UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
ESCUELA PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
Efecto de la concentración del aceite esencial de Tagetes minuta L. sobre el crecimiento de Morganella morganii, in vitro
Tesis
para optar el Título Profesional de Biólogo – Microbiólogo
AUTORES:
Br. Hilario Rodriguez, Oscar Javier Br. Mendoza Mendoza, Gabriela Soraida
ASESORA:
Dra. Rodriguez Haro, Icela Marissa
TRUJILLO – PERÚ
2022
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AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
Dr. Carlos Alberto Vásquez Boyer
RECTOR DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
Dr. Juan Amaro Villacorta Vásquez
VICERRECTOR ACADÉMICO DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO
Dr. Guillermo Arturo García Pérez VICERRECTOR DE INVESTIGACIÓN
Dr. Esteban Alejandro Ilich Zerpa SECRETARIO GENERAL
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AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Dr. Heber Max Robles Castillo
DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS
Dra. Manuela Natividad Luján Velásquez
DIRECTORA DE LA ESCUELA PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
Dra. Judith Enit Roldan Rodriguez
DIRECTORA DEL DEPARTAMENTO ACADÉMICO DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA
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DEL ASESOR
El que suscribe: Dra. Icela Marissa Rodriguez Haro, asesor de la presente tesis titulada:
“Efecto de la concentración del aceite esencial de Tagetes minuta L. sobre el crecimiento de Morganella morganii, in vitro”.
CERTIFICA:
Que, la investigación ha sido ejecutada de acuerdo al reglamento establecido por la Facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, y en conformidad con su correspondiente proyecto, y que el informe ha sido redactado acogiendo las observaciones y sugerencias alcanzadas.
Por lo tanto, autorizo a Oscar Javier Hilario Rodriguez y Gabriela Soraida Mendoza Mendoza, continuar con el trámite del reglamento correspondiente.
Trujillo, 30 de Junio del 2022
Dra. Icela Marissa Rodriguez Haro ASESOR
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PRESENTACIÓN
SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR:
En cumplimiento con las disposiciones establecidas en el Reglamento de Grados y Títulos de la Universidad Nacional de Trujillo ponemos a vuestra consideración y criterio, el informe de tesis titulado: “Efecto de la concentración del aceite esencial de Tagetes minuta L.
sobre el crecimiento de Morganella morganii, in vitro”, con el propósito de obtener el Título Profesional de Biólogo – Microbiólogo.
Trujillo, 30 de Junio del 2022
Br. Gabriela Soraida Mendoza Mendoza Br. Oscar Javier Hilario Rodriguez
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MIEMBROS DEL JURADO
Ms.C. Iván Wilfredo Angulo Castro PRESIDENTE
Dr. Eduardo José Muñoz Ganoza SECRETARIO
Dra. Icela Marissa Rodriguez Haro MIEMBRO
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APROBACIÓN
Los docentes que suscriben, miembros del jurado dictaminador, declaran que el presente informe de tesis titulado: “Efecto de la concentración del aceite esencial de Tagetes minuta L. sobre el crecimiento de Morganella morganii, in vitro”, ha cumplido con los requisitos formales y fundamentales, siendo APROBADO por UNANIMIDAD.
Ms.C. Iván Wilfredo Angulo Castro PRESIDENTE
Dr. Eduardo José Muñoz Ganoza SECRETARIO
Dra. Icela Marissa Rodriguez Haro MIEMBRO
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DEDICATORIA
HILARIO RODRIGUEZ, OSCAR JAVIER
A mi hijo:
Renzo André, eres mi orgullo y mi gran motivación, libras de mi mente todas las adversidades que se presentan y me impulsas a cada día superarme en la carrera de ofrecerte siempre lo mejor.
Para ti “mi incondicional”, que siempre me brindas tu apoyo, comprensión, tolerancia, paciencia y tu tiempo valioso. Mi infinito amor y gratitud.
A Dios:
Por darme esa fortaleza para levantarme cada día y no claudicar en todos estos años que duro mi formación profesional.
Por haberme otorgado una familia hermosa, por permitirme vivir y disfrutar de ella cada día.
A mis padres:
Andrés y María, por haberme forjado como la persona que soy en la actualidad; muchos de mis logros se los debo a ustedes entre los que se incluye este.
Mi amor y gratitud hacia ustedes, por estar a mi lado siempre, brindándome ejemplo de superación, humildad y sacrificio;
enseñándome a valorar todo lo que tengo.
A mi esposa:
Eilen, por estar conmigo en los buenos y malos momentos, siempre brindándome tu amor y apoyo incondicional, siempre creyendo en mi cuando nadie más creía.
Eres mi amor, fuerza y mi ilusión, deseo una larga vida a tu lado, porque eres una mujer muy especial y maravillosa que siempre sacó lo mejor de mí.
A mis hermanos:
Juan Miguel, mi instructor, quien desde que era niño, me guio por el camino de la educación y me protegió con sus consejos de los peligros de la vida.
Roger Andrés, mi protector, siempre apostaste y viste en mí, lo que yo no creía que podía alcanzar. A
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MENDOZA MENDOZA, GABRIELA SORAIDA
Dios:
Por regalarme salud, permitirme culminar mi carrera, y brindarme confianza para seguir adelante frente a cualquier propósito.
A mis padres:
Con gran amor muy especial, María E. Mendoza y Santos E.
Mendoza, quienes me apoyaron incondicionalmente en todo momento tanto económico y moral e hicieron su mayor esfuerzo posible una de mis metas.
A mi hermana:
Elena Mendoza Mendoza, por sus consejos y oraciones.
A mis hijas:
Alise R. Angulo y Shirley I. Angulo por ser mi mayor fuente de inspiración y depositar su confianza en mí, para lograr juntas este objetivo.
Elmer Gil:
Por su linda y respetuosa amistad.
