PRIMER PARCIAL doc

I PARCIAL DE BACTERIOLOGIA

PRACTICO VALIDO PARA LA

EVALUACIÓN TRIMESTRAL

COLABORACION DE LA CATEDRA

DE BACTERIOLOGIA PRACTICA

PARA LOS ESTUDIANTES

SIN COSTO ALGUNO.

ESTE DOCUMENTO PUEDE SER

REPRODUCIDO SIN NINGUN

PROBLEMA LEGAL

“

DIGALE

NO

A LA CORRUPCIÓN Y

NO

A LA COMPRA DE FOLLETOS A

CAMBIO DE PUNTOS.”

Nota: Cada Presidente de grupo

acercarse a la secretaria para sacar

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UNIVERSIDAD DE GUAYAQUIL

FACULTAD DE CIENCIAS MÉDICAS

“GUIA PRACTICA DE BACTERIOLOGIA” AUTORES:

DR. MIGUEL VARGAS DRA. JOSEFINA RAMIREZ

DR. JUAN MORENO DRA. HILDA ROSADO

DR. ERNESTO RONQUILLO DRA. MARTHA GUEVARA( +)

DR. EDMUNDO BUÑAY DRA. JANETT RECALDE

DR. CARLOS MOSQUERA DR. JULIO ROMERO

DR. EDUARDO FLORENCIA DR. JULIO GUZMAN

DR. ROBERTO VILLACIS. DR. GONZALO ZAVALA

DR: EDUARDO CHANCAY LOPEZ

"COORDINADOR DE LA CATEDRA"

GUAYAQUIL NOVIEMBRE 1995

INTRODUCCION

Esta guía de trabajos prácticos de la Cátedra de Bacteriología de la Facultad de Ciencias Médicas de la Universidad Estatal de Guayaquil, nace como una alternativa didáctica científica, a la propuesta del Rectorado de la referida Universidad de realizar un trabajo monográfico para el ascenso de Profesores Auxiliares a Profesores Agregados, y la misma se propone los siguientes objetivos:

OBJETIVOS GENERALES:

1. - Aplicar los conocimientos teóricos-prácticos de la Asignatura.

2. - Ampliar los conocimientos actuales acerca de las Bacterias, y los variados métodos para su diagnóstico.

3. - Profundizar en las técnicas de Diagnóstico Bacteriológico.

4. - Describir algunos procedimientos fundamentales de la microscopía Bacteriana.

5. - Utilizar adecuadamente los métodos de aislamiento de los Cultivos Bacterianos.

6. - Demostrar técnicas específicas de tinción General y especial de las Bacterias.

7. - Usar los instrumentos adecuados en Bacteriología.

8. - Estudiar la estructura y función de las células bacterianas. 9. - Dar instrucciones específicas sobre Bioseguridad.

10. - Seleccionar Material adecuado como: Audiovisuales, Gráficos y variadas preguntas de evaluación.

11. - Describir técnicas actuales sobre Inmunología Bacteriana.

12. - Conocer e identificar los Diferentes Medios de Cultivos Utilizados en Bacteriología.

La referida guía contiene varios procedimientos y técnicas comunes. Además se ha incluido gráficos, dibujos y varias preguntas para evaluación formativa. Así mismo, al final de cada capítulo se ha incluido una pequeña bibliografía para el estudiante que desee obtener una información adicional sobre los principios y fenómenos descritos.

Pretendemos al mismo tiempo la ambición de aplicarlo a nuestra Facultad, aún en las crisis económica que incide en la adquisición de los recursos materiales que se necesitan para desarrollar nuestro trabajo.

Intentamos por lo tanto clarificar y difundir un nuevo enfoque paradigmático en los procesos de Enseñanza-Aprendizaje en forma sencilla, pero apoyados en el avance de la ciencia y la tecnología Educativa Superior.

Dr. Eduardo Chancay López COORDINADOR DE LA CATEDRA DE

AUTOR:DR EDUARDO CHANCAY L

BIOSEGURIDAD EN MICROBIOLOGIA

La Facultad de CC.MM. No tiene ningún estudio acerca de las

enfermedades ocasionadas por las prácticas que nuestros estudiantes y docentes realizan a diario en las diferentes cátedras en las que

utilizamos materiales de alto riesgo, sea éste: Químico, Físico, Biológico, Humano e infeccioso.

Es por esta razón que nuestra Cátedra incorporará desde la presente guía, éste capítulo de Bioseguridad en Microbiología, con el objetivo de: 1. - Conocer y Aplicar el concepto y los principios de BIOSEGURIDAD EN MICROBIOLOGIA.

2. - Dar una serie de normas para la manipulación correcta de agentes infecciosos, que los Profesores Auxiliares y estudiantes realizaremos durante todo el año lectivo.

