Estudio de la ecología de Ulmus laevis Pallas en la Península Ibérica

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(1)DEPARTAMENTO DE SILVOPASCICULTURA ESCUELA TÉCNICA SUPERIOR DE INGENIEROS DE MONTES UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID. ESTUDIO DE LA ECOLOGÍA DE Ulmus laevis Pallas EN LA PENÍNSULA IBÉRICA. MARTIN DAVID VENTURAS Licenciado en Ciencias Ambientales. DIRECTORES:. CARMEN COLLADA COLLADA. LUIS GIL SÁNCHEZ. Doctora en Ciencias Químicas. Doctor Ingeniero de Montes. 2013.

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(3) UNIVERSIDAD POLITÉCNICA DE MADRID. Tribunal nombrado por el Magfco. y Excmo. Sr. Rector de la Universidad Politécnica de Madrid, el día ……… de ………………… de 201… Presidente: ………………………………………………………. Vocal: …………………………………………………………….. Vocal: …………………………………………………………….. Vocal: …………………………………………………………….. Secretario: ……………………………………………………….. Suplente: ………………………………………………………… Suplente: …………………………………………………………. Realizado el acto de defensa y lectura de la Tesis el día ….. de ………… de 201… en la E.T.S.I. / Facultad ……………………………………. EL PRESIDENTE. LOS VOCALES. EL SECRETARIO.

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(7) AGRADECIMIENTOS La realización de esta tesis doctoral ha sido posible gracias al trabajo, el cariño y el apoyo de muchas personas, por ello quiero dar las gracias: A mis directores, Luis Gil y Carmen Collada, quienes son los mayores responsables de que esta tesis haya llegado a buen puerto y que a lo largo de estos años me han enseñado a “hacer ciencia”. A los coautores de los manuscritos. A Rosana López y Antonio Gascó por su inestimable ayuda con la anatomía e hidráulica. A Victoria Fernández y Juan José Lucena por abrirme las puertas de la nutrición del hierro. A Paula Guzmán por estar siempre dispuesta a echar una mano con lo que sea. A Nikos Nanos por ayudarme a navegar en el complejo mundo de la estadística y modelización. A Ramón Perea por añadir la perspectiva de la interacción del olmo con la fauna a este trabajo. A Pablo Fuentes por haberme ayudado en los temas más diversos desde que inicié mis trabajos con el olmo, pero sobre todo por su ayuda con la genética. And thanks to Richard Ennos for having hosted me at the University of Edinburgh, and for teaching me many things about population genetics. Thanks to Steve and Janet Davis for having hosted me in their house and treating me like a son during my stay at Pepperdine University. And to Steve for having taught me most of what I know about water relations in plants. A Jorge Domínguez, Eva Miranda, Miriam Fajardo, Guillermo González, Elena Zafra, Ana Moreno, José Carlos Miranda, Zaida Lorenzo, Juan Martín y Paloma Nadal por su asistencia técnica, sin la cual no dispondría de la mayoría de los datos de esta tesis. A Unai López, David Macaya, Juan Antonio Martín, Javier Cano, Sven Mutke, Pedro Perdiguero, María Valbuena y Jesús Rodríguez por resolver muchas de mis dudas y por sus valiosos comentarios. A Salustiano Iglesias por su constante apoyo al Programa del Olmo. A Enrique Sastre, Carlos Guadaño y la cuadrilla del vivero de Puerta de Hierro por mantener las parcelas de ensayo y su apoyo técnico. A Eudaldo González y César Cardo por sus inventarios de las poblaciones de olmos ibéricas. A Pablo Sanjuanbenito y a los gestores y guardería del Parque Regional Cuenca Alta del Manzanares por permitirnos trabajar en la olmeda de Valdelatas y por su apoyo. A Inés González por empujarme hacia el mundo de la investigación y animarme a continuar mis estudios tras graduarme como Ingeniero Técnico Forestal. A la Universidad Politécnica de Madrid por financiarme con una beca PIF. Al Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO), al Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente (MAGRAMA) y a la Comunidad de Madrid por financiar los trabajos de esta tesis. A Cristina Olano por la magnífica ilustración de la contraportada. A todos mis amigos por conseguir que no perdiera la cordura por culpa de los olmos, ya que siempre estaban dispuestos a escucharme, aguantarme, organizar alguna excursión al campo o ir de cañas para desconectar y pasarlo bien. A Elena que ha sido muy comprensiva y que con su cariño me ha ayudado a superar los momentos de mayor estrés del final de la tesis. Y en especial a mis padres por revisar el inglés de mis artículos y, sobre todo, por haberme apoyado constantemente a lo largo de todos mis años de formación, asegurándose de que nunca me faltara de nada y siempre animándome a seguir adelante con mis estudios. Es por ello que quiero dedicarle esta tesis a mis padres y a mi abuelo, Opa, que lamentablemente ya no está con nosotros, pero que hubiera estado muy feliz y orgulloso de ver a un nieto suyo convirtiéndose en doctor.. ¡Muchas gracias a todos!.

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(9) Resumen. RESUMEN Esta tesis doctoral pretende profundizar en el conocimiento de la ecología de Ulmus laevis Pallas, especie autóctona en peligro de extinción en la Península Ibérica, con el fin de proponer medidas adecuadas para su conservación. Se ha estudiado la distribución natural de la especie atendiendo a aspectos edáficos. Los resultados muestran que U. laevis presenta menor capacidad de acidificación de la rizosfera, menor actividad de la reductasa férrica y menor homeostasis que U. minor Mill. cuando crecen en sustratos con una disponibilidad de hierro limitada. Estas diferencias ayudan a comprender la distribución de ambas especies en la Península Ibérica: U. laevis se ve restringido a suelos ácidos o moderadamente ácidos, mientras que U. minor es capaz de habitar tanto suelos ácidos como básicos. Se han analizado las propiedades hidráulicas y anatómicas de U. laevis, constatando que sus características son favorables en ambientes con gran disponibilidad hídrica y que se trata del olmo ibérico más vulnerable a la cavitación por estrés hídrico, por lo que la aridificación del clima y la pérdida de los freáticos supone un riesgo para sus poblaciones. Para evaluar la capacidad de recuperación de la especie se han estudiado la diversidad y estructura genética espacial de las dos mayores poblaciones españolas. Los resultados evidencian que estas poblaciones mantienen niveles de diversidad equiparables o ligeramente superiores a los europeos, pese a haber sufrido un cuello de botella prolongado durante las glaciaciones y a las reducciones poblacionales recientes. En la actualidad la endogamia no representa un riesgo para estas poblaciones. También se ha analizado la producción, dispersión y predación de semillas en Valdelatas (Madrid). Los resultados han mostrado que el viento dispersa las sámaras a corta distancia (<30 m) y que los años no veceros las probabilidades de establecimiento de regenerado son bajas. Además, la producción de sámaras vanas puede tratarse de un carácter adaptativo que aumenta la eficiencia biológica de la especie, ya que favorece la supervivencia de las semillas embrionadas disminuyendo sus tasas de predación pre- y post-dispersión. La modificación del hábitat de esta especie como consecuencia de las actividades humanas afecta de manera negativa al establecimiento del regenerado. La conservación de esta especie a largo plazo requiere la recuperación de los niveles freáticos y de regímenes hidrológicos que permitan avenidas, ya que estas crean las condiciones adecuadas para el establecimiento de regenerado al eliminar la vegetación preexistente y depositar barro. Palabras clave: reductasa férrica, anatomía, anemocoría, cavitación, clorosis férrica, conservación, dispersión, distribución, diversidad genética, ecología reproductiva, estrés hídrico, estructura genética, extrusión de protones, hidrocoría, intervención humana, kernel de dispersión, olmo, partenocarpia, predación, regenerado, Ulmus, vecería, xilema.. i.

