Efecto del aceite esencial de Rosmarinus officinalis “romero” sobre el crecimiento in vitro de Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Salmonella enteritidis

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(1)AC I. Ó. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. M UN. Facultad de Ciencias Biológicas. IC. UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. Escuela Académico Profesional de Microbiología y Parasitología. EM AS. DE. IN. Efecto del aceite esencial de Rosmarinus officinalis “romero” sobre el crecimiento in vitro de Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Salmonella enteritidis.. BIÓLOGO-MICROBIÓLOGO. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST. TESIS PARA OBTENER EL TÍTULO PROFESIONAL DE. AUTORA: Br. Milagros Violeta Guevara Carranza ASESORA: Ms. C. María Nelly Vásquez Valles. Trujillo, Perú 2013. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(2) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO QUE OTORGAN EL TÍTULO PROFESIONAL DE. M UN. IC. RECTOR DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. AC I. Ó. N. BIÓLOGO- MICROBIÓLOGO. RM. ÁT. IC. Dra. Vilma Méndez Gil. A. Y. VICERRECTORA ACADÉMICO. CO. Dr. Orlando Velásquez Benitez. FO. SECRETARIO GENERAL DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. DE. IN. Dr. Pedro Lavalle Dios. EM AS. DECANO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. SI. ST. Dr. Hermes Escalante Añorga. Dr. Cesar Jara Campos. CC. IO. N. DE. SECRETARIO DE LA FACULTAD DE CIENCIAS BIOLÓGICAS. DI. RE. DIRECTOR DE LA ESCUELA ACADÉMICO PROFESIONAL DE MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA Ms. C. Pedro Arnaldo Alvarado Salinas. ii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(3) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Ms. C. Pedro Arnaldo Alvarado Salinas. IC. IN. FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. PRESIDENTE. M UN. …………………………………………………………………. AC I. Ó. N. MIEMBROS DEL JURADO. EM AS. DE. ………………………………………………………………… Ms. C. Aníbal Quintana Díaz. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST. SECRETARIO. …………………………………………………………………. Ms. C. María Nelly Vásquez Valles VOCAL. iii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(4) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Ó. N. DE LA ASESORA. Y. CO. M UN. IC. AC I. El que suscribe, en calidad de profesora asesor de la presente tesis, declara que ésta ha sido ejecutada de acuerdo al reglamento establecido por la Facultad de Ciencias Biológicas estando en conformidad con su correspondiente proyecto y con las debidas orientaciones brindadas al tesista. En cuanto al informe, este ha sido revisado y acoge las observaciones y sugerencias correspondientes.. EM AS. DE. IN. FO. RM. ÁT. IC. A. Por tanto, autorizo a la Br. Milagros Violeta Guevara Carranza, continuar con el trámite de reglamento correspondiente.. Ms. C. María Nelly Vásquez Valles. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST. Asesora. iv Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(5) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. APROBACIÓN. IC. A. Y. CO. M UN. IC. AC I. Ó. N. Los profesores que suscriben, miembros del jurado examinador, declaran que el presente informe de tesis ha cumplido con los requisitos formales y fundamentales, siendo aprobado por UNANIMIDAD.. RM. ÁT. …………………………………………………………………. EM AS. DE. IN. FO. Ms. C. Pedro Arnaldo Alvarado Salinas PRESIDENTE. Ms. C. Aníbal Quintana Díaz SECRETARIO. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST. …………………………………………………………………. …………………………………………………………………. Ms. C. María Nelly Vásquez Valles VOCAL v. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(6) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AC I. Ó. N. DEDICATORIAS. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. Con todo mi ser a Dios todo poderoso, por estar siempre a mi lado, por haberme dado la vida ,cuidado, guiado y por permitirme el haber llegado hasta esta etapa de mi formación profesional.. SI. ST. EM AS. DE. IN. FO. A la memoria de mi abuelita paterna por haberme criado y amado hasta el último día de su existir. Gracias por seguir velando por mí aun desde el cielo, los momentos que pasamos juntas nunca los olvidaré.. DI. RE. CC. IO. N. DE. A mis amados padres Celso y Beny, por ser el motivo de mi existir, por su amor y apoyo incondicional durante todo el trayecto de mi vida.. vi Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(7) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Ó. N. AGRADECIMIENTOS. M UN. IC. AC I. A la Ms.C. María Nelly Vásquez Valles quién me depositó su confianza y me brindó su tiempo, experiencia y acertado asesoramiento en la realización de la presente investigación.. IC. A. Y. CO. Al Ms.C. Pedro Alvarado Salinas, profesor responsable del Laboratorio de Microbiología y Tecnología de Alimentos, del Departamento Académico de Microbiología y Parasitología de la Universidad Nacional de Trujillo, por haberme facilitado el uso de equipos, instrumentos y reactivos disponibles en la ejecución de esta tesis.. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST. EM AS. DE. IN. FO. RM. ÁT. Al Dr. Wilson Reyes Lázaro, por haberme asesorado en la extracción del aceite esencial usado en el desarrollo de la investigación.. vii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(8) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Ó. N. PRESENTACIÓN. AC I. Señores miembros del jurado dictaminador:. Trujillo, Mayo del 2013. IO. N. DE. SI. ST. EM AS. DE. IN. FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. Dando cumplimiento a lo dispuesto en el reglamento de grados y títulos de la facultad de Ciencias Biológicas de la Universidad Nacional de Trujillo, me es honroso presentar y someter a vuestra consideración y elevado criterio el presente informe de tesis titulado “Efecto del aceite esencial de Rosmarinus officinalis “romero” sobre el crecimiento in vitro de Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Salmonella enteritidis.”, con el cual pretendo obtener el título de Biólogo Microbiólogo.. DI. RE. CC. Milagros Violeta Guevara Carranza. viii Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(9) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CONTENIDO. Ó. N. AUTORIDADES DE LA UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO. IC. AC I. QUE OTORGAN EL TÍTULO PROFESIONAL ..................................................... ii. M UN. MIEMBROS DEL JURADO .................................................................................... iii. CO. DE LA ASESORA .................................................................................................... iv. Y. APROBACIÓN ......................................................................................................... v. IC. A. DEDICATORIAS...................................................................................................... vi. RM. ÁT. AGRADECIMIENTOS............................................................................................. vii. FO. PRESENTACIÓN ..................................................................................................... viii. IN. CONTENIDO............................................................................................................ ix. DE. RESUMEN................................................................................................................ xi. EM AS. INTRODUCCIÓN..................................................................................................... 