Efecto antibacteriano in vitro del aceite esencial del rosmarinus officinalis (romero) sobre el streptococcus mutans atcc 25175

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(1)Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO FACULTAD DE ESTOMATOLOGIA. -. T N U. “EFECTO ANTIBACTERIANO IN VITRO DEL ACEITE ESENCIAL. A I G. DEL Rosmarinus officinalis (Romero) sobre el Streptococcus. O L O. mutans ATCC 25175”. T A PARA OPTAR EL GRADO DE BACHILLER EN ESTOMATOLOGÍA M O TAUTORA: S E E MARY ROCHA MORALES DRAQUEL D A T ASESOR: L CU TESIS. FA. DR. GUSTAVO GUARDIA MÈNDEZ COASESORA: DRA. ELVA MEJIA DELGADO TRUJILLO – PERÚ 2016. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(2) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. DEDICATORIA. A DIOS, el protagonista de todos mis logros, quien estuvo presente en cada uno de mis pasos, concretando todas mis. T N U. metas obtenidas hasta hoy; ya que, a pesar de las pruebas, me hizo alguien muy fuerte e inquebrantable y me dio el apoyo de. -. muchas personas para continuar mi brega hacia el éxito.. O L O. A I G. A mi hijo JESÚS, que amo con todo mí ser, mi aliciente, razón y quien no me T A permitió desfallecer frenteM a ningún obstáculo y que estuvo ahí Oacadémica y personal. en cada etapa de lucha T ES DE CARMEN Y DANIEL, por haberme dado una A mis padres, D formación y educación en base a valores, por su apoyo A buena LT fortaleza para seguir creciendo e ir por más,. FA. CU. incondicional, horas de consejos y ser grandes ejemplos de dedicación, sacrificio y superación.. A mis hermanos: KARLA, CHRIST, JERUSALEM, SINAI Y CIELITO, que son los mejores amigos que la vida me pudo obsequiar, por su lealtad, amor y por hacer mis días cataclísmicamente felices.. 2 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(3) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. AGRADECIMIENTOS. A la Dra. Elva Mejía Delgado por su íntegro y constante apoyo, orientación y pulcra dedicación para la realización de este trabajo.. T N docente y amigo, por su tiempo, paciencia, entrega, empatía U y dedicación, coadyuvando por entero en la consecución del A desarrollo y culminación de esta investigación. I G O L O A Omar Chávez Galarreta, porTsu amistad y colaboración en A M este trabajo de investigación. O T S E Por último, a todos aquellos que me acompañaron en mi etapa E D universitaria, contribuyendo a la obtención de mis objetivos a D A Tcorto y a largo plazo; a los que estuvieron aportando en mi vida Al Dr. Gustavo Guardia Méndez, mi asesor, un excelente. FA. L U C. académica y personal; y a los que actualmente están, pues siempre les estaré eternamente agradecida.. 3 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(4) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. RESUMEN El propósito del presente estudio de tipo experimental fue determinar el efecto antibacteriano in vitro del aceite esencial del Rosmarinus officinalis (Romero) sobre el Streptococcus mutans ATCC 25175, el cual se realizó en las concentraciones de 5%, 25%, 50%, 75% y 100%. Se efectuó la prueba de susceptibilidad, utilizando el método. T N U halo de inhibición, y los tamaños de éstos aumentaron directamente proporcional a las concentraciones utilizadas. A Para hallar la I G de dilución en Concentración Mínima Inhibitoria se empleó el Método O L tubos; de cada cultivo se sembró en placas O con Agar Mueller HintonT A Formadoras de Colonias Sangre, para determinar las Unidades M O (UFC); en tanto que, las cinco concentraciones de aceite esencial de T S romero presentaronE efecto inhibitorio del crecimiento de S. mutans, asimismo sólo DseEhalló la concentración mínima inhibitoria en aceite esencialD de romero al 75%. A Tconcluyó que tanto el aceite esencial de romero a las L Se CU de difusión en discos; en los cuales todos los discos presentaron. FA. concentraciones mencionadas poseen actividad inhibitoria in vitro sobre el crecimiento de cepas de Streptococcus mutans.. Palabras clave: Aceite Esencial de Romero, Streptococcus mutans.. 4 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(5) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ABSTRACT The purpose of this experimental study was to determine the antibacterial effect in vitro of essential oil of Rosmarinus officinalis (Rosemary) on Streptococcus mutans ATCC 25175, which was held at concentrations of 5%, 25%, 50%, 75% and 100%. susceptibility testing was performed using the disk diffusion method; where all. T N U proportional to the concentrations used. To find the -Minimum Inhibitory Concentration dilution method was used inAtubes; of each I crop was sown on plates with Blood Agar G Mueller Hinton- to O L determine the colony forming units O (CFU); while the five T A oil showed growth inhibitory concentrations of rosemary essential M O effect of S. mutans, also only the minimum inhibitory concentration in T S essential oil of rosemary E to 75% was found. It was concluded DE that both the essential oil of rosemary to the D mentioned have inhibitory activity in vitro on the concentrations A T of Streptococcus mutans strains. L growth CU disks had inhibition halo, and these sizes increased directly. FA. Keywords: Rosemary Essential Oil, Streptococcus mutans.. 5 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(6) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ÍNDICE. DEDICATORIA .......................................................................................... 2 AGRADECIMIENTOS ................................................................................ 3 RESUMEN ................................................................................................. 4. T N U. ABSTRACT ................................................................................................ 4 I.. INTRODUCCIÓN ................................................................................. 7. -. II. MATERIAL Y MÉTODOS .................................................................. 23. A I G. III. RESULTADOS .................................................................................. 43. O L O. IV. DISCUSIÓN....................................................................................... 48. T A VI. RECOMENDACIONES ..................................................................... 54 M O......................................................... 55 REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS T ES ANEXOS .................................................................................................. 65 DE D A T L U C FA V. CONCLUSIONES .............................................................................. 53. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(7) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. I.. INTRODUCCIÓN. La caries dental es una de las enfermedades infecciosas de mayor prevalencia en el hombre y continua manteniéndose como una de las principales problemas de salud pública a nivel mundial1,2.La caries es una entidad patológica, infecciosa, crónica, progresiva y transmisible, de origen multifactorial, que es producida por la acción de microorganismos. T N U la especialmente por la fermentación de hidratos de carbono, originando desmineralización gradual del esmalte seguida de A la destrucción I Ga la pérdida total proteolítica rápida de la estructura dental, hasta llegar O L del diente . O T A M O Según la Organización Mundial de la Salud (OMS)“caries es aquella T S lesión patológica que reblandece E los tejidos duros del diente y que llega a formar una cavidad DEen estos tejidos” .La caries dental es una de las D más comunes en nuestra población, según MINSA el patologías orales A T L 90% de la población padece esta patología . U C FA La Academia Americana de Odontología Pediátrica (AADP) en el de la placa bacteriana, los cuales por su metabolismo producen ácido,. 