DEFINICION.-

La Bioseguridad es la disciplina que se ocupa de la Prevención de Riesgo Biológico en personas, directa o indirectamente expuestos al mismo, producto de un trabajo de manipulación de agentes infecciosos. Las medidas de Bioseguridad recomendada para los que trabajan con gérmenes patógenos están encomendadas a la Seguridad General y a la Particular de nuestros estudiantes y docentes.

PRINCIPIOS DE LA

BIOSEGURIDAD.-La Bioseguridad consta de tres principios básicos, para garantizar el aislamiento o contención adecuada de los agentes infecciosos (Bacterias en nuestro caso). Las mismas son:

a.- Técnicas y Prácticas correctas en el laboratorio. b.- Equipos de Seguridad.

C.- Diseño adecuado de las instalaciones del Laboratorio.

a.- TECNICAS Y

PRACTICAS.-Es el elemento más importante para la Bioseguridad y tiene el mayor peso en la Prevención Eficiente del Riesgo Biológico y recoge los procedimientos básicos del trabajo prácticas de Higiene Personal y la conducta que deben observar los docentes y dicentes

b.- EQUIPOS DE

- Instrumento de pipeteo,

- Copas de seguridad para centrífugas, - Guantes

- Mandil

- Máscara respiratorias o faciales - etc.

c.- DISEÑO ADECUADO DE LAS

INSTALACIONES.-A las instalaciones se las denomina “Barreras Secundarias”, ya que garantiza la protección del personal que trabaja en el edificio y fuera del laboratorio así como de la comunidad, del posible escape accidental de agentes infecciosos del laboratorio de Microbiología.

NORMAS PARA LA BIOSEGURIDAD.

1. - Usar mandil largo adecuado durante las prácticas y quitárselo antes de abandonar el laboratorio.

2. - No sacar jamás equipos, medios de cultivos con Bacterias fuera del laboratorio.

3. - No pipetear con la boca.

4. - No comer, beber, fumar, guardar alimentos ni aplicar cosméticos en el laboratorio.

5. - Lavarse las manos después de manipular el material infeccioso así como antes de abandonar el laboratorio.

6. - Mantener el laboratorio limpio, aseado y desinfectado.

7. - Todos los procedimientos y técnicas se practicarán de manera que se evite en lo posible la formación de aerosoles.

8. - Todos los derramamientos, accidentes y exposiciones reales, potencialmente de material infeccioso se notificarán de inmediato al instructor - jefe.

9. - Cada práctica los materiales del vidrio contaminados deben ser colocados en recipientes adecuados.

AUTOR :DR GONZALO ZABALA VILLACIS

INSTRUMENTOS UTILIZADOS EN BACTERIOLOGIA

PRACTICA

OBJETIVOS ESPECIFICOS DE LA CLASE.

1. - Que el alumno al final de la clase sea capaz de seleccionar los instrumentos de acuerdo al examen bacteriológico a realizar.

2. - Que el alumno al final de la clase sea capaz de utilizar correctamente cada instrumento con la técnica apropiada.

3. - Que el alumno al final de la clase sea capaz de demostrar todos los materiales de vidrio que se utilizan en los diferentes exámenes.

4. - Diferenciar cada instrumento en las diferentes técnicas bacteriológicas.

MATERIALES Y METODOS:

Entre los principales instrumentos usados en Bacteriología lo podemos clasificar en: Materiales de vidrio, Instrumentos y Aparatos

Entre los APARATOS tenemos:

Autoclave, Horno, Estufa, Centrífuga, Microscopio Fluorescente, Microscopio Electrónico, Baño María, Contador de Colonias, Balanza, Peachímetro, Destilador de Agua.

Entre los INSTRUMENTOS tenemos:

Pinza portaláminas, Aguja de inoculación, Asa de inoculación, Bajalengua, Aplicadores de madera, Espátula, Pinzas, Gradillas, Canastillas, Cinta indicadora de esterilización.

MATERIALES DE VIDRIO. :

Pipetas, Tubos de ensayo, Caja de petri, Láminas porta objeto y Cubre objeto, Matraz Erlenmeyer de cuello estrecho y cuello ancho, Matraz fondo plano, Matraz aforado, Densímetro, Probeta, Termómetro, Cubeta para tinción, Vaso de Coplín, Vaso de precipitación, Agitador, Frascos goteros, Mecheros.

PIPETAS.-Es un utensilio de vidrio cilíndrico de gran utilidad que ofrecen un máximo nivel de exactitud y sirven para transferir de un recipiente a otro, cantidades específicas de líquido. Las pipetas son calibradas en 0.1, 0.2, 1, 2, 5, 10, 20 cc. etc.

Las pipetas graduadas a partir de 5ml. tienen una boca de aspiración

de algodón pueden prolongar el tiempo de vertido y por lo tanto influir en la exactitud de la medición.

