Digestibilidad in vitro de tres leguminosas tropicales: efecto del inóculo microbiano y la adición de levadura

Texto completo

(1)Facultad de Ciencias Agropecuarias Departamento de Medicina Veterinaria y Zootecnia Maestría en Salud Animal Avanzada 4ta Edición. Tesis en opción al grado de Master en Ciencia Título: Digestibilidad in vitro de tres leguminosas tropicales: efecto del inóculo microbiano y la adición de levadura.. Title:. In vitro digestibility of three tropical legumes: effect of the. microbial inoculum and yeast addition. Maestrante: Dr. MVZ. Beydis Reguera Barreto Tutor: MSc. Einar Artiles Ortega. Dr. MVZ. PhD. Raciel Lima Orozco. Dr. MV.. Curso: 2017-2018.

(2) Digestibilidad in vitro de tres leguminosas tropicales: efecto del inóculo microbiano y la adición de levadura. [In vitro digestibility of three tropical legumes: effect of the microbial inoculum and yeast addition].. Beydis Reguera Barreto Dr. MVZ., fue soportado por el Laboratory for Animal Nutrition and Animal Product Quality (LANUPRO, University of Ghent, Ghent, Belgium), y el Laboratorio de Nutrición Animal en conjunto con el Laboratorio de Espectrofotometría, ambos del Centro de Investigaciones Agropecuarias de la Facultad de Ciencias Agropecuarias de la Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas (Cuba).. Para referir esta tesis: Reguera-Barreto, B. 2018. Digestibilidad in vitro de tres leguminosas tropicales: efecto del inóculo microbiano y la adición de levadura. M.Sc. disertación, Universidad Central “Marta Abreu” de Las Villas, Santa Clara, Cuba..

(3) RESUMEN Este estudio evaluó el efecto de las comunidades microbianas ruminales incubadas durante 14 d con diferentes fuentes de carbohidratos, con o sin levadura sobre la degradación in vitro de tres leguminosas tropicales: Leucaena leucocephala, Mucuna pruriens y Canavalia ensiformis, y determinó la influencia de los taninos sobre la degradabilidad de las mismas. Los forrajes fueron químicamente caracterizados, y se determinó la presencia de fenoles y taninos totales, y taninos condensados, evaluándose la actividad biológica de los taninos. Las leguminosas en estudio no difieren significativamente en los valores de materia seca, proteína bruta y taninos condensados. L. leucocephala tuvo valores de FDN y FDA dos veces superior al resto, y al igual que M. pruriens, mostró valores altamente significativos en fenoles y taninos totales. Los inóculos obtenidos durante 14 d consecutivos de incubación in vitro no mostraron diferencias en la capacidad de degradación de las leguminosas. Sin embargo, la degradación de estas con inóculos suplementados con levadura activa o inactiva se asemejó a la degradación con inóculo fresco, mientras que con inóculos sin levadura la degradación fue menor. Los valores de actividad biológica de los taninos no indicaron diferencias significativas en las tres leguminosas. En conclusión, las comunidades microbianas cultivadas durante 14 días estimulan la fermentación ruminal de las tres leguminosas, y la presencia de taninos totales y condensados no influyeron en la degradabilidad aparente de los carbohidratos ni en los patrones de fermentación de las plantas en estudio.. Palabras claves: incubación consecutiva, ARDC, taninos, actividad biológica..

(4) ABSTRACT This study was carry out to assess the effect of ruminal microbial communities incubated during 14 d with different sources of carbohydrates, with or without yeast on the in vitro degradation of three tropical legumes: Leucaena leucocephala, Mucuna pruriens and Canavalia ensiformis, and determined the influence of tannins on the degradability of them. The forages were chemically characterized, and the presence of phenols and total tannins, and condensed tannins were determined, evaluating the biological activity of the tannins. The legumes under study do not differ significantly in the values of dry matter, crude protein and condensed tannins. L. leucocephala had NDF and ADF values twice higher than the rest, and like as M. pruriens, and showed highly significant values in phenols and total tannins. The inocula obtained during 14 consecutive days of in vitro incubation did not show differences in the degradation capacity of legumes. However, the degradation of these with inocula supplemented with active or inactive yeast resembled the degradation with fresh inoculum, whereas with inoculum without yeast degradation was lower. The values of biological activity of the tannins did not indicate significant differences in the three legumes. In conclusion, the microbial communities cultivated for 14 days stimulate the ruminal fermentation of the three legumes, and the presence of total and condensed tannins did not influence the apparent degradability of the carbohydrates or the fermentation patterns of the plants under study.. Keywords: consecutive incubation, ARDC, tannins, biological activity..

(5) ÍNDICE. INTRODUCCIÓN: ................................................................................................................... 1 CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA ...................................................................... 4 I.1. Características de las leguminosas tropicales ......................................................... 4 I.2. Adaptación de la flora microbiana mediante incubaciones consecutivas y la suplementación con levaduras para mejorar la digestibilidad de los alimentos. ...... 6 I.3. Presencia de taninos en las leguminosas. ............................................................... 7 I.4. Efecto de los taninos en la fermentación ruminal.................................................... 9 I.5. Uso de Polietilenglicol (PEG) para determinar digestibilidad en leguminosas con taninos ......................................................................................................................... 12 CAPÍTULO II. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL......................................................... 14 II.1. Obtención del forraje de las leguminosas y preparación de las harinas .......... 14 II.2. Análisis químico proximal ......................................................................................... 14 II.3. Incubación consecutiva con o sin levadura y con diferentes fuentes de carbohidratos...................................................................................................................... 14 II.4. Incubación ruminal in vitro (24 h) de tres leguminosas tropicales ..................... 15 II.7. Determinación de la actividad biológica de los taninos ....................................... 17 II.8. Análisis estadístico .................................................................................................... 18 CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN................................................................ 20 III.1. Análisis químico proximal, fenoles y taninos totales, y taninos condensados de las leguminosas estudiadas ....................................................................................... 20 III.2. Cultivo consecutivo por lotes .................................................................................. 21 III.3. Incubaciones de rumen in vitro (24 h) de leguminosas...................................... 22 III.4. Actividad biológica de los taninos .......................................................................... 25 CONCLUSIONES: ................................................................................................................ 27 RECOMENDACIONES: ...................................................................................................... 28 BIBLIOGRAFÍA: ................................................................................................................... 29.

(6) INTRODUCCIÓN. INTRODUCCIÓN: Los compuestos secundarios producidos por las plantas ejercen actividades beneficiosas en el organismo animal, debido a su actividad antioxidante y sus efectos favorables sobre procesos inflamatorios y tumorales, pero sus actividades más conocidas son como estimulantes digestivos, antisépticos y antimicrobianos (McArthur et al., 1993). El uso de extractos vegetales en la alimentación animal constituye actualmente una alternativa natural a los aditivos antibióticos promotores del crecimiento (Windisch et al., 2008). Existe un gran número de compuestos secundarios que pueden utilizarse como aditivos en la alimentación de los rumiantes, pero entre ellos destacan las saponinas, los aceites esenciales y los taninos (Jouany y Morgavi, 2007). Las plantas producen taninos como un mecanismo de defensa ante los ataques de bacterias, hongos e insectos, y además de la preferencia por los herbívoros ya que generan astringencia, lo que reduce la calidad nutricional de las mismas (McArthur et al., 1993). Estos complejos se disocian a valores de pH inferiores a 3,5 (pH en el abomaso) y superiores a 7,5 (pH en el intestino delgado), por lo que las proteínas pueden ser digeridas en el estómago e intestino delgado sin haberse degradado en el rumen (Min et al., 2003). Generalmente las plantas leguminosas tropicales se caracterizan por sus altas concentraciones de taninos condensados (TC) que tienen alta afinidad por las proteínas,. carbohidratos. y. otros. constituyentes. de. las. plantas,. afectando. notablemente la digestibilidad de los nutrientes (Waghorn, 2008; Tiemann et al., 2008). Sin embargo, los efectos negativos sobre la digestibilidad dependen de la concentración de taninos en las plantas, que no guarda un patrón común en éstas, por ejemplo en Leucaena leucocephala el 0,018-0,046 g/ 100 g MS de la materia seca son taninos (García et al., 2008; Galindo et al., 2009), en Mucuna pruriens del 0,01-0,033 g/100 g MS de la materia seca (Siddhuraju et al., 2000; Betancur-Ancona et al., 2004; Kala y Mohan, 2010), mientras que en Canavalia ensiformis los valores son generalmente insignificantes (Mora et al., 1986; León et al., 1989; BetancurAncona et al., 2004; Estupiñan et al., 2007;). Concentraciones entre el 0,02 g/100 g MS y 0,04 g/100 g MS de taninos en la materia seca son consideradas óptimas para la obtención de beneficios de estas plantas (Aerts el al., 1999; Min et al., 2003). 1.