3,4. 5. 6. 2009 ha definido a la caries dental como una enfermedad multifactorial, dinámica, crónica infecciosa transmisible pero prevenible. Así mismo se han descrito a la caries dental como un proceso dinámico de desmineralización y remineralización, producto del metabolismo bacteriano sobre la superficie dentaria7.. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(8) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. A lo largo del tiempo, se ha planteado diferentes teorías del proceso carioso, siendo Miller en 1890, con la Teoría Acidogénica, el que instituyó el papel esencial de los microorganismos en la etiología de la caries, incluso Black quien describió una “placa microbiana gelatinosa” como la fuente de los ácidos8,9.. T N Paul Keyes en 1960, estableció que la etiopatogenia de la U caries obedece a la interacción simultánea de tres factores principales: un A factor “microorganismo” que en presencia de un Ifactor “sustrato” G O (ingesta de Carbohidratos), logra afectar a un factor “diente” (también L O refirió tanto en forma T denominado Hospedero). Dicho investigador, A teórica como experimental que laM interacción entre estos tres factores O T para el desarrollo de la caries dental . constituye, la base fundamental S E E D La Caries, tienen su origen en la existencia de una placa D A dentobacteriana previa o biopelícula de la placa, definida según la T L U Mundial de la Salud (OMS) como una entidad bacteriana COrganización 10. FA. proliferante con actividad enzimática que se adhiere firmemente a las. superficies dentarias y que por su actividad bioquímica y metabólica ha sido propuesta como el agente etiológico principal en el desarrollo de la caries dental11.. 8 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(9) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. La placa dental ha sido definida como: una masa blanda, translúcida y muy adherente12.La formación de la placa bacteriana ocurre a través de la fijación de bacterias sobre las superficies dentarias. Así la placa bacteriana, debido a su característica de agregación continua, va adquiriendo nuevas especies en cada etapa de su desarrollo. Dentro de estos microorganismos se pueden encontrar:. T N sobrinus U. Streptococcus mutans (S. mutans), Streptococcus mitis (S. mitis), Streptococcus. sanguis. (S.. sanguis),. Streptococcus. (S.sobrinus) y Lactobacillus casei( L. casei) 13.. O L O. A I G. -. Los Streptococcus son bacterias que presentan forma de coco,. AT M positivamente a la coloración de esporas y generalmente reaccionan O T Gram . La especie Streptococcus mutans se ubica dentro de un S E conjunto de bacterias denominado “Grupo Mutans”, los cuales E D presentan diversidad genética, antigénica y bioquímica; también, D A comparten T rasgos fenotípicos como fermentación del manitol y sorbitol, L U producción de glucanos extracelulares a partir de sacarosa, ciertos C FA morfotipos coloniales al ser cultivados en agar con sacarosa y la crecen en cadenas o en parejas, no tienen movimiento, no forman. 14. inducción de caries a partir del consumo de carbohidratos (sobre todo sacarosa) por parte del huésped15.. El S.mutans se caracteriza por ser cocos gram positivos, dispuestos en cadenas cortas de 4 a 6 cocos, los cuales miden de 0,5. 9 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(10) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. a 0,8 μ de diámetro, anaerobio facultativo forman parte de la flora residente en la cavidad bucal y vías respiratorias altas; autores tales como Berkowitz, Kohler, col. y Van Houte han sugerido al S. mutans como el principal agente de la formación de caries dental 16. Su temperatura óptima de desarrollo del S. mutans es de 36 +-1 ºC.10 ,11 17.. Tiene poder acidofílico pues es capaz de crecer a pH 5.2 y su. T N U. carácter acidúrico, ya que puede mantenerse metabólicamente activo a pesar de un pH bajo 17,18.. A I G. -. Hay que destacar que no todas las cepas poseen estas. O L O. características y que unas son más patógenas que otras, por lo que ha. AT Mpatogenicidad de algunas de ellas de la especie. Las propiedades de O T permiten su adaptación y crecimiento sobre la película adquirida del S E esmalte y así la colonización del diente .En esta etapa influyen, E D también factores exógenos como el mayor o menor consumo de D A sacarosa T en la dieta. Para que S.mutans se disemine entre las L U superficies dentarias debe estar presente en cantidad suficiente en la C FA saliva, para poder vencer la resistencia a la colonización que opone la cobrado una gran relevancia el estudio de variantes genotípicas dentro. 19. microbiota bucal normal 19,20.. El principal hospedador del S. mutans es la boca del hombre, puede desarrollarse en temperaturas que van desde 18 a 40 ºC, coloniza especialmente las superficies duras de la cavidad oral. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(11) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. (esmalte o cemento); se han obtenido también aislamientos a partir de heces humanas. El S. mutans induce lesiones cariosas tanto de superficies lisas, de fosas y fisuras, como en zonas interproximales y cemento radicular. A nivel extraoral, el S. mutans está relacionado con endocarditis subagudas y raramente con otros procesos patológicos21.. T N microorganismo más importante en la iniciación de la caries, conduce U a diseñar medidas de prevención dirigidas hacia la eliminación o A disminución de éste en la cavidad oral. Al respecto, Ise han planteado G O diferentes estrategias: Control inmunológico, control microbiológico, L O educación sanitaria, control de la dieta,T detección previa de factores de A M y aplicación de fluoruros, riesgo, higiene bucodental, ingestión O T y aplicación de fármacos . aplicación de sellantes, ingestión S E E D La contaminación microbiológica es actualmente un riesgo para la D A salud T debido a la resistencia de algunos microorganismos a los L U convencionales .Por esta causa, ha aumentado la Cantibióticos Por consiguiente, el hecho de reconocer a S. mutans como el. 22,23. FA. 24. tendencia al uso de conservantes naturales, que han llegado a. constituir una alternativa promisoria como fuente de sustancias con actividad antimicrobiana25.. En la actualidad a nivel mundial las plantas son utilizadas en la medicina general, pero la ciencia moderna, analizando y estudiando. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(12) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. los efectos terapéuticos de las plantas quiere precisar, comparar y clasificar las diversas propiedades, para conocer los principios activos responsables de cortar, aliviar o curar las enfermedades. Un análisis de. esta. naturaleza. debe. ser. realizado. como. una. acción. multidisciplinaria con la intervención de biólogos, químicos y farmacólogos26.. T N Las plantas son importantes fuentes de productos naturales U biológicamente activos que constituyen modelos y materia prima para A I la síntesis de productos farmacéuticos .También G se consideran como O recursos terapéuticos para el tratamiento y mantenimiento de la salud, L O T como medicina popular, sobre todo en los A países subdesarrollados . M O T Según la Organización Mundial de la Salud, el 80 % de la población S E lo utilizan en las prácticas tradicionales en de los países en desarrollo E D la atenciónDprimaria de salud con el fin de tratar y curar sus A . T enfermedades L U C 27. 