(10) Abstract. ABSTRACT Ulmus laevis Pallas is an endangered species in the Iberian Peninsula. Therefore, in order to be able to propose adequate management guidelines for its conservation, this PhD Thesis intends to advance the knowledge on the species ecology in the region. Firstly, the species natural distribution was studied in relation to soil nature. Results show that U. minor Mill. had a higher root ferric reductase activity and proton extrusion capability than U. laevis, and maintained a better nutrient homeostasis when grown under iron limiting conditions. These differences in root Fe acquisition efficiencies proved helpful to understand the distribution of these species in the Iberian Peninsula, where U. laevis is restricted to acid or moderately acid soils, whereas U. minor can grow both in acid and basic soils. Secondly, we studied Ulmus laevis’ xylem anatomy and hydraulic traits. These proved favourable for growing under high water availability, but highly susceptible to drought-stress cavitation. Therefore, this species is vulnerable to the Iberian Peninsula’s aridification. Spatial genetic structure and diversity were evaluated in two of the biggest U. laevis populations in Spain in order to evaluate their recovery capabilities. These populations maintain similar or slightly higher diversity levels than European populations, despite having undergone an ancestral genetic bottleneck and having suffered recent population size reductions. No inbreeding problems have been detected in these populations. Seed production, dispersal and predation were assessed in Valdelatas’ elm grove (Madrid). Despite U. laevis samaras being winged nuts, wind dispersed them short distances from the mother tree (<30 m). The seed shadow models show that non-mast years provide very few chances for the stand to regenerate due to their low full seed flux. Empty samaras deceive pre- and post-dispersal predators increasing full seed survival probabilities. Therefore, empty fruit production might be an adaptive trait that increases plant fitness. Finally, human-induced changes in water-table levels and river regulation may affect U. laevis seed dispersal and regeneration establishment negatively. The long-term conservation and expansion of this species in the Iberian Peninsula requires the recovery of water-tables and of natural hydrological regimes, as flooding eliminates vegetation, creating open microhabitats and deposits mud, creating the ideal conditions for seedling establishment. Keywords: anatomy, anemochory, conservation, dispersal kernel, distribution, drought-stress, elm, genetic diversity, habitat transformation, hydrochory, iron chlorosis, iron reductase activity, masting, parthenocarpy, predation, regeneration, root proton extrusion, reproductive ecology, seed dispersal, spatial genetic structure, Ulmus, xylem cavitation.. ii.

(11) Índice. ÍNDICE ÍNDICE DE TABLAS ................................................................................................................................ v ÍNDICE DE FIGURAS ............................................................................................................................. vi ABREVIATURAS PRINCIPALES .......................................................................................................... vii 1. INTRODUCCIÓN ................................................................................................................................. 1 1.1. Ulmus laevis Pallas en la Península Ibérica ............................................................................ 3 1.2. Naturaleza edáfica y distribución de especies ........................................................................ 5 1.3. Susceptibilidad al estrés hídrico .............................................................................................. 8 1.4. Biología reproductiva .............................................................................................................. 10 1.4.1. Perspectiva genética ....................................................................................................... 10 1.4.2. Producción, consumo y dispersión de semillas .............................................................. 11 2. OBJETIVOS ....................................................................................................................................... 15 3. MATERIAL Y MÉTODOS .................................................................................................................. 19 3.1. Evaluación de la eficiencia de los mecanismos de absorción de hierro en Ulmus laevis y U. minor (Anexo I) ............................................................................................................. 21 3.1.1. Cultivo de plantas ............................................................................................................ 21 3.1.2. Evaluación fisiológica de la respuesta al reabastecimiento de hierro ............................. 22 3.1.3. Evaluación de la capacidad de extrusión de protones de las raíces .............................. 23 3.1.4. Evaluación de la actividad de la reductasa férrica .......................................................... 23 3.1.5. Análisis estadísticos ........................................................................................................ 24 3.2. Estudio de la vulnerabilidad a la cavitación por estrés hídrico en las especies ibéricas del género Ulmus (Anexo II) ............................................................................................ 25 3.2.1. Material vegetal ............................................................................................................... 25 3.2.2. Curvas de vulnerabilidad y conductividad hidráulica ...................................................... 26 3.2.3. Propiedades anatómicas ................................................................................................. 28 3.2.4. Análisis estadísticos ........................................................................................................ 28 3.3. Análisis genético de poblaciones de Ulmus laevis (Anexo III) ........................................... 28 3.3.1. Poblaciones estudiadas................................................................................................... 28 3.3.2. Análisis moleculares ........................................................................................................ 30 3.3.3. Análisis estadísticos ........................................................................................................ 30 3.4. Producción, dispersión y predación de semillas de Ulmus laevis (Anexos IV, V y VI) ............................................................................................................................................... 32 3.4.1. Lugar de estudio .............................................................................................................. 32 3.4.2. Fenología, muestreo y caracterización de las sámaras .................................................. 34 3.4.3. Modelización de la dispersión de sámaras ..................................................................... 35 3.4.4. Modelización de la dispersión del regenerado ................................................................ 37 3.4.5. Efectos de la meteorología sobre la dispersión de sámaras .......................................... 37 3.4.6. Identificación de la fauna granívora ................................................................................ 38. iii.

(12) Índice. 3.4.7. Predación pre-dispersión ................................................................................................ 39 3.4.8. Predación post-dispersión .............................................................................................. 39 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ......................................................................................................... 43 4.1. Eficiencia de los mecanismos de absorción de hierro de U. laevis y U. minor ................ 45 4.2. Susceptibilidad al estrés hídrico de los olmos ibéricos ..................................................... 51 4.3. Diversidad y estructura genética de poblaciones de U. laevis........................................... 58 4.4. Producción, predación y dispersión de sámaras de U. laevis ........................................... 65 4.4.1. Fenología floral ............................................................................................................... 65 4.4.2. Producción y dispersión de sámaras .............................................................................. 66 4.4.3. Dispersión efectiva ......................................................................................................... 72 4.4.4. Identificación de la fauna granívora ................................................................................ 74 4.4.5. Factores involucrados en la predación post-dispersión ................................................. 75 4.4.6. Importancia de la vecería y producción de frutos partenocárpicos ................................ 78 4.4.7. Importancia del microhábitat ........................................................................................... 80 4.5. Implicaciones para los proyectos de gestión y conservación ........................................... 81 5. CONCLUSIONES / CONCLUSIONS ................................................................................................ 85 6. BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................................. 91 7. ANEXO DE PUBLICACIONES ....................................................................................................... 107 Publicaciones científicas Anexo I. Venturas M, Fernández V, Nadal P, Lucena J, Guzmán P, Gil L. Ulmus laevis and U. minor iron uptake efficiency differences related to their distribution in the Iberian Peninsula. Manuscrito. Anexo II. Venturas M, López R, Gascó A, Gil L. (2013) Hydraulic properties of European elms: Xylem safety-efficiency tradeoff and species distribution in the Iberian Peninsula. Trees – Structure and Function. DOI: 10.1007/s00468-013-0916-7 Anexo III. Venturas M, Fuentes-Utrilla P, Ennos R, Collada C, Gil L (2013) Human-induced changes on fine-scale genetic structure in Ulmus laevis Pallas wetland forests at its SW distribution limit. Plant Ecology 214(2): 317-327. Anexo IV. Venturas M, Nanos N, Gil L. The reproductive ecology of Ulmus laevis Pallas in a transformed habitat. Manuscrito. Anexo V. Perea R, Venturas M, Gil L (2013) Empty seeds are not always bad: Simultaneous effect of seed emptiness and masting on animal seed predation. Plos One 8(6): e65573. Anexo VI. Perea R, Venturas M, Gil L. Foraging on the ground or in the tree? Mechanisms underlying seed predation by an assemblage of granivorous birds. Manuscrito. Publicaciones de divulgación Anexo VII. Venturas M, Collada C, Gil L (2011) Una olmeda singular en la Dehesa de Valdelatas (Fuencarral-Madrid). Foresta 52: 469-477. Anexo VIII. Venturas M, Collada C, Iglesias S, Gil L (2013) Guía técnica para la conservación genética y utilización del negrillo (Ulmus laevis) en España. Foresta, Madrid, 6 pp.. iv.

