líquida. Esto implica el uso de microplacas en vez de probetas, con lo cual se economiza reactivo (líquido centelleante) y se simplifica la metodología de separación libre/ligado. Este método se caracteriza por su sensibilidad y especificidad.
20 Se llevaron a cabo 6 pasos de trabajo para poder realizar con éxito el RIA.
El primer paso consistió en la adsorción del anticuerpo anti-IgG de conejo. Para esto 200 µl de anticuerpo (producido en una cabra) fueron diluidos al 1:1000 con acetato de sodio (0,15 mM pH9) y se distribuyeron en los 96 pozos de la microplaca. Se dejó incubar por una noche a 4°C con el fin de que se realizara la adsorción del anticuerpo sobre las paredes del pozo. Una vez desocupada la microplaca, a cada pozo se le agregó 200 µl de tampón RIA conteniendo albúmina bovina (BSA). Después de una segunda incubación (1H, 4°C), la microplaca fue desocupada y conservada a -20°C (no más de 4 semanas) hasta el momento de la utilización.
El siguiente paso fue la incubación con el anticuerpo específico anti-cortisol. Para esto a cada pozo se le agregaron 200 µl de antisuero anti-cortisol diluido al 1:8000, se dejó incubar por una noche a 4°C, para luego desocupar y lavar la microplaca con tampón RIA.
Para la incubación con la muestra extraída de las heces, fueron añadidos a cada pozo 20 µl de muestra, 10 µl de cortisol 3H (trazador marcado) y 180 µl de tampón RIA y se dejó incubar por una noche a 4°C.
A este punto se obtuvo la fase de separación del antígeno marcado libre del antígeno marcado ligado al anticuerpo, la cual se efectuó por enjuague de los pozos: la microplaca fue desocupada y lavada 4 veces con tampón RIA (200 µl por pozo) así las moléculas de antígeno marcado que fueron ligadas al anticuerpo permanecieron adheridas a las paredes del pozo mientras que el antígeno libre fue lavado.
Finalmente se preparó la microplaca para la lectura de la radioactividad: 200 µl de líquido centelleante (Microscint 20 – Packard) fueron distribuidos en
cada pozo. Luego, la microplaca sellada a calor con su respectiva película, fue puesta en el contador de centelleos (Topcount-Packard).
Para cada microplaca se preparó una curva de calibración del siguiente modo: 50 µl de cantidades crecientes de Ag no marcado (3.125, 6.25, 12.5, 25, 100, 200 pg), 10 µl de cortisol marcado y 150 µl de tampón RIA.
Análisis estadístico.
Los análisis estadísticos y gráficos fueron realizados con el programa STATISTIX 7 para windows (Analitycal software 2000). La tendencias de los datos fueron mostradas por medio de un gráfico de cajas (box y Whisker plot) (Gráfico 1).
Para observar si existían diferencias entre los tratamientos, se realizó en primera instancia la prueba de normalidad Shapiro Wilk para ver si los datos eran normales. Al ser estos datos no normales se utilizó la prueba no paramétrica de Kruskal Wallis y se determinó si existían diferencias significativas entre los meses de muestreo.
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RESULTADOS
A partir de la recolección hecha en la zona de Moscheta durante los meses de muestreo se obtuvieron 9 muestras de heces de lobo italiano. Dichas muestras se encontraron en su mayoría, por senderos de gran tamaño y en un estado bien conservado. Al realizar la extracción del cortisol de estas muestras se encontraron concentraciones de este glucocorticoide en un rango entre 0.9 y 40 ng/g de heces secas (Tabla 3). Con estas concentraciones, se realizó una prueba de normalidad (Shapiro Wilk), donde se rechazó la hipótesis nula de distribución normal de los datos (W = 0.7159, P = 0.0022), razón por la cual se realizó la prueba para datos no paramétricos de Kruskal Wallis.
Tabla 3. Resultados de la medición de los niveles de cortisol en las heces de lobos.