28. 29. FA. El Perú tiene una gran variedad de especies de plantas en su flora, sin embargo, la producción científica médica relacionada con las publicaciones y las propiedades de las plantas medicinales son escasas, por lo cual, es menester contribuir con el conocimiento y difusión de sus diferentes usos en la medicina30,31.. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(13) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. El Rosmarinus officinalis (R. officinalis) es una planta mediterránea cuyo término se deriva del griego “rhops y myrinos” que significa “arbusto marino” por su crecimiento cercano a las costas. El epíteto "officinalis" se aplica a muchas especies que se usan en las oficinas o farmacias y también a aquellas plantas que son consideradas medicinales32,33.. La especie vegetal R. officinalis perteneciente a la. -. T N familia U. Lamiaceae, y conocida popularmente como romero, es una especie. A I G. originaria de la región mediterránea, rica fuente de metabolitos activos,. O L O. esta planta es muy usada en la medicina tradicional por sus efectos. AT OM. digestivos, antiespasmódicos y carminativos32.. T S E. El romero, es una planta que crece en todas partes del mundo se. E D Incluso se encuentra también en Asia Menor y Sudamérica. En España D A se halla T en la mayor parte de Cataluña, hasta los Pirineos en Aragón y L U Castilla-La Mancha, Castilla y León, La Rioja, Madrid, Murcia, CNavarra, distribuye desde la región mediterránea, sur de Europa, norte de África.. FA. Extremadura, en las zonas montañosas de la Comunidad Valenciana, Andalucía e islas Baleares, en Centroamérica y el Caribe, a nivel de américa del sur crece en varios países, en el Perú crece en la costa, sierra y selva33, 34,35.. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(14) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Este arbusto se desarrolla en climas tropicales, subtropicales y húmedos, y en suelos áridos, secos, ligeros, algo arenosos, muy permeables, bien drenados, calcáreos o pobres, pero no se adapta a las tierras arcillosas compactas. En el Perú crece en la costa, sierra y selva. hasta los 3,500 msnm, formando parte del sotobosque, en. laderas de tierras bajas y en lugares secos30.. T N El romero es un arbusto leñoso de hojas perennes muy ramificado, U puede llegar a medir 2 metros de altura. Lo encontramos de color verde Ade color rojizo I todo el año, con tallos jóvenes borrosos y tallos añosos G O con la corteza resquebrajada . Las hojas, pequeñas y muy L Oopuestas, sésiles, con los T abundantes, presentan forma linear. Son A Mverde oscuro, mientras que por el bordes hacia abajo y de un color O T envés presentan un color blanquecino y están cubiertas de vellosidad. S E En la zona de unión de la hoja con el tallo nacen los ramilletes E D floríferos . D A T L CU Las flores son de unos 5 mm de largo. Tienen la corola bilabiada de 30,31. 31. FA. una sola pieza. El color es azul violeta pálido, rosa o blanco, con cáliz. verde o algo rojizo, también bilabiado y acampanado. Son flores axilares, muy aromáticas y melíferas (contienen miel), se localizan en la cima de las ramas, tienen dos estambres encorvados soldados a la corola y con un pequeño diente. Florece a comienzos de primavera, aunque pueden encontrarse flores prácticamente durante todo el año31.. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(15) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. No obstante, las plantas de romero son capaces de desarrollarse en condiciones diferentes a las indicadas como su hábitat ideal, y es por eso que algunos autores citan que el estrés medioambiental al que estarían afectadas en esos ambientes, se vería reflejado en una posterior alteración tanto de su rendimiento en extractos, como de su composición química ﬁnal.. -. T N U. Así, factores a tener en cuenta, como son el pH del suelo 35,36 ,la. A I G. temperatura y precipitaciones a Ias que se ven sometidas Ias. O L O. plantas36,el área geográfica donde crece/se desarrolla37,38,39,40, la fase. AT el estrés abiótico que las plantas M puedan sufrir durante su desarrollo y O la herencia genética propiaT de Ias poblaciones vegetales , pueden S E ser determinantes a la hora de originar los distintos quimiotipos que E D podemos encontrar en la naturaleza. D A T L U C FA En la planta se han reportado diversos compuestos químicos los de desarrollo vegetativo cuando se procede a realizar la siega41,42,43,44, 45. 43,46. cuales han sido agrupados de manera general por diversos autores en ácidos fenólicos, flavonoides, aceite esencial, ácidos triterpénicos y alcoholes triterpénicos. El aceite esencial de romero es el componente más estudiado cualitativamente, Diferentes trabajos de investigación afirman que dependiendo del lugar geográfico donde crezcan las. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(16) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. plantas bajo condiciones de tipo de suelo, clima y altura sobre el nivel del mar generan diferentes cambios en cantidad y tipos de moléculas bioactivaspresentes31,32.. De manera general, la composición química del aceite esencial de romero ha sido descrita en trabajos que indican el tipo de moléculas. T N pineno, canfeno, ésteres terpénicos como el 1,8-cineol, alcanfor, U linalol, verbinol, terpineol, carnosol, rosmanol, isorosmanol, 3-octanona, A caféico, I isobanil-acetato y ß-cariofileno; los ácidos vanílico, G O clorogénico, rosmarínico, carnósico, ursólico, oleanólico, butilínico, L O borneol, y acetato de T betulínico, betulina, a-amirina, ß-amirina, A M bornilo . O T S E En el caso de las hojas del romero prevalece un alto contenido de E D ácido rosmarínico y su derivado rosmaricina, también está presente el D A ácido T carnósico que se caracteriza por ser inestable, su degradación se L CdaUpor incremento de la temperatura y exposición a la luz; en presencia activas presentes. Se ha identificado la presencia de a-pineno, ß-. 36. FA. de. oxígeno. puede. oxidarse. para. formar. carnosol,. rosmanol,. epirosmanol y 7- metil-epirosmanol36.. La actividad antimicrobiana del R. officinalis es mayor contra las bacterias. Se sugiere que esta capacidad se debe a la acción de flavonoides, terpenoides, polifenoles, tanino y aceites esenciales, cuyo. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(17) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. mecanismo. de. acción. consiste. en:. degradar. la. membrana. citoplasmática de las bacterias, lo que conduce a una pérdida de iones de potasio, provocando autolisis de la célula, también aumenta la permeabilidad de la membrana, y disipa su potencial, haciendo que las bacterias pierdan su capacidad de motilidad, transporte de membrana y síntesis de ATP, haciéndolas más vulnerables al ataque inmunológico y potenciando a los antibióticos31,35.. -. T N U. Se hicieron estudios de la actividad antibacteriana in vitro del aceite. A I G. esencial de R. officinalis, utilizando cepas periodontopatógenas y cariogénicas. como. P.. gingivalis,. O actinomycetemcomitans, L O. A.. AT M de S. mutans, además inhibió el inhibió la capacidad de adherencia O crecimiento de lasT bacterias Gram-negativas A. S E actinomycetemcomitans, P. gingivalis y F.nucleatum . DE D A EnTvarios trabajos de investigación realizados in vitro se tuvo como L U desarrollar un enjuague bucal que contiene la combinación de objetivo C FA extractos hidroalcohólicos de R. officinalis, Plantago psyllium, F.nucleatum, S. mutans, y S.sobrinus. El aceite esencial de R.officinalis. 