(13) Índice de tablas. ÍNDICE DE TABLAS Tabla 3.1 Cronograma del ensayo de nutrición de hierro ..................................................................... 22 Tabla 3.2 Diseño del experimento de evaluación de la predación post-dispersión .............................. 41 Tabla 4.1 Índice SPAD y concentración de clorofila y hierro de las hojas ............................................ 46 Tabla 4.2 Contenido mineral de tallos y hojas ....................................................................................... 48 Tabla 4.3 Contenido mineral de las semillas de olmos ......................................................................... 50 Tabla 4.4 Características de las hojas y morfología de los olmos del ensayo de hidráulica ................ 52 Tabla 4.5 Características anatómicas del xilema de los olmos ............................................................. 52 Tabla 4.6 Propiedades hidráulicas de los olmos ibéricos ...................................................................... 54 Tabla 4.7 Diversidad y diferenciación genética de las poblaciones estudiadas .................................... 59 Tabla 4.8 Análisis demográficos ............................................................................................................ 63 Tabla 4.9 Distancias de dispersión de las sámaras .............................................................................. 67 Tabla 4.10 Factores del modelo de predación post-dispersión ............................................................. 76 Tabla 4.11 Parámetros del modelo de predación post-dispersión ........................................................ 76 Tabla 4.12 Concentración de nutrientes en las sámaras llenas y vanas .............................................. 80. v.

(14) Índice de figuras. ÍNDICE DE FIGURAS Fig. 1.1 Mapa de distribución de U. laevis .............................................................................................. 4 Fig. 1.2 Localización de las poblaciones de U. laevis en España y pH del suelo .................................. 6 Fig. 1.3 Estrategias de captación de hierro de las raíces ....................................................................... 8 Fig. 1.4 Estructura genética de U. laevis en el oeste de Europa .......................................................... 11 Fig. 1.5 Sámaras de U. laevis ............................................................................................................... 13 Fig. 3.1 Cultivo hidropónico de brinzales de U. minor y U. laevis ......................................................... 21 Fig. 3.2 Plantas del ensayo de extrusión de protones .......................................................................... 23 Fig. 3.3 Plantas del ensayo de evaluación de la actividad de la reductasa férrica .............................. 24 Fig. 3.4 Distribución de los olmos ibéricos y los climodiagramas de las poblaciones muestreadas .... 25 Fig. 3.5 Parcela con las plantas de la evaluación de la vulnerabilidad al estrés hídrico ...................... 26 Fig. 3.6 Dispositivo para medir la conductividad hidráulica .................................................................. 27 Fig. 3.7 Rotor de la centrífuga para someter los tallos a estrés hídrico ............................................... 27 Fig. 3.8 Disposición de las trampas de semillas en la olmeda de Valdelatas ...................................... 33 Fig. 3.9 Trampas de semillas ................................................................................................................ 34 Fig. 3.10 Clasificación de las sámaras.................................................................................................. 35 Fig. 3.11 Cámara de video empleada para observar a los predadores post-dispersión ...................... 42 Fig. 3.12 Estaciones de suministro de sámaras en microhábitat abierto ............................................. 42 Fig. 3.13 Estaciones de suministro de sámaras en microhábitat cubierto ............................................ 42 Fig. 3.14 Estación de suministro de sámaras sin malla de exclusión ................................................... 42 Fig. 3.15 Estación de suministro de sámaras del tratamiento de exclusión de aves ........................... 42 Fig. 3.16 Estación de suministro de sámaras sólo accesible a los insectos ........................................ 42 Fig. 4.1 Incremento de alturas de los brinzales tratados con distintas concentraciones de hierro ...... 45 Fig. 4.2 Evolución del índice SPAD ...................................................................................................... 45 Fig. 4.3 Brinzales de olmo afectados por la clorosis férrica.................................................................. 46 Fig. 4.4 Variación de minerales en hojas y tallos de plantas cloróticas ................................................ 47 Fig. 4.5 Actividad de la reductasa férrica .............................................................................................. 49 Fig. 4.6 Corte transversal del xilema de los olmos ibéricos .................................................................. 53 Fig. 4.7 Distribución de vasos por clases diamétricas y conductancia hidráulica teórica .................... 53 Fig. 4.8 Curvas de vulnerabilidad .......................................................................................................... 54 Fig. 4.9 Correlaciones entre parámetros hidráulicos y anatómicos ...................................................... 56 Fig. 4.10 Agrupación de individuos inferida por STRUCTURE............................................................. 60 Fig. 4.11 Estructura genética espacial de Quitapesares y Valdelatas .................................................. 61 Fig. 4.12 Distribución de clorotipos en Quitapesares y Valdelatas ....................................................... 62 Fig. 4.13 Fenología floral en Valdelatas................................................................................................ 66 Fig. 4.14 Parámetros de fecundidad de los modelos de dispersión de sámaras ................................. 67 Fig. 4.15 Relación entre sámaras llenas predadas y sámaras vanas producidas................................ 67 Fig. 4.16 Kernels de dispersión de las sámaras ................................................................................... 68. vi.

(15) Índice de figuras. Fig. 4.17 Patrones de dispersión de las sámaras llenas ....................................................................... 69 Fig. 4.18 Variación temporal intra-anual de la proporción de sámaras llenas, vanas y predadas ........ 70 Fig. 4.19 Tasa de abscisión de sámaras, viento y precipitación ........................................................... 71 Fig. 4.20 Kernel de dispersión efectiva .................................................................................................. 72 Fig. 4.21 Proporción de sámaras predadas pre- y post-dispersión por especie ................................... 74 Fig. 4.22 Pinzón vulgar consumiendo una semilla en el suelo .............................................................. 75 Fig. 4.23 Ratón de campo comiéndose una sámara ............................................................................. 75 Fig. 4.24 Censo de las poblaciones de aves en 2010 y 2011 ............................................................... 75 Fig. 4.25 Proporción de sámaras predadas en función de los efectos principales del GLMM ............. 77 Fig. 4.26 Principales interacciones en el modelo de predación post-dispersión ................................... 77 Fig. 4.27 Esquema del hábitat de los olmos ibéricos ............................................................................ 82 Fig. 4.28 Fotografía de la parcela de conservación de Calabazanos ................................................... 83. vii.

(16) Abreviaturas principales. ABREVIATURAS PRINCIPALES Generales ANOVA. Análisis de varianza. DN. Diámetro normal. H. Altura de la planta. HSD. Diferencias honestamente significativas (honestly significant difference). IC. Intervalo de confianza. SD. Desviación estándar (standard deviation). SE. Error estándar (standard error). EDAR. Estación depuradora de aguas residuales. P. P-valor. Relacionadas con el ensayo de nutrición de hierro ARF. Actividad de la reductasa férrica. BPDS. Ácido disulfónico de la batofenantrolina. EDTA. Ácido etilendiamino tetraacético. HBDE. Ácido N,N’–di(2-hidroxibencil)etilendiamina–N,N’–diacético. HEPES. 4-(2-hidroxietil)-1-ácido piperazineethanesulfonico. MES. Ácido 2-morfolino etano sulfónico. SPAD. Índice de verdor proporcional al contenido de clorofila de las hojas. T0. Tratamiento sin hierro (0 µM Fe). T1. Tratamiento suministrando 1 µM Fe. T20. Tratamiento suministrando 20 µM Fe. T5. Tratamiento suministrando 5 µM Fe. Relacionadas con la evaluación hidráulica a. Pendiente de la curva de vulnerabilidad. AH. Superficie foliar. AH:AX. Superficie foliar dividido por la superficie del xilema. AV. Área transversal media de los vasos. AX. Área transversal del xilema. CV. Curva de vulnerabilidad. DH. Diámetro hidráulico. DM. Densidad de la madera. DV. Diámetro medio de los vasos. FAA. Formaldehido - ácido acético - etanol. K. Conductividad hidráulica. KL-N. Conductividad específica de las hojas para el periodo seco (dry season specific leaf conductivity). Kmax. Conductividad hidráulica máxima. KN. Conductividad hidráulica nativa. KS. Conductividad máxima específica del xilema (xylem specific hydraulic conductivity). MH. Masa de las hojas. NH. Número de hojas. P50. Presión a la que se produce el 50 % de pérdida de conductividad. P80. Presión a la que se produce el 80 % de pérdida de conductividad. viii.