(7) INTRODUCCIÓN Los taninos poseen efectos antimicrobianos y pueden afectar negativamente al crecimiento de determinados microorganismos ruminales, lo que resulta en efectos perjudiciales (como la reducción del crecimiento bacteriano) o beneficiosos (por ejemplo, reducción de la producción de metano y la degradación proteica). Finalmente, los efectos de los taninos sobre los procesos digestivos varían ampliamente en función de su estructura química y de la dosis administrada (Frutos et al., 2004), pero tienen gran potencial para modificar la fermentación ruminal. En un experimento in vitro precedente realizado por Artiles-Ortega et al., (2016) con líquido ruminal de ovejas alimentadas a base de heno, encontraron valores de fermentación aparente de carbohidratos de 43.7, 40.2 y 26.9 g/100 g de MS en Canavalia ensiformis, Mucuna pruriens y Leucaena leucocephala respectivamente, donde el diseño experimental no permitió inferir si la presencia de taninos en estas leguminosas influyó en estos valores de digestibilidad. Problema científico: Es poco conocido el efecto de la adaptación de la flora microbiana a diferentes fuentes de carbohidratos y su interacción con la suplementación de levadura sobre la degradación ruminal in vitro de Leucaena leucocephala, Mucuna pruriens y Canavalia ensiformis. Hipótesis: La fermentación ruminal in vitro de Leucaena leucocephala, Mucuna pruriens y Canavalia ensiformis puede diferir cuando los inóculos microbianos ruminales han sido previamente sometidos a estrés nutritivo (diferentes fuentes de carbohidratos) y suplementados o no con levadura. Objetivo general: Evaluar el efecto de las comunidades microbianas cultivadas durante 14 días frente a diferentes fuentes de carbohidratos, ya sea en presencia o no de levadura sobre la fermentación ruminal in vitro de tres leguminosas tropicales. Objetivos específicos: 1. Evaluar el efecto de inóculos ruminales adaptados a diferentes fuentes de carbohidratos sobre la digestibilidad in vitro de forrajes de L. leucocephala , M. pruriens y C. ensiformis. 2. Evaluar el efecto de inóculos ruminales adaptados a diferentes fuentes de carbohidratos en combinación con la suplementación in vitro de levadura sobre la digestibilidad in vitro de forrajes de L. leucocephala , M. pruriens y C. ensiformis.. 2.

(8) INTRODUCCIÓN 3. Determinar la composición químico proximal y las concentraciones de fenoles y taninos totales y taninos condensados en Canavalia ensiformis, Mucuna pruriens y Leucaena leucocephala. 4. Determinar la digestibilidad ruminal aparente de carbohidratos y la actividad biológica de los taninos en Canavalia ensiformis, Mucuna pruriens y Leucaena leucocephala.. 3.

(9) CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA. CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA I.1. Características de las leguminosas tropicales Las leguminosas tropicales (por ejemplo, L. leucocephala, M. pruriens, C ensiformis) son forrajes prometedores para rumiantes ya que poseen un alto potencial productivo de granos y follaje, y un alto contenido de sustancias nitrogenadas con un elevado valor nutritivo (Cáceres et al , 1995; Siddhuraju et al., 2000 ; Aye y Adegun, 2013),. pero. los. factores. anti-nutricionales. (FAN). que. contienen. afectan. negativamente la fermentación de estas en el rumen (Bhat et al., 1998; Bhatta et al., 2009; Jayanegara et al., 2015). Las legumbres son una fuente barata de proteínas, presentando características nutricionales importantes como: concentraciones elevadas de hidratos de carbono, contenidos altos de fibra y bajos de grasa (excepto las semillas oleaginosas), y altos tenores de ácidos grasos insaturados. Además, poseen niveles importantes de complejo de vitaminas B, y minerales (García et al., 2006). También son conocidas por contener cierta. cantidad. de. compuestos bioactivadores cuyos efectos. beneficiosos necesitan ser explorados para la explotación (Sridhar y Seena, 2006). En las leguminosas pratenses tropicales disminuye el valor nutritivo al madurar la planta, debido a que los cambios en la relación hoja-tallo son menos marcados que en gramíneas, lo que representa una ventaja sobre estas últimas (Norton y Poppi, 1995). En el caso de las leguminosas temporales, estos cambios en la proporción de los componentes de la planta, hacen que su calidad bromatológica se mantenga, aún más que en las leguminosas perennes, debido a las características morfológicas de sus vainas y al valor nutritivo de sus granos (Díaz, 2000). Debido a su alto aporte de nutrientes, y el paso de proteína no degradada al abomaso, Leucaena se ha convertido en una de las leguminosas más usadas en la alimentación de rumiantes (Barros-Rodríguez et al., 2014). Un alto contenido de proteína bruta, que varía entre 24 y 30 % dependiendo de la variedad y la época del año (García et al., 2008) y valores de digestibilidad de proteínas y materia seca medidas in vivo que alcanzan 63 % y del 60-70 % respectivamente (BarrosRodríguez et al., 2012), permiten que sea ampliamente aceptado el uso de esta como un suplemento de proteína en los sistemas de producción ganadera en las regiones tropicales (Galindo et al., 2009). 4.

(10) CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA La composición bromatológica de las leguminosas puede variar grandemente en dependencia del lugar donde se desarrolla el cultivo, la época de siembra o la época de corte del mismo, por ejemplo en cultivares de L. leucocephala en Sao Pablo, Brasil se obtuvieron valores de 93.6 g/100 g MS y 23.6 g/100 g MS de materia orgánica y proteína bruta respectivamente (Soltan et al., 2013) mientras que en Egipto la proteína bruta obtuvo valores de 20.4 g/100 g MS (Sallam et al., 2010) y en Cuba los valores alcanzan los 90.7 g/100 g MS de materia orgánica y los 27.0 g/100 g MS de proteína cruda (Rodríguez et al., 2008). Canavalia ensiformis es una leguminosa que destaca especialmente por su contenido de proteínas, por lo que ha sido empleada como una fuente proteica en la alimentación tanto de monogástricos como de rumiantes (Belmar, 1999). C. ensiformis podría ser un cultivo del futuro como alternativa en la alimentación animal; esta planta se destaca por su adaptación a un amplio rango de condiciones climáticas y agronómicas, con capacidad de producir en suelos con bajos contenidos de nutrientes y regiones con pocas precipitaciones (Beyra et al., 2004). Un trabajo realizado por Estupiñan et al. (2007) demuestra que la composición química de los componentes de la pared celular de C. ensiformis varía en diferentes edades de corte, por ejemplo, la fibra detergente neutra varía en valores de 49.16 – 52.10 – 52.66 – 54.74 g/100 g MS a edades de corte de 60 – 75 – 90 - 105 días respectivamente. Canavalia es una leguminosa de alta producción de forraje (7 hasta 12.4 t/ha) y elevado contenido de proteína bruta en sus hojas y posee un alto potencial de aminoácidos esenciales, con excepción del triptófano (Sridhar y Seena, 2006). Los hallazgos de Díaz (2000) evidenciaron la posibilidad agronómica que manifiestan la especie C. ensiformis para la producción de forrajes y forrajes integrales, cuando se siembran al inicio de la estación lluviosa, bajo las condiciones de. Cuba.. Posteriormente,. Díaz. et. al. (2002) demostraron la. posibilidad. bromatológica que manifiesta esta leguminosa para la producción de forrajes, forrajes integrales y granos, cuando se siembran al final del período lluvioso en Cuba y además su calidad bromatológica superior al resto de las leguminosas evaluadas en el estudio (Lablab purpureus y Stizolobium niveum).. 5.

(11) CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA I.2. Adaptación de la flora microbiana mediante incubaciones consecutivas y la suplementación con levaduras para mejorar la digestibilidad de los alimentos. Gaviria et al. (2015) reportaron que la degradabilidad de L. leucocephala solo fue mayor cuando se combinó con la hierba de guinea, pero no fue diferente entre la combinación de Leucaena con hierba de guinea (Panicum maximum) y con la hierba de guinea suplementada (melaza y harina de arroz). En otro estudio, Blandino y Pineda (2015) informaron que la digestibilidad in vitro de C. ensiformis con harina de caña de azúcar fue de 71.8 – 73.4 % (5 a 10 % de la tasa de inclusión de Canavalia), y Mora et al. (1983) demostraron que los niveles crecientes de inclusión de granos de harina de C. ensiformis en las dietas de forraje de ovejas disminuyó la digestibilidad de la materia seca (MS) (de 61.7 a 57.4 % respectivamente). Además, Herawaty et al. (2013) demostraron que el uso de paja de arroz como un sustituto del pasto fue similar a los resultados obtenidos con pasto cuando se le añade 0,5 % de Saccharomyces cerevisiae y 15 % de L. leucocephala. La incubación ruminal consecutiva in vitro podría permitir una modificación de la actividad o la composición de la microflora del rumen, Theodorou et al. (1987) mostró variaciones en la capacidad de la población microbiana ruminal de adaptarse a los compuestos fenólicos empleando este tipo de incubación como adaptación a estos compuestos. Por otro lado, Kondwani (2007), demostraron que tienen una alta digestibilidad y producción de gas a pesar de su contenido de L- Dopa usando la incubación consecutiva para adaptar la microflora a los contenidos de este factor presente en las semillas de Mucuna. Además, Mbiriri et al. (2015) usando una incubación consecutiva informó que se observaron adaptaciones microbianas en el rumen cuando se utilizaron como aditivos dos sustancias diferentes (carvacrol y timol). En adición, la suplementación con levadura también se ha sugerido para modificar la comunidad microbiana del rumen (Öztürk et al.,2015), y por tanto mejorar la fermentación (Chaucheyras et al., 2008). La mejora de la fermentación en el rumen con la adición de la levadura se atribuyó a la capacidad que tiene esta para incrementar el número de microorganismos ruminales, especialmente hongos y poblaciones de bacterias fibrolíticas (Mao et al., 2013). Por otra parte, la. 6.