1. ST. MATERIAL Y MÉTODOS ...................................................................................... 7 7 7. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. 1. Material Biológico ........................................................................................... 2. Procedimientos................................................................................................. 2.1 Protocolo para la obtención del aceite esencial de Rosmarinus officinalis ................................................................................................ 2.1.1 Recolección y transporte de Rosmarinus officinalis ................... 2.1.2 Identifación taxonómica................................................................ 2.1.3 Extracción del aceite esencial ....................................................... 2.2 Reactivación de los cultivos ................................................................... 2.3 Preparación del inoculó .......................................................................... 2.4 Preparación del medio de cultivo............................................................. 7 7 8 8 9 9 9. ix Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(10) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. N. 9 9 10 10 11. Ó. Inoculación del medio de cultivo............................................................ Preparación de las diferentes concentraciones de aceite esencial........... Determinación del efecto antimicrobiano............................................... Lectura de los resultados......................................................................... Análisis estadístico .................................................................................. AC I. 2.5 2.6 2.7 2.8 2.9. M UN. IC. RESULTADOS ......................................................................................................... 12 DISCUSIÓN.............................................................................................................. 17. CO. CONCLUSIONES..................................................................................................... 22. IC. A. Y. RECOMENDACIONES ........................................................................................... 23. ÁT. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 24. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST. EM AS. DE. IN. FO. RM. ANEXOS ................................................................................................................... 29. x Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(11) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESUMEN. DE. SI. ST. EM AS. DE. IN. FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. AC I. Ó. N. La presente investigación tuvo como objetivo evaluar el efecto del aceite esencial de Rosmarinus officinalis “romero” sobre el crecimiento in vitro de Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Salmonella enteritidis mediante un diseño experimental de estimulo creciente. Se utilizó el método de destilación por arrastre con vapor de agua para la obtención del aceite esencial. Los cultivos bacterianos que se utilizaron fueron Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Salmonella enteritidis proporcionados por el Laboratorio Referencial de Trujillo, Departamento de La Libertad. La evaluación de la actividad antimicrobiana se determinó por el método de difusión en agar utilizando concentraciones al 10%, 50% y 100% del aceite esencial de romero, más el alcohol etílico absoluto como solvente. La lectura de los resultados se realizó a las 24 horas, se midió el radio de inhibición (mm) de cada concentración para cada bacteria, obteniéndose un promedio de los halos de inhibición del crecimiento bacteriano en cada ensayo. Para los análisis de datos, se empleó la prueba de ANOVA para evaluar si existe diferencia significativa entre las concentraciones del aceite esencial que tienen efecto inhibitorio sobre el crecimiento de Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Salmonella enteritidis. Además para evaluar que concentración es la que inhibe mejor el crecimiento de Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Salmonella enteritidis se utilizó la prueba Duncan. Los resultados demostraron que todas las concentraciones del aceite esencial de Rosmarinus officinalis “romero”, tienen efecto inhibitorio sobre el crecimiento in vitro de Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Salmonella enteritidis, siendo la concentración de 100% la que tiene mayor efecto inhibitorio.. DI. RE. CC. IO. N. Palabra clave: Aceite esencial, Rosmarinus officinalis, Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Salmonella enteritidis.. xi. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(12) DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST. EM AS. DE. IN. FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. AC I. Ó. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(13) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. I.. INTRODUCCIÓN. M UN. IC. AC I. Ó. N. Las tendencias actuales de los consumidores indican su preferencia por alimentos de fácil preparación, de calidad, seguros, y naturales, que estén poco procesados pero a la vez tengan una mayor vida útil 1. En nuestro ámbito, la inocuidad y calidad de los alimentos deben potenciarse ya que las enfermedades de origen alimentario han aumentado considerablemente en todo el mundo durante los últimos 10 años2.. FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. Las enfermedades transmitidas por alimentos (ETA) son producidas por la ingestión de alimentos o agua contaminados con agentes químicos o microbiológicos 3. En particular han aumentado las enfermedades de origen microbiológico 2, siendo uno de los problemas con mayor impacto en el mundo 4. Estas enfermedades típicamente son causadas por microorganismos y/o sus toxinas presentes en los alimentos y la mayoría se manifiestan como cuadros gastrointestinales, que varían en gravedad y duración 5, 6.. ST. EM AS. DE. IN. Los alimentos asociados a las ETA son muy variados; sus características intrínsecas resultan determinantes para el desarrollo y proliferación de bacterias. Los de alto contenido proteico, como la carne, el pescado, los huevos, la leche y derivados, son considerados de alto riesgo 7.. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. Las bacterias responsables de intoxicaciones alimentarias pueden hallarse presentes tanto en los alimentos crudos como en los cocidos 8, 9, 10, debido a la deficiencia en el proceso de elaboración, manipulación, conservación, transporte, distribución o comercialización 3, 11, y se multiplican haciendo que un alimento sea peligroso para la salud. No todas las bacterias que deterioran los alimentos causan intoxicaciones alimentarias. Tampoco las bacterias productoras de intoxicaciones alimentarias causan siempre alteraciones visibles en los alimentos, aun cuando se hallen presentes en cantidades enormes. Tampoco el simple aspecto de un alimento puede darnos alguna seguridad acerca de su peligrosidad o inocuidad10.. 