(17) Abreviaturas principales. PLC. Porcentaje de pérdida de conductividad (percentage loss of conductivity). PLCN. Porcentaje de pérdida de conductividad nativa (native percentage loss of conductivity). PVAMed. Porcentaje de vasos agrupados en la madera contigua a la médula. PVATar. Porcentaje de vasos agrupados en la madera tardía. PVATem. Porcentaje de vasos agrupados en la madera temprana. SLA. Superficie foliar específica (specific leaf area). (t/b). 2. Resistencia a la implosión de dos vasos contíguos. THC. Conductancia hidráulica teórica (theoretical hydraulic conductance). VF. Densidad de vasos (vessel frequency). VTA. Superficie transversal del corte ocupada por el lúmen de los vasos (vessel transectional area). Ψ. Potencial hídrico. Relacionadas con el estudio genético A. Abundancia alélica. ADN. Ácido desoxirribonucleico. ADNcp. ADN del cloroplasto. ADNn. ADN nuclear. Ar. Riqueza alélica. Dst. Diversidad genética interpoblacional. DY. Años transcurridos desde que comenzó el aumento o la reducción poblacional (yeas since demographic change started). EGE. Estructura genéticica espacial. Fis. Coeficiente de endogamia intrapoblacional. Fit. Coeficiente de endogamia total. Fst. Coeficiente de fijación. He. Heterocigosidad esperada. Ho. Heterocigosidad observada. Hs. Diversidad genética intrapoblacional. Ht. Diversidad genética total. IAM. Modelo de mutación alelos infinitos (infinite alleles mutation model). M. Estadístico de Garza y Williamson. NANC. Tamaño poblacional ancestral. Ne. Tamaño efectivo poblacional. NPOP. Tamaño poblacional actual. NV. Número de individuos del vecindario. SMM. Modelo de mutación paso a paso (single step mutation model). TPM. Modelo de mutación de dos fases (two phase mutation model). σg. Distancia cuadrática media de dispersión entre progenitor y vástago. Relacionadas con la producción, dispersión y predación de semillas AIC. Criterio de información de Akaike (Akaike information criterion). b. Parámetro de fecundidad por unidad de área basimétrica. BAi. Área basimétrica del árbol i (basal area). CAL. Calidad de sámaras. D95. Distancia por debajo de la cual cae el 95 % de las sámaras. DIS. Disponibilidad de sámaras. Dm. Distancia de dispersión media. ix.

(18) Abreviaturas principales. EST. Estación de suministro de sámaras. EXC. Tratamiento de exclusión. f(r). Kernel de dispersión. GLM. Modelo lireal generalizado (generalized lineal model). GLMM. Modelo lineal mixto generalizado (generalized lineal mixed model). LOC. Localización. MDR. Modelo de dispersión del regenerado. MDS. Modelo de dispersión de semillas. MIC. Microhábitat. MMTAS. Media móvil de 5 mediciones de tasa de absición de semillas. OCA. Ocasiones de suministro de sámaras. p. Parámetro de forma del kernel 2Dt. Q. Fecundidad. Qi. Fecundidad del árbol i. r. Distancia. REML. Máxima verosimilitud restringida (restricted maximum likelihood). SLL. Sámaras llenas. SP. Sámaras predadas. SSD. Sámaras sin desarrollar. SV. Sámaras vanas. TAS. Tasa de abscisión de sámaras. u. Parámetro de forma del kernel 2Dt. Vm. Velocidad media del viento. Vmax. Velocidad máxima del viento. YTAS. Variable respuesta para evaluar la tasa de absición de semillas. σ. Parámetro a estimar en el kernel log-normal (desviación estándar). µ. Parámetro a estimar en el kernel log-normal (logaritmo de la distancia media). 2Dt. Kernel de dispersión de t de Student bivariante. x.

(19) 1. INTRODUCCIÓN.

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(21) Introducción. 1. INTRODUCCIÓN 1.1. Ulmus laevis Pallas en la Península Ibérica La Península Ibérica posee un rico patrimonio natural siendo las actividades humanas uno de los principales motores transformadores del paisaje vegetal (Antrop 2005). Esta transformación antrópica, que comenzó hace más de 4000 años con las culturas neolíticas y que se ha intensificado en los últimos siglos, ha ido alterando profundamente los ecosistemas forestales (Iriarte 2009; Valbuena-Carabaña et al. 2010). Los bosques de ribera, de llanuras fluviales y de zonas inundadas se encuentran entre los más afectados puesto que, al ser abundantes en agua y nutrientes, fueron convertidos en pastos para ganado y tierras de cultivo. Posteriormente, para evitar problemas de salud pública muchas zonas empantanadas fueron drenadas. En la actualidad, estas zonas se ven afectadas por la industria extractiva de áridos, las plantaciones de chopos (Populus spp.), la sobreexplotación de los acuíferos por la captación de agua para regadíos y abastecimiento humano, la proliferación de campos de golf, la construcción de urbanizaciones y el control hidrológico de los ríos (Gallego-Fernández et al. 1999; Hooke 2006; Bejarano et al. 2012). Como consecuencia, se ha producido tal degradación, fragmentación y extinción local o regional de los bosques riparios, que en muchas ocasiones es difícil determinar cuál fue su estructura y composición originales, llegándose incluso a cuestionar si algunas de las especies arbóreas presentes hoy día son autóctonas o introducidas, como es el caso de Ulmus laevis Pallas (olmo blanco europeo). Ulmus laevis es un árbol caducifolio que habita las orillas de los ríos y lagos, en suelos húmedos o moderadamente secos si son profundos, y se trata de uno de los pocos árboles europeos que aguanta encharcamientos prolongados (Collin 2003). El olmo blanco europeo se distribuye por el este y centro de Europa, desde los Urales hasta el este de Francia y desde el sur de Finlandia hasta el Caúcaso y Bosnia (Collin 2003). En la Península Ibérica, al igual que en el Sur de Francia, las poblaciones de U. laevis son escasas, pequeñas, fragmentadas y su origen controvertido (Fig. 1.1). La presencia de esta especie ha sido descrita en diferentes lugares de la Península Ibérica, en especial en la zona noreste, desde los primeros trabajos botánicos (Lapeyrouse 1813; Pastor 1853) hasta tiempos recientes (Malagarriga 1971; Segura 1973), y aparece citada en los primeros trabajos de flora ibérica (Willkomm y Lange 1861; Amo 1871). Sin embargo, posteriormente no aparece incluida en tratados como Flora Forestal Española (Laguna y de Ávila 1883) y se la considera una especie propia de Europa (Casadevall y. 3.

(22) Introducción. Font i Quer 1933). En la actualidad la obra Flora Ibérica (Navarro y Castroviejo 1993), referencia para la comunidad internacional sobre flora autóctona, la considera especie introducida para jardinería y asilvestrada. Estudios más locales como los llevados a cabo por Aizpuru et al. (1999) ponen de manifiesto que no se puede afirmar si las poblaciones presentes en las riberas de algunos valles atlánticos del País Vasco son autóctonas o naturalizadas.. Fig. 1.1 Mapa de distribución de Ulmus laevis Pallas. El sombreado azul corresponde a las zonas de distribución continua y los puntos azules a poblaciones fragmentadas (EUFORGEN 2009). Los puntos negros corresponden a poblaciones marginales de U. laevis en base a citas bibliográficas y localizaciones realizadas por el Programa Español del Olmo (detalles en Anexo III).. Un estudio más detallado de las olmedas se abordó en el Programa Español del Olmo, que desde hace más de 27 años desarrolla la Universidad Politécnica de Madrid (UPM) en colaboración con el Ministerio de Agricultura, Alimentación y Medio Ambiente (MAGRAMA). Dentro de este programa se han localizado un mayor número de poblaciones que a pesar de contar con pocos individuos, apuntaban a que U. laevis es autóctono en la Península Ibérica. El uso de marcadores moleculares de ADN nuclear y de cloroplasto evidenció su condición autóctona y la existencia de un refugio glaciar para la especie en la Península Ibérica (Fuentes-Utrilla 2008; Fuentes-Utrilla et al. 2013). La pequeña superficie que ocupa U. laevis en la Península Ibérica, la disminución en el área y número de individuos adultos de sus poblaciones y el deterioro en calidad. 4.