(12) CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA suplementación in vitro con levaduras vivas afectó la fermentación ruminal en mayor grado que las levaduras inactivadas, pero ninguno de ellos mostró efectos significativos (Opsi et al., 2012). I.3. Presencia de taninos en las leguminosas. Los taninos son metabolitos secundarios generados por las plantas para su defensa contra microorganismos patógenos y la depredación por insectos o herbívoros (Barry y Manley, 1987; Wallace, 2004), y en relación con estos últimos, afectan los procesos. metabólicos. del animal y/o la tasa de crecimiento de algunos. microorganismos después de su ingestión. Son sustancias astringentes que producen sabores amargos que se encuentran a menudo en las hojas de la planta (Durmic y Blache, 2012). Los taninos son un complejo químico de polifenoles hidrosolubles, que se pueden combinar con otros polímeros como la celulosa, hemicelulosa y pectinas para formar complejos estables (Mangan, 1988), especialmente cuando se combinan con proteínas, disminuyen su digestibilidad (Waghorn, 2008). La presencia de taninos se relaciona con una disponibilidad biológica menor de algunos nutrientes porque forman complejos con la fibra, las proteínas y otras macromoléculas e iones metálicos mediante puentes de hidrógeno, enlaces covalentes, enlaces iónicos e interacciones hidrófobas (Schofield et al., 2001). Las especies forrajeras que contengan taninos y, además, un adecuado contenido de proteínas constituyen excelentes fuentes suplementarias para la alimentación de rumiantes en el trópico (García et al., 2006; Lezcano et al., 2012). Por el contrario, cuando los niveles de taninos en las forrajeras son cuantiosos pueden ocasionar pérdidas de nutrimentos y un mal aprovechamiento de las raciones en los rumiantes, además de toxicidad aguda en animales monogástricos (Abdulrazak et al., 2000), aspectos estos importantes a la hora de definir la inclusión de estas leguminosas como alimentos para estos animales en los diferentes sistemas de crianza. Hay dos tipos de taninos, hidrolizables (TH) y condensables (TC). Los TC se localizan en las hojas de numerosas plantas y arbustos, y son compuestos definidos como compuestos proantocianina-flavonoides con enlace carbono-carbono uniendo el monómero flavonoide individual que puede ser catequina, galocatequina, epicatequina y epigalocatequina (Perchellet et al., 1996). 7.

(13) CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Los TC son sustancias complejas con capacidad de reaccionar con macromoléculas y proteínas del forraje, según su concentración, estructura química y peso molecular. No son hidrolizables por ácidos ni enzimas y son conocidos como poliflavonoides o proantocianidinas, ya que están constituidos por flavonoides con diferente grado de condensación, además de carbohidratos y trazas de aminoácidos y tienen un peso molecular que fluctúa entre 1 900 y 28 000 Da (Posada et al., 2005). Estos se encuentran comúnmente en las especies forrajeras de la zona templada y en leguminosas utilizadas en los sistemas de producción pastoril. La concentración en estas especies es muy variable: 0.01 a 10 % de la materia seca (MS). Sin embargo, en un rango de concentración de 0.2-0.4 g/100 g MS, producen cambios a nivel nutricional productivo y sanitario en los animales que los consumen (Paolini et al., 2003). Estos polifenoles producen una reducción en el consumo, la digestibilidad de la proteína, materia seca y fracciones minerales (Ojeda et al., 2010). Según Barbehenn y Constabel (2011) los taninos hidrolizables (TH) son ésteres fácilmente hidrolizables por ácidos, bases y enzimas, formados por una molécula de azúcar (generalmente glucosa) unida a un número variable de ácidos fenólicos, ácido gálico y elágico, agrupándose así en galotaninos y elagitaninos. Tienen una distribución limitada en la naturaleza pero abundan en frutos, vainas y hojas de algunas dicotiledóneas y su peso molecular varía desde 500 a 3 000 Da. Los TH son generalmente tóxicos para los animales (Haslam et al., 1977; Pérez-Maldonado y Norton, 1996). L. leucocephala ha sido ampliamente estudiada en cuanto a la presencia y cantidad de taninos, estando su estudio y aplicación distribuido ampliamente por todo el mundo. Trabajos realizados en Egipto por Sallam et al. (2010) y Soltan et al. (2013), encontraron valores de 0.03 y 0.05 g/100 g MS de taninos condensados, respectivamente. En América los valores son muy distantes en dependencia del país en que se muestrea, por ejemplo, García et al. (2008) en evaluaciones en Venezuela encuentran valores de 0.03- 0.05 g/100 g MS y Soltan et al. (2013) en Brasil de 0.02 g/100 g MS, mientras que Rahim et al. (2012) determinaron que los taninos condensados se encuentran en la especie en valores de 0.09 g/100 g MS. Por otro lado, en Cuba la cantidad de taninos condensados en Leucaena oscila entre 0.020.05 g/100 g MS (Galindo et al., 2009). Siddhuraju et al. (1996), y Siddhuraju et al. (2000) demostraron que M. pruriens presenta niveles de taninos condensados dentro del rango de 0.01-0.05 g/100 g MS 8.

(14) CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA en la India. Por otro lado, en México los valores oscilaron entre 0.014- 0.023 g/100 g MS (Kalidass y Mohan, 2011) y en Nigeria, Amira et al. (2014) indicaron niveles de 0.026 g/100 g MS de taninos condensados en esta especie. I.4. Efecto de los taninos en la fermentación ruminal. Dependiendo de su concentración los TC pueden tener efectos beneficiosos o nocivos; los efectos favorables se presentan con concentraciones moderadas (2-4 %), mientras que los efectos nocivos se presentan cuando las concentraciones son relativamente altas (6-12 %) (Aerts el al., 1999). Getachew et al. (2000) determinó algunos efectos adversos de los taninos como son: disminución de la ingesta y la digestibilidad, efectos sistémicos debido a la asimilación de productos de degradación de los taninos hidrolizables en el tracto digestivo, inhibición de enzimas digestivas y pérdida de proteína endógena. Por otro lado, los taninos pueden generar varios efectos positivos pero los más estudiados son su actividad como antiparasitarios biológicos (McSweeney et al., 2001; Min y Hart, 2003). Estos provocan la disminución de la solubilidad y degradabilidad de las proteínas de la pastura de alfalfa, la cual es generadora de altas concentraciones de amoníaco ruminal y, por ende, más exigente en energía para detoxificar la urea metabólica (Conti et al., 2007), y generan una mayor eficacia energética de la dieta al reducirse la producción de metano (Gurbuz, 2009). Otras interacciones a tener en cuenta son taninos-protozoos que depende del tipo de taninos, su origen y los niveles de suplementación (Carmona, 2007; Patra y Saxena, 2011), y taninos-hongos que depende de la naturaleza de la asociación del tanino con la enzima (Barahona et al., 2006). Los. taninos. se. unen. a. proteínas. y polisacáridos. estructurales. (celulosa,. hemicelulosa y pectina, minerales, almidón) retrasando su tasa de digestión e interfiriendo con la actividad de las enzimas microbianas (McSweeney et al., 2001; Min et al., 2003). El efecto de los taninos retardando la digestión de la fibra es considerado un efecto secundario comparado con la digestión del nitrógeno (N) (Pereira-Filho et al., 2005; Animut et al., 2008). Los taninos, por lo general, mejoran la asimilación del N por los rumiantes ya que reducen la cantidad de N amoniacal (N-NH3) producido en el rumen (Patra y Saxena, 2011), además reducen el número de bacterias totales y celulolíticas en el 9.

(15) CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA rumen lo que está relacionado con la reducción o mantenimiento de la producción de ácidos grasos volátiles (Patra et al., 2006; Cieslak et al., 2012). Las altas emisiones de CH4 ocurren particularmente cuando los forrajes de gramíneas. son los. ingredientes. principales. en las dietas para rumiantes,. considerando que las legumbres parecen tener una más baja producción potencial de CH4. Sin embargo, la mayoría de los esfuerzos por mitigar la producción de CH 4 a través de la variación de los forrajes dietéticos produce una reducción en la degradación de la fibra ruminal o la digestibilidad de los nutrientes en el tracto gastrointestinal (Tan et al., 2011; Abdalla et al., 2012; Goel y Makkar, 2012). Un posible beneficio adicional de la utilización de leguminosas en la alimentación de los rumiantes son los efectos derivados de los compuestos secundarios que contiene, por ejemplo: taninos, que tienen un posible efecto en la disminución de los gases de efecto invernadero (Barros-Rodríguez et al., 2014). Aumentando la dosis en la dieta a 2.5 % de taninos, la producción del metano en el ganado y ovejas se disminuye en un 15 %, pero a este efecto también podría atribuirse un 5 % de reducción de digestibilidad de la fibra. Recientemente, se ha demostrado in vitro que las propiedades antimetanogénicas de la Leucaena (Soltan et al., 2012) puede ser resultado de las cantidades significativas de CT que contienen sus hojas (33 - 61 g/kg MS) (Tan et al., 2011; Soltan et al., 2012). Además, es una fuente de minerales tales como azufre, que actúa como potenciador de las poblaciones de la microbiota ruminal (principalmente hongos y bacterias celulolíticas) (Aregheore, 1999). La digestibilidad in vitro de la proteína de M. pruriens presenta un nivel mayor comparado otras especies. La presencia de factores antinutricionales no es un problema para el consumo de estas semillas, una vez sean sometidas a un proceso adecuado. En vista de su composición química y nutricional, las semillas de estas leguminosas pueden ser empleadas como materia prima en la elaboración de alimentos balanceados para animales. Ha sido demostrado que en este forraje los niveles de fenoles y taninos es eliminado mediante el secado (Siddhuraju et al., 1996) y autoclaviado (Vijayakumari et al., 1996) y su reducción mejora la digestibilidad de la proteína. En las semillas de Mucuna pruriens, Josephine y Janardhanan (1992) reportaron que la mayor proporción de taninos se encuentra en la testa de la semilla y solo trazas en los cotiledones. 10.