37. Impetiginosa tabebuia, Achilleamille folium y Nasturtium officinale, la actividad antibacteriana se evaluó frente a P. aeruginosa, E. coli, S. aureus , B. subtilis, E. fecalis38,39.. 17 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(18) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Investigaciones realizadas demuestran que el aceite esencial de R. officinalis a diversas concentraciones posee actividad antimicrobiana sobre Salmonella sp,usando como control positivo sulfametoxazol, norfloxacina, neomicina. El aceite esencial comercial de R.officinalis sólo presenta actividad inhibitoria ante Salmonella sp. cuando es usada al 100% de su concentración40.. T N Se han realizado estudios in vitro con extractos de R. officinalis U en los que se ha evaluado su actividad contra bacterias Gram positivas (S. APseudomonas I aureus y B. cereus) y Gram negativas (E. coli, G O aeruginosa) y antifúngica: Candida albicans L . O T A M la actividad antimicrobiana del En un estudio in vitro se comparó O extracto hidroalcohólico de T R. officinalis (romero) y clorhexidina al 0,12 S E %, contra cepas estandarizadas de: S. mutans, S. mitis, S. sobrinus, S. E D sanguis y L .casei; los resultados demostraron un gran potencial D A antibacteriano T del extracto hidroalcohólico de R.officinalis frente a todas L ClasU cepas utilizadas, con halos de inhibición de 11 a 20 mm. Similar a 41. FA. clorhexidina al 0,12 %, con halos de inhibición de 11 a 18 mm 42,43.. Se realizó una investigación sobre actividad inhibitoria del extracto etanólico y del aceite esencial de hojas de R. officinalis L. (Romero) sobre algunas bacterias de interés alimentario. En donde el aceite esencial exhibió un amplio espectro de la acción antimicrobiana, en. 18 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(19) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. bacterias Gram +; determinando así que las hojas de romero contienen compuestos con clara actividad antimicrobiana sobre microorganismos de importancia en contaminaciones alimentarias y justifica el potencial de aplicación en la industria de la investigación44.. Investigaciones realizadas demuestran que elaceite esencial de. T N U. R.officinalis posee actividad antibacteriana sobre el Escherichia coli, Enterococcus fecalis y Enterobacter aerogenes45.. A I G. -. En otro estudio se hizo el ensayo antimicrobiano sobre extractos. O L O. etanólicos de diez plantas, una de las muestras ensayadas fue el R.. AT usando el método de difusión M en disco estándar. Los resultados O T de R. officinalis fue de 11.52 ± 0,96 obtenidos del extracto etanólico S E significativamente menor a clorhexidina 14.07 ±1.70 E D De igual manera en un estudio in vivo publicado por Teixeira, D A manifiesta T que el extracto de R.officinalis Linn presenta acción L U antimicrobiana en bacterias orales presentes en la biopelícula . C FA officinalis en Streptococcus mutans, comparando con la clorhexidina. 46. 47. Se analizó el efecto antibacteriano in vitro del extracto etanólico de R. officinalis, utilizando concentraciones (25mg/ml, 50 mg/ml y 75 mg/ml) contra microorganismos frecuentes en la flora salival y compararlos con el control positivo la clorhexidina 0,12 % y control negativo el agua destilada.. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(20) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Los resultados que se obtuvieron fueron halos de inhibición en promedio de 12,47 mm para 25 mg/ml, 17 mm para 50 mg/ml, 20,56 para 75 mg/ml, 15,56 para la clorhexidina 0,12 %, 5 mm para el agua destilada. Comprobándose que el extracto etanólico de Rosmarinus officinalis (romero), presenta una efectividad antibacteriana sobre flora salival 48.. -. T N U. En otro estudio in vitro se demostró la actividad antimicrobiana del extracto. etanólico. de. R.officinalis. sobre. Ade I G. cultivos. O L O. bacterias. anaerobias frecuentes en pacientes con bolsa periodontal, tomando. AT M experimentales y se incubó en difusión en pocillos con las soluciones O T por 48 h a 37 ºC, se encontró que el condiciones de anaerobiosis, S E extracto etanólico de R. officinalis a una concentración de 75mg/ml con E D la clorhexidina 0,12% posee actividad antimicrobiana sobre los cultivos D A de bacterias T anaerobias frecuentes en pacientes con periodontitis L U . crónica C FA como control positivo a la clorhexidina 0.12% mediante el método de. 49. Debido a que la caries dental es una de las enfermedades orales con mayor prevalencia en el mundo y considerando al S. mutans como el principal microorganismo responsable del inicio de este proceso, se han realizado estudios científicos para encontrar la forma de eliminarlo. 20 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(21) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. o controlarlo; sin embargo, aún no se ha encontrado un agente ideal que permita lograr estos objetivos.. Por ende, hoy en día, se mantiene una permanente búsqueda de alternativas terapéuticas en la biodiversidad de plantas medicinales; es así que, nace el interés en determinar la existencia de la propiedad. T N U. antimicrobiana del Rosmarinus officinalis frente al microorganismo causante de la caries dental.. -. Puesto que, existen pocos estudios científicos orientados hacia su. A I G. uso en el campo odontológico, el presente trabajo pretende contribuir a. O L O. aumentar dicha información, ya que, la utilización de un producto. AT reducido; y de esta manera, evitarM daños tóxicos colaterales. O T S E Por tanto, de acuerdo con lo anteriormente descrito, el propósito del E D presente estudio es evaluar el efecto antibacteriano in vitro del aceite D A esencial T del Rosmarinus officinalis (Romero) sobre el Streptococcus L U ATCC 25175. Cmutans natural tendría un alto beneficio para la salud oral con un costo. FA. 1. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA. ¿Tiene efecto antibacteriano in vitro del aceite esencial Rosmarinus officinalis sobre el Streptococcus mutans ATCC 25175?. 21 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(22) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 2. HIPÓTESIS El aceite esencial de Rosmarinus officinalis inhibe el crecimiento bacteriano in vitro del. Streptococcus mutans ATCC 25175 y el. efecto varía de acuerdo a la concentración utilizada.. 3. OBJETIVOS. 3.1.. Objetivo General:. -. T N U. Evaluar el efecto antibacteriano in vitro del aceite esencial de. A I G. Rosmarinus officinalis sobre Streptococcus mutans ATCC. O L O. 25175.. AT M 3.2. Objetivos Específicos: O T 3.2.1. Medir laS susceptibilidad in vitro de las concentraciones E25%, 50%, 75% y 100% del aceite esencial 5%, E DRosmarinus officinalis sobre Streptococcus mutans D A ATCC 25175. T UL. C A F. 3.2.2. Medir la concentración mínima inhibitoria in vitro de. las concentraciones 5%, 25%, 50%, 75% y 100% del aceite. esencial. Rosmarinus. officinalis. sobre. Streptococcus mutans ATCC 25175.. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(23) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. II. MATERIAL Y MÉTODOS. 