(23) Introducción. ambiental aconsejan su inclusión en el Libro Rojo de la Flora Vascular Española (VV.AA. 2008) bajo la categoría de En Peligro Crítico de Extinción (Fuentes-Utrilla 2008; FuentesUtrilla et al. 2013). La conservación y recuperación de especies amenazadas requiere el desarrollo de medidas apropiadas que implican conocer, de acuerdo con Schemske et al. (1994): (i) los cambios demográficos de la especie; (ii) el papel que juegan la dispersión y dinámica de meta-poblaciones en su persistencia; (iii) la importancia relativa que tienen los factores genéticos y ecológicos en la dinámica de sus poblaciones; (iv) el efecto de los procesos demográficos y ecológicos estocásticos sobre su persistencia; y (v) el desarrollo de guías técnicas para la creación y el establecimiento de nuevas poblaciones. Por lo tanto, la necesidad de conocer los factores ecológicos y genéticos que influyen en la dinámica de poblaciones del negrillo u olmo ciliado (U. laevis) para su conservación y recuperación en la Península Ibérica han motivado la elaboración de la presente tesis doctoral.. 1.2. Naturaleza edáfica y distribución de especies El área de distribución natural de los olmos ibéricos antes de producirse la transformación humana del paisaje forestal es difícil de establecer si exceptuamos la del olmo de montaña (Ulmus glabra Huds.), que crece en el norte peninsular y en las regiones montañosas del centro y sur (Rossignoli y Génova 2003). Los registros polínicos muestran la presencia del género Ulmus L. en gran parte de la Península Ibérica a lo largo del Pleistoceno y Holoceno, corroborando que esta región fue refugio glaciar (Gil y García-Nieto 1990; López 2000). No obstante, sólo es posible la identificación a nivel de especie cuando en los registros palaeobotánicos aparecen macrorrestos de hojas, flores o frutos de olmo, evento bastante raro (García-Amorena et al. 2008), ya que la madera (Schweingrüber 1990) y el polen (Stafford 1995) de estos olmos sólo permiten la identificación a nivel de género. El olmo común (Ulmus minor Mill.) ha sido ampliamente propagado por toda la Península Ibérica desde hace más de 2000 años. Su uso más generalizado en la agricultura se remonta a los romanos donde se impone el uso del olmo frente a otras especies como árbol tutor en el cultivo del viñedo, práctica que va desapareciendo a lo largo de la segunda mitad del siglo XIX a raíz de la crisis de la filoxera (Dactylosphaera vitifoliae Fitch; Messiez 1998), y pasa a ser usado simplemente como árbol de sombra y ornamental (Gil et al. 2004). En el siglo XX sus poblaciones se vieron seriamente mermadas, casi desapareciendo por completo los ejemplares de gran porte, a raíz de la irrupción de dos pandemias de grafiosis (Brasier 2000), la primera causada por Ophiostoma ulmi (Buisman) Nannf. y la segunda, que fue mucho más letal, por Ophiostoma novo-ulmi Brasier (Brasier 1991). Sin embargo, U.. 5.

(24) Introducción. laevis es una especie que no ha sido manejada en la Península Ibérica para uso forestal ni agrario y cuyas poblaciones, pese a ser susceptibles a la grafiosis, han sido menos afectadas por esta enfermedad debido a las preferencias alimenticias por U. minor de su vector de propagación, los escarabajos del género Scolytus Geoffroy (Pajares 2004). En base a las características de sus olmedas y a un estudio taxonómico se determinó que la mitad oriental peninsular, predominantemente caliza, parecía ser el área de distribución natural de U. minor (Richens y Jeffers 1986). Esta distribución concuerda con lo observado en estudios de diversidad genética (Gil et al. 2004; Fuentes-Utrilla 2008). En contraste, las poblaciones de U. laevis localizadas hasta la fecha se encuentran predominantemente en suelos ácidos (Fig. 1.2). Esta distribución diferencial de las dos especies parece indicar que U. minor sería calcícola y U. laevis calcífuga.. Fig. 1.2 Localización de las poblaciones españolas de Ulmus laevis Pallas y el tamaño de las mismas. Los símbolos blancos corresponden a localizaciones realizadas dentro del Programa Español del Olmo (1986-2012), los sombrados en gris a citas bibliográficas (Anexo III). Al este de la línea discontinua se encuentra la región donde Ulmus minor Mill es considerado autóctono por Richens y Jeffers (1986). El mapa del pH del suelo ha sido adaptado de Rodríguez et al. (2009).. 6.

(25) Introducción. Las plantas calcícolas crecen con normalidad en suelos calcáreos (Zohlen 2002). Sin embargo, las calcífugas se ven restringidas por limitaciones en la disponibilidad de nutrientes, tales como fósforo (P; Tyler 1992; Zohlen y Tyler 2004), manganeso (Mn; Messenger 1986; Thomas et al. 1998; Kuster et al. 2013) y especialmente hierro (Fe; Zohlen y Tyler 1997, 2000; Zohlen 2002). El hierro desempeña un importante papel en numerosos procesos metabólicos y enzimáticos (Kobayashi y Nishizawa 2012). Pese a su abundancia en la corteza terrestre, la solubilidad de los compuestos de Fe3+ en suelos con gran contenido de carbonato cálcico (CaCO3) y pH entre 7.5 y 8.5 es baja, lo que dificulta la captación de hierro por las plantas, provocando su deficiencia clorosis férrica (Lindsay 1984; Lucena 2006). Este proceso compromete el crecimiento y establecimiento de las plantas al reducirse sus tasas fotosintéticas por la disminución de la eficiencia de captación de luz, del fotosistema II y de la carboxilación de la rubisco (Larbi et al. 2006). En las plantas se pueden establecer dos estrategias diferenciadas en cuanto a mecanismos de captación de hierro (Marschner y Römheld 1994; Fig. 1.3): . Estrategia I, basada en la reducción (dicotiledóneas y monocotiledóneas excluyendo gramíneas), se pueden identificar 4 subestrategias: (i) la producción de reductasa férrica, enzima que transforma los compuestos de Fe3+ en Fe2+ para su absorción; (ii) la inducción de transportadores de Fe2+; (iii) la extrusión de protones (H+) para acidificar la rizosfera y facilitar la disolución de hierro y (iv) la excreción de compuestos orgánicos, como compuestos fenólicos, carboxilatos y flavonoides, que incrementan la disponibilidad de hierro de forma directa o indirecta (López-Millán et al. 2001; Rombolà et al. 2002; Abadía et al. 2011).. . Estrategia II, basada en la quelación (únicamente en gramíneas), las plantas son capaces de producir fitosideróforos (aminoácidos no proteicos) además de disponer del mecanismo de las plantas con Estrategia I (Marschner y Römheld 1994).. El peso relativo y la eficiencia de cada una de las etapas pueden variar entre especies y procedencias, lo que podría estar relacionado con la tolerancia o susceptibilidad para crecer en suelos alcalinos y la competencia con otras especies riparias.. 7.