(16) CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Aunque se han detectado factores anti-nutricionales en M. pruriens (sobre todo en los granos), no hay evidencia de un efecto perjudicial de estos compuestos cuando se alimenta con este forraje a los rumiantes en grandes cantidades (Castillo-Caamal et al., 2003; Pérez-Hernández et al., 2003). La inclusión de vainas de M. pruriens en las dietas no tienen un efecto negativo en el consumo total de MS (Loyra-Tzab et al., 2013). La inclusión de Canavalia tiene un posible efecto sobre las bacterias Gram positivas ruminales y una disminución en el rumen de amoníaco acompañado por un aumento de la concentración de aminoácidos libres (Domínguez-Bello y Stewart, 1990) lo que causaría la depresión de la digestión observado en algunos reportes. Algunos autores también reportan un incremento de flagelados (clase no común de protozoario ruminal) y un aumento neto de la población de protozoarios en bovinos alimentados con Canavalia (Sandoval-Castro y Herrera, 2001). Numerosos autores señalan que las semillas de Canavalia no contiene taninos o están presentes en valores muy bajos (Rajaram y Janardhanan, 1992; BetancurAncona et al., 2004; Sridhar y Seena, 2006) y atribuyen los efectos negativos de la inclusión en la dieta de rumiantes de este forraje a compuestos antrinuticionales como la canavanina y la concanavanina A (Natelson, 1985; Rodrigues y Torne, 1992; Sridhar y Seena, 2006). La inclusión de taninos, por ejemplo, con utilización de la harina de plátano verde, puede detoxificar la Canavalia, al formar complejos irreversibles con los tóxicos, pero puede también reducir la disponibilidad de la fracción nitrogenada restante (Escobar et al., 1983). Escobar et al. (1983) informan un buen consumo de Canavalia en animales adaptados, y recomiendan que estos deben tener un período de adaptación de alrededor de 30 días. El potencial de la Canavalia para los rumiantes es más amplio que en las aves y los cerdos, incluyendo el uso de la planta entera como: a) un componente de un pastizal de gramíneas y leguminosas; b) un banco de proteína con un pastoreo intensivo adecuadamente controlado; y c) en un sistema de alimentación. en. confinamiento. total. o. parcial;. puede. resultar. viable,. alternativamente, usar el grano, las legumbres y las vainas o el follaje remanente después de la cosecha del grano.. 11.

(17) CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA I.5.. Uso. de. Polietilenglicol. (PEG). para. determinar. digestibilidad. en. leguminosas con taninos Para evaluar la actividad de taninos en la fermentación ruminal de árboles y arbustos tropicales se utiliza frecuentemente la técnica de producción de gas in vitro combinada con un agente inactivador de taninos como el polietilenglicol (PEG) (Ben Salem et al., 2005; Makkar, 2005). El PEG (OH(C 2H4O)nH) es un detergente iónico que se adhiere a los taninos hidrolizables y condensados mediante enlaces hidrofóbicos en un rango de pH que va desde 2 a 8,5 (Getachew et al., 2000). Este compuesto desplaza a los TC de los complejos tanino-proteína formando complejos insolubles e irreversibles con las proteínas vegetales y, además formando complejos PEG-taninos que son solubles, evitando de esta forma la formación tanino-proteína (Jones y Mangan 1977; Barry y Manley, 1986). La unión es más fuerte entre PEG y taninos que con las proteínas de la planta por lo que el tratamiento con PEG se utiliza para separar los efectos nutricionales atribuibles a los TC en rumiantes alimentados con forrajes que lo contengan (Getachew et al., 2002). La afinidad de los taninos al PEG es mayor que las de las otras moléculas presentes en la solución de incubación y el sustrato fermentado, por lo que los taninos son inactivados, y el tratamiento con PEG funciona como un control libre de taninos (Muetzel y Becker, 2006). Getachew et al. (2002) concluyó en un estudio que las muestras que contengan fenoles y taninos totales por encima de 0,4 y 0,2 g/100 g DM, respectivamente, no producen un aumento en la producción de gas en conjunto con PEG. Los estudios de la proporción de inclusión de PEG para lograr una neutralización completa de los taninos varían notablemente (Makkar et al., 1995; Kamalak et al., 2005) por lo que estas proporciones no pueden ser universalmente aplicables. La eficacia de la inclusión de PEG puede variar por especies de forraje, lo que se debe a la estructura química y peso molecular diferente de los taninos (Makkar et al., 1995). También esta inclusión de PEG puede variar en la misma especie si crece en ambientes significativamente diferentes, por lo que determinar los niveles de inclusión de PEG óptimos es crítico para evaluar el costo eficaz de forrajes taníferos en los países en vías de desarrollo (Edwards et al., 2012).. 12.

(18) CAPÍTULO I. REVISIÓN BIBLIOGRÁFICA Según este propio autor, con niveles de inclusión de 200 mg/g MS de la muestra es suficiente para el diagnóstico de la actividad biológica de los taninos in vitro en forrajes de tres especies de leguminosas, dentro de las cuales se encontró L. leucocephala.. 13.

(19) CAPÍTULO II. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL. CAPÍTULO II. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL II.1. Obtención del forraje de las leguminosas y preparación de las harinas La harina de forraje de cada leguminosa tropical se preparó de la siguiente manera: para C. ensiformis y M. pruriens se utilizó una mezcla de granos y forraje [base seca 1:1], mientras que para L. leucocephala solo se utilizó forraje. Las tres leguminosas tropicales fueron cultivadas en la vaquería "Tres Caminos" (22º25'22.9 "N, 80º03'13" W) de la UBPC "Desembarco del Granma", ubicada en Santa Clara, en el centro de Cuba. M. pruriens se sembró intercalada con pasto Elefante (King Grass) en una parcela de 1 ha, mientras que C. ensiformis y L. leucocephala se sembraron en diferentes parcelas de 0.2 y 1 ha, respectivamente. La precipitación, temperatura y humedad promedio durante el período de cultivo fueron de 47.5 ± 42.13 mm, 26.3 ± 2.02ºC y 82.5 ± 4.19 %, respectivamente. Los cultivos no fueron fertilizados ni irrigados. El forraje fresco de las tres leguminosas se cosechó por separado alrededor del mediodía al finalizar temporada lluviosa (23/10/2014 - 27/10/2014). M. pruriens y C. ensiformis se cosecharon a unos 5 cm por encima del nivel del suelo (planta entera en etapa de floración), y los materiales de L. leucocephala se cortaron de las ramas jóvenes (se extrajeron los tallos para obtener solo las ramitas y las hojas). Además, los granos de M. pruriens y C. ensiformis se obtuvieron en las mismas parcelas en la etapa de grano seco. II.2. Análisis químico proximal El análisis químico proximal fue realizado de acuerdo a lo descrito en AOAC (2005) (MS: material seca – número ID 930.15; PB: proteína bruta. – como 6.25 x N -. número ID 954.01); MO: materia orgánica (EC, 2009) y el fraccionamiento de la fibra según Van Soest et al. (1991). Además, se realizó determinación de Fenoles y Taninos totales, y taninos condensados según lo recomendado por Makkar et al. (2007). II.3. Incubación consecutiva con o sin levadura y con diferentes fuentes de carbohidratos La incubación ruminal consecutiva in vitro se llevó a cabo de acuerdo a lo recomendado por Castro-Montoya et al (2015), con algunas modificaciones que se muestran a continuación: los frascos de incubación de 120 mL recibieron uno de tres 14.