1 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(14) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. M UN. IC. AC I. Ó. N. Algunos de los microorganismos que se han asociados a las ETA son Staphylococcus aureus, que resulta la especie más frecuentemente relacionada a productos de repostería, así como alimentos de origen animal, en tanto que Salmonella sp. y E. Coli aparecen a continuación, y vinculados a cárnicos de varias especies; la presencia de estos microorganismos en alimentos vinculados a ETA resulta algo perfectamente explicable: primero, por la naturaleza de los alimentos, en su mayoría de origen animal; segundo, debido a la influencia de errores de manipulación y conservación de dichos alimentos 12.. EM AS. DE. IN. FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. S. aureus es una bacteria en forma de coco, Gram- positiva, no esporulado, la presentación característica son sus agrupaciones irregulares semejantes a racimos de uvas. Es una bacteria aerobia o anaerobia facultativa, inmóvil, mesófila, necesita de aminoácidos y vitaminas para su crecimiento, es capaz de fermentar la glucosa y también el manitol, toleran condiciones ambientales muy variables: puede tolerar concentraciones salinas entre 10 y 20% y de azúcar entre 50 y 60%; también soporta los nitritos, cualidad que le permite crecer en productos conservados por esta vía. Además es resistente a la desecación, congelación y calor 13. Cuando S. aureus se encuentra presente en los alimentos en concentraciones elevadas (105 -106 UFC/g) y en condiciones adecuadas de temperatura, pH, actividad de agua y oxigeno producen una o mas enterotoxinas en los alimentos, que al ingerirse causan intoxicación alimentaria 11,14.. CC. IO. N. DE. SI. ST. Las enterotoxinas estafilocócicas son proteínas termoestables de bajo peso molecular, hidrosolubles y resistentes a la acción de enzimas digestivas permaneciendo activas después de la ingestión. Aunque se trata de una especie fermentativa y proteolítica, por lo general no da lugar a olores ni alteraciones visibles del producto, por lo que su presencia, o la de sus toxinas, no pueden ser detectadas por métodos sensoriales 12.. DI. RE. Salmonella sp.es un representante de la familia Enterobacteriaceae; el cual está integrado por gérmenes de forma bacilar, no esporulado, habitualmente móviles, gramnegativos, anaerobios facultativos, fermentan la glucosa con producción de gas, lactosa negativa, catalasa positiva, oxidasa negativa, reducen los nitratos a nitritos, su temperatura óptima de crecimiento es de 37 ºC y el pH 5-9. Hasta el momento existen más de 2200 2. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(15) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. tipos serológicamente diferentes y continuamente se añaden a la lista serotipos nuevos 15.. CO. M UN. IC. AC I. Ó. N. La salmonelosis en humanos es una de las enfermedades de transmisión alimentaria de gran importancia en salud pública; así, la gastroenteritis causada por Salmonella sp. en el hombre ha sido usualmente asociada con la ingestión de alimentos, agua o fómites contaminados por las heces de un animal o personas infectadas y constituye una pandemia de distribución mundial 16, siendo las especies más comunes son S. enteritidis, S. typhi, S. typhymurium, S. paratyphi 17.. EM AS. DE. IN. FO. RM. ÁT. IC. A. Y. Escherichia coli es la especie tipo del género Escherichia. Incluye gérmenes generalmente móviles, que producen ácido y gas a partir de la glucosa, la arabinosa, y habitualmente de la lactosa y otros azúcares. Producen reacción positiva de rojo de metilo, y negativa de Vogues-Proskauer. Son inhibidos por KCN e incapaces de crecer en medio con citrato como única fuente de carbono y energía, pero sí en caldo acetato. Son H2S, ureasa y fenilalanina negativos, pero en general son indol positivos y decarboxilan la lisina. Se clasifican en más de 170 serogrupos O según las características antigénicas de su LPS, y en serotipos por la combinación de antígenos O y H flagelares. Otros antígenos presentes en distintas cepas (capsulares, fimbriales y otros) han sido empleados para su clasificación o identificación 18.. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST. Por lo anterior, la presencia de estos microorganismos en los alimentos conduce a buscar alternativas de inhibición y eliminación con una mayor posibilidad de aplicación como pueden ser sustancias naturales. Actualmente, debido a la demanda por parte del consumidor de productos frescos mínimamente tratados, está aumentando el interés por los antimicrobianos de origen natural que puedan extraerse para ser utilizados con el fin de prolongar la vida útil y la seguridad para el consumidor 4.. DI. Los antimicrobianos continúan estando entre los aditivos alimentarios más importantes y su uso como conservantes es una práctica común en la industria de los alimentos, por muchos años se han utilizado antimicrobianos sintetizados químicamente, redundando en un rechazo por parte de los consumidores de productos procesados. El uso 3. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(16) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CO. M UN. IC. AC I. Ó. N. de aditivos alimentarios de origen natural implica el aislamiento, purificación, estabilización e incorporación de dichos compuestos a los alimentos con fines antimicrobianos, sin que ello afecte negativamente a las características sensoriales, nutritivas y a su garantía sanitaria. Muchas hierbas y “especias” contienen aceites esenciales que son antimicrobianos: se menciona que cerca de 80 productos de origen vegetal contiene alto niveles de antimicrobianos con uso potencial en alimentos por ejemplo: clavo, ajo, cebolla, salvia, romero, cilantro, perejil, orégano, mostaza y vainilla entre otros 1.. SI. ST. EM AS. DE. IN. FO. RM. ÁT. IC. A. Y. Los aceites esenciales son líquidos a temperatura ambiente, volátiles, normalmente incoloros, liposolubles, solubles en los solventes orgánicos y pueden almacenarse en distintos órganos vegetales; flores, hojas, brotes, frutos, cortezas, raíces, rizomas y semillas 19, 20 . Son mezclas complejas y muy variables de constituyentes que pertenecen al grupo de los terpenos (monoterpenos, sesquiterpenos), compuestos alifáticos de bajo peso molecular (ácidos, alcoholes, aldehídos, cetonas, ésteres) y, compuestos aromáticos derivados del fenilpropano, en menor frecuencia 1. Debido a la mezcla de componentes presentes en los aceites esenciales, son considerados de bajo riesgo en el desarrollo de resistencia en patógenos, ya que cada uno de los componentes tiene su propia contribución a la actividad biológica, y es difícil correlacionar la acción de un único compuesto o clases de compuestos, debido que los efectos antimicrobianos, antimicóticos y el potencial fungitóxico son el resultado del actuar sinérgico de los constituyentes 19,21.. DI. RE. CC. IO. N. DE. La especie vegetal Rosmarinus officinalis perteneciente a la familia Lamiaceae, y conocida popularmente como romero, es una especie originaria de la región mediterránea, rica fuente de metabolitos activos; esta planta es muy usada en la medicina tradicional por sus efectos digestivos, antiespasmódicos y carminativos. El aceite esencial obtenido de sus hojas es considerado como un antimicrobiano natural que puede ser utilizado en la producción de nuevos agentes con actividad antimicrobiana para la industria farmacéutica y alimentaría 22. Esta actividad antimicrobiana se debe a la presencia de ciertos metabolitos tales como 1,8 cineol, alcanflor y alfa pinedo, los cuales han sido reportados como componentes mayoritarios del aceite esencial del romero 23, 24, 25. 4. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(17) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. AC I. Ó. N. Se han realizado estudios in vitro con extractos y aceite esencial de R. officinalis en los que se ha evaluado su actividad contra bacterias Gram positivas y Gram negativas. Castaño et al., 2010 22evaluaron su actividad contra bacterias Gram positivas (Bacillus cereus, Staphylococcus aureus y Listeria monocytogenes) y Gram negativas (Salmonella typhimurium, Shigella sonnei, Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa), encontrando que las hojas de R. officinalis contienen compuestos con clara actividad antimicrobiana sobre los microorganismos de importancia en contaminaciones alimentarias, con un mayor espectro de acción el aceite esencial , que el extracto etanólico de la hoja. En el estudio de Agustín et al., 2003 26 encontraron que los extractos de R. officinalis presentan una importante actividad antibacteriana contra Salmonella sp. , Staphylococcus aureus y Listeria monocytogenes, debido probablemente a la presencia de ácido cafeico, ácido rosmerico, carnosol , ácido carnosólico, flavonoides y otros compuestos polifenólicos que se vinculan con laguna actividad antimicrobiana.. IO. N. DE. SI. ST. EM AS. DE. IN. Teniendo en cuenta que la contaminación microbiológica en los alimentos es actualmente un riesgo para la salud debido a la resistencia de algunos microorganismos a los conservantes sintéticos utilizados en la industria alimentaria, los cuales son considerados como responsables de ser cancerígenos y teratogénicos por su toxicidad residual, se ha generado la necesidad de buscar nuevas alternativas de conservación que cubran las mismas propiedades antimicrobianas y compatibilidad con el alimento. Por esta causa, ha aumentando la tendencia al uso de conservantes naturales, que han llegado a constituir una alternativa promisoria como fuente de sustancias con actividad antimicrobiana 26.. DI. RE. CC. Por lo descrito anteriormente, se llevó la presente investigación y tuvo como objetivo evaluar el efecto del aceite esencial de Rosmarinus officinalis “romero” sobre el crecimiento in vitro de Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Salmonella enteritidis, contribuyendo de ese modo a sus posibles usos como conservante natural de alimentos destinados al consumo humano y se pueda garantizar la calidad microbiológica en los alimentos. 5. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(18) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Ó. N. OBJETIVO GENERAL. CO. M UN. IC. AC I. Demostrar el efecto del aceite esencial de Rosmarinus officinalis “romero” sobre el crecimiento in vitro de Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Salmonella enteritidis.. ÁT. IC. A. Y. OBJETIVOS ESPECÍFICOS. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST. EM AS. DE. IN. FO. RM. Evaluar el efecto del aceite esencial de Rosmarinus officinalis “romero”a concentraciones de 10%, 50 % y 100% sobre el crecimiento in vitro de Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Salmonella enteritidis.. 6 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(19) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. MATERIAL Y MÉTODOS. N. II.. AC I. Ó. 1. Material Biológico. CO. M UN. IC. Hojas de la planta de Rosmarinus officinalis “romero” de ocho a diez meses de edad, recolectado en el caserío de San Isidro, Provincia de Otuzco, Departamento de La Libertad.. RM. ÁT. IC. A. Y. Cultivos de Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Salmonella enteritidis proporcionados por el Laboratorio Referencial de Trujillo, Departamento de La Libertad.. FO. 2. Procedimientos. EM AS. DE. IN. 2.1 Protocolo para la obtención del aceite esencial de Rosmarinus officinalis “romero” (Anexo 1).. ST. 2.1.1 Recolección y transporte de Rosmarinus officinalis “romero”. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. a) Recolección Se recolectaron plantas frescas completas de Rosmarinus officinalis “romero” provenientes de un cultivar del caserío de San Isidro, Provincia de Otuzco, Departamento de La Libertad. En total se recolectó aproximadamente 2Kg de materia prima.. b) Transporte Las muestras adquiridas fueron envueltas en papel kraft para su conservación durante el transporte hasta su posterior procesamiento. Se recolectaron tres muestras completas de la planta Rosmarinus officinalis “romero” para su identificación. 7. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(20) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.1.2 Identifación taxonómica. M UN. IC. AC I. Ó. N. Las muestras completas de la planta R. officinalis fueron llevadas a las instalaciones del herbario botánico de la Universidad Nacional de Trujillo para su identificación taxonómica.. CO. 2.1.3 Extracción del aceite esencial. A. Y. a) Tratamiento. DE. IN. FO. RM. ÁT. IC. Las plantas de R. officinalis se transportaron a las instalaciones del laboratorio físico químico de investigación N°4 de Ingeniería Química de la Universidad Nacional de Trujillo para ser lavadas y luego secadas en una estufa a 55°C durante 48. Posteriormente a su secado se separó manualmente solo las hojas.. EM AS. b) Método el método por arrastre con vapor. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST. La cantidad total de hojas de la materia prima que entró en el balón destilador fue de 500g.; previa instalación del conducto refrigerante, haciendo circular el agua a través del mismo. Luego se llevo a calentamiento hasta el desprendimiento de un líquido inmiscible conteniendo vapor de agua condensada y el aceite esencial, siendo recolectados en el bulbo de destilación, para posteriormente decantar el aceite esencial. El aceite esencial se recolectó en frascos ámbares estériles y se procedió a eliminar todo rastro de agua con pastillas de cloruro de calcio (0.05g.). El aceite esencial fue conservado en refrigeración hasta su utilización. 8. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(21) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.2 Reactivación de los cultivos. M UN. IC. AC I. Ó. N. Se sembraron los cultivos de E. coli, S. aureus y S. enteritidis en frascos con Agar Nutritivo (Anexo 2) inclinado, los cuales se incubaron a 37°C durante 24 horas.. CO. 2.3 Preparación del inoculó. RM. ÁT. IC. A. Y. A partir de cada cultivo de E. coli, S. aureus y S. enteritidis en Agar Nutritivo (Anexo 2), se preparó una suspensión en solución Salina Fisiológica Estéril (SSFE) a una turbidéz semejante al tubo Nº 1 de la escala de Mac Farland (3 x 108 UFC/mL).. IN. FO. 2.4 Preparación del medio de cultivo. EM AS. DE. Se utilizó como medio de cultivo el agar Mueller-Hinton deshidratado, el cual se preparó de acuerdo a las indicaciones del fabricante (Merck) 27(Anexo 3).. ST. 2.5 Inoculación del medio de cultivo. RE. CC. IO. N. DE. SI. Con una pipeta estéril, a partir de cada suspensión bacteriana, se vertió 0.1mL de inoculó a placas con agar Mueller-Hinton, luego con un asa de Digralsky se extendió el inóculo homogéneamente por toda la superficie del medio de cultivo. Posteriormente las placas sembradas se secaron en la estufa a 37ºC durante 15 minutos.. DI. 2.6 Preparación de las diferentes concentraciones de aceite esencial Se prepararon concentraciones de 10%, 50% y 100% con el aceite esencial de romero, más el alcohol etílico absoluto como solvente: 10 µl, 50 µl y 9. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(22) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 100µl de aceite esencial y 90 µl, 50 µl y 0 µl de etanol absoluto, respectivamente.. AC I. Ó. N. 2.7 Determinación del efecto antimicrobiano. EM AS. DE. IN. FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. De forma aséptica y con la ayuda de una pinza estéril, se colocó sobre la superficie de las placas sembradas los discos estériles de papel Whatman N°2 de 6 mm de diámetro. Los discos fueron embebidos con 0.1mL de cada concentración de aceite esencial y para cada control negativo se colocó 0.1 mL de agua destilada estéril. La disposición de los discos fue de 3cm de distancia entre sí para evitar la sobre posición de los halos de inhibición. Se dejó en reposo las placas por una hora a temperatura ambiente para permitir la difusión del aceite esencial. Posteriormente las placas fueron adecuadamente rotuladas e incubadas a 37ºC durante 24 horas. Pasado el tiempo de incubación y utilizando una regla se midió los halos de inhibición (mm) del crecimiento de cada bacteria en estudio.. ST. 2.8 Lectura de los resultados. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. Pasada las 24 horas después de la siembra se procedió a tomar medida de los halos de inhibición del crecimiento en mm radiales de E. coli, S. aureus y S. enteritidis en cada concentración, con lo cual se obtuvo un radio promedio para cada ensayo. Los resultados de los halos de inhibición del crecimiento de Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Salmonella enteritidis fueron reportados en mm radiales.. 10 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(23) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 2.9 Análisis estadístico. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST. EM AS. DE. IN. FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. AC I. Ó. N. Para el análisis de datos, se aplicó Análisis de Varianza ANOVA para la comparación entre los promedios de los halos de inhibición del crecimiento, obtenidos en cada concentración del aceite esencial de Rosmarinus officinalis. Posteriormente se aplicó la prueba de Duncan para encontrar la mejor concentración que inhibe mejor el crecimiento de E. coli, S. aureus y S. enteritidis.. 11 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(24) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. RESULTADOS. Ó. N. III.. Y. CO. M UN. IC. AC I. En la Fig.01 se presentan los resultados de los diámetros promedios de los halos de inhibición del crecimiento de E. coli a concentraciones de 100%, 50% y 10% del aceite esencial de R. officinalis. Observándose que el mayor efecto inhibitorio lo tiene la concentración de 100% que presenta un halo de inhibición de 11mm. También se observa que existe diferencia significativa entre las concentraciones estudiadas y que es mayor el efecto inhibitorio a mayor concentración del aceite esencial de Rosmarinus officinalis. DE. IN. FO. RM. ÁT. IC. A. En el Anexo 5. se presentan los diámetros promedios de los halos de inhibición, durante los seis ensayos, para las concentraciones de 100%, 50% y 10% del aceite esencial de R. officinalis frente a E. coli. Se observa que el efecto inhibitorio disminuye conforme va disminuyendo la concentración del aceite esencial de R. officinalis, siendo la concentración de 100% la que presenta mayor efecto inhibitorio sobre el crecimiento de Escherichia coli.. DE. SI. ST. EM AS. En la Fig.02 se presentan los resultados de los diámetros promedios de los halos de inhibición del crecimiento de S. aureus a concentraciones de 100%, 50% y 10% del aceite esencial de R. officinalis. Observándose que el mayor efecto inhibitorio lo tiene la concentración de 100% que presenta un halo de inhibición de 13mm. También se observa que existe diferencia significativa entre las concentraciones estudiadas y que es mayor el efecto inhibitorio a mayor concentración del aceite esencial de Rosmarinus officinalis. DI. RE. CC. IO. N. En el Anexo 6. se presentan los diámetros promedios de los halos de inhibición, durante los seis ensayos, para las concentraciones de 100%, 50% y 10% del aceite esencial de R. officinalis frente a S. aureus. Se observa que el efecto inhibitorio disminuye conforme va disminuyendo la concentración del aceite esencial de R. officinalis, siendo la concentración de 100% la que presenta mayor efecto inhibitorio sobre el crecimiento de Staphylococcus aureus.. 12 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(25) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IC. AC I. Ó. N. En la Fig.03 se presentan los resultados de los diámetros promedios de los halos de inhibición del crecimiento de S. enteritidis a concentraciones de 100%, 50% y 10% del aceite esencial de R. officinalis. Observándose que el mayor efecto inhibitorio lo tiene la concentración de 100% que presenta un halo de inhibición de 15mm. También se observa que existe diferencia significativa entre las concentraciones estudiadas y que es mayor el efecto inhibitorio a mayor concentración del aceite esencial de Rosmarinus officinalis. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST. EM AS. DE. IN. FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. En el Anexo 7. se presentan los diámetros promedios de los halos de inhibición, durante los seis ensayos, para las concentraciones de 100%, 50% y 10% del aceite esencial de R. officinalis frente a S. enteritidis. Se observa que el efecto inhibitorio disminuye conforme va disminuyendo la concentración del aceite esencial de Rosmarinus officinalis, siendo la concentración de 100% la que presenta mayor efecto inhibitorio sobre el crecimiento de Salmonella enteritidis.. 13 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(26) IC M UN CO. 12. Y. 11. IC. 8. a. a. DE. IN. 4. RM. a. 6. ÁT. 7. FO. 8. A. 10. 2 0. 0 50%. 10%. Control. ST. 100%. EM AS. H a lo d e in h ib ición d el c reciem ien to e n m m d e E sc herichia coli. AC I. Ó. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IO. N. DE. SI. Concentración del aceite esencial de Rosmarinus officinalis (%). DI. RE. CC. Fig.01. Promedios del halo de inhibición del crecimiento de E.coli a las concentraciones de 100%, 50% y 10% del aceite esencial de R. officinalis. a:p< 0.05: Existe diferencia significativa. 14 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(27) 13. CO. H a lo d e in h ib ición d el c reciem ien to e n m m d e S ta phylococcus a ureus. 14. M UN. IC. AC I. Ó. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Y. 12. a. IC RM. 8. 8. FO. a. DE. IN. 6. a. EM AS. 4. DE. SI. ST. 2. 0. A. 10. ÁT. 10. 100%. 0. 50%. 10%. Control. CC. IO. N. Concentraciones del aceite esencial de Rosmarinus officinalis (%). DI. RE. Fig. 02. Promedios del halo de inhibición del crecimiento de S. aureus a las concentraciones de 100%, 50%,10% del aceite esencial de R. officinalis. a:p< 0.05: Existe diferencia significativa. 15 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(28) IC M UN. 16. 15. a. A. Y. 12. IC. 12. CO. 14. FO. RM. a. 8. IN. 6. a. DE. 4. 10. ÁT. 10. EM AS. 2 0. ST. H a lo d e in h ib ición d el c reciem ien to e n m m d e S a lm onella e nteritidis. AC I. Ó. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. 50%. 10%. Control. SI. 100%. 0. IO. N. DE. Concentraciónes del aceite esencial deRosmarinus officinalis (%). DI. RE. CC. Fig.03. Promedios del halo de inhibición del crecimiento de S. enteritidis a las concentraciones de 100%, 50%,10% del aceite esencial de R. officinalis. a: p< 0.05: Existe diferencia significativa. 