¡El pipeteado a boca está prohibido! Debido al alto riesgo de infección. Resulta por lo tanto imprescindible utilizar un auxiliar de pipeteado, que son excelentes en forma y función. Él más sencillo y frecuente son las Peras de Goma que son de caucho natural y se adaptan bien a la mano.

PIPETAS

AUTOMATICAS.-Con el advenimiento de la precisión, exactitud y además con el objeto de romper la comunicación con la boca del operador se crearon estas pipetas que ya las tenemos en el mercado y que van de pequeñas cantidades hasta cantidades mayores, las tenemos de: 1, 5, 20, 25, 50, 100, 200, 250, 500, 1.000 ul.

TUBOS DE

ENSAYOS.-Los tubos de ensayo para cultivo son de vidrio. Hay con bordes rectos y con roscas resistentes a la esterilización por vapor (121 °C). Existen en diversas longitudes y diámetros. Los tubos con bordes rectos deben ser protegidos por un tapón estéril de algodón revestidos de gasa, cuando contienen en su

interior sustancias que se desean mantener estériles tales como solución salina, agua destilada, etc. o en su defecto medios de cultivo (sólidos, semisólidos, líquidos). El tapón que los protege permite el paso del aire necesario para el crecimiento de las Bacterias, pero impide el paso de las impurezas del medio ambiente, de tal forma que ejercen una función filtrante.

CAJAS DE

PETRI.-Las hay de vidrio y de polietileno. PETRI.-Las cajas de petri de vidrio borosilicato ó vidrio de soda. Elevada calidad de vidrio y de acabado. Fondo y tapa planos tanto en el interior como el exterior. Las cajas de petri sirven para envasar los medios de cultivo sólidos, sobre los cuales se efectúan siembras en estrías para permitir una mejor individualización de las colonias.

LAMINAS PORTA

OBJETO.-Son de vidrio óptico y sirven para realizar el frotis a observarse

microscópicamente, ya sean estas preparaciones fijados y teñidos o en frescos, deben ser con bordes pulidos y antes de su uso deben estar

completamente limpios, excepto de polvo y grasa. También hay porta objeto con cavidades, llamadas láminas excavadas.

LAMINILLAS CUBRE

OBJETO.-Se emplean para cubrir las preparaciones en fresco a ser observadas microscópicamente. Las laminillas tienen por finalidad evitar cualquier contaminación del manipulador, evitar que la preparación se mueva con la corriente de aire exterior y nos da también una mayor superficie de

MATRACES.-Los hay de cuello ancho y cuello estrecho de fondo plano y matraces aforados.

MATRACES

AFORADOS.-Los matraces aforados son recipientes de vidrio, ofrecen un máximo nivel de exactitud. Los matraces aforados se suministran con tapón de PP. , Parte superior cuadrado, con punta de goteo. Este tapón reduce notablemente el peligro de rotura en caso de vuelco y evita que el matraz aforado se caiga al rodar por la mesa del Laboratorio.

MATRAZ ERLENMEYER cuello

estrecho.-Son recipientes de vidrio con reborde y graduación

MATRAZ ERLENMEYER cuello

ancho.-Al igual que el anterior sino con la particularidad como su nombre lo indica es de cuello ancho. Ambos sirven para lectura del volumen aproximado y depositar medios de cultivo, fundir medios de cultivo en el autoclave.

DENSIMETROS.-Los densímetros son instrumentos de precisión imprescindible para

determinar la densidad de líquidos o la concentración de sustancias disueltas.

PROBETA.Son recipientes de vidrio graduados y rotulados con pico y pie hexagonal que ofrecen un máximo nivel de exactitud.

TERMOMETRO.-Es un instrumento de vidrio imprescindible para la medición de la temperatura en el laboratorio.

La alta duración de éstos instrumentos de calidad se obtienen de su característica de construcción “de una sola pieza”.

CUBETA PARA TINCION, VASO DE

COPLIN.-Recipientes de vidrio sirven para mantener en posición vertical u horizontal las láminas porta objetos, ya sea para someterlos a la acción tintorial de los colorantes ó también para eliminar el aceite de inmersión del frotis teñidos después de haber sido observados.

VASO DE

PRECIPITACION.-Son recipientes de vidrio de forma baja y de forma alta con graduaciones, reborde y pico sirven para mezclar y preparar soluciones.

AGITADOR DE

VIDRIO.-Los agitadores de vidrio son varillas que vienen con bordes redondeados que sirven para agitar y mezclar las soluciones usadas en el laboratorio y en las preparaciones de los medios de cultivos.

FRASCOS

contenido gota a gota para lo cual debe hacerse coincidir la ranura que existe tanto en la tapa del frasco como la que existe en el cuello del mismo.