(20) CAPÍTULO II. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL sustratos (530 mg de celulosa, 470 mg de almidón o 500 mg de mixto [1:1 almidón y celulosa]) según lo planteado por Vlaeminck et al (2014), en combinación con uno de tres tratamientos con Saccharomyces cerevisiae (40 mg de células de levadura vivas [AY], 40 mg de levadura inactivada [IY] [AY esterilizada en autoclave a 121°C durante 20 min] o sin levadura [-Y]). La fuente de levadura fue Yea Sacc®, cultivo de levadura vivo basado en la cepa CNCM I-1026 (Alltech, Deinze, Bélgica) (Hassim et al., 2012). Posteriormente, los frascos se cerraron con tapones de goma y se enjuagaron exhaustivamente con CO2 para obtener condiciones anaeróbicas. Para la primera incubación, el fluido ruminal se obtuvo a partir de tres ovejas fistuladas de la raza Texel [aprobado por la comisión ética del Instituto de Investigación Agrícola y Pesquera (ILVO), Bélgica (EC 2014, 241)] alimentadas con heno ad libitum y con acceso libre al agua potable. El fluido ruminal obtenido se recogió en matraces aislados para el transporte y se mezcló, homogenizó y filtró según lo planteado por Castro-Montoya et al. (2015), y modificado para suministrar N extra (g/L de agua destilada: hidrolizado de caseína ácida: 1.25; peptona: 1.25; Na 2HPO4.12H2O: 2.685; KH2PO4: 1.1625; MgCl2.6H2O: 0.093; NaHCO3: 6.555; NH4HCO3: 0.75) y se incubaron a 39°C en una incubadora con agitación intermitente (Edmund Bühler GmbH SM - 30 Control, Alemania), empleándose tres frascos/tratamiento como réplicas estadísticas (Figura 1). Después de 48 h, todos los frascos se retiraron de la incubadora y se transfirió 10 mL de cada uno con una jeringa estéril a otro nuevo con los mismos sustratos y suplementos de levadura, y se les añadieron 40 mL del buffer mencionado anteriormente en combinación con fluido ruminal clarificado de acuerdo con Kenters et al. (2011) (3:1 v/v). Todos los frascos se incubaron de nuevo durante 48 h y se realizaron transferencias consecutivas durante un período de 12 días. II.4. Incubación ruminal in vitro (24 h) de tres leguminosas tropicales Las incubaciones ruminales in vitro (24 h) se llevaron a cabo siguiendo el método descrito por Vlaeminck et al. (2014), con inóculos derivados de la última transferencia. de. las. incubaciones. consecutivas. descritas anteriormente. Se. transfirieron 5 mL de cada inóculo a un nuevo frasco de 120 mL al cuál se le añadió 24 mL del mismo buffer descrito anteriormente mezclado con líquido ruminal clarificado (3:1 v/v), y una de tres leguminosas (mezcla de granos y forraje de 15.

(21) CAPÍTULO II. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL Mucuna pruriens o C. ensiformis [250 mg, 1:1 base seca], o 250 mg de forraje de Leucaena leucocephala (Figura 1), y se incubaron durante 24 h a 39ºC en incubadora con agitación intermitente (Edmund Bühler GmbH SM - 30 Control, Alemania).. Leyenda: Color carmelita: sustrato (530 mg de celulosa, 470 mg de almidón, o 500 mg de mixto [1:1 celulosa y almidón]) y suplementación con levadura (40 mg de levadura viva [AY], 40 mg de levadura inactivada [IY] [AY. autoclaveada a 121º C durante 20 min] o sin levadura [-Y]); Color azul: Buffer; Color dorado y. : inóculo. frescamente obtenido a partir de ovejas fistuladas; Color naranja: Buffer + Fluido ruminal clarificado; Color verde: Legumbres (250 mg): Canavalia ensiformis, Mucuna pruriens, o Leucaena leucocephala; Color rojo: inóculo obtenido a partir de la incubación consecutiva.. Figura 1. Representación esquemática de la incubación consecutive durante 14 d, así como la incubación ruminal in vitro (24 h) de las tres legumbres tropicales. El control de los tratamientos se preparó con 6 mL de inóculo fresco obtenido de las mismas ovejas, y 18 mL de tampón bicarbonato/fosfato. Se incubaron bajo las mismas condiciones descritas anteriormente. Todos los frascos se retiraron de la incubadora después de 24 h, deteniéndose la actividad fermentativa en un baño de. 16.

(22) CAPÍTULO II. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL hielo. Después de 5 minutos, se prepararon las muestras para el análisis de ácidos grasos de cadena corta (AGCC), y bases púricas y pirimidínicas. II.5. Análisis de los productos finales de la fermentación. La producción total de AGCC, la proporción molar de cada AGCC y la degradabilidad ruminal aparente de carbohidratos (ARDC) fueron empleados como proxy de la capacidad fermentativa. El análisis de los AGCC fue realizada según lo descrito por Castro-Montoya et al (2012). ARDC fue calculado como sigue: ARDC (g/100 g MS) = (acetato/2+propionato/2+butirato+caproato)*162 Donde 162 es asumido como peso molecular de 1 mol de carbohidratos fermentables; acetato, propionato, butirato y caproato son expresados en mol/100 g MS de sustrato añadido (Demeyer, 1991). Como se puede observar a la relación estequiométrica descrita previamente por el autor mencionado, se le añadió el caproato basado en los mismos principios estequiométricos de formación de AGCC a partir de carbohidratos fermentables como lo subrayó Demeyer (1991). II.6. Análisis de bases púricas y pirimidínicas. La determinación de bases nitrogenadas (púricas y pirimidínicas) se realizó basado en lo metodología propuesta por Makkar and Becker (1999) con algunas adaptaciones, las cuales fueron descritas detalladamente por Vlaeminck et al. (2005). El total de nucleobases (mg/mL) fue calculada como la suma de la cantidad de purinas y pirimidinas. II.7. Determinación de la actividad biológica de los taninos La determinación de la actividad biológica de los taninos se realizó según lo recomendado por Makkar et al. (1995) con algunas modificaciones. La incubación ruminal in vitro (24 h), fue llevada a cabo siguiendo la metodología descrita por Vlaeminck et al. (2014). El fluido ruminal fue obtenido de tres ovejas fistuladas (aprobado por el comité de ética del Instituto de Investigación Agropecuaria y Pesquera (ILVO), Bélgica (EC 2009, 114), las cuales fueron alimentadas con heno ad libitum y libre acceso al agua. Se emplearon frascos de 120 mL, cada uno recibió una de tres leguminosas (250 mg de harina mixta de granos y follaje de Canavalia ensiformis [50:50 en base seca], 17.

(23) CAPÍTULO II. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL 250 mg de harina mixta de granos y follaje de Mucuna pruriens [50:50 en base seca], o 250 mg de harina de forraje of Leucaena leucocephala) en combinación con la adición o no de 250 mg de polietilenglicol (PEG 6000). El fluido ruminal obtenido fue colectado en frascos aislados para su mezclado y transporte, fueron homogenizados y filtrados a través de una tamiz con poros de 1 mm bajo continuo enjuagado con CO2 y mantenidos luego en baño María a 39ºC para ser usados como fuente de inóculo. El fluido ruminal colado y una mezcla anaeróbica saturada con CO2 (lavado con CO2 durante 30 min) de buffer carbonato/fosfato (conteniendo en g/L de agua destilada: Na2HPO4.12H2O: 3.58; KH2PO4: 1.55; MgCl2.6H2O: 0.124; NaHCO3: 8.74; NH4HCO3: 1.0) fue añadida a cada frasco de incubación. Un mL de etano fue añadido como estándar interno y se incubaron durante 48 h a39ºC en una incubadora con agitación intermitente (Edmund Bühler GmbH SM – 30 Control, Alemania). Fueron utilizados tres frascos por tratamiento como replicas estadísticas. Todos los frascos fueron extraídos de la incubadora luego de 24 h, y la actividad fermentativa fue detenida en un baño con agua helada. Luego de 5 min se les midió el contenido de gases por cromatografía gaseosa (GC) (3000 micro – GC, Agilent, USA) y las muestras fueron preparadas para el análisis de ácidos grasos de cadena corta (AGCC) por GC (Shimadzu 2010, Shimadzu Corporation‘s-Hertogenbosch, The Netherlands). II.8. Análisis estadístico Todos los datos fueron analizados usando SPSS 21.0 (SPSS, 2012). Se usó un modelo lineal general (GLM) para analizar la producción de AGCC, nucleobases y la degradabilidad ruminal aparente de carbohidratos (ARDC) para cada una de las leguminosas, de acuerdo con Y =μ+Ai=1-3+Bj=1-3+ ABij+ξ, con Ai=1-3 efecto del sustrato (celulosa vs. almidón vs. mixto) utilizado en la incubación consecutiva, Bj. = 1-3. el. efecto de la levadura (levadura activa vs. levadura inactiva vs. sin levadura) durante la incubación consecutiva, ABij la interacción entre los factores indicados; y ξ el error residual. Las diferencias se declararon significativas a P<0.05 mediante el procedimiento de Tukey para comparaciones múltiples. Además, se completó una prueba de Dunnett para evaluar si el ARDC con inóculo derivado de la incubación consecutiva difería de aquellos con inóculo fresco. 18.