Y a todas las personas que desinteresadamente me ayudaron a culminar mi carrera profesional.
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AGRADECIMIENTO
A la Dra. Icela Marissa Rodriguez Haro, Docente Principal DE del Departamento Académico de Microbiología y Parasitología de la Universidad Nacional de Trujillo, por su predisposición, la amistad, el tiempo, y la experiencia brindada en el asesoramiento a lo
largo de todo el proceso y culminación de esta Tesis.
Al Dr. Marco Salazar Castillo, Docente Principal DE del Departamento Académico de Química Biológica y Fisiología Animal por su amistad, consejos, aportes, y apoyo brindado
incondicionalmente, para llevar por buen camino el proceso de la investigación.
Al Sr. Carlos Guzmán, por su amistad, compañerismo y apoyo desinteresado, desde el inicio de este camino intelectual, conservando siempre esa buena actitud. Al personal técnico
y administrativo por su valiosa ayuda en cada etapa del proceso.
Finalmente dar gracias a todos los compañeros, amigos y familiares, quienes de una u otra manera su apoyo y motivación fueron parte importante de la
esencia de esta investigación.
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ÍNDICE
AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ... ii
AUTORIDADES DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS ... iii
DEL ASESOR ... iv
PRESENTACIÓN ... v
MIEMBROS DEL JURADO ... vi
APROBACIÓN ... vii
DEDICATORIA ... viii
AGRADECIMIENTO ... x
ÍNDICE ... xi
RESUMEN ... xii
ABSTRACT ... xiii
I. INTRODUCCIÓN ... 1
II. MATERIAL Y METODO ... 8
III. RESULTADOS ... 15
IV. ANALISIS Y DISCUSIÓN ... 22
V. CONCLUSIÓN ... 26
VI. RECOMENDACIONES ... 27
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 28
VIII. ANEXOS ... 33
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RESUMEN
El aceite esencial (AE) de la hojas de Tagetes minuta L. fue obtenido mediante la técnica de arrastre por vapor de agua; se evaluó el efecto de las concentraciones al 5, 10, 15 y 20 µL/mL del AE sobre el crecimiento de Morganella morganii, y se cuantificó mediante la técnica de difusión en agar, concentración mínima inhibitoria (CMI) y concentración mínima bactericida (CMB); hallándose la medida promedio de las halos de inhibición de crecimiento de 8.7, 14.8, 16.4 y 18.1 mm respectivamente a cada concentración en aumento, el resultado de la CMI fue de 0.49 µL/mL y de la CMB de 0.98 µL/mL. Se determinó, in vitro, que el AE de las hojas de Tagetes minuta L. posee efecto antibacteriano sobre el crecimiento de Morganella morganii;
siendo esta una alternativa Fito farmacológica para el tratamiento de infecciones producidas por esta bacteria.
Palabras clave: Tagetes minuta L., Morganella morganii, Aceite Esencial, Concentración Mínima Inhibitoria, Concentración Mínima Bactericida.
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ABSTRACT
The essential oil (EO) from the leaves of Tagetes minuta L. was obtained by the water vapour entrainment technique; the effect of concentrations of 5, 10, 15 and 20 µL/mL of EO on the growth of Morganella morganii was evaluated and quantified by the agar diffusion technique, minimum inhibitory concentration (MIC) and minimum bactericidal concentration (MBC); the average measurement of the growth inhibition halos was found to be 8, 7, 14.8, 16.4 and 18.1 mm respectively at each increasing concentration, the MIC was 0.49 µL/mL and the MBC was 0.98 µL/mL. It was determined, in vitro, that the EO from the leaves of Tagetes minuta L. has an antibacterial effect on the growth of Morganella morganii; this being a phytopharmacological alternative for the treatment of infections produced by this bacterium.
Key words: Tagetes minuta L., Morganella morganii, Essential Oil, Minimum Inhibitory Concentration, Minimum Bactericidal Concentration.
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I. INTRODUCCIÓN
Realidad problemática
Las infecciones causadas por M. morganii resistentes a múltiples fármacos está en aumento en los últimos años, colocándola en camino a convertirse en la próxima “superbacteria”, esto se debe principalmente a factores de virulencia como hemolisinas, ureasas y lipopolisacáridos (LPS); planteando a esta bacteria como un patógeno oportunista con capacidad para generar nuevas infecciones. (Bandy, 2020)
La adquisición de un gen de resistencia o mutación se realiza por transferencia horizontal, mediante genes intrínsecos y adquiridos codificados por plásmidos, los cuales permiten que las bacterias se adapten en un constante cambio ambiental, ofreciendo ventajas funcionales a el huésped, como factores de virulencia y resistencia a los fármacos. (Band & Weiss, 2021;
Diebold et al., 2021)
Esta bacteria ha sido reportada en casos de sepsis neonatal, meningitis, corioamnionitis, sin embargo, en raras ocasiones ha sido implicada en muerte fetal; la cirugía, la hospitalización, el uso de fármacos, niños pequeños, son el factor de riesgo más común para causar una infección sistémica potencialmente mortal. (Dessie et al., 2020; Zaric et al., 2021)
En la actualidad, los fármacos utilizados en el tratamiento de enfermedades infecciosas han disminuido su eficiencia con efectos secundarios, buscando así nuevas alternativas de solución en el estudio más profundo de la fitomedicina. (Igwaran et al., 2017)
Los aceites esenciales (AE) cobraron gran importancia, ya que tienen múltiples propiedades, como antioxidante, antiinflamatoria, anticancerígena; además, investigaciones recientes demuestran su capacidad de enfrentar microorganismos, como bacterias, hongos, levaduras y parásitos resistentes a fármacos. (Giarratana et al., 2017)
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Marco teórico
Según Salehi et al. (2018), en su evaluación “Tagetes spp. Aceites esenciales y otros extractos:
caracterización química y actividad biológica” compara que, desde la antigüedad se han utilizado plantas para tratar diversas enfermedades, esto debido a sus propiedades terapéuticas y su eficacia de cada planta. Los fármacos vegetales poseen algunas ventajas, ya que actúan sobre diferentes dianas moleculares, agregando a ello un menor costo y menos efectos secundarios.