1. Tipo y área de estudio: La presente investigación es aplicada (de acuerdo al grado de utilidad de los resultados), experimental “in vitro”. La cual se. desarrolló. en. el. Laboratorio. de. la. Sección. de. T N U. Microbiología de la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Trujillo.. A I G. -. O L Estuvo constituida por el conjunto O de placas Petri con Agar T A las diferentes concentraciones Mueller Hinton- sangre, con M del aceite esencialO de Rosmarinus officinalis con siembra T S adecuada de E Streptococcus mutans (3x10 UFC), en el laboratorio DE de Microbiología de la Facultad de Medicina Dla Universidad Nacional de Trujillo en el año 2016. de A T. 2.. Definición de la población muestral:. 8. FA. L U C. i. Criterios de Inclusión.  Placas con siembra adecuada de Streptococcus mutans (3x108 UFC/mL) a priori al enfrentamiento con el aceite.. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(24) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación.  Placas con Agar Mueller Hinton-sangre y el contenido del aceite esencial de Rosmarinus officinalis y que presentaron inhibición o no del crecimiento bacteriano (ausencia o presencia de halos de inhibición de un diámetro mayor de 8mm).. T N susceptibilidad, que no presenten contaminación U por otros microbios. A I G O L O T ii. Criterios de Exclusión A M del proceso de incubación, se  Placas que después O T por otros microbios (otras bacterias u contaminaron S E hongos). DE AD  Placas que se emplearon para la determinación de la. T L U. 3. Consideraciones éticas: C FA Al realizar una investigación médica, hay que prestar atención adecuada a los factores que puedan dañar el medio ambiente.. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(25) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Se tuvo en cuenta la manipulación y desecho de las muestras sobre todo de la cepa Streptococcus. mutans. de. acuerdo. ATCC 25175 de al. manual. de. Bioseguridad en Laboratorios de Microbiología y Medicina durante la ejecución del trabajo.. T N del Comité Permanente de Investigación de la Facultad de U Medicina de la Universidad Nacional de Trujillo y-se siguió A los principios de la Declaración de HelsinkiIde la Asociación G O Médica Mundial, adoptada L por la 64 Asamblea O. General,(Fortaleza – Brasil 2013) T A M O T 4. Diseño estadístico de muestreo: S E E D i. Unidad de análisis D A La unidad de análisis la constituyó cada uno de los T L U cultivos de Streptococcus mutans (ATCC 25175). C Esta investigación contó a su vez con la autorización. a. 43. FA. ii.. Unidad de muestreo: Las unidades de muestreo fueron conformadas por todas las cepas de. Streptococcus mutans (ATCC. 25175) tratadas con el aceite de romero, que cumplan con los criterios de inclusión.. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(26) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. iii.. Marco de muestreo El marco muestral lo constituyó. la cepa de. Streptococcus mutans (ATCC 25175). iv.. Tamaño de muestra. T N U. El cálculo para el número de ensayos se determinó mediante la fórmula:. A I n = (Z + Z 2GS / d O L O T Siendo: A Mde repeticiones a efectuar en cada n : número O T S investigación. E DZE : 1.96 coeficiente de confiabilidad para α=0.05 α/2. UL. D A T. C A F. -. β. )2. 2. 2. α/2. Zβ. : 0.84 coeficiente de confiabilidad para β=0.20. S. : 1.1d valor asumido por no haber estudios. previos. d. : Diferencia entre promedios para rechazar la igualdad de medias.. Reemplazando:. n = (1.96 + 0.84)2 2(1.21)d2/ d2= 20. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(27) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Con estos datos se determinó una muestra de 20 repeticiones para cada grupo.. 5. Diseño de contrastación:. La. presente. investigación. se. ajustó. a. experimental.. A I G. A continuación una representación esquemática:. O L O. un. -. T N U diseño. AT OM. D A T. FA. DE. T S E. L U C. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(28) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 6. Procedimiento e Instrumento de Recolección de Datos:. i. Recolección de la muestra:. Se recolectaron 3 Kg de las hojas de Rosmarinus officinalis (romero) de la Granja Porcon del distrito de Cajamarca, provincia de Cajamarca.. ii. Preparación de la muestra:. O L O. T L U. C A F. -. A I G. AT M recolectado fue transportado al El material vegetal O T de Farmacognosia de la Facultad de laboratorio S E Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional DE Selección. AD. T N U. Cajamarca, región de. de Trujillo, donde se eliminaron las hojas que. presentaban signos de enfermedades evidentes como pigmento café, amarillo u oscuro.. Lavado: Se procedió a lavar el material vegetal con agua. destilada,. utilizando. seguido. hipoclorito. de. de. una. sodio. desinfección, al. 0.5. %.. Posteriormente se realizó un enjuague con agua. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(29) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. destilada estéril, esto fue para retirar los residuos de hipoclorito.. Secado: Una vez lavado las hojas se procedió. a. adecuar la droga en papeles Kraft, y se secó a temperatura ambiente.. T N Molienda y tamizaje: Se procedió a moler lasU hojas con molino hasta obtener polvo grueso y luego se A pasó a través de un set deI tamices para G O homogenizar el tamaño deL partículas. O T A M El polvo obtenido, se guardó en Almacenamiento: O un frascoT de vidrio de color ámbar de boca ancha . S E DE 50. UL. D A Tiii. Preparación. C A F. del. aceite. esencial. de. Rosmarinus. officinalis (romero) La obtención del aceite se realizó por el método de “destilación por arrastre de vapor de agua”. Se colocó cada 100 g de polvo grueso de las hojas en un recipiente de vidrio; así como 500 mL de agua destilada en un balón de vidrio de 1000 mL. Luego se armó el equipo de destilación, sometiendo la. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(30) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. muestra a una corriente de sobrecalentada,. arrastrando. vapor de agua la. esencia. que. posteriormente por acción del refrigerante, fue condensada, repitiéndose esta operación hasta completar el kilogramo de muestra.. T N propiedades de inmiscibilidad y diferencia U de densidades entre el agua y el aceite esencial, para A de vidrio, I lo cual se utilizó una pera de separación G O deshidratándose las impurezas de agua en el aceite L O esencial con Na SO T anhidro. A M O T se filtró, guardándose en un frasco de Finalmente S E vidrio color ámbar estéril (para evitar la DE El destilado se separó tomando en cuenta sus. 2. LT. AD. U C FA. 4. descomposición por la luz) y. bajo refrigeración a. una temperatura de 4 a 8 oC.. Las concentraciones se prepararon según el siguiente cuadro:. 30 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(31) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Volumen de aceite esencial. Volumen de Tween. Volumen Concentración final. (%). 80. 0.5 Ml. 9.5 Ml. 10 mL. 5. 2.5 Ml. 7.5 mL. 10 mL. 25. 5.0 Ml. 5.0 Ml. 10mL. 50. 7.5 Ml. 2.5 Ml. 10 mL. 75. 10 Ml. -. 10 mL. 100. A I G. -. T N U. Luego, se colocó cada una de las concentraciones. O L O. en frascos de vidrio de color ámbar estéril, para. AT M4 a 8 °C, hasta la realización del refrigeración de O T análisis microbiológico . S E DE. protegerlas de la luz, llevándolas posteriormente a. 51. L U C 7.. FA. D A T Método de Selección de la muestra. A. Obtención de la cepa:. Este estudio utilizó un cultivo liofilizado de la cepa de Streptococcus mutans ATCC 25175, el cual se obtuvo del Laboratorio de Microbiología de. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(32) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. la Facultad de Medicina de la Universidad Nacional de Trujillo.. B. Preparación del inóculo:. T N se cultivaron en tubos de ensayo cerrados U herméticamente conteniendo el medio Agar Soya A I Tripticasa. G O L Obajo condiciones de T Se incubaron A M a 37ºC con el fin de obtener microanaerobiosis O Tjóvenes. Luego de 24 horas cada cepa colonias S E Streptococcus mutans se diluyó en E D Las cepas de Streptococcus mutans ATCC. 25175,. ATCC 25175,. AD. T L U. C A F. caldo tioglicolato hasta obtener una turbidez semejante al tubo número 05 de la escala de Mac Farland. Una vez girados los tubos durante 30 segundos se procedió al sembrado para distribuir los microorganismos adecuadamente.. 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(33) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. C. Prueba de la susceptibilidad: Determinación de la susceptibilidad o resistencia bacteriana según el Halo de Inhibición (Efecto antibacteriano) de acuerdo a la Escala de Duraffourd 52. T N preparada a una distancia de 10cm de la llama U del mechero, se procedió al sembrado en camada en A placas Petri conteniendo Agar IMueller Hinton G O Sangre, se dispersó el hisopo uniformemente L O de agar girando cada T sobre toda la superficie A M 10 veces aproximadamente. placa 30 grados O T S ELas placas recién sembradas fueron incubadas DE Un hisopo estéril fue embebido con la cepa. AD. T L U. C A F. en condiciones de microanaerobiosis a 37ºC en atmósfera con 5% de CO2 durante 24 horas. Para el efecto antibacteriano se utilizó la técnica de. difusión de Kirby y Bauer modificada, la cual consistió en preparar los discos de papel de filtros estériles, los que serán sumergidos dentro de cada. concentración. del. aceite. esencial. del. Rosmarinus officinalis, por el periodo no menor de 1 hora, luego con una aguja estéril, estos se. 33 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(34) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. colocaron sobre los cultivos de Streptococcus mutans. ATCC25175. previamente. en. cultivadas;. las las. placas. placas. Petri. Petri se. mantuvieron en la misma posición por 5 minutos.. Luego de este tiempo las placas se voltearon. T N microanaerobiosis utilizando la jarra GasPack, Ucon el método de vela, mediante el cual se obtuvo un A ambiente aproximado de 5 a 10%Ide CO , a 37°C. G O L O se llevó a cabo dentro T Todo el procedimiento A del diámetroM de 10cm de la llama al mechero. La O lecturaT de los resultados se llevó a cabo después S E de las 24 horas, mediante la inspección visual de DE de posición y se incubaron por 24 horas en. 2. AD. T L U. C A F. cada placa.. Se efectuó tomando el registro en milímetros de los halos de inhibición del crecimiento de Streptococcus mutans ATCC 25175 mediante la técnica de Duraffourd.. 34 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(35) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. D. Determinación mínima. de. inhibitoria. la. concentración (CMI). según. Koneman53.. Para. determinar. la. concentración. mínima. inhibitoria del aceite esencial del Rosmarinus. T N del aceite esencial del Rosmarinus officinalis U al 5%, 25%, 50%, 75% y 100% respectivamente, A de ensayo, I cada concentración en un tubo G O previamente etiquetado. L O T A Después M del proceso de dilución se colocó un O inóculoTde 0.2 ml del cultivo preparado de S E Streptococcus mutans, en los tubos con las E D officinalis se realizó lo siguiente: se colocó 0.8 ml. AD. T L U. C A F. diversas concentraciones del extracto; así como al. control positivo (tubo con penicilina procaínica), y al control negativo (tubo con el cultivo de Streptococcus mutans en ningún tratamiento) y se obtuvo un volumen final de 1mL para cada tubo y se llevó a incubación a 37° C por un periodo de 24 horas en condiciones de microanaerobiosis.. 35 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(36) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Luego de 24 horas se realizó la determinación de la CIM, tomando 0,1mL de las suspensiones de cada tubo y se dispersó en las placas con Agar Mueller Hinton - Sangre con el asa de Driglasky para determinar las unidades formadoras de colonia (UFC).. AD. T L U. C A F. T N Después del sembrado, se llevó a incubación U a 37°C por 24 horas en jarra Gaspak en A5 a 10% de I condiciones de microanaerobiosis G O CO2. L O T A Todo el M procedimiento fue realizado bajo O T asépticas y se efectuaron 20 condiciones S E repeticiones por concentración. Luego de 24 horas DE se realizó el conteo de las colonias de cada una. de las placas. La concentración inhibitoria fue aquella en la que se llegó a inhibir completamente el desarrollo de los gérmenes.. 36 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(37) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. E. Controles: Para determinar el efecto antibacteriano: Se utilizó como control positivo, discos de penicilina, y. como. control. negativo,. discos. de. suero. fisiológico.. T N utilizó como control positivo, penicilina procaínica, U y como control negativo, la suspensión estándar A I de Streptococcus mutans. G O L O T F. Instrumento de Recolección de Datos: A Mvisualmente mediante una lupa, Si Fue medido O T de UFC es menor de 300, pero si el el número S E número fue mayor se utilizó el contador de DE Para la concentración inhibitoria mínima: Se. AD. T L U. C A F. colonias contenido en 4 cuadrantes y aplicado a la fórmula siguiente: UFC= N/4 x A x D. Se ha estructurado dos protocolos para el registro de la CMI y la susceptibilidad. (Anexo 01 y 02). 37 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(38) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 8. VARIABLES DE ESTUDIO Y ESCALAS DE MEDICION. VARIABLES. INDICE. INDICADOR. TIPO. ESCALA. Cualitativa. Nominal. Concentración del Aceite Independiente esencial de Rosmarinus. 5%,25%,. Tiene efecto. 50%, 75% y. o no tiene. 100%. efecto. officinalis Escala de Durafford:. Halo de inhibición. Dependiente. AD. Efecto. según el. antibacteriano. diámetro. Sobre el. (mm). A I G. Nula,. sensible,. muy O L O sensible y. T A Streptococcus M mutans O T S E Concentración inhibitoria E D. -. T N U. Cuantitativa. Ordinal. sumamente sensible. Efectiva y no efectiva mediante. Cuantitativa De razón. (UFC/ml). T L U. C A F. 38 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(39) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 9. Definición de las variables:. i. Concentración del Aceite esencial de las hojas de Rosmarinus officinalis (romero):.  Definición Conceptual:. T N por diversos procedimientos. El Rosmarinus officinalis U es un planta natural con propiedades beneficiosas A I para la salud . G O L O T  Definición Operacional: A M coincidió con la conceptual, El La definición O T officinalis es un planta natural con Rosmarinus S E beneficiosas para la salud . propiedades DE Sustancia que se obtiene a partir de las hojas. 38. UL. D A T. C A F. En la presente investigación el aceite esencial de. Rosmarinus. officinalis. fue. a. diferentes. concentraciones de 5%, 25%, 50%, 75% y 100%.. 39 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(40) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. ii.. Streptococcus. mutans. ATCC. 25175..  