(24) CAPÍTULO II. METODOLOGÍA EXPERIMENTAL Los valores de los indicadores obtenidos en el análisis químico proximal se analizaron usando el paquete estadístico SPSS 21.0 (SPSS software for Windows, release 11.0; SPSS, 2012). El Modelo Lineal General fue empleado para analizar los datos de acuerdo al modelo Yij=µ+Ai+ξij, siendo Yij la respuesta esperada; µ la media total; Ai el efecto de la leguminosa (factor fijado), y ξij el error residual. Las diferencias fueron declaradas significantes con P<0.05 y la comparación de las proporciones. fue. hecha. usando. el. procedimiento. Tukey’s. para. múltiples. comparaciones. La actividad biológica de los taninos y la fermentación ruminal in vitro de cada leguminosa individualmente fueron analizados estadísticamente mediante un Modelo Lineal General de acuerdo al modelo Yij=µ+Ai+ξij, siendo Yij la respuesta esperada; µ la media total; Ai el efecto de la inclusión de PEG (factor fijado), y ξij el error residual. Las diferencias fueron declaradas significantes con P < 0.05 y la comparación de las proporciones fue hecha usando el procedimiento Tukey’s para múltiples comparaciones.. 19.

(25) CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN III.1. Análisis. químico. proximal, fenoles. y taninos totales, y taninos. condensados de las leguminosas estudiadas Existe una amplia variación en cuanto a la composición bromatológica de las tres leguminosas, siendo de especial atención los niveles de FDN y FAD (Tabla 1), así como los valores de PB. Tabla 1. Análisis químico proximal de Leucaena leucocephala, Mucuna pruriens y Canavalia ensiformis (n = 3). Legumbres. MS. Cenizas. PB. Leucaena. 916.5. 61.3a. 297.2. Canavalia. 952.3. 53.9b. Mucuna. 954.7. SEM. 3.14. FDN. TT. TC. 532.5a 318.7a 47.4a. 47.3a. 0.4. 237.0. 284.0c 146.5b. 6.9b. 0.1. 62.8a. 253.9. 316.0b 181.6b 44.6a. 44.6a. 0.3. 0.09. 4.2. 0.15. 0.01. 0.68. FDA. 2.82. FT 7.0b. 0.15. Leyenda: MS: materia seca (g/kg MF); PB: proteína bruta, FDN: fibra detergente neutra, FDA: fibra detergente ácida (g/kg MS); FT: fenoles totales (eq-g ácido tánico/kg MS); TT: taninos totales (eq-g ácido tánico/kg MS); TC: taninos condensados (eq-g leucocianidina/kg MS); SEM: Error estándar de la media. a, b, c. media con diferentes superíndices en la misma columna denota diferencias significativas. (P<0.05) de acuerdo con la prueba de Tukey’s.. Las tres leguminosas contienen valores similares, que no difieren significativamente (P>0.05), en cuanto a MS, PB y TC. L. leucocephala presenta mayor contenido de PB y valores significativamente superiores en FDN y FDA (P<0.05), mientras que los valores más significativos de MS son los obtenidos por las especies Canavalia ensiformis y Mucuna pruriens aunque no difieren de Leucaena. Esta elevación de la fibra en Leucaena se debe a que al ser una planta arbustiva, su crecimiento es más prolongado, acumulando mayores niveles de lignina en sus tallos y hojas que en las leguminosas rastreras. Sallam et al (2010) exponen que L. leucocephala tiene altos valores de NDF, ADF y compuestos fenólicos particularmente TC, indicando que este compuesto es un factor limitante de la fermentación in vitro, lo que además es consistente con lo planteado por Haque et al. (2008) que reportan una correlación negativa entre NDF y ADF, y el rango y extensión de producción de gas (incluyendo la degradabilidad).. 20.

(26) CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Existen diferencias significativas en las cantidades de FT, TT entre Leucaena. y. Mucuna con respecto a Canavalia, no siendo así con respecto a los TC. Podemos observar que los valores más altos los posee también Leucaena mientras que Canavalia presenta escasas cantidades de estos metabolitos secundarios. Los valores de TC obtenidos en Leucaena coinciden con los resultados de Soltan et al. (2013) en Egipto, y Galindo et al. (2009) en Cuba; este último autor plantea que los TC de esta especie en Cuba oscilan entre 0.9 y 0.5 g/kg MS. En Mucuna los resultados coinciden con los de Siddhuraju et al. (2000), y en Canavalia son más altos que los encontrados por Betancur-Ancon et al. (2004) y Sridhar y Seena (2006) que solo contabilizaron trazas de taninos condensados en esta especie. III.2. Cultivo consecutivo por lotes La incubación consecutiva durante dos semanas usando diferentes fuentes de carbohidratos, afectó la producción total de AGCC (P <0,05) (Tabla 2), la cual fue 1,6 veces mayor cuando se usó almidón como sustrato en comparación con la celulosa. Tabla 2. Efecto del tipo de sustrato (celulosa, almidón o mezcla) sobre la producción total de AGCC (μmol / mL) y nucleobases (mg / mL) después de 14 días de incubación discontinua consecutiva (n = 9). Parámetros Producción total de AGCC Nucleobases. Cellulose. Starch. Mixture. SEM. p-value. 1920b. 3128a. 2246b. 124.8. <0.001. 8c. 22a. 16b. 1.2. <0.001. Los valores con diferentes superíndices (a, b, c) difieren significativamente (P <0,05) de acuerdo con la prueba de Tukey’s.. Además, la incubación con almidón como fuente de carbohidrato dio como resultado un aumento de aproximadamente tres veces en la cantidad nucleobases en comparación con la incubación con celulosa. Lo anterior expuesto sugiere que el inóculo derivado de las incubaciones consecutivas con almidón, potencialmente contenía tres veces más bacterias (Tabla 2). La suplementación con levadura no cambió (P> 0,05) la producción total de AGCC ni la cantidad de nucleobases (datos no mostrados).. 21.

(27) CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN III.3. Incubaciones de rumen in vitro (24 h) de leguminosas Aunque los inóculos derivados de la incubación con almidón contenían más nucleobases, la producción neta de nucleobases durante las 24 h de incubación con las leguminosas generalmente generó menos nucleobases en la incubación con almidón - inóculo (Tabla 3), mientras que la cantidad producida no fue afectada por la exposición del inóculo a la levadura. Tabla 3. Cuantificación de la producción neta de nucleobases (mg / mL) durante 24 h de incubación in vitro con diferentes leguminosas utilizando inóculo de cultivo consecutivo que había sido expuesto a almidón, celulosa o su mezcla en presencia (Ay e IY) o ausencia (- Y) de levadura (n = 3). Adaptación del inóculo a Substrato. Celulosa. Almidón. Mixto. Suplementos A. C. ensiformis 10.7cd. 12.8. 10.4. IY. 12.0bcd. 13.1. 11.1. -Y. 10.5d. 13.0. 9.9. AY. 7.3e. 11.6. 10.5. IY. 7.2e. 10.6. 9.1. -Y. 6.4e. 9.6. 9.5. AY. 14.7a. 14.9. 9.9. IY. 12.8abc. 13.5. 9.9. -Y. 13.1ab. 15.0. 13.3. 0.56. 0.40. <0.001. <0.001. 0.204. YS. 0.051. 0.507. 0.451. S x YS. 0.032. 0.385. 0.068. S B. L. leucocephala. AY. SEM. P – value. M. pruriens. 0.33. Los valores con diferentes superíndices ( a,b,c,d) en una misma columna difieren significativamente (P<0.05) según la prueba de Tukey’s. A. Suplementos : AY = levadura activa; IY = levadura inactivada; - Y = sin levadura.. B. S = sustrato, YS = suplemento de levadura; S x YS = interacción sustrato x suplemento de levadura.. Las cantidades más bajas de nucleobases generalmente estaban de acuerdo con una menor producción neta de AGCC en incubación con almidón - inóculo, como se observó. para. las. tres. leguminosas. (Tabla. 4). Independientemente. de. la. suplementación de levadura, los inóculos obtenidos después de 14 días de 22.

(28) CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN exposición a almidón como fuente de carbohidratos degradaron menos las tres leguminosas tropicales en comparación con la celulosa y el inóculo expuesto a la mezcla. Tabla 4. Degradación ruminal aparente de carbohidratos (g / g de MS) de tres leguminosas tropicales durante 24 h de incubación in vitro utilizando inóculo de cultivo consecutivo que había sido expuesto a almidón, celulosa o su mezcla en presencia (AY y IY) o ausencia (-Y) de levadura (n = 3). Adaptación del inóculo a Supplements A. Substrate. C. ensiformis. M. pruriens. L. leucocephala. AY. 0.47a. 0.36. 0.28ab. IY. 0.38c. 0.36. 0.35a. -Y. 0.41abc. 0.38. 0.24ab. AY. 0.35c *. 0.40. 0.20b. IY. 0.39bc. 0.36. 0.23b. -Y. 0.40bc. 0.32*. 0.23b. AY. 0.45ab. 0.38. 0.24ab. IY. 0.45ab. 0.37. 0.22b. -Y. 0.40bc. 0.39. 0.31ab. SEM. 0.008. 0.006. 0.011. Control. 0.44. 0.40. 0.28. S. 0.004. 0.371. 0.004. YS. 0.417. 0.469. 0.417. S x YS. 0.006. 0.105. 0.006. Celulosa. Almidón. Mixto. P – value. B. Los valores con diferentes superíndices en la misma columna ( a, b, c, d, e, f) difieren significativamente (P<0,05) según la prueba de Tukey’s. Los valores con * difieren significativamente (P <0,05) de acuerdo con la prueba de Dunnett. A. Suplementos : AY = levadura activa; IY = levadura inactivada; - Y = sin levadura.. B. S = sustrato, YS = suplemento de levadura; S x YS = interacción sustrato x suplemento de levadura.. La suplementación de levadura al cultivo consecutivo no indujo un cambio consistente en el inóculo con respecto a su capacidad para degradar las tres leguminosas tropicales. De hecho, para todas las leguminosas el efecto de la levadura dependía de la fuente de hidratos de carbono (PS x YS <0,05). El inóculo de celulosa al que se había suplementado la levadura activa dio como resultado una degradación más amplia de C. ensiformis (Tabla 4), aunque esto no 23.