(26) Introducción. Estrategia I. Compuestos fenólicos, carboxilatos y flavonoides. Estrategia II. Fitosideróforos (FS). Célula de la raíz. H+ Reductasa férrica Fe3+. Fe2+. Fe3+ - FS Fe2+ - FS. Transportadores IRT. Célula de la raíz Transportadores YLS. Fig. 1.3 Esquema que representa las dos estrategias de captación de hierro descritas para las raíces de las plantas de manera simplificada (figura adaptada de Abadía et al. 2011).. Los mecanismos involucrados en la captación de hierro y la respuesta fisiológica a la clorosis férrica han sido ampliamente estudiados en especies agronómicas (Römheld et al. 1984; Römheld 1987; de la Guardia y Alcántara 2002; Ojeda et al. 2003; Abadía et al. 2011; Donnini et al. 2011; Kobayashi y Nishizawa 2012); sin embargo, la información sobre especies forestales es reducida (Gorgocena et al. 2001; Fodor et al. 2005; Pestana et al. 2012; Kuster et al. 2013). En algunos estudios ecológicos se ha descrito la incidencia de clorosis férrica tras el establecimiento de plantas silvestres calcífugas y calcícolas en suelos calcáreos de pH básico (Hutchinson 1970; Anderson 1984; Tyler 1996; Zohlen y Tyler 1997, 2000; Zohlen 2002; Donnini et al. 2012). En la mayoría de estos trabajos, la respuesta a la clorosis se evaluó solamente analizando el contenido de hierro en los tejidos de las plantas. Para poder profundizar en los procesos de asimilación de Fe, en esta tesis se plantea el estudio de la relación entre la eficiencia en los mecanismos de asimilación de hierro y la distribución de U. laevis y U. minor.. 1.3. Susceptibilidad al estrés hídrico La vulnerabilidad a la cavitación por estrés hídrico de los vasos del xilema es uno de los factores que más afecta a la productividad y supervivencia de las plantas (Tyree y Sperry 1988; Sperry et al. 2008; López et al. 2013), debido a lo cual, diferencias en vulnerabilidad a la cavitación determinan en muchos casos la distribución de las especies en relación a factores ambientales (p. ej. Nardini et al. 2000; Rood et al. 2003; Maherali et al. 2004; Tissier et al. 2004; Jacobsen et al. 2008). La teoría de la tensión-cohesión (Dixon y Joly 1895) explica el ascenso de savia por el sistema vascular de las plantas. Al producirse la evapotranspiración en las hojas, las moléculas de agua desprendidas son reemplazadas por otras mediante procesos de. 8.

(27) Introducción. capilaridad y tensión superficial, y éstas arrastran la columna de agua que sube desde las raíces, venciendo la fuerza de la gravedad. Este proceso se produce bajo tensiones negativas, es decir, a presiones inferiores a la atmosférica dentro de los vasos del xilema. En condiciones de estrés hídrico esta tensión se incrementa y la columna de savia puede llegar a cavitar, pasando el agua a estado de vapor, lo que facilita que el vaso se llene de aire interrumpiéndose la continuidad del transporte a las hojas a través del elemento cavitado (Sperry y Tyree 1988). La entrada de aire en los vasos contiguos suele evitarse debido a las propiedades hidrofílicas de las membranas de las punteaduras y las plantas tienen sistemas de transporte redundantes para superar episodios de cavitación (Sperry y Tyree 1988; Sperry 2003). La arquitectura hidráulica de las plantas es el resultado de procesos de compensación entre eficiencia en el transporte de agua y seguridad de suministro por resistencia frente a la cavitación (Sperry 2003). Los vasos de mayor longitud y diámetro permiten mayores conductividades, pero también suelen ser más sensibles a la cavitación (Tyree y Zimmerman 2002). La vulnerabilidad de los vasos de mayor dimensión se debe a que hay más superficie de membrana de punteaduras y, por consiguiente, mayor probabilidad de existir poros de gran tamaño por los que la entrada de aire es más fácil (Wheeler et al. 2005; Christman et al. 2009). Las plantas con muchos vasos de pequeño tamaño son inherentemente menos susceptibles a la cavitación que aquellas cuyo suministro de agua se produce a través de pocos vasos de gran tamaño (Sperry y Tyree 1988; Sperry et al. 2008): Los modelos de cambio climático prevén periodos de sequía más acusados y prolongados en la Península Ibérica (Somot et al. 2008; De Luis et al. 2010). Debido a este cambio se incrementará la demanda de agua para regadío y abastecimiento humano e industrial, lo que a su vez podría reducir aún más los caudales de los ríos y niveles freáticos, con el consiguiente impacto para las especies riparias. Se estima que más del 60 % de los humedales españoles han desaparecido en los últimos 50 años debido a causas antrópicas (Gallego-Fernández et al. 1999). El estudio comparativo de las tres especies de olmo presentes en la Península Ibérica a nivel de características anatómicas e hidráulicas permitirá evaluar el efecto de la desecación sobre sus poblaciones en el pasado y el riesgo que supondrá en el futuro. Además, ayudará a comprender procesos adaptativos de compensación entre eficiencia y seguridad en el transporte de agua dentro de las plantas.. 9.

(28) Introducción. 1.4. Biología reproductiva 1.4.1. Perspectiva genética Diversos factores genéticos pueden ejercer gran influencia sobre los procesos demográficos de una especie, tanto a escala intra-poblacional como meta-poblacional, y es importante conocerlos, como se ha apuntado anteriormente, para poder diseñar estrategias eficaces para la conservación de especies en peligro de extinción (Schemske et al. 1994). La depresión endogámica, reducciones en flujo genético y pérdida de diversidad genética son factores que incrementan el riesgo de extinción de las especies en peligro (Ellstrand y Elam 1993; Frankham 2005). Ignorar o desconocer estos factores subestima el riesgo real de las poblaciones y da lugar a propuestas de medidas de conservación inadecuadas (Frankham 2005). Asimismo, la fragmentación de poblaciones incrementa la vulnerabilidad de las mismas a perturbaciones ambientales, lo que junto con la consiguiente reducción de propágulos de dispersión, comprometen la supervivencia de las poblaciones remanentes (Thuiller et al. 2005). Las plantas no se desplazan y sus propágulos (i.e. polen, semillas y esquejes) suelen presentar restricciones moderadas o fuertes en la capacidad de dispersión, lo que suele generar una estructura genética espacial a pequeña o gran escala (Vekemans y Hardy 2004). Además, en especies riparias esta estructura es afectada por cambios antrópicos en el régimen hidrológico de los ríos (Kikuchi et al. 2011) y la deforestación de las márgenes para el acceso del ganado. Por todos estos motivos es importante conocer la estructura genética espacial de las especies amenazadas para establecer medidas de conservación adecuadas (Newton et al. 1999; Moritz 2002). Ulmus laevis presenta baja diversidad genética en todo su rango de distribución en comparación con otras especies forestales (Whiteley 2004; Nielsen y Kjær 2010; FuentesUtrilla et al. 2013). En cuanto a la estructura genética espacial a gran escala, cabe destacar que las poblaciones del centro y norte de Europa son muy homogéneas (Whiteley 2004) y se distinguen claramente de las poblaciones marginales de Finlandia (Vakkari et al. 2009) y de España y del sur de Francia (Fuentes-Utrilla et al. 2013). Dentro de la Península Ibérica la diversidad genética de las poblaciones permite agruparlas en unidades de gestión (Moritz 2002) para su manejo en proyectos de conservación (Fig. 1.4; Fuentes-Utrilla et al. 2013). En relación a la estructura genética espacial a pequeña escala, sólo existen datos de la población de Krenkerup Haveskov (Dinamarca), con una fuerte estructura espacial (los individuos cercanos están más emparentados que los alejados), lo que unido al carácter. 10.

(29) Introducción. anemófilo y alógamo de la especie y su baja diversidad genética hacen que sea muy vulnerable a reducciones del tamaño poblacional (Nielsen y Kjær 2010). Dado el escaso conocimiento a nivel de estructura genética espacial a pequeña escala a nivel europeo y nulo a nivel de la Península Ibérica se realiza el análisis genético de dos de las poblaciones de mayor tamaño de la Península Ibérica, para las cuales se conoce el proceso de intervención humana sobre las mismas. Esto permitirá determinar los procesos demográficos que han tenido lugar, la distancia de dispersión de sus propágulos, el grado de diversidad y clonalidad de la especie, información a tener en cuenta para establecer si están en riesgo de sufrir depresión endogámica y el establecimiento de estrategias de conservación.. Fig. 1.4 Distribución de los haplotipos (A y B) y las unidades de gestión (clusters genéticamente homegéneos en cuanto ADN nuclear) propuestas para el manejo de las poblaciones de U. laevis del suroeste y centro de Europa (FuentesUtrilla et al. 2013).. 1.4.2. Producción, consumo y dispersión de semillas La dispersión de semillas y el establecimiento del regenerado son procesos clave en la dinámica de poblaciones. No obstante, algunos bosques y especies tienen problemas de regeneración que pueden deberse a la escasez de propágulos (por problemas de fructificación, de viabilidad de las semillas o consumo de las mismas por predación1), a. 1. Anglicismo comúnmente empleado para referirse a la alimentación de la fauna granívora.. 11.