16 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(29) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. N. DISCUSIÓN. AC I. Ó. IV.. CO. M UN. IC. Los resultados muestran que el aceite esencial de Rosmarinus officinalis “romero” tiene efecto sobre el crecimiento de E. coli (Fig. 01), S. aureus (Fig. 02), y S. enteritidis (Fig. 03) a 10%, 50 % y 100%, inhibiendo más el crecimiento a mayor concentración del aceite esencial (Anexo 4).. DE. IN. FO. RM. ÁT. IC. A. Y. Las especies de Rosmarinus perteneciente a la familia Lamiaceae, y conocida como “romero”, es una planta muy usada en la medicina tradicional y el aceite esencial obtenido de sus hojas es considerado como un antimicrobiano natural que puede ser utilizado en la producción de nuevos agentes con actividad antimicrobiana para la industria farmacéutica y alimentaria22.. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST. EM AS. En la Fig. 01 se presentan los diámetros promedio de los halos de inhibición del crecimiento de E. coli a las concentraciones de 100%, 50% y 10%del aceite esencial de R. officinalis, observándose que existe un mayor efecto inhibitorio a la concentración de 100% y va disminuyendo dicho efecto conforme disminuye la concentración de aceite esencial. En el Anexo 5 se presentan los seis ensayos de las concentraciones al 100%, 50% y 10% del aceite esencial de R. officinalis, observándose que el mayor halo de inhibición del crecimiento de Escherichia coli es de 12 mm a la concentración de 100% y el menor halo de inhibición es de 7 mm a la concentración de 10% a las 24 horas de incubación. Se observó, a través del análisis estadístico ANOVA, que para E.coli, existe una diferencia altamente significativa entre las concentraciones del aceite esencial de Rosmarinus officinalis (Anexo 8), es decir , que el 17. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(30) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AC I. Ó. N. efecto de las concentraciones es diferente; y mediante la prueba de Duncan se obtuvo que la concentración al 100% del aceite esencial de R. officinalis es la más eficiente respecto a las concentraciones de 50% y 10% (Anexo 9), ya que tiene mayor efecto inhibitorio sobre el crecimiento de E. coli.. ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. Los resultados obtenidos coinciden con los estudios realizados por Moreira et al., 200528, quienes demostraron la actividad antimicrobiana del aceite esencial de hojas de R. officinalis contra varias cepas de E. coli, y encontraron halos de inhibición entre 18 y 21 mm en difusión por agar. En otro estudio realizado por Bozinet al., 2007 29 se demostró que el aceite esencial de R. officinalis presenta una importante actividad antibacteriana contra cepas de E. coli además de poseer una notable actividad antifúngica.. N. DE. SI. ST. EM AS. DE. IN. FO. RM. En la Fig.02 se presentan los diámetros promedio de los halos de inhibición del crecimiento de S. aureus a las concentraciones de 100%, 50% y 10%del aceite esencial de R. officinalis, observándose que existe un mayor efecto inhibitorio a la concentración de 100% y va disminuyendo dicho efecto conforme disminuye la concentración de aceite esencial. En el Anexo 6 se presentan los seis ensayos de las concentraciones al 100%, 50% y 10% del aceite esencial de R. officinalis, observándose que el mayor halo de inhibición del crecimiento de Staphylococcus aureus es de 13 mm a la concentración de 100% y el menor halo de inhibición es de 8 mm a la concentración de 10% a las 24 horas de incubación.. DI. RE. CC. IO. Se observó, a través del análisis estadístico ANOVA, que para de S. aureus, existe una diferencia altamente significativa entre las concentraciones del aceite esencial de Rosmarinus officinalis (Anexo 10), es decir , que el efecto de las concentraciones es diferente; y mediante la prueba de Duncan se obtuvo que la concentración al 100% del aceite esencial de R. officinalis es la más eficiente respecto a las concentraciones de 50% y 10% (Anexo 11), ya que tiene mayor efecto inhibitorio sobre el 18. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(31) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Ó. N. crecimiento de S. aureus. Los resultados obtenidos coinciden con los estudios realizados por Bozinet al., 200729, los cuales determinaron un halo de inhibición del aceite esencial de R. officinalis sobre S. aureus de 17 mm.. FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. AC I. En la Fig. 03se presentan los diámetros promedio de los halos de inhibición del crecimiento de S. enteritidis a las concentraciones de 100%, 50% y 10%del aceite esencial de R. officinalis, observándose que existe un mayor efecto inhibitorio a la concentración de 100% y va disminuyendo dicho efecto conforme disminuye la concentración de aceite esencial. En el Anexo 7 se presentan los seis ensayos de las concentraciones al 100%, 50% y 10% del aceite esencial de R. officinalis, observándose que el mayor halo de inhibición del crecimiento de Salmonella enteritidis es de 15 mm a la concentración de 100% y el menor halo de inhibición es de 10 mm a la concentración de 10% a las 24 horas de incubación.. N. DE. SI. ST. EM AS. DE. IN. Se observó, a través del análisis estadístico ANOVA, que para de S. enteritidis, existe una diferencia altamente significativa entre las concentraciones del aceite esencial de Rosmarinus officinalis (Anexo 12), es decir , que el efecto de las concentraciones es diferente; y mediante la prueba de Duncan se obtuvo que la concentración al 100% del aceite esencial de R. officinalis es la más eficiente respecto a las concentraciones de 50% y 10% (Anexo 13), ya que tiene mayor efecto inhibitorio sobre el crecimiento de S. enteritidis.. DI. RE. CC. IO. Los resultados obtenidos coinciden con estudios realizados por Castaño et al., 201022, quienes encontraron una apreciable actividad antibacteriana del aceite esencial de R. officinalis contra cepas de S. typhimurium, S. enteritidis y S. sonnei, con halos de inhibición entre 19,8 y 25 mm.. 19 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(32) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. IN. FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. IC. AC I. Ó. N. Según los resultados obtenidos en comparación con los hallazgos de los estudios anteriormente citados en cada tratamiento, si bien coinciden con el mismo efecto inhibitorio, la eficacia del aceite esencial Rosmarinus officinalis resultó ser menor en este estudio, esto se debió posiblemente a la variación en su composición19 del aceite esencial de Rosmarinus officinalis utilizado en esta investigación como también puede ser por el método utilizado para evaluar la actividad antimicrobiana, el cual no fue el mejor, pues se ha reportado que el método de difusión en agar es inadecuado para aceites esenciales, debido a que sus componentes volátiles se pueden evaporar con el solvente durante el tiempo de incubación, mientras que sus componentes menos solubles no se difunden bien en el agar. No obstante, es la técnica más común para evaluar actividad antibacteriana de un aceite esencial porque es más fácil de llevarla a cabo y requiere solo pequeñas cantidades del aceite esencial 4.. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST. EM AS. DE. Los resultados presentados en las Fig. 01, Fig. 02 y Fig. 03 también muestran que el aceite esencial de R. officinalis a concentraciones de 100%, 50% y 10% tiene un mayor efecto inhibitorio sobre S. enteritidis y menor efecto inhibitorio sobre S. aureus y E. coli, siendo la concentración de 100% la que tiene mejor efecto sobre las tres bacterias en estudio. Los resultados obtenidos coinciden con los estudios realizados por Castaño et al., 2010 22 quienes encontraron que la actividad del aceite esencial es mayor contra las bacterias Gram negativas que contra las Gram positivas. Rau et al., 2006 30 , reportaron la actividad antimicrobiana y citotoxicidad del α-pineno, 1,8 cineol, canfeno, β-mirceno, alcanfor y borneol, contenidos en el aceite esencial de Rosmarinus officinalis y demostraron un efecto moderado con el grupo de las Gram positivas y Gram negativas. Estudios realizados por Montes de Oca 201025, demostraron que los componentes principales del aceite esencial de Rosmarinus officinalis son: 20. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(33) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. A. Y. CO. M UN. IC. AC I. Ó. N. alcanfor, 1,8-cineol, α-pineno y otros monoterpenos como borneol, βpineno, limoneno y p-cimeno. De manera paralela Dehkardiet al., 2009 31, estudiaron e identificaron al α- pineno en una proporción de 14.06 %, alcanfor 1,8-cineol 13.62%; verbenona 11.2%; borneol 7.3%; 3–octanona 7.02%; canfeno 5.46% y linalol 5.07% en el aceite esencial y concluyeron que la acción inhibitoria del romero es eficaz. Considerando la gran variedad de compuestos químicos presentes en los esenciales, es muy probable que su actividad antimicrobiana no se atribuya a un mecanismo específico, sino a la acción combinada de varios de ellos sobre distintas localizaciones de la célula bacteriana32.. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST. EM AS. DE. IN. FO. RM. ÁT. IC. Según Maguna et al., 2006 33, las bacterias gram negativas resultan ser más sensibles a los terpenoides presentes en el aceite esencial de Rosmarinus officinalis; esto se puede fundamentar por el hecho de que uno de los principales mecanismos de acción propuestos para los terpenoides consiste en la disrupción de la membrana celular bacteriana mediante tres posibles vías: aumentando la permeabilidad de la membrana a iones pequeños, afectando la estabilidad estructural de la membrana y desestabilizando el empaquetamiento de la bicapa lipídica, cualquiera de estos tres efectos produce la muerte en la célula bacteriana. Entonces podríamos considerar que el hecho de que las bacterias gram-negativas presenten mayor sensibilidad, entre otras cosas, puede deberse a su pared celular menos compleja dado que tiene una capa simple (red de mureína delgada), mientras que en las gram-positivas es una estructura de multicapa (red de mureína muy desarrollada y llega a tener hasta 40capas. El conocimiento generado con la realización de la presente investigación se propone utilizar el aceite esencial de Rosmarinus officinalis “romero” como conservante natural debido a su capacidad de inhibir el crecimiento microbiano con el fin de preservar los alimentos y al mismo tiempo permitan sustituir los aditivos químicos. 21. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(34) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CONCLUSIONES. Ó. N. V.. M UN. IC. AC I. 1. El aceite esencial de Rosmarinus officinalis tiene efecto inhibitorio sobre el crecimiento in vitro de Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Salmonella enteritidis.. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST. EM AS. DE. IN. FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. 2. A mayor concentración del aceite esencial de Rosmarinus officinalis “romero” es menor el crecimiento in vitro de Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Salmonella enteritidis.. 22 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(35) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. VI.. RECOMENDACIONES. IC. AC I. Ó. N. Se recomienda utilizar otros medios de extracción para evaluar el efecto del aceite esencial de Rosmarinus officinalis sobre el crecimiento in vitro de Escherichia coli, Staphylococcus aureus y Salmonella enteritidis.. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST. EM AS. DE. IN. FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. M UN. Hacer la determinación de la composición fitoquímica del aceite esencial de Rosmarinus officinalis.. 23 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(36) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS. AC I. Ó. N. 1. Rodríguez E. Uso de agentes antimicrobianos naturales en la conservación de frutas y hortalizas. Ra Ximhai 2011; 7(1): 153-170.. CO. M UN. IC. 2. Ortega A, Ferris Tortajada J, Ortí A, López A, Cánovas J, Garcia J et al. Contaminantes medioambientales en la alimentación. Pediatría Integral 2002; (5): 69-76.. ÁT. IC. A. Y. 3. Zamudio L, Martinez J. Experiencias en la vigilancia epidemiológica de agentes patógenos transmitidos por alimentos a través de electroforesis en campo pulsado (PFGE) en el Perú. Perú Med Exp Salud Publica 2011; 28(1): 128-35.. DE. IN. FO. RM. 4. Rincón L. Estudio del efecto antimicrobiano del aceite de Minthostachys molis combinado con inactivación térmica, sobre cepas de Listeria monocytogenes y Bacillus cereus. Tesis. Pontificia Universidad Javeriana. Colombia; 2007.. EM AS. 5. Pigoott D. Enfermedades asociadas a los alimentos. Emerg Med Clin North Am 2008; (26): 475-97.. N. DE. SI. ST. 6. González V, Ruíz O, García E, Vega M. Aplicaciones de la biotecnología en seguridad alimentaria. Informe de un grupo de científicos de La Agencia Española de Seguridad Alimentaria (AESA).España; 2005.. RE. CC. IO. 7. Rosas R. Contaminaciones alimentarias: Cuadros principales, tratamiento y prevención. AMBITO FARMACÉTICO Nutrición. 2007; 26 (6): 95-100.. DI. 8. Burt S. Essential oils: their antibacterial properties and potencial applications in food- a review. International Journal of Food Microbiology 2004; (94): 223-253.. 24 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(37) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Ó. N. 9. Gutiérrez L, Acosta E. Determinación del potencial bactericida In vitro de un aislado nativo de Lactobacillus cassei frente E.coli. Lasallista de Investigación 2008; 5(2): 68-73.. M UN. IC. AC I. 10. Agrado LL. Alimentos seguros en el Distrito Metropolitano de Quito: Determinación de principales gérmenes en los alimentos consumidos en el D.M.Q. [Tesis doctoral]. Universidad San Francisco de Quito. Ecuador; 2006.. IC. A. Y. CO. 11. Zuta N. Aplicación de la reacción en cadena de polimerasa (PCR) para la detección de entertoxinas en Staphylococcus aureus aislados de alimentos en la cuidad de lima. Tesis. Universidad Nacional Mayor de San Marcos. Perú; 2009.. IN. FO. RM. ÁT. 12. Barreto G, Sedrés M, Rodríguez H, Guevara G. Agentes bacterianos asociados a brotes de Enfermedades Transmitidas por Alimentos (ETA) aislados de coprocultivos. REDVET 2010; 11(03): 1695-7504.. EM AS. DE. 13. Bustos J, Mu A, Gutiérrez M. Staphylococcus aureus: la reemergencia de un patógeno en la comunidad. Rev. Biomed. 2006; (17): 287-305. DE. SI. ST. 14. Ingrid LP, Pilar M. Determinación y aislamiento de Staphylococcus aureus y Clostridium perfringens enterotoxigénicos a partir de alimentos. Rev. Col. Cienc. Quim. Farm. 2004; 33(1): 59-60. CC. IO. N. 15. Gil-Setas A, Mazón A, Martín C, Urtiaga M, Inza E. Salmonelosis no tifoidea en un área de salud de Navarra-España. Rev. Esp. Salud Pública 2002; 76(1):49-56. DI. RE. 16. Uribe C, Suarez M. Salmonelosis no tifoidea y su transmisión a través de alimentos de origen aviar. ClombMed. 