Yuan et al. (2021), en su investigación “Las bacterias desnitrificantes patógenas y autóctonas son activas desde el punto de vista de la transcripción y son actores clave resistentes a los antibióticos”, reporta que en los últimos años se ha presentado una crisis creciente que amenaza con la salud pública y la atención medica moderna, la cual está determinada por la resistencia a los antimicrobianos, esto se debe al uso inadecuado y excesivo de los fármacos en humanos y animales, desafiando el tratamiento de las infecciones bacterianas.
Según Septimus (2018), “Resistencia a los antimicrobianos: Enfoque de administración de antimicrobianos, diagnóstico y prevención de infecciones”, determinó que los aceites esenciales de plantas medicinales contienen compuestos antimicrobianos naturales que han demostrado ser eficaces para limitar el crecimiento y la supervivencia de muchos patógenos.
Según Giacone et al., (2020), los autores en su evaluación “Actividad fotodinámica de los extractos de Tagetes minuta contra las infecciones fúngicas superficiales”, determina que la planta de T. minuta dispone de sustancias activas de gran importancia, utilizados originalmente para aromatizar, en las industrias alimentarias, farmacéutica y nutricional; en especial aceite esenciales (AE) y flavonoles, extraído de hojas, tallos y flores.
Santos et al. (2017), en su investigación sobre “Revisión sistemática y resumen tecnológico de la actividad antimicrobiana de Tagetes minuta y perspectivas de futuro”, esta planta conocida
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con el nombre común de “huacatay”, posee propiedades desinflamantes usado para tratar diversos problemas de salud como trastornos dentales, estomacales, intestinales, nerviosos y emocionales; además usada en la agricultura por presentar propiedades bactericidas, fungicidas e insecticidas.
Shahzadi & Shah (2015), su investigación “Glucósidos de flavonol aislados de Tagetes minuta con actividad antibacteriana”, reporta que las actividades antimicrobianas de plantas como las especies de M. piperita y T. minuta poseen altos niveles de monoterpenos, por lo que exhiben actividad contra bacterias Gram positivas y Gram negativas.
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Marco conceptual
El género Tagetes, pertenece a la familia Asteraceae, nativa de América, extendiéndose su cultivo actualmente a otros continentes. Sus diversidades de especies son cultivadas como plantas ornamentales; pero algunas especies como Tagetes minuta, T. erecta, T. patula y T.
tenuifolia son estudiadas por sus propiedades medicinales, sobre base del uso en la medicina tradicional desde la antigüedad. (Apaza Ticona et al., 2021; Salehi et al., 2018)
Tagetes minuta es la especie más cultivada, crece en áreas húmedas y secas de la región tropical, subtropical y templada entre una altitud de 1000 a 2500 metros sobre el nivel del mar; además esta hierba es fuertemente perfumada, con el tallo erecto y ramificado. (Walia & Kumar, 2021) Las especies de Tagetes presentan propiedades antibacterianas en Gram negativos como Escherichia coli, Shiguella dysenteriae, Salmonella enteritidis; y en Gram positivos como Staphylococcus aureus, Streptococcus pneumoniae, Streptococcus pyogenes; antifúngica contra especies de Aspergillus, Candida y Penicillium. (Brochot et al., 2017; Giarratana et al., 2017) Según la clasificación moderna, Morganella es un tipo de una nueva familia de Morganellaceae.
Esta familia consta de 8 géneros: Arsenophonus, Cosenzaea, Moellerella, Morganella, Photorhabdus, Proteus, Providencia y Xenorhabdus. El género Morganella, actualmente consta de una sola especie M. morganii, con dos subespecies, morganii y sibonii. (Minnullina et al., 2019)
Morganella morganii es un bacilo gramnegativo con capacidad anaerobia facultativo perteneciente a la familia Enterobacteriaceae; por lo general se encuentra en el microbiota comensal intestinal humana, causante infecciones en heridas, tracto urinario, así como en el tracto hepatobiliar. (Bond & Stadler, 2020; Dessie et al., 2020)
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Es reconocido como un patógeno oportunista de gran importancia clínica, actualmente ciertos aislamientos presentan resistencia a múltiples fármacos, ya que portan genes resistentes como blaNDM-1 y qnrD1. (Jiang et al., 2019; Luo et al., 2020; Park et al., 2020)
El método para la extracción y el rendimiento en porcentaje del Aceite Esencial (AE), se asocia a la estructura y al estado fisiológico de la planta. La destilación por el método de arrastre de vapor de agua, es el más utilizado por la facilidad de realizar, menor tiempo, bajo consumo de energía, menor emisión de dióxido de carbono y la limpieza del producto. (Aziz et al., 2018;
Zheljazkov & Maggi, 2021)
La destilación por arrastre de vapor de agua, actualmente usada para obtener aceites esenciales, consiste en la separación de sustancias orgánicas insolubles por diferencia de temperatura.
Transformada la esencia en vapor, se condensa mediante enfriamiento, la cual ayuda a purificar el producto. Este sistema por arrastre del vapor de agua se prepara en equipo de vidrio llamado equipo de destilación o equipo de metal denominados alambiques. (Rafiq et al., 2016)
El aceite esencial es un líquido hidrófobo obtenido de diversas partes de las plantas, como tallos, hojas, flores y semillas. El aceite esencial ha sido utilizado durante mucho tiempo como agente aromatizante en la industria alimentaria y cosmética. Además, diversos estudios has reconocido efectos biológicos como actividades antimicrobianas, anticancerígenas y antidiabéticas. (Rafiq et al., 2016)
El aceite esencial de Tagetes minuta, de color característico amarillo-naranja, presenta compuestos principales como dihidrotagetona, ocimeno, tagetona y limoneno y un rendimiento medio del 0.77% de la muestra de la planta extraída. (Brochot et al., 2017; Rezaei et al., 2018)
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Justificación y relevancia
En los últimos años, la creciente demanda por conseguir nuevas alternativas para el tratamiento contra las infecciones causadas por bacterias ha intensificado la investigación en la fitomedicina, por sus amplias propiedades antimicrobianas y efectos secundarios menores.