Muestra Fecha de recolección Características Peso de la muestra en g Cortisol ng/g de heces fecales secas 1 23-02-03 PELO, HUESOS 5,1 7,1 2 19-03-03 PELO 5,4 5 3 19-03-03 PELO 7,9 4 4 19-03-03 PELO 6,1 15,3 5 28-03-03 HECES 6,7 0,9 6 29-03-03 PELO, HUESOS 16,8 5,7 7 9-04-03 PELO, HUESOS 7,7 7,4 8 16-04-03 HECES 35,9 11,3 9 16-04-03 PELO, HUESOS 13,7 40
Los resultados encontrados no mostraron diferencias significativas entre los distintos meses de muestreo (K. W. 3.48, P = 0.1751). Sin embargo si observamos los promedios, los máximos y los mínimos graficados en un diagrama de cajas (box y whisker plot; Fig. 6) vemos que la variación en el promedio entre los meses de febrero y marzo no fue tan grande, pero al
observar los promedios entre los meses de marzo y abril se encuentra una ligera tendencia a un aumento de la concentración de cortisol en las muestras de heces.
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DISCUSION
Aunque ya hacia el mes de marzo las condiciones ambientales comienzan a mejorar (los días se alargan, la temperatura ambiente aumenta y la vegetación comienza a crecer) no es sino hasta comienzos de abril que empieza a verse la actividad humana. El turismo hacia la zona crece y se da inicio a las actividades pastorales.
Estadísticamente los resultaron mostraron que no hay razones suficientes para determinar que hubo diferencias significativas en los niveles de glucocorticoides entre los 3 meses. Sin embargo en el mes de abril, junto con la actividad humana, se observó un incremento en el nivel de cortisol. Este aumento pudo ser causado por el acrecentamiento de turistas en la zona y por el tránsito de estos y de automóviles por los senderos forestales que los lobos también usan. Esto puede explicar además la dificultad de obtención de muestras a medida que pasaba el tiempo. Los animales al sentirse invadidos muy probablemente se alejaron de la zona trasladándose hacia la parte alta de las montañas o simplemente ocupando otros territorios, evadiendo así los caminos y los lugares frecuentados por los humanos.
Por otro lado, estudios llevados a cabo en lobos de Estados Unidos mostraron que si existía una correlación entre el aumento de las hormonas del estrés y la actividad y el uso de vehículos de nieve de los humanos (Creel, 2002).
Sin embargo, con este tipo de estudios no se puede concluir si los lobos sufren de alguna de las patologías provocadas por un estrés prolongado o repetitivo, o si la aptitud de los individuos está decayendo. Aunque los métodos para medir el nivel de glucocorticoides fecales son simples y efectivos y se sugieren para monitorear los efectos humanos en las poblaciones animales, inclusive los efectos incipientes (Creel, 2002), no nos dan una aproximación sobre el estado patológico del organismo.
Además hay que tener precaución y realizar estudios bien planificados para observar que tanto el estrés influye negativamente en los animales. Por ejemplo se podría observar si las elevaciones de GCs están teniendo efectos negativos en la dinámica de población o en la demografía (Creel, 2002). Para esto, junto con los estudios de GCs se debería llevar a cabo un estudio de la población de la especie en cuestión.
Por otro lado, hay que mirar hasta que punto el estrés provocado por los humanos puede ser nocivo, ya que por el contrario las situaciones podrían llegar a ser beneficiosas para los lobos, como lo muestra Creel en su estudio sobre el efecto de los vehículos para nieve en los lobos: los animales sacaban de los trayectos realizados por los vehículos, ya que aplanaban y compactaban la nieve lo que los ayudaba en su desplazamiento.
Las situaciones que creemos estresantes deben ser evaluadas y estudiadas, para discernir si son positivas o potencialmente negativas, y de este modo saber si los animales sufren o pueden sacar beneficios de nuestras acciones.
Existen todavía muchos aspectos desconocidos de las especies animales y esto genera muchos campos de investigación. La medición de glucocorticoides se puede aplicar a cualquier animal de cualquier especie, esté libre o en cautiverio. Es un estudio importante ya que puede llegar a ser una herramienta muy valiosa en estudios de conservación, evolución y protección de la vida animal.
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BIBLIOGRAFIA
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Ciucci, P. Boitani, L. 1998. Il lupo. Elementi di biologia, gestione, ricerca. Istituto Nazionale per la Fauna Selvatica “Alessandro Ghigi”, Documenti Tecnici, 23. Bologna, Italia.
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