Conceptual: Bacteria del género Streptococcus, Gram positiva, con capacidad cariogénica17.. T N conceptual, para efectos de la investigación U fue valorada mediante el conteo UFC/ y el halo de A I inhibición. G O L O T Halo de Inhibición: A M O  Definición conceptual: Zona alrededor del T S E disco donde una sustancia antibacteriana es DE capaz de impedir el crecimiento de la.  Operacional:. iii.. D A T. FA. La. definición. coincidió. con. la. bacteria al cabo de 18 a 24 horas de. L U C. incubación 54.. . Definición operacional: Se utilizó como medida los diámetros de estas zonas en mm, según la escala de Duraffourd. y. manejar. los. siguientes. indicadores:. 40 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(41) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Escala de Duraffourd. Escala. utilizada. para. determinar. cualitativamente el efecto inhibitorio in vitro, según diámetro de inhibición:. . T N diámetro comprendido entre 8 a 14 mm. U  Medio (muy sensible = ++) para un IA diámetro entre 15 y 20 G mm. O (+++) para un  Sumamente sensible L O a 20 mm. T diámetro superior A M O T Mínima Inhibitoria (CMI) Concentración S E DEConceptual: se interpretó como la mínima . iv.. D A T. Sensibilidad límite (sensible = +) para un. concentración del aceite que inhibe el crecimiento. UL. C A F. Nula (-) para un diámetro inferior a 8 mm.. del microorganismo después de su incubación45.. . Operacional:. La definición. coincidió. con. la. conceptual al ser valorada mediante el número obtenido en mg/ mL del aceite esencial de Rosmarinus officinalis donde se pretende apreciar crecimiento del Streptococcus mutans menor a. 41 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(42) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. 300 UFC si es efectiva y mayor a 300 UFC si es no efectiva. Tanto la determinación del halo de inhibición como de la concentración mínima inhibitoria fueron necesarias y actuaron en simultáneo ya que con ellas logramos determinar la eficacia y efectividad del aceite esencial.. A I G. 10. Análisis estadístico e interpretación de datos:. -. T N U. Para analizar la información se construyeron cuadros. O L O. de distribución de frecuencias de una entrada y doble con. AT Desviación estándar deM las variables cuantitativas y gráfico. O T S E Para determinar cuál es la Concentración Mínima E D Inhibitoria (CMI), se empleó la prueba de Análisis de D A T Varianza y para determinar la susceptibilidad, se empleó la. sus valores absolutos y relativos, se calculó el promedio y. FA. L U C. Prueba No Paramétrica de Independencia de Criterios, utilizando la Distribución Chi cuadrado.. Para determinar que concentración es más efectiva contra el Streptococcus mutans se aplicó la prueba de comparaciones múltiples utilizando la prueba de Duncan. Ambas con un nivel de significancia del 5%(P <0.05).. 42 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(43) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. III. RESULTADOS. El presente estudio de tipo experimental, demostró el efecto antibacteriano in vitro del aceite esencial de Rosmarinus officinalis (Romero) a concentraciones de 5%, 25%, 50%, 75% y 100% sobre. T N U. una muestra de 135 placas con el inoculo de Streptococcus mutans ATCC 25175; al análisis de los datos se encontraron los siguientes resultados:. O L O. A I G. -. Tabla N° 01. Efecto antibacteriano in vitro del Aceite Esencial de Romero al 5%, 25%, 50%, 75% y 100% sobre el crecimiento del. T A halos de inhibición según EscalaM de Duraffourd. O T S E Grupo de tratamiento N Promedio E 5% 20 11.90 D D 25% 20 17.70 A T 50%L 20 18.25 U 20 19.70 C75%. Streptococcus mutans ATCC 25175. Tamaño promedio de los. FA 100%. Penicilina Procaína. Desv. Estándar 1.294 0.657 0.444 0.470. 20. 19.70. 0.470. 20. 17.35. 0.489. Fuente: Datos recogidos por el investigador, año 2016 En la tabla 01, se observa que cuando la concentración del aceite de romero. aumenta,. el. promedio. del. halo. crece,. excepto. a. las. 43 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(44) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. concentraciones de 75% y 100% que son iguales; así por ejemplo, al 5% el halo tenía un promedio de 11.9 mm y al 100% el promedio del halo es 19.7 mm, este valor es ligeramente superior al halo promedio que ese forma con la penicilina procaínica que es de 17.35 mm.. T N diámetro deUhalo A I G. TABLA N° 02. Efecto antibacteriano in vitro del Aceite Esencial de Romero 5%, 25%, 50%, 75%, 100% sobre el crecimiento del Streptococcus mutans ATCC 25175, según inhibitorio y mediante el Análisis de Varianza.. F de V. SC. Tratamientos Error. 832.767. 114 T 889.467 ES 119 DE 56.700. Total. D A T. O L GL CM F O T 5 334.869 A166.553 OM. P 0.0000. 0.497. Fuente: Datos obtenidos por el investigador, año 2016.. L U C. FAEn la tabla 02, se observa que hay diferencias altamente significativas entre los promedios de los halos en los distintos tratamientos.. 44 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(45) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. TABLA N° 03. Efecto antibacteriano in vitro del Aceite Esencial de Romero. sobre el crecimiento del Streptococcus mutans ATCC. 25175, según diámetro de halo inhibitorio y mediante la Prueba de Duncan.. T N 6 U. Subconjunto para alfa = 0.05. Grupos de Tratamiento. n. 1. 2. 5%. 20 11.90. Penicilina Procaína. 20. 17.35. 25%. 20. 17.70. 50%. 20. 75%. 20. 100%. 20. 3. 4. A I G. O 18.25 L O. AT OM. -. 5. 19.70 19.70. T S E. Fuente: Datos obtenidos por el investigador, año 2016.. D A T. DE. En la tabla 03, se observa cuatro grupos; así en el segundo grupo la. UL. penicilina. procaína. con. el. aceite. esencial. al. 25%. no. difieren. significativamente sus promedios y en el cuarto grupo C A F concentraciones de 75% y 100% de aceite esencial tampoco difieren.. las. 45 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(46) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. TABLA N° 04. Efecto antibacteriano in vitro del Aceite Esencial de Romero sobre el crecimiento del Streptococcus mutans ATCC 25175, según el promedio de Unidad Formadoras de Colonias (UFC). Grupo de tratamiento. N. Promedio. Desv. Estándar. 5%. 20. 131.10. 12.871. 25%. 20. 76.20. 13.950. 50%. 20. 30.05. 6.573. 75%. 20. 6.40. 2.604. T N U Control sin tratamiento 20 5.30E+06 2.21E+06 A I Fuente: Datos obtenidos por el investigador, año 2016. G O L O la concentración del En la tabla 04, se observa que cuando aumenta T A de colonias disminuyen; así aceite de romero las unidades formadoras M O T UFC como promedio y al 75% solo por ejemplo: al 5% se tenía 131.10 S E 6.40 UFC como promedio. DE D TABLA N°A 05. Efecto antibacteriano in vitro del Aceite Esencial de Tsobre el crecimiento del Streptococcus mutans ATCC Romero L U según UFC y mediante el Análisis de Varianza. 25175, C FA F de V SC GL CM F p Tratamientos. 181681.938. 3. 60560.646. Error. 7794.750. 76. 102.563. Total. 189476.688. 79. 590.476. 0.0000. Fuente: Datos obtenidos por el investigador, año 2016.. 46 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(47) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. En la tabla 05, se observa que hay una diferencia significativa en el crecimiento de UFC de la bacteria, entre los promedios de las concentraciones del aceite esencial de romero (p < 0.001).. TABLA N° 06. Efecto antibacteriano in vitro del Aceite. T N U. Esencial de Romero sobre el crecimiento del Streptococcus mutans ATCC 25175, según UFC y mediante la Prueba de Duncan.. Subconjunto para alfa = 0.05. Concentración del aceite de Romero 75% 25% 5%. FA. T S E 20. DE. AT 2 M O6.40. N 20. 