La presente investigación pretende ampliar el conocimiento científico con la existencia de plantas con propiedades antibacterianas, con el fin de elaborar nuevos fármacos las cuales pueden referenciarse como coadyuvantes de prevención, control y tratamiento de enfermedades como infecciones en la piel, tracto urinario y otros órganos.
De esta forma permite que personas con recursos económicos bajos puedan usar estas alternativas de tratamiento a un bajo costo, con el uso del aceite esencial de Tagetes minuta L.
Problema
¿Cuál es el efecto de la concentración 5, 10, 15, y 20 µL/mL del aceite esencial de Tagetes minuta L. sobre el crecimiento de Morganella morganii?
Objetivos
Objetivo general
• Determinar el efecto de la concentración del aceite esencial de Tagetes minuta L. sobre el crecimiento de Morganella morganii, in vitro.
Objetivos específicos
• Determinar la inhibición de crecimiento de cada concentración de aceite esencial.
• Establecer la Concentración Mínima Inhibitoria.
• Establecer la Concentración Mínima Bactericida.
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• Establecer el nivel de significancia de cada concentración de aceite esencial mediante análisis estadístico.
Hipótesis
A medida que aumenta la concentración al 5, 10, 15 y 20 µL/mL del aceite esencial de Tagetes minuta L., aumentara la medida del halo de inhibición de crecimiento de Morganella morganii, in vitro.
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II. MATERIAL Y METODO
2.1. Tipo de Investigación
Básica, experimental, con diseño de estímulo creciente.
Testigo A1 Tween 80 al 0.1 % A2
Experimental I B1 Concentración de AE 5 µL/mL B2
Experimental II C1 Concentración de AE 10 µL/mL C2
Experimental III D1 Concentración de AE 15 µL/mL D2
Experimental IV E1 Concentración de AE 20 µL/mL E2
2.2. Población / muestra 2.2.1. De la bacteria:
Población: Todos los cultivos de Morganella morganii.
Muestra: Cultivo puro de Morganella morganii.
2.2.2. Del material vegetal
Población: Todas las plantas de Tagetes minuta L.
Muestra: 6 kg de hojas de Tagetes minuta L. recolectadas del caserío Huaca Blanca, Provincia de Chepén.
2.3. Criterios de inclusión 2.3.1. De la bacteria:
Cultivo sin contaminación y en la fase de crecimiento logarítmica media.
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2.3.2. Del material vegetal:
Hojas en buen estado fisiológico vegetal, sin roturas y sin signos de evidencia de infección por hongos y/o bacterias.
2.4. Unidad de análisis 2.4.1. De la bacteria:
Una UFC del cultivo puro de Morganella morganii.
2.4.2. Del material vegetal:
El AE extraído de Tagetes minuta L. a través de destilación mediante arrastre por vapor de agua.
2.5. Instrumentos
Cuaderno de registro de datos.
Vernier calibrado.
Formulas en Excel.
2.6. Control de calidad de los datos: Confiabilidad y pruebas de validez
Los datos se obtuvieron realizando medidas a los halos de inhibición de los 5 grupos: I (Testigo con Tween 80 en solución al 0,1 %), II (AE al 5 µL/mL con Tween 80 en solución al 0,1 %), III (AE al 10 µL/mL con Tween 80 en solución al 0,1 %), IV (AE al 15 µL/mL con Tween 80 en solución al 0,1 %) y V (AE al 20 µL/mL con Tween 80 en solución al 0,1 %). Posteriormente los datos recolectados fueron analizados estadísticamente por el programa SPSS.
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2.7. Procedimiento
Recolección de la muestra vegetal
La muestra vegetal, Tagetes minuta L., se recolectó de cultivos agrícolas ubicados en el centro poblado “Huaca Blanca”, Provincia de Chepén, del Departamento de La Libertad.
Selección del material vegetal
El material vegetal colectado fue transportado al laboratorio, se seleccionó según la calidad de hojas, se procedió luego a lavar con agua destilada; posteriormente fue llevado al equipo de extracción. (Núñez et al., 2020)
Obtención del aceite esencial
Para la obtención del AE de las hojas de Tagetes minuta L., empleamos la técnica de arrastre por vapor de agua. El destilado fue separado teniendo en cuenta la inmiscibilidad como propiedad característica, y las densidades diferentes entre el hidrolato y el aceite esencial, para lo cual se usó una pera de separación de vidrio. El aceite esencial fue conservado en frascos ámbar y bajo refrigeración a 4 °C. (Borges et al., 2019)
Preparación de las concentraciones del aceite esencial
Se preparó diferentes concentraciones 5, 10, 15 y 20 µL/mL del AE de Tagetes minuta L. con Tween 80 en solución al 0.1 %, se guardó en viales, y se conservaron en refrigeración a 4° C.
(Massuh et al., 2017)
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Reactivación bacteriana
A partir del cultivo puro de Morganella morganii, se sembró por suspensión en tubo con TSB.