(30) Introducción. limitaciones en la distancia de dispersión o a la mortalidad del regenerado (Clark et al. 1999a). Estas limitaciones a su vez pueden ser intrínsecas a las especies o debidas a la transformación de su hábitat. En este trabajo se analizarán estos aspectos en una población de U. laevis alterada por la acción humana que carece de suficiente regenerado y cuyo crecimiento demográfico parece estar constreñido. Para determinar las distancias de dispersión y capacidad colonizadora de las semillas es necesario conocer los mecanismos de dispersión de las mismas. Los frutos de U. laevis son sámaras con el borde del ala ciliado (Fig. 1.5), dispersados por el viento (anemocoría) o el agua (hidrocoría) (Collin 2003). No obstante, al igual que para muchas otras especies riparias, todavía no se ha determinado si las adaptaciones morfológicas de sus frutos alados favorecen a uno de estos mecanismos de dispersión o a ambos (Seiwa et al. 2008). Al crecer U. laevis también en navas y pequeñas cuencas endorreicas, que muchas veces se encuentran aisladas en el paisaje y rodeadas de vegetación perennifolia que actúa de pantalla, el viento puede ser un vector de dispersión limitado. No obstante, las alas y tricomas de muchos frutos anemócoros favorecen su dispersión hidrócora al aumentar su flotabilidad por atrapar burbujas de aire y por la tensión superficial del agua (Nilsson et al. 2010). En especies de dispersión hidrócora la fenología de la liberación de semillas, los mecanismos que influyen en este proceso y el momento en que se produce en relación a las grandes avenidas de los ríos también son factores de gran importancia para el establecimiento del regenerado (Nilsson et al. 2010). En esta tesis se pretende evaluar la distancia de dispersión de los frutos de U. laevis y la influencia que sobre ella tienen factores ambientales como el viento y la lluvia. En relación a la producción y predación de frutos de U. laevis cabe destacar dos características de esta especie: (i) es vecera, es decir, unos años produce grandes cosechas de manera sincronizada y otros no; (ii) presenta de manera habitual frutos partenocárpicos que se forman pese a no ser polinizada la flor y por lo tanto son vanos y carecen de una semilla viable (López-Almansa y Gil 2003; López-Almansa et al. 2004). Las fuerzas selectivas que suelen favorecer la evolución de la vecería en las especies anemófilas son el incremento de la eficiencia de la polinización y de manera alternativa o complementaria el saciado de los predadores de semillas (Kelly y Sork 2002). La presencia de un mayor porcentaje de semillas viables los años de mayor producción de flores apoya la hipótesis de eficiencia en la polinización, mientras que la prueba más simple que aboga por el saciado de predadores es el descenso del porcentaje de semillas predadas los años veceros (Kelly y Sork 2002). Por otro lado, la producción de frutos vanos podría incrementar. 12.

(31) Introducción. la eficiencia reproductiva de las plantas, al servir como cebo para los predadores de semillas y dificultar la localización de las semillas viables, disminuyendo las tasas de predación sobre estas últimas (Janzen 1971; Mustard et al. 1995; Fuentes y Schupp 1998; Verdú y GarcíaFayos 2000; Ghazoul y Satake 2009; Ramos-Ordóñez y Arizmendi 2011). La mayoría de estos trabajos sólo han evaluado el efecto de los frutos vanos sobre la predación predispersión, cuando las tasas de predación post-dispersión en muchas especies son cuantitativamente más importantes (Pizo 1997; Forget et al. 1999; Fedriani y Delibes 2011). Además, son pocos los trabajos que han estudiado el efecto simultáneo de la vecería y producción de frutos partenocárpicos (Verdú y García-Fayos 2000; Ramos-Ordóñez y Arizmendi 2011). Para establecer la dinámica de las poblaciones es necesario conocer además de los procesos de dispersión los procesos de establecimiento del regenerado, para lo que se requiere el estudio del microhábitat en el que se depositan las semillas y el consumo post-dispersión de las semillas (Hulme y Borelli 1999; Hulme y Hunt 1999; Perea et al. 2011). Debido a ello, es interesante conocer los patrones de dispersión de semillas (tanto de las llenas como vanas y su proporción relativa) en relación a los microhábitats.. A. B. C. D. Fig. 1.5 Sámaras de Ulmus laevis: (A) antes de llegar a su madurez, (B) maduras en el árbol durante el periodo de dispersión, (C) siendo dispersadas en un arroyo y (D) cubriendo el suelo.. 13.

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(33) 2. OBJETIVOS.

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(35) Objetivos. 2. OBJETIVOS El objetivo general de la presente tesis doctoral es conocer la ecología de U. laevis en la Península Ibérica, para ello se establecen los siguientes objetivos específicos: . Determinar las diferencias en la eficiencia de los mecanismos de captación de hierro de las raíces de U. laevis y U. minor y su papel en el carácter calcífugo o calcícola de estas especies.. . Analizar la vulnerabilidad de U. laevis a la cavitación por estrés hídrico y su relación con la distribución de la especie en función de la disponibilidad hídrica.. . Determinar la viabilidad de las dos mayores poblaciones españolas de U. laevis a través de la estimación de la diversidad genética, estructura genética espacial a pequeña escala, evolución demográfica, capacidad de regeneración y el riesgo de sufrir depresión endogámica.. . Estimar la capacidad de dispersión de las semillas de U. laevis.. . Analizar el efecto de la producción de sámaras vanas y la vecería sobre la predación de las semillas llenas por parte de la fauna granívora.. . Proponer medidas de conservación adecuadas para U. laevis en base a la capacidad de recuperación de las poblaciones ibéricas.. 17.

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(37) 3. MATERIAL Y MÉTODOS.

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(39) Material y métodos. 3. MATERIAL Y MÉTODOS En este apartado se resumen los Materiales y Métodos de los distintos ensayos realizados a lo largo de esta tesis doctoral. En los correspondientes apartados de los anexos se recoge una información más detallada.. 3.1. Evaluación de la eficiencia de los mecanismos de absorción de hierro en Ulmus laevis y U. minor (Anexo I) 3.1.1. Cultivo de plantas Se recolectaron semillas de un árbol de U. laevis en Valdelatas (Madrid, 40º 32’ N, 3º 40’ W) y de un ejemplar de U. minor en el vivero de Puerta de Hierro (Madrid, 40º 27’ N, 3º 45’ W). Las semillas se germinaron en perlita lavada con una disolución de HCl 0.1 M y posteriormente con una disolución de etilenodiamino tetraacetato sódico (Na2EDTA) 100 µM para evitar contaminaciones de hierro (Fe). Las semillas se regaron inicialmente con agua destilada. Cuando las plántulas diferenciaron los primeros nomófilos, se regaron durante una semana con la solución nutritiva (T0), que contenía todos los micro y macronutrientes salvo hierro (Anexo I) y cuyo pH era 7.5 (Nadal et al. 2012), diluida a ¼. Posteriormente se trasladaron a un cultivo hidropónico con la solución ½ T0 durante dos semanas y, luego, con la solución T0 hasta la aplicación de los tratamientos (Tabla 3.1). Al cultivo hidropónico se transfirieron 72 plantas de cada especie de tamaño similar. Doce plantas por especie se colocaron juntas en envases de 6 L (Fig. 3.1), aireados continuamente con un caudal de aproximadamente 100 L de aire h-1 por recipiente. Las plantas se mantuvieron en invernadero con un régimen de 16 h de luz y 8 h de oscuridad. Las temperaturas oscilaron entre 25 y 10 ºC.. Fig. 3.1 Cultivo hidropónico de brinzales de U. laevis y U. minor en envases de 6 L antes de iniciar los tratamientos.. 21.