(29) CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN difirió del inóculo fresco o del inóculo de celulosa sin levadura. Por otra parte, la ausencia de levadura durante 14 días de incubación consecutiva con almidón, dio como resultado un inóculo que mostró una capacidad considerablemente inferior para degradar M. pruriens (Tabla 4). La suplementación de levadura inactivada a cultivos consecutivos con celulosa dio como resultado un inóculo que degradaba más ampliamente L. leucocephala. No obstante, ARDC cuando se empleó el inóculo procedente de la incubación consecutiva no superó la degradación con inóculo de fluido ruminal fresco (Tabla 4). Se ha informado que la levadura estimula el crecimiento de microorganismos beneficiosos en el rumen (Denev et al., 2007) y aumenta el número microbiano (Kholif et al., 2016), específicamente anaerobios ruminales totales, bacterias celulolíticas (Castillo-González et al. , 2014), hongos (Chaucheyras et al., 1995, Mao et al., 2013) y bacterias acetogénicas que convierten el hidrógeno molecular en acetato (Chaucheyras et al., 1995). Otros estudios sugirieron que los cultivos de levadura potencian el crecimiento de las bacterias que utilizan ácido láctico (Jouany, 2001), mientras que la población de protozoos en general no es estimulada por la levadura (Doreau y Jouany, 1998, Mao et al, 2013). Sin embargo, en el presente estudio, la suplementación con levadura no cambió el número de nucleobases al final de los 14 d de cultivo consecutivo, ni resultó en inoculaciones que aumentaran la producción de biomasa microbiana durante la degradación de las tres leguminosas tropicales. Después de 14 d de cultivo consecutivo se crearon diferentes poblaciones microbianas que mostraron diferencias en los parámetros de fermentación después de 24 h de fermentación in vitro de las tres leguminosas. Los inóculos obtenidos después de la exposición al almidón como fuente de hidratos de carbono - bajo condiciones extremas de estrés de nutrimentos - aumentaron la cantidad de caproato producido en detrimento de la cantidad de propionato producido. Sin embargo, la capacidad de degradación ruminal aparente de carbohidratos de los diferentes. inóculos. obtenidos. después. del. cultivo. consecutivo. tuvo. un. comportamiento similar al obtenido con inóculo fresco. De hecho, los inóculos de ovejas adultas no adaptadas cambiaron después de 14 d de incubación consecutiva en condiciones extremas de nutrimentos, pero no mostraron. diferencias. en. su. capacidad. para. degradar. las. leguminosas,. 24.

(30) CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN especialmente L. leucocephala, que fue significativamente inferior a las otras leguminosas. III.4. Actividad biológica de los taninos Luego de 24 h de incubación in vitro con y sin PEG de las tres leguminosas en estudio (Tabla 5) se pudo apreciar que no existieron diferencias significativas entre los valores obtenidos para los patrones de fermentación y la digestibilidad aparente de los carbohidratos (P>0.05), excepto para la proporción molar de butírico, el cual fue significativamente superior (P<0.05) cuando fue empleado el PEG en la incubación de Canavalia y Leucaena, no así en el caso de Mucuna. Tabla 5. Efecto del PEG sobre los productos finales de la fermentación de cada leguminosa [metano (mL/g OM), AGCC totales (µmol/g OM), proporción molar de los AGCC (mmol/mol AGCC), (ARDC g/100g MS)] (n=6). Parámetros. CH4. Canavalia - PEG + PEG. 44,8. SEM. 45,8. Mucuna - PEG + PEG. Leucaena - PEG + PEG. SEM. 52,0. 49,2. 0,87 29,0 28,4 76,9 5679,2 5712,8 4 3745,2 3737,7. 1,30 29,7 4. SEM. AGCC Totales. 5966,0. 1,20 103,0 5796,2 0. acético. 610,2. 601,8. 3,40. 591,4. 600,4. 4,70. 660,3. 650,4. 3,31. propiónico. 263,4. 263,5. 1,90. 252,5. 240,6. 3,67. 233,2. 234,5. 1,84. butírico. 82,6b. 90,9a. 3,74. 95,2. 98,9. 1,48. 68,9b. 74,4a. 1,32. ARDC. 47,5. 46,5. 0,81. 45,0. 45,5. 0,61. 29,57. 29,58. 0,23. PEG: Polietilenglicol, CH4: metano, AGCC: Ácidos Grasos de Cadena Corta, ARDC: Degradabilidad Ruminal Aparente de los Carbohidratos, SEM: Error estándar de la media. a, b, c. media con diferentes superíndices en la misma fila dentro del efecto principal denota diferencias. significativas (P<0.05) de acuerdo con la prueba de Tukey’s.. La inclusión de PEG en legumbres tropicales resulta en un incremento de producción de gas, particularmente en plantas ricas en taninos condensados (Sallam et al., 2010). No se encontraron diferencias significativas en la producción de metano en ninguna de las especies estudiadas con PEG y sin este compuesto, lo que sugiere que la producción in vitro de metano en estos forrajes no fue afectada por la presencia de taninos, lo que difiere con los resultados de Sallam et al. (2010) que encontró una reducción de metano del 88 % en el fluido ruminal con inclusión de PEG en L. leucocephala. Sin embargo, otra investigación realizada por el propio autor en el 2013 plantea que en el experimento in vivo usando PEG los taninos 25.

(31) CAPÍTULO III. RESULTADOS Y DISCUSIÓN presentes en esta leguminosa no afectaron la digestibilidad de la MS ni de los nutrientes. Consecuentemente, es improbable que la baja degradabilidad ruminal in vitro de L. leucocephala sea causada por la concentración de taninos presentes en ella, pudiendo deberse a los bajos tenores de TC contenidos en las tres leguminosas estudiadas. En efecto, existen otros compuestos fenólicos que son más fácilmente degradados por los microrganismos ruminales (Bhat et al., 1998; Patra and Saxena, 2011).. 26.

(32) CONCLUSIONES. CONCLUSIONES: 1- Las leguminosas en estudio presentan valores similares de MS y PB, presentando L leucocephala las mayores concentraciones de cenizas, FDN y FDA. 2- Leucaena y Mucuna presentan mayores concentraciones de fenoles y taninos totales, siendo bajas las concentraciones de taninos condensados para las tres leguminosas en estudio. 3- Las comunidades microbianas cultivadas in vitro durante 14 d con diferentes fuentes de carbohidratos en presencia de suplementos de levadura estimulan la fermentación ruminal de Leucaena leucocephala, Mucuna pruriens y Canavalia ensiformis, la cual depende de las fuentes de carbohidratos empleadas en la misma. 4- Los taninos totales y condensados no influyeron en la degradabilidad aparente de los carbohidratos ni en los patrones de fermentación de las tres leguminosas en estudio.. 27.

(33) RECOMENDACIONES. RECOMENDACIONES: 1- Realizar análisis de digestibilidad in vitro con líquido ruminal de ovejas tropicales adaptadas al consumo de estos alimentos para comparar con los realizados en ambos experimentos. 2- Determinar la presencia de otros factores antinutricionales (factor inhibidor de tripsina y quimiotripsina, mimosina e intermediarios, canavanina, y Con A) y su influencia en la digestibilidad de estas leguminosas.. 28.

(34) BIBLIOGRAFÍA. BIBLIOGRAFÍA: Abdalla, A.L., Louvandini, H., Sallam, S.M.A.H., Bueno, I.C.S., Tsai, S.M., Figueira, A.V.O. 2012. In vitro evaluation, in vivo quantification, and microbial diversity studies of nutritional strategies for reducing enteric methane production. Trop Anim Health Prod, 44: 953–964. Abdulrazak, S.S., Fujihara, T., Ondiek, J.K., Ørskov, E.R. 2000. Nutritive evaluation of some Acacia tree leaves from Kenya. Anim Feed Sci Technol, 85: 89. Aerts, R.J., Barry, T.N., McNabb, W.C. 1999. Polyphenols and agriculture: Beneficial effects of proanthocyanidins in forages. Agric Ecosyst Environ, 75: 1-12. Aharoni, Y., Gilboa, N., Silanikove, N. 1998. Models of suppressive effect of tannins. Analysis of the suppressive effect of tannins on ruminal degradation by compartmental models. Anim Feed Sci Tech, 71: 251-267. Amira, P.O.; Daramola, A.S., Oyelade W.A. 2014. Comparative studies on some anti-nutritional factors in seeds of Mucuna Pruriens (Velvet Beans) and Sphenostylis Stenocarpa (African Yam Beans). J Biol Agric Healthc, 16 (4): 13-16. Animut, G., Puchala, R., Goetsch, A.L., Patra, A.K., Sahlu, T., Varel, V.H., Wells, J. 2008. Methane emission by goats consuming diets with different levels of condensed tannins from lespedeza. Anim Feed Sci Tech, 144: 212–227. AOAC, 2005. Official Methods of Analysis of AOAC International, 18th edition; Association of Official Analytical Chemists, Gaithersburg, Maryland, USA. Aregheore, E.M. 1999. Nutritive and antinutritive value of some tree legumes used in ruminant livestock nutrition in Pacific island countries. Journal of South Pacific Agriculture, 6: 50- 61. Artiles-Ortega, E., Lima-Orozco, R., Fievez, V. 2016. Effect of changed rumen microbial community (as resulted of the sequential in vitro incubation) and yeast supplementation, on the in vitro rumen fermentation of three ANFcontaining feedstuff. VII Edition of the International Scientific Conference of Agricultural Development and Sustainability “AGROCENTRO 2016”. Hotel Memories Paraíso Azul, Caibarién, Villa Clara, Cuba. ISBN: 978-959-312-1743.. 29.