50%. O L O. A I G. -. 1. 3. 4. 30.05. 20 20. 76.20 131.10. D A T Datos obtenidos por el grupo investigador, año 2016. Fuente: L CU. En la tabla 06, se observa que al aumentar la concentración, disminuye las UFC; por lo tanto, la efectividad aumenta; siendo la más efectiva la concentración al 75% de aceite esencial de romero.. 47 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(48) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. III.. DISCUSIÓN. El uso de las plantas medicinales bucodentales, en la actualidad, ha cobrado gran importancia debido a los efectos positivos en la odontología para prevención de enfermedades.. Se ha demostrado el EFECTO ANTIBACTERIANO IN VITRO DEL. T N U Streptococcus mutans , habiendo encontrado resultados- eficaces, manifestados a través de los halos de susceptibilidad A bacteriana y I Gdemuestra que el Unidades Formadoras de Colonia (UFC), lo cual O L aceite esencial de romero tiene efectos O inhibitorios sobre el T A crecimiento de S. mutans. M O T S Se determinó el efecto E antibacteriano del aceite esencial de romero sobre S. mutans DEutilizando el método de difusión de discos, para lo D 2 grupos experimentales, uno de 5 concentraciones cual se formaron A T de L aceite esencial de romero, y un grupo control utilizando penicilina, CU ACEITE ESENCIAL DE Rosmarinus officinalis (ROMERO) SOBRE. FA. observándose un aumento creciente de los promedios de los halos de. inhibición del crecimiento bacteriano del S. mutans a medida que la concentración de aceite esencial de romero aumentaba (Tabla 03).. 48 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(49) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Estos resultados demuestran que el aceite de romero, además de tener acción antibacteriana, tiene relación directa con la concentración utilizada; es decir, que a mayor concentración de aceite de romero se tiene mayor efecto antibacteriano; considerando que en el presente trabajo se utilizó el aceite de romero a 5 concentraciones (5%, 25%, 50%, 75% y 100%), lo cual no se realizó en trabajos anteriores.. FA. T N También se determinó la concentración mínima inhibitoria obtenida U fue aceite esencial de romero al 75%, ya que el número de UFC a Arespecto a las I partir de esta concentración fue menor a 300, con G O demás concentraciones, donde se observaron efecto inhibitorio, ya L O alta (Tabla 4). Estos T que el inóculo de S,mutans fue demasiado A Maceite de romero tiene acción resultados demuestran que el O T conforme aumenta la concentración. antibacteriana frente a S. mutans S E E D Los resultados obtenidos durante esta investigación coinciden con D A los siguientes T estudios realizados por otros autores, tales como: L CU Teixeira, en el 2012, realizó estudios de la actividad antibacteriana. in vitro del aceite esencial de R. officinalis, utilizando cepas periodontopatógenas. y. cariogénicas. como. P.. gingivalis,. A.. actinomycetemcomitans, F.nucleatum, S. mutans, y S.sobrinus, dando como resultado que el aceite esencial de R.officinalis inhibió la capacidad de adherencia de S. mutans, además inhibió el crecimiento. 49 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(50) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. de las bacterias Gram-negativas A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis y F.nucleatum37.. En otras investigaciones como las de Cordeiro et al y Gontijo et al, en el 2006, realizados in vitro se tuvo como objetivo desarrollar un enjuague. bucal. que. contiene. la. combinación. de. extractos. T N cuales U. hidroalcohólicos de R. officinalis, Plantago psyllium, Impetiginosa tabebuia, Achilleamille folium y Nasturtium officinale, las. -. evidenciaron una actividad antibacteriana frente a P. aeruginosa, E. coli, S. aureus , B. subtilis, E. fecalis38,39.. O L O. A I G. AT M posee actividad antimicrobiana officinalis a diversas concentraciones O T como control positivo sulfametoxazol, sobre Salmonella sp,usando S E norfloxacina, neomicina. El aceite esencial comercial de R.officinalis E D sólo presenta actividad inhibitoria ante Salmonella sp. cuando es usada D A al 100% T de su concentración . L CU. Hentz et al , en el 2007, demostraron que el aceite esencial de R.. 40. FA. Alves et al y Silva et al, en un estudio in vitro compararon la. actividad antimicrobiana del extracto hidroalcohólico de R. officinalis (romero) y clorhexidina al 0,12 %, contra cepas estandarizadas de: S. mutans, S. mitis, S. sobrinus, S. sanguis y L .casei; los resultados demostraron. un. gran. potencial. antibacteriano. del. extracto. hidroalcohólico de R.officinalis frente a todas las cepas utilizadas, con. 50 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(51) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. halos de inhibición de 11 a 20 mm. Similar a clorhexidina al 0,12 %, con halos de inhibición de 11 a 18 mm 42,43.. Castaño et al, realizó una investigación sobre actividad inhibitoria del extracto etanólico y del aceite esencial de hojas de R. officinalis L. (Romero) sobre algunas bacterias de interés alimentario. En donde el. T N en bacterias Gram +; determinando así que las hojas de romero U contienen compuestos con clara actividad antimicrobiana sobre Aalimentarias y I microorganismos de importancia en contaminaciones G O justifica el potencial de aplicación en la industria de la investigación . L O T A Mhizo el ensayo antimicrobiano sobre Dalirsani et al, en otro estudio, O Tplantas, una de las muestras ensayadas extractos etanólicos de diez S E fue el R. officinalis en Streptococcus mutans, comparando con la E D clorhexidina usando el método de difusión en disco estándar. Los D A resultados T obtenidos del extracto etanólico de R. officinalis fue de L U ± 0,96 significativamente menor a clorhexidina 14.07 ±1.70 C11.52 aceite esencial exhibió un amplio espectro de la acción antimicrobiana,. 44. FA. 46. De igual manera en un estudio in vivo publicado por Teixeira, manifiesta que el extracto de R.officinalis Linn presenta acción antimicrobiana en bacterias orales presentes en la biopelícula47.. 51 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.

(52) Biblioteca Digital – Dirección de Sistemas de Informática y Comunicación. Purca Peña , en el 2013, analizó el efecto antibacteriano in vitro del extracto. etanólico. de. R.. utilizando. officinalis,. concentraciones. (25mg/ml, 50 mg/ml y 75 mg/ml) contra microorganismos frecuentes en la flora salival y compararlos con el control positivo la clorhexidina 0,12% y control negativo el agua destilada.. -. T N U. Los resultados que se obtuvieron fueron halos de inhibición en. A I G. promedio de 12,47 mm para 25 mg/ml, 17 mm para 50 mg/ml, 20,56. O L O. para 75 mg/ml, 15,56 para la clorhexidina 0,12 %, 5 mm para el agua. AT officinalis (romero), presenta unaM efectividad antibacteriana sobre flora O T salival . S E E D Finalmente el presente estudio de investigación se encontró que el D A uso del T aceite de romero al 5%, 25%, 50%, 75% y 100% presentaron L efecto antibacteriano frente a Streptococcus mutans ATCC 25175. CU destilada. Comprobándose que el extracto etanólico de Rosmarinus. 48. FA. 52 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento No Comercial. Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia visite: http://creativecommons.org/licenses/by.nc.sa/2.5/pe/.