(40) Material y métodos. Tabla 3.1 Cronograma del cultivo de plantas para la evaluación de la capacidad de asimilación de hierro por parte de U. laevis y U. minor. Se considera la semana 1 cuando las semillas ya han germinado. a. Tiempo (semanas) 1 2 3 4 Sustrato. b. 5. 6. 7. 8. 9. 10 11 12 13 14 15. P P P P H H H H H. H. H. H. H. H. -. -. -. *. *. -. H. H2O Cultivo inicial de las plantas. T0 ¼; HEPES (pH 7.5) T0 ½; HEPES (pH 7.5) T0; HEPES (pH 7.5). Respuesta fisiológica. T0, T1, T5, T20; HEPES (pH 7.5). Actividad de la c reductasa. T0; 100 µM Fe -EDTA; MES (pH 6.0); 300 µM BPDS. Extrusión de H. +. 3+. T0; HEPES (pH 7.5) T0, T5, T20; pH inicial 7.0. a. Zona sombreada, semana en la que se aplicó el tratamiento o se realizaron las medidas; (-) tiempo durante el cual a las plantas de T1 no se les suministró hierro (0 µM Fe); (*) tiempo durante el que las plantas de T1 recibieron hierro (1 µM Fe). b. P, perlita; H, hidropónico.. c. Para este ensayo se emplearon plantas de T0, T1 y T20 de la evaluación de la respuesta fisiológica.. 3.1.2. Evaluación fisiológica de la respuesta al reabastecimiento de hierro En la semana 9 a los brinzales se les aplicó distintos tratamientos que diferían en la concentración de hierro añadido a la solución nutritiva T0 (Tabla 3.1). El hierro (Fe3+) se suministró empleando como agente quelante el ácido N,N’–di(2-hidroxibencil)etilendiamina– N,N’–diacético (HBED). Se utilizaron tres concentraciones: 0 µM Fe (T0, aplicado a 4 envases por especie), 5 µM Fe (T5, un envase por especie) y 20 µM Fe (T20, un envase por especie). Las soluciones nutritivas se cambiaron una vez por semana. Las plantas T5 y T20 se recuperaron de la clorosis inicial por lo que, para obtener un nivel de clorosis férrica intermedio, se aplicó un cuarto tratamiento durante dos semanas de 1 µM Fe (T1) a un envase de los de T0 por especie durante las semanas 12 y 13 (Tabla 3.1), hasta que se detectó cierta recuperación de estas plantas. Se evaluó la respuesta al reabastecimiento de hierro en 12 plantas por especie y tratamiento (semanas 9-14). Para ello se midieron semanalmente las alturas de las plantas y el contenido de clorofila de dos hojas subapicales por planta empleando el índice de verdor SPAD, utilizando un medidor Minolta SPAD 502. Al finalizar el ensayo, se separaron las hojas y tallos de las plantas, se lavaron con HCl 0.1 % y surfactante al 0.05 % (Tween 20,. 22.

(41) Material y métodos. Sigma-Aldrich) y se enviaron a un laboratorio externo para determinar su contenido mineral (Servicio de Ionómica, CEBAS-CSIC, Murcia). Se evaluó el peso seco de las semillas sin alas y el contenido mineral de semillas de ambas especies (Servicio de Ionómica, CEBAS-CSIC, Murcia).. 3.1.3. Evaluación de la capacidad de extrusión de protones de las raíces Al inicio de la semana 11 se seleccionaron 15 plantas de U. laevis y 15 de U. minor, a las que nunca se había administrado hierro (T0), para evaluar la capacidad de acidificación del medio por parte de sus raíces (Römheld et al. 1984). Se colocó cada una de estas plantas en cultivo hidropónico en un envase individual de 250 mL (Fig. 3.2). Las soluciones nutritivas utilizadas no estaban tamponadas (no contenían 4-(2-hidroxietil)-1ácido piperazineethanesulfonico (HEPES)) y su pH era 7. Se aplicaron tres tratamientos que diferían en la concentración de Fe añadido a la solución nutritiva (T0, T5 y T20, sin HEPES; 5 plantas por especie y tratamiento). En cada recipiente se introdujeron 200 mL de la disolución correspondiente a los respectivos tratamientos. Los días 1, 2, 3, 4, 7, 8 y 9 tras el inicio del ensayo, primero se añadió agua destilada para reponer el agua evapotraspirada hasta completar los 200 mL y a continuación se tomó una alícuota de 5 mL. A cada alícuota se le añadió 25 mL de agua destilada y se valoró el contenido de H+ con NaOH 0.5 mM hasta alcanzar el pH inicial de 7.0 empleando un pH-metro (Micro-pH 2002, Crison Instruments, España). Al final del experimento se registró el peso fresco (g) de las raíces y se calculó capacidad de extrusión diaria por unidad de peso fresco de raíz como el incremento de protones en cada recipiente respecto al día anterior (H+, µmol g-1 raíz. Fig. 3.2 Plantas de U. minor y U. laevis en cultivo hidropónico en envases individuales de 250 mL del ensayo de extrusión de + H del tratamiento T0.. fresca día-1).. 3.1.4. Evaluación de la actividad de la reductasa férrica Se evaluó la actividad de la reductasa férrica (ARF) siguiendo el método descrito por Lucena y Chaney (2006). Al inicio de la semana 15, se seleccionaron plantas de los. 23.

(42) Material y métodos. tratamientos T0, T1 y T20 (7 plantas por especie y tratamiento), puesto que se buscaba distintos grados de afección de clorosis férrica, y se trasvasaron dos días antes de medirse la ARF a una cámara de cultivo con un periodo día/noche de 16/8 h, una temperatura 30/25 ºC y una intensidad de luz de 200 µE m-2 a la altura de las plantas. En dicha cámara se introdujeron recipientes de 250 mL conteniendo 200 mL de la disolución empleada para la evaluación de la ARF (T0 sin HEPES y con 2 mM de ácido 2-morfolino etano sulfónico (MES), que tampona el medio a pH 6, y 300 µM de ácido disulfónico de la batofenantrolina (BPDS), que es el agente colorante que captura el Fe2+). Los envases no permitían la entrada de luz y tenían un orificio para insertar un tubo de aireación, otro para introducir una pipeta y un tercero para colocar la planta (Fig. 3.3). Antes de pasar las plantas seleccionadas a estos envases se lavaron sus raíces con la disolución T0 a la que se añadió 37.5 µM de Na2BPDS. Una vez introducidas todas las plantas en los recipientes de 250 mL, se les añadió 100 µM de Fe3+-EDTA y se tomaron alícuotas de 3 mL de cada uno de los envases 0, 10, 20, 60 y 120 minutos después de su introducción. Se evaluó la concentración de Fe2+-BPDS con un espectrofotómetro (V650, Jasco, Meryland, EEUU). La ARF se determinó como la pendiente de la gráfica que enfrenta Fe2+ producido en función del tiempo dividido por el peso fresco de la raíz de cada planta (µmol g-1 h-1).. Fig. 3.3 Plantas en envases individuales de 250 mL para la medición de la actividad de la reductasa con los tubos preparados para tomar las alícuotas de 3 mL.. 3.1.5. Análisis estadísticos Se realizaron análisis de varianza (ANOVA) para comparar los valores de SPAD (índice de verdor), altura de plantas, capacidad de extrusión de protones, actividad de la reductasa férrica y el contenido mineral de los tejidos en función de las variaciones en la concentración de Fe dentro de cada especie. Las comparaciones de medias se realizaron con el test de Tukey (HSD) al 95 %. Todos los análisis estadísticos se realizaron con el programa STATISTICA 7.0 (StatSoft Inc., Oklahoma, EEUU).. 24.