(35) BIBLIOGRAFÍA Aye, P. A., Adegun, M. K., 2013. Composición química y algunas propiedades funcionales de Moringa, Leucaena y harinas de hojas de Gliricidia. Agric Biol J N Am, 4: 71-77. Barahona, R., Sanchez, S., Lascano, C.E., Owenc, E., Morris, P., Theodorou, M.K. 2006. Effect of condensed tannins from tropical legumes on the activity of fibrolytic enzymes from the rumen fungus Neocallimastyx hurleyensis. Enzym Microb Technol, 39: 281–288. Barbehenn, R.V., Constabel, C.P. 2011. Tannins in plant–herbivore interactions. Phytochemistry, 72 (13): 1551-1565. Barros-Rodríguez, M., Sandoval-Castro, C. A., Solorio-Sánchez, J., SarmientoFranco, L. A., Rojas-Herrera, R., Klieve, A. V. 2014. Leucaena leucocephala in ruminant nutrition. Trop Subtrop Agroecosyst, 17 (2): 173-183. Barros-Rodríguez, M., Solorio-Sánchez, J., Ku-Vera, J.C., Ayala-Burgos, A., Sandoval-Castro, C., Solís-Pérez, G. 2012. Productive performance and urinary excretion of mimosine metabolites by hair sheep grazing in a silvopastoral system with high densities of Leucaena leucocephala. Trop Anim Health Pro, 44: 1873-1878 Barry, T.N., Manley, B.J. 1987. Secondary compounds of forages. In: The Nutrition of Herbivores. Pp: 91-119. Barry, T.N., Manley, T.R. 1986. Interrelationships between the concentrations of total condensed tannin, free condensed tannin and lignin in Lotus sp. and their possible consequences in ruminant nutrition. J Sci Food Agric, 37: 248-254. Belmar, R., Nava-Montero, R., Sandoval-Castro, C., McNab, J.M. 1999. Jack bean (Canavalia ensiformis L. DC) in poultry diets: Antinutritional factors and detoxification studies- a review. World’s Poultry Sci J, 55: 37-59. Ben Salem, H., Saghrouni, L., Nefzaoui, A. 2005. Attempts to deactivate tannins in fodder shrubs with physical and chemical treatments. Anim Feed Sci Tech, 122: 109. Betancur-Ancona, D., Peranza-Mercado, G., Moguel-Ordoñez, Y., Fuertes-Blanco, S. 2004. Physicochemical characterization of lima bean (Phaseolus lunatus) and jack bean (Canavalia ensiformis) fibrous residues. Food Chem, 84: 287– 295.. 30.

(36) BIBLIOGRAFÍA Beyra, A., Reyes, G., Hernández, L., Herrera, P. 2004. Revisión Taxonómica del género Canavalia D.C. (Leguminosa E-Papilionoideae) en Cuba. Rev Acad Coloma Cienc, 28 (107): 158-175. Bhat, T. K., Singh, B., Sharma, O.P., 1998. La degradación microbiana de los taninos - Una perspectiva actual. Biodegradación, 9: 343-357. Bhatta, R., Uyeno, Y., Tajima, K., Takenaka, A., Yabumoto, Y., Nonaka, I., Enishi, O., Kurihara, M., 2009. La diferencia en la naturaleza de los taninos en en vitro metano ruminal y la producción de ácidos grasos volátiles y en las poblaciones de archaea metanogénicas y por protozoos. J Dairy Sci, 92: 5512 - 5522. Blandino, GA, Pineda, JA, 2015. Caracterización nutricional de la fermentación en estado Sólido de Caña de Azúcar (Saccharum officinarum) con Diferentes Niveles de inclusión de harina de granos de Canavalia (Canavalia ensiformis). Tesis para obtener el grado de Ingeniería Zootecnista. Animal Facultad de Ciencias. Universidad Nacional Agraria. Nicaragua., Pp. 11-13. Cáceres, O., González, E., Delgado, R., 1995. Canavalia ensiformis: leguminosa forrajera promisoria para la Agricultura tropicales (Canavalia ensiformis: prometiendo leguminosa forrajera para la agricultura tropical). Pastos y Forrajes, 18: 107-119. Carmona, J.C. 2007. Efecto de la utilización de arbóreas y arbustivas forrajeras sobre la dinámica digestiva en bovinos. Rev Lasallista Investig, 4 (1): 40-50. Castillo-Caamal, A.M., Castillo-Caamal, J.B., Ayala-Burgos, A.J. 2003. Mucuna bean (Mucuna spp.) supplementation of growing sheep fed with a basal diet of Napier grass (Pennisetum purpureum). Trop Subtrop Agroecosyst, 1: 107– 110. Castro-Montoya, J., De Campeneere, S., Van Ranst, G., Fievez, V. 2012. Interactions between methane mitigation additives and basal substrates on in vitro methane and VFA production. Anim Feed Sci Technol, 176: 47-60. Castro-Montoya, J., Peiren, N., Cone, J.W., Zweifel, B., Fievez, V., De Campeneere, S., 2015. In vivo and in vitro effects of a blend of essential oils on rumen methane mitigation. Liv Sci. 180, 134–142. Chaucheyras-Durand F., Walker, N. D. y Bach, A., 2008. Efectos de las levaduras secas activas en el ecosistema microbiano del rumen: pasado, presente y futuro. Anim Sci Technol. 145, 5-26. 31.

(37) BIBLIOGRAFÍA Cieslak, A., Zmora, P., Pers-Kamczyc, E., Szumacher-Strabel, M. 2012. Effects of tannins source (Vaccinium vitisidaea L.) on rumen microbial fermentation in vivo. Anim Feed Sci Tech, 176: 102–106. Conti, G., Garnero, O., Bértoli, J., Gallardo, M., Gatti, E., Zoratti, O. 2007. Efecto de los taninos condensados sobre la producción y composición de leche de vacas lecheras en pastoreo de verano. Rev Arg Prod Anim, 27 (Supl. 1): 104-105. Demeyer, D., 1991. Quantitative aspects of microbial metabolism on rumen and hindgut, in Jouany, J. P. (Ed.), Rumen microbial metabolism and ruminant digestion. INRA. Paris, France, pp. 217-237. Denev, S.A., Peeva, Tz., Radulova, P., Stancheva, N., Staykova, G., Beev, G., Todorova, P., Tchobanova, S., 2007. Yeast cultures in ruminant nutrition. Bulg J Agric Sci. 13, 357-374. Díaz, M.F. 2000. Producción y caracterización de forrajes y granos de leguminosas temporales para la alimentación animal. Tesis en opción al grado científico de Doctor en Ciencias Agrícolas. Instituto de Ciencia Animal, La Habana. Cuba: 91. Domínguez-Bello, M.G., Stewart, C. 1990. Effects of feeding Canavalia ensiformis on the rumen flora of sheep, and of the toxic amino acid canavanine on rumen bacteria. System Appl Microbiol, 13: 388-393. Doreau, M., Jouany, J.P., 1998. Effect of a Saccharomyces cerevisiae culture on nutrient digestion in lactating dairy cows. J Dairy Sci. 81, 3214–3221. Durmic, Z., Blache, D. 2012. Bioactive plants and plant products: effects on animal function, health and welfare. Anim Feed Sci Technol, 176 (1): 150-162. Edwards, A., Mlambo, V., Octavius, C.H., Wayne, G., Davanan, M. 2012. In vitro ruminal fermentation of leaves from three tree forages in response to incremental levels of polyethylene glycol. J Anim Sci, 2 (3): 142-149. Escobar, A., Mora, M., Preto, J. 1983. Efecto del tratamiento con taninos sobre la toxicidad de Canavalia ensiformis. IPA. Informe anual, 81: 26. Estupiñan, K., Vasco, D., Duchi, N. 2007. Digestibilidad de los componentes de la pared celular del forraje de Canavalia ensiformis (L) DC. en diferentes edades de corte. Revista Tecnológica-ESPOL, 20 (1): 223-228. Frutos, P., Hervas, G., Giraldez, F.J., Mantecon, A.R. 2004. Tannins and ruminant nutrition. Review. Span J Agric Res, 2 (2): 191-202. 32.