Luego se incubó a 37°C por 18 a 24 horas. Posteriormente se sembró por estría, del caldo TSB, en Agar MacConkey. Asimismo, se incubó a 37° C por 24 horas. (Koneman et al., 2008)
Preparación del inóculo bacteriano
El inóculo se preparó haciendo una suspensión en solución fisiológica salina al 0.85%, de las colonias aisladas anteriormente y se estandarizó al tubo N° 0.5 del Nefelómetro de Mc Farland (1.5 x 108 UFC/mL). (Koneman et al., 2008)
Métodos de evaluación antimicrobiana: Kirby-bauer
Siguiendo el método establecido por el Instituto de Estándares Clínicos y de Laboratorios (CLSI), de manera óptima, posterior al ajuste de la turbidez del inóculo suspendido, se introdujo el hisopo de algodón estéril en el tubo.
Luego se sembró en la superficie de Agar Müller Hinton en placa, rayando el hisopo sobre la superficie del agar estéril.
El procedimiento se realizó rayando dos veces más el agar, girando aproximadamente la placa 60 ° cada vez, para una distribución uniforme del inóculo. Para finalizar, se rodeó con el hisopo por el borde del agar.
La tapa se dejó entreabierta durante 5 minutos, pero no exceder más de 15 minutos, para disminuir en la superficie del agar el exceso de humedad.
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Posteriormente se procedió a realizar los pocillos, de 6 mm de diámetro. Luego se colocó cada concentración de aceite esencial de Tagetes minuta L. en cada pocillo. Se incubó a 37° C durante 24 horas. Se evaluó la inhibición del crecimiento con un vernier calibrado del diámetro del halo formado por la inhibición del crecimiento.
Para tener garantía de la reproducibilidad y la confiabilidad de los resultados se realizó 3 ensayos y cada ensayo por triplicado.
Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)
Para la determinación de CMI se basó en el método de macrodilución en Caldo Müeller Hinton (MH), siguiendo las recomendaciones del CLSI (2019). Para ello se preparó diluciones sucesivas del aceite esencial de T. minuta L. al medio (1/2) en el caldo MH, siendo el volumen final de 1 mL en cada tubo.
La concentración del inoculo bacteriano se estandarizó con el tubo N° 0.5 del Nefelómetro de McFarland, que luego fue diluido al centésimo en caldo MH, para lograr una concentración final aproximada de 1.5 x 105 UFC/mL en cada tubo.
Este procedimiento se realizó por triplicado y fueron llevados a incubar a 37 °C por 24 horas.
La CMI se determinó como concentración mínima del aceite esencial en la que no se observe crecimiento.
Determinación de la Concentración Mínima Bactericida (CMB)
Según el CLSI (2019), posterior a realizar la CMI, con un asa estéril, se tomó un inoculo de los tubos que no presenten crecimiento visible, se sembró por estría en placas con agar MH y se
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incubó a 37 °C por 24 horas. La CMB se tomó como la concentración mínima del AE que no evidencia crecimiento de colonias visibles en la placa. Si del tubo con la concentración del AE se observa crecimiento en placa, concluimos que posee un efecto bacteriostático.
Control de esterilidad
Los medios de cultivo usados en este trabajo fueron esterilizados en autoclave a 121 °C por 15 minutos a presión de 1 atm y el control se realizó usando la cinta 3M para calor húmedo.
Terminado este proceso, los medios fueron agregados, en condiciones de asepsia, en placas de Petri previamente esterilizadas, las que luego fueron incubados a 37 °C por 24 horas para el control de esterilidad de medios preparados. (Bykowski & Stevenson, 2020)
2.8. Procesamiento de los datos
Los resultados in vitro de las pruebas, se expresaron en milímetros; se utilizó un vernier digital para realizar las medidas promedio del diámetro de los halos de inhibición del crecimiento de M. morganii; para las diferentes concentraciones, el AE de T. minuta L. Se usó Tween 80 a concentración del 0.1 %, para la emulsión utilizando micropipetas calibradas. Los datos fueron registrados en una plantilla en el programa Excel 2019 para luego ser procesados estadísticamente.
2.9. Definición de variables
Variable Independiente: Concentración del aceite esencial de T. minuta L.
Variable Dependiente: Crecimiento de Morganella morganii.
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Variables Definición Conceptual
Definición Operacional
Indicadores
Escala de medición
Independiente:
Aceite esencial de las hojas de T. minuta L. “huacatay” a
concentraciones diferentes.
Conjunto de moléculas con peso molecular bajo, sintetizadas por las plantas y obtenidas con arrastre de vapor
de agua.
Proceso de extracción del aceite
esencial de hojas de T. minuta L. y
cálculo de las concentraciones de
ensayo.
Concentraciones diferentes del aceite esencial de
T. minuta L.
“huacatay”
µL.mL-1
Dependiente:
Crecimiento de M. morganii en el medio agar Müller-
Hinton
Se refiere a división celular llevado a un aumento exponencial del número de
células iniciales de una población y por lo tanto el
aumento de la biomasa microbiana.
Siembra y asilamiento de
Morganella morganii.
Halo de inhibición de crecimiento en
la placa de siembra.
mm.
2.10. Consideraciones éticas y de rigor
Este proyecto denominado “Efecto de la concentración del aceite esencial de Tagetes minuta L.
sobre el crecimiento de Morganella morganii, in vitro”, muestra total convicción como aporte a la solución de problemas de salud y ambiente, ya que la utilización de productos naturales, como el aceite esencial en estudio, como una alternativa a los antibióticos, coadyuva en tratamientos comprobados y validados de organismos resistentes; las buenas prácticas aplicadas en cada uno de los procedimientos usados en la ejecución de la presente de tesis ya que están enmarcados dentro de la valoración del ambiente, del respeto y del aspecto ético.
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III. RESULTADOS
En la evaluación, el efecto del aceite esencial de Tagetes minuta L. sobre el crecimiento de Morganella morganii a las concentraciones de 5, 10, 15 y 20 µL/mL, se observaron halos de la inhibición de crecimiento con la medida directamente proporcional a cada concentración empleada (Imagen 1).