2006; (37): 151-158.. 25 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(38) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Ó. N. 17. Rodríguez D, Torres F, Gutierrez E, López M, Martínez M, Carrascal A. Determinación de Salmonella typhimurium en compost inoculado artificialmente empleado en un cultivo de lechuga. Acta biol. Colomb. 2008; 13(3): 61-74.. CO. M UN. IC. AC I. 18. Roldán M, Chinen L, Otero L, Miliwebsky E, Alfaro N, Bums p, Rivas M. Aislamiento, caracterización y subtipificación de cepas de Escherichia coli O157: H7 a partir de productos cárnicos y leche. Revista Argentina de Microbiología 2007; 39(2): 113-119.. RM. ÁT. IC. A. Y. 19. Borboa J, Rueda E, Acedo E, Cruz M, García J, Ortega M. Evaluación de la actividad antibacteriana in vitro de Aceites esenciales contra clavibacter michiganensis subespecie michiganensis. Tropical and Subtropical Agroecosystem 2010; 12(3): 539-547.. DE. IN. FO. 20. Rodríguez A. Efecto del aceite esencial de cinco especies nativas chilenas sobre el crecimiento de Botritis cinérea y Penicillium expansum. Tesis. Universidad de Concepción. Chile; 2010.. SI. ST. EM AS. 21. Alzamora L, Morales L, Armas L, Fernández G. Medicina Tradicional en el Perú: Actividad Antimicrobiana in vitro de los Aceites Esenciales Extraídos de Algunas Plantas Aromáticas. Copyright 2001; 62(2): 156-161.. CC. IO. N. DE. 22. Castaño H, Ciro G, Zapata J, Jiménez S. Actividad bactericida del extracto etanólico y del aceite esencial de hojas de Rosmarinus officinalis L. sobre algunas bacterias de interés alimentario. VITAE 2010; 17(2): 149-154.. DI. RE. 23. Romeu C, Botta E, Díaz Y. Caracterización titoquímica del aceite esencial de romero (Rosmarinus officinalis L.) y evaluación n vitro de su actividad acaricida. Fitosanidad 2007; 11(2): 75-78.. 26 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(39) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. AC I. Ó. N. 24. Vargas A y Bottia E. Estudio de la composición química de los aceites esenciales de seis especies vegetales cultivadas en los municipios de Bolivar y el PeñonSantander, Colombia. [Tesis]. Universidad Industrial de Santander. Colombia; 2008.. A. Y. CO. M UN. IC. 25. Montes de oca V. “Elaboración y control de calidad de comprimidos fitofarmacéuticos de ajenjo (Arthemisia absinthium L.), Romero (Rosmarinus officinalis L.) y manzanilla (Matricaria chamomilla L.) para combatir la menstruación dolorosa”. [Tesis]. Escuela Superior Politécnica de Chimborazo. Ecuador; 2010.. FO. RM. ÁT. IC. 26. Agustín R, García I, Totosaus A, Minor H. Actividad antimicrobiana de extractos de romero (Rosmarinus officinalis L.) y chile ancho (Capsicum annuum L. grossum sent). Journal of Food Science 2003; 68(6):2066-2071. Disponible. en. :. DE. IN. 27. Merck. Microbiology Manual 2002. http://service.merck.de/microbiology/start.html. ST. EM AS. 28. Moreira M, Ponce A, Del Valle C, Roura S. Inhibitory parameters of essential oils to reduce a foodborne pathogen. FoodSciTechnolInt. 2005;38 (5): 565-570.. IO. N. DE. SI. 29. Bozin B, Mimica-Dukic N, Samojlik I, Jovin E. Antimicrobial and antioxidant properties of rosemary and sage (Rosmarinus officinalis L. and Salvia officinalis L., Lamiaceae) essential oils. J Agr.Food Chem. 2007; 55 (19): 7879-7885.. DI. RE. CC. 30. Rau U, Wurglies M, Paulke J. Zitzkowsi D. Meid A. Dingerman. Carnosic acid and carnosol, phenolic diterpeno compounds of the labiale herbs rosemary and sage, are activators of the human peroxisome proliferator- activated receptor gamma. Plant Medicinale.2006; 72(10): 881- 885.. 27 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(40) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Ó. N. 31. Dehkardi S, Tajik M, Moradi M. Chemical composition and antibacterial effects of Rosmarinus officinalis L. essential oil with kysozyme on Listeria monocytogenes. Scientific and Research.2009; 4(1): 1-11.. M UN. IC. AC I. 32. Dan Z. Los aceites esenciales una alternativa a los antimicrobianos. Laboratorios Calier.2010: 1-6.. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST. EM AS. DE. IN. FO. RM. ÁT. IC. A. Y. CO. 33. Magua F, Romero A, Garro O, Okulik N. Actividad antimicrobiana de un grupo de terpenoides. Comunicaciones Científicas y Tecnológicas en internet. Facultad de Agroindustrias, UNNE. Argentina. 2006.. 28 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(41) Y. CO. M UN. IC. AC I. Ó. N. Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. DI. RE. CC. IO. N. DE. SI. ST. EM AS. DE. IN. FO. RM. ÁT. IC. A. Anexos. 29 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(42) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. CO. M UN. IC. AC I. Ó. N. Anexo 1: Obtención del aceite esencial de Rosmarinus officinalis “romero”. (b). DE. IN. FO. RM. ÁT. IC. A. Y. (a). (d). (e). (f). RE. CC. IO. N. DE. SI. ST. EM AS. (c). DI. (a): Recolección de plantas de Rosmarinus officinalis “romero”, (b): Plantas de romero acondicionadas en papel kraft para su Transporte, (c): Identificación como Rosmarinus officinalis “romero”, (d): Secado de las plantas de “romero “en estufa a 55°C por 48 horas, (e) Extracción del aceite esencial de R. officinalis por el método por arrastre con vapor, (f) Aceite esencial de R. officinalis conservado en un frasco de vidrio color ámbar. 30. Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(43) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Anexo 2: Medio de cultivo. Ó. N. Agar Nutritivo. M UN. IC. AC I. Fórmula (en gramos por litro). 3,15. CO. Peptona de caseína. 5,1. IC. A. Y. Cloruro de Sodio. 13. RM. ÁT. Agar -Agar. DE. IN. FO. pH final: 7,5±0,1 a 25°C. SI. DE. FUNDAMENTO:. ST. EM AS. Disolver 25g en 1 litro de agua destilada. Llevar a ebullición hasta disolver completamente. Esterilizar a 121°C a 1 atmosfera durante 15 minutos. Verter en placas estériles.. DI. RE. CC. IO. N. Medio solido para el cultivo y enriquecimiento de bacterias poco exigentes, para mantenimiento de cultivos en el tiempo y como base para la preparación de medios de cultivos especiales. La peptona actúa como fuente de nitrógeno para el crecimiento celular y la glucosa como fuente energética para el crecimiento celular y la glucosa como fuente energética para el metabolismo celular.. 31 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..

(44) Biblioteca Digital - Direccion de Sistemas de Informática y Comunicación - Universidad Nacional de Trujillo. Anexo 3: Medio de cultivo. AC I. Ó. N. Agar Mueller- Hinton. Caseína hidrolizada. 17.5. Almidón. M UN. 5.0. CO. Infusión de carne. Y. IC. Fórmula (en gramos por litro). IC. A. 1.5. 12.5. RM. ÁT. Agar- Agar. IN. FO. pH final: 7,4±0,2 a 25°C. SI. FUNDAMENTO:. ST. EM AS. DE. Disolver 36,5g en 1 litro de agua destilada. Llevar a ebullición hasta disolver completamente. Esterilizar a 121°C a 1 atmosfera durante 15 minutos. Verter en placas estériles.. DI. RE. CC. IO. N. DE. El Agar Mueller-Hinton se utiliza para la realización del ensayo de difusión en placa. La composición de este medio garantiza las condiciones favorables de crecimiento así como la ausencia de antagonistas.. 32 Esta obra ha sido publicada bajo la licencia Creative Commons Reconocimiento-No comercial-Compartir bajo la misma licencia 2.5 Perú. Para ver una copia de dicha licencia, visite http://creativecommons.org/licenses/by-ns-sa/2.5/pe/ . No olvide citar esta tesis..