Los resultados de la CMI y la CMB fueron de 0.49 y 0.98 µL/mL respectivamente, demostrando así su efecto inhibitorio y bactericida a mínimas concentraciones. (Imagen 2 y 3)
La prueba estadística T student y pruebas de Normalidad demostraron que se acepta la hipótesis alternativa, la cual evidencia tener eficacia el aceite esencial de T. minuta a concentraciones de 5, 10, 15 y 20 µL/mL sobre el crecimiento de M. morganii, con un nivel de significancia con el valor de P = 0.000.
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Tabla 1. Promedio de diámetro (mm) de los halos de inhibición del crecimiento de Morganella morganii
a las diferentes concentraciones del aceite esencial de Tagetes minuta L.
Concentración del aceite esencial de T. minuta L.
(µL/mL)
Promedio del diámetro de los halos de inhibición del crecimiento de M. morganii
(mm)
5 8.7
10 14.8
15 16.4
20 18.1
Fuente: Cuaderno de registro de datos.
Tabla 2. Evaluación del efecto del aceite esencial de Tagetes minuta L. a la concentración de 5 y 10 µL/mL sobre el crecimiento de Morganella morganii en milímetros, in vitro.
Evaluación 1
Concentración del aceite esencial
5 10
Pre test Post test
Ensayo 1 8.75 14,81
Ensayo 2 8.73 14,80
Ensayo 3 8.72 14,81
Media (promedio) 8.7 14.8
Desviación estándar 0.02 0.01
Fuente: Cuaderno de registro de datos.
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Tabla 3. Evaluación del efecto del aceite esencial de Tagetes minuta L. a la concentración de 10 y 15 µL/mL sobre el crecimiento de Morganella morganii en milímetros, in vitro.
Evaluación 2
Concentración del aceite esencial
10 15
Pre test Post test
Ensayo 1 14,81 16.40
Ensayo 2 14,80 16.39
Ensayo 3 14,81 16.41
Media 14.8 16.4
Desviación estándar 0.01 0.01
Fuente: Cuaderno de registro de datos.
Tabla 4. Evaluación del efecto del aceite esencial de Tagetes minuta L. a la concentración 15 y 20 µL/mL sobre el crecimiento de Morganella morganii en milímetros, in vitro.
Evaluación 3
Concentración del aceite esencial
15 20
Pre test Post test
Ensayo 1 16.40 18,10
Ensayo 2 16.39 18,09
Ensayo 3 16.41 18,10
Media 16.4 18.1
Desviación estándar 0.01 0.01
Fuente: Cuaderno de registro de datos.
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Tabla 5. Medidas estadísticas de las concentraciones del aceite esencial de Tagetes minuta L. sobre el crecimiento de Morganella morganii, in vitro.
Evaluación
Pre test Post test
Concentración del AE 5 10
1
Media 8.7 14.8
Desviación estándar 0.02 0.01
Coeficiente de variación 0.2% 0.1%
2
Concentración del AE 10 15
Media 14.8 16.4
Desviación estándar 0.01 0.01
Coeficiente de variación 0.1% 0.1%
3
Concentración del AE 15 20
Media 16.4 18.1
Desviación estándar 0.01 0.01
Coeficiente de variación 0.1% 0.1%
Fuente: Cuaderno de registro de datos.
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Tabla 6. Análisis estadísticos con respecto a la concentración 5 y 10 µL/mL del aceite esencial de Tagetes minuta L. sobre el crecimiento de Morganella morganii, in vitro.
Variable Prueba T-student “tc” T–tabular “tt” Significancia “p”
Concentración del AE de Tagetes minuta L.
Pre test
Post test
688.65 ±4.30 0.000
Fuente: Base de datos.
Región Crítica de la prueba de hipótesis
Fuente: Elaboración propia.
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Tabla 7. Análisis estadísticos con respecto a la concentración 10 y 15 µL/mL del aceite esencial de Tagetes minuta L. sobre el crecimiento de Morganella morganii, in vitro.
Variable Prueba T-student “tc” T–tabular “tt” Significancia “p”
Concentración del AE de Tagetes minuta L.
Pre test
Post test
478.00 ±4.30 0.000
Fuente: Base de datos.
Región Crítica de la prueba de hipótesis
Fuente: Elaboración propia.
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Tabla 8. Análisis estadísticos con respecto a la concentración 15 y 20 µL/mL del aceite esencial de Tagetes minuta L. sobre el crecimiento de Morganella morganii, in vitro.
Variable Prueba T-student “tc” T–tabular “tt” Significancia “p”
Concentración del AE de Tagetes minuta L.
Pre test
Post test
527.00 ±4.30 0.000
Fuente: Base de datos.
Región Crítica de la prueba de hipótesis
Fuente: Elaboración propia.
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IV. ANALISIS Y DISCUSIÓN
En la presente investigación, se determinó el efecto in vitro, a diferentes concentraciones del AE de Tagetes minuta L. la inhibición del crecimiento de Morganella morganii. En este estudio se demostró la actividad antibacteriana, al incrementar la concentración del AE de T. minuta L.
mayor fue la medida del halo de inhibición de crecimiento de M. morganii, esto puede atribuirse a su composición de monoterpenos.
El efecto antimicrobiano de los aceites esenciales puede deberse a su capacidad para penetrar la membrana bacteriana y así alterar sus propiedades funcionales, a través de la interacción con los orgánulos que componen el citoplasma de la célula y las bacterias; y la interferencia con el metabolismo celular. (Argote Vega et al., 2017)
La interacción de los componentes del aceite esencial con las membranas celulares microbianas permite inhibir el crecimiento de algunas bacterias Gram positivas L. monocytogenes, B. cereus y S. aureus que son más sensibles a los aceites esenciales.(Igwaran et al., 2017)
En la tabla 1, observamos los resultados promedio en milímetros, de la evaluación del efecto de concentraciones a 5, 10, 15 y 20 µL/mL del aceite esencial de T. minuta L., denotados en formación de halos de inhibición del crecimiento de M. morganii, in vitro. Estos datos fueron almacenados en hojas de Excel para su análisis estadístico.
La composición fitoquímica presente en las hojas posee actividad antimicrobiana a través de diferentes mecanismos de acuerdo al tipo de metabolito usado, reportándose estudios relacionados con actividad antibacteriana contra Gram negativas. (Khan et al., 2021)
Otros compuestos biológicamente activos que poseen las especie de Tagetes, son las fuentes de Tiofenos, este componente inhibe factores de virulencia, formación del tubo germinativo,
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adherencia a las superficies epiteliales de Candida, dermatofitos e inhibición del crecimiento de bacterias Gram positivas y negativas.(Giacone et al., 2020b)
Existen diversidad de factores los cuales influyen en la composición de fitoquímicos en las plantas, como la forma de recolectar las plantas, la estación y el clima, el estado de madurez fisiológica de la planta, ya que es ideal para obtener una mayor concentración del aceite esencial en las hojas. En las publicaciones nacionales, se aplicaron extractos hidroalcohólicos y aceites esenciales de T. minuta, sobre bacterias, hongos, nematodos; obteniendo resultados favorables como antimicrobianos, pese a ello hubo diferencia en los resultados de acuerdo a la procedencia del material recolectado para la obtención del AE, ya que se diferencia en la cantidad de los componentes fitoquímicos. (Segovia et al., 2010)
Según la tabla 2, observamos los resultados de estadística, donde encontramos que la concentración 5 µL/mL su valor promedio del pre-test fue de 8.7 mm y luego al aplicar una concentración de 10 µL/mL en el post-test hubo un incremento llegando a un valor el valor promedio de 14.8 mm, esto demuestra que hay un efecto significativo de la concentración del AE de Tagetes minuta L. para el crecimiento de Morganella morganii, in vitro.
Según la tabla 3, observamos los resultados de estadística, donde encontramos que la concentración 10 µL/mL su valor promedio del pre-test fue de 14.8 mm y luego al aplicar una concentración de 15 µL/mL en el post-test hubo un incremento llegando a un valor el valor promedio de 16.4 mm, esto demuestra que hay un efecto significativo de la concentración del AE de Tagetes minuta L. para el crecimiento de Morganella morganii, in vitro.
Según la tabla 4, observamos los resultados de estadística, donde encontramos que la concentración 15 µL/mL su valor promedio del pre-test fue de 16.4 mm y luego al aplicar una concentración de 20 µL/mL en el post-test hubo un incremento llegando a un valor el valor
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promedio de 18.1 mm, esto demuestra que hay un efecto significativo de la concentración del AE de Tagetes minuta L. para el crecimiento de Morganella morganii, in vitro.
Según resultados de la Evaluación 1, en el pre-test se halló una media de 8.7 puntos, posterior a la aplicación de concentración del aceite, en el post-test mejoró significativamente llegando a 14.8; mientras que el coeficiente de variación conseguido en el pre-test fue de 0.2% y en el post- test disminuyo a 0.1%, manteniendo una variación porcentual homogénea.
En cuanto en la Evaluación 2, en el pre-test se halló una media de 14.8, posterior a la aplicación de concentración del aceite, en el post-test mejoró significativamente llegando a 16.4; mientras que el coeficiente de variación conseguido en el pre-test fue de 0.1% y en el post-test 0.1 manteniendo su variación porcentual.
Finalmente, en la Evaluación 3, en el pre-test se halló una media de 16.4, posterior a la aplicación de concentración del aceite, en el post-test mejoró significativamente llegando a 18.1;
mientras que el coeficiente de variación conseguido en el pre-test fue de 0.1% y en el post-test 0.1 manteniendo de igual forma en su variación porcentual.
De acuerdo a los análisis inferenciales de la tabla 6, que se basa sobre la comparación de las concentraciones 5 y 10 µL/mL del AE de Tagetes minuta L., se halló un valor de t de student de 688.65 mostrando ser mayor a ±4.30, razón por la cual rechazamos la hipótesis nula y se aceptamos la hipótesis alternativa, respaldando con un nivel de significancia de p = 0.000 (p <
0.05), evidenciando tener una eficacia de concentración del AE de Tagetes minuta L. sobre el crecimiento de Morganella morganii, in vitro.
De acuerdo a los análisis inferenciales de la tabla 7, que se basa sobre la comparación de las concentraciones 10 y 15 µL/mL del AE de Tagetes minuta L., se halló un valor de t de student de 478.00 mostrando ser mayor a ±4.30, razón por la cual rechazamos la hipótesis nula y se aceptamos la hipótesis alternativa, respaldando con un nivel de significancia de p = 0.000 (p <
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0.05), evidenciando tener una eficacia de concentración del AE de Tagetes minuta L. sobre el crecimiento de Morganella morganii, in vitro.
De acuerdo a los análisis inferenciales de la tabla 8, que se basa sobre la comparación de las concentraciones 15 y 20 µL/mL del AE de Tagetes minuta L., se halló un valor de t de student de 527.00 mostrando ser mayor a ±4.30, razón por la cual rechazamos la hipótesis nula y se aceptamos la hipótesis alternativa, respaldando con un nivel de significancia de p = 0.000 (p <
0.05), evidenciando tener una eficacia de concentración del AE de Tagetes minuta L. sobre el crecimiento de Morganella morganii, in vitro.
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V. CONCLUSIÓN
La evaluación en la formación de halo de inhibición, así como la CMI y la CMB, demuestran su alta capacidad antibacteriana, con propiedades bactericidas y bacteriostáticas en bajas concentraciones del aceite esencial de Tagetes minuta L, con la visión futura de llegar a competir con los fármacos sintéticos y semisintéticos usados en la actualidad.
Los resultados obtenidos demuestran estadísticamente la eficacia del aceite esencial de las hojas de Tagetes minuta L. sobre el crecimiento de Morganella morganii. La información de los resultados de la investigación aporta conocimiento sobre la actividad antibacteriana del aceite esencial de las hojas de Tagetes minuta L. para posteriores estudios realizados a mayor escala y con grupos mayores de estudio.
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VI. RECOMENDACIONES
La presente investigación pretende ampliar el conocimiento científico sobre las plantas con propiedades medicinales y antibacterianas, las cuales pueden referenciarse como coadyuvantes de prevención, control y tratamiento de enfermedades como infecciones en la piel, en el tracto urinario y otras.
De este modo se podrá elaborar nuevos fármacos con efectos secundarios mínimos, los cuales contengan compuestos químicos en su composición, propios de esta planta.
Se recomienda continuar con la investigación del aceite esencial de Tagetes minuta L. a una mayor escala, para tener mejores alternativas de tratamiento en el control de microorganismos, a un menor costo.
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VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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VIII. ANEXOS
Imagen 1. Medida en milímetros de los halos de inhibición de crecimiento. T: 0 mm (Testigo: Solución de Tween al 0.1%), C1: 8.7 mm (concentración de AE de 5 µL/mL), C2:
14.8 mm (concentración de AE de 10 µL/mL), C3:16.4 mm (concentración de AE de 15 µL/mL), C4: 18.1 (concentración de AE de 20µL/mL).
C1
C2
C3 C4
T
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Imagen 2. Evaluación de CMI con diluciones al medio (Tubo del 1 -10). Controles A: Caldo Müller-Hinton en crecimiento con M. morganii, B: Caldo Müller-Hinton sin siembra, C: Caldo Müller-Hinton con solución de Tween 80 al 0.1%. CMI: Tubo N° 7 (0.49 µL/mL).
Imagen 3. Evaluación de CMB. Siembra del tubo N° 6 y 7. CMB: Tubo N° 6 (0.98 µL/mL).
Tubo N° 6 Tubo N° 7
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Imagen 4. Preparación de las concentraciones al 5, 10, 15 y 20 µL/mL del aceite esencial de T. minuta L.
con solución de Tween 80 al 0.1%.
Imagen 5. Inoculación de las concentraciones del aceite esencial de Tagetes minuta L. en los pocillos realizados en Agar Müller-Hinton.
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Imagen 6. Obtención del aceite esencial de Tagetes minuta L. separado por inmiscibilidad entre el aceite y el hidrolato.
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Imagen 7. Equipo de destilación por arrastre de vapor de agua.
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Imagen 8. Identificación de la especie vegetal Tagetes minuta L. en el Herbarium Truxillense (HUT).
Código: 63326.
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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO DECLARACIÓN JURADA
Los AUTORES suscritos en el presente documento DECLARAMOS BAJO JURAMENTO que somos los responsables legales de la calidad y originalidad del contenido del Proyecto de Investigación Científica, así como, del Informe de la Investigación Científica realizado.
TITULO: “Efecto de la concentración del aceite esencial de Tagetes minuta L. sobre el crecimiento de Morganella morganii, in vitro”
PROYECTO DE INVESTIGACIÓN CIENTIFICA INFORME FINAL DE INVESTIGACIÓN CIENTIFICA PROY DE TRABAJO DE INVESTIGACIÓN ( )
(PREGRADO) TRABAJO DE INVESTIGACIÓN (PREGRADO) ( ) PROYECTO DE TESIS PREGRADO ( ) TESIS PREGRADO ( X ) PROYECTO DE TESIS MAESTRIA ( ) TESIS MAESTRÍA ( ) PROYECTO DE TESIS DOCTORADO ( ) TESIS DOCTORADO ( ) Equipo Investigador Integrado por:
N° APELLIDOS Y NOMBRES FACULTAD DEP. ACADÉMICO
CONDICIÓN DOCENTE (NOMBRADO, CONTRATADO, EMÉRITO, ALUMNO,
OTROS)
Código Docente Número Matricula del
estudiante
Autor Coautor
asesor
1 Hilario Rodriguez, Oscar Javier CC.BB. Microbiología y
Parasitología Egresado 1511900313 Autor 2 Mendoza Mendoza, Gabriela
Soraida CC.BB. Microbiología y
Parasitología Egresado 1051901211 Autor 3 Rodriguez Haro, Icela Marissa CC.BB. Microbiología y
Parasitología
Docente
Principal D.E. 4008 Asesor
Trujillo 30 de junio de 2022
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Trujillo 30 de junio de 2022
Los autores suscritos del INFORME FINAL DE INVESTIGACIÓN CIENTÍFICA
Titulado: “Efecto de la concentración del aceite esencial de Tagetes minuta L. sobre el crecimiento de Morganella morganii, in vitro”
AUTORIZAMOS SU PUBLICACION EN EL REPOSITORIO DIGITAL INSTITUCIONAL, REPOSITORIO RENATI-SUNEDU, ALICIA - CONCYTEC, CON EL SIGUIENTE TIPO DE ACCESO:
A. Acceso Abierto:
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ESTUDIASTES DE PREGRADO: TRABAJO DE INVESTIGACIÓN TESIS
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El equipo investigador Integrado por:
N° APELLIDOS Y NOMBRES FACULTAD
CONDICIÓN (NOMBRADO, CONTRATADO, EMÉRITO, estudiante,
OTROS)
CÓDIGO Docente Número Matricula
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Autor Coautor
asesor
1 Hilario Rodriguez, Oscar Javier CC.BB. Egresado 1511900313 Autor
2 Mendoza Mendoza, Gabriela Soraida CC.BB. Egresado 1051901211 Autor
3 Rodriguez Haro, Icela Marissa CC.BB. Docente Principal D.E. 4008 Asesor
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