MECHEROS.-Existen de alcohol y de gas; éstos últimos producen una llama mas firme y potente. Los mecheros en general alrededor de la llama dan una área dentro de la cual el material con el que se trabaja está libre de toda contaminación con las Bacterias del medio ambiente. La llama del mechero sirve también para fijar el frotis a ser teñidos y esterilizar el asa de alambre como la aguja del alambre antes y después de ser usadas, representando éstos una

aplicación directa del calor seco (incineración). Debe recordarse que el máximo poder de la llama se encuentra en la punta de la misma.

INSTRUMENTOS

PINZAS.-Las hay con extremos en puntas, redondeados y con extremos cuadrangulares de extraordinaria resistencia química y térmica, muy manejables.

En Bacteriología las utilizamos para los antibiogramas con los discos de sensibilidad y en las tinciones de frotis; Que hay unas pinzas llamadas

portaláminas que sirven para sujetar las láminas porta objeto en el momento que efectuamos la tinción de frotis

ASA DE INOCULACION.

-El asa de inoculación consiste de un alambre cuyo extremo distal termina en un aro de diámetro variable, dicho alambre está unido por su extremo

proximal a un mango metálico. Tienen innumerables usos pero en general sirven para tomar el material con el que vamos a trabajar, ya sea éste una colonia a ser estudiada, gotas de diferentes sustancias líquidas o especímenes tales como heces, sedimento urinario, etc.

AGUJA DE INOCULACION.

Instrumento igual al anterior con la salvedad, de que el alambre en vez de terminar el aro termina en punta. Sirve para efectuar inoculaciones en la profundidad de los medios de cultivo o también cuando queremos

individualizar colonia rodeada estrechamente de otras no deseables.

Actualmente existen asas y agujas descartables de material de polietileno, la elevada flexibilidad del material permite una siembra suave sin dañar la superficie del medio de cultivo, además no es necesario flamear y enfriar tras cada proceso de trabajo. Por lo tanto ya no existe formación de aerosoles.

BAJALENGUAS.-Sirven para deprimir la lengua y facilitar la toma de una muestra de exudado faríngeo. Los hay de madera y metálicos, rectos y ligeramente curvos con extremos redondeados.

APLICADORES DE MADERA

ESTERILES.-Sirven para efectuar hisopados faríngeos, vaginales, rectales, ópticos y desde cualquier lesión productiva o supurativa

ESPATULAS.-Sirven para coger sustancias y pesarlas, terminan en extremo redondeado o en un extremo en forma de cuchara.

CINTA INDICADORA DE

ESTERILIZACION.-Papel crepado, con colorantes sensibles al calor para esterilización al vapor.

APARATOS

AUTOCLAVE

.-Es un aparato que consiste de un caldero cilíndrico de paredes resistentes, cerrado superiormente por una tapa que cierra herméticamente gracias a la interposición de un empaque apropiado y a la presión ejercida por una serie de tornillos que la apretan.

En el interior del cilindro existe un soporte sobre el cual se coloca una cesta metálica conteniendo el material a esterilizar; entre el fondo de la cesta y el caldero queda un espacio que se llena de agua.

De modo general se puede considerar que el vapor saturado bajo presión de 15 libras por pulgada cuadrada con una temperatura de 120 °C, es suficiente para esterilizar cualquier medio o instrumento de 15 a 30 minutos.

HORNO O

ESTERILIZADOR.-Es un aparato que está constituido por un recipiente que puede ser rectangular o cuadrado de paredes dobles, revestido exteriormente de amianto y calentado por quemadores que pueden ser eléctricos, gas, gasolina, Kérex, etc.

En el interior del horno existen repisas móviles y en la parte superior orificios o chimeneas de ventilación y un orificio donde se coloca el termómetro

graduado hasta 200 °C.

Generalmente se requiere para lograr la esterilización someter los materiales a una temperatura de 180 °C por una o dos horas.

En los laboratorios se utiliza el horno para esterilizar el material de vidrio tales como pipetas, fiolas, cajas de petri, etc.

COLONIAS.-Es un aparato eléctrico que registra la cantidad de colonias que se encuentra en una muestra de cultivo de orina.

MICROPLATOS.-Son planos de polivinil, que se las utiliza especialmente en pruebas

serológicas: se usan en Pruebas de Fijación del Complemento, Inhibición de Hemoglutinacón, etc. estas placas están constituidas por 96 hoyos divididos en filas 8 x12.

BALANZAS

BALANZA ABIERTA DE DOS

PLATILLOS.-Esta balanza cuenta con dos platillos que reposan en sendas columnas. Puede estar constituida para usarse con pesos separados, o tener un astil graduado en que se coloca una pesa corrediza.

Se emplea para pesar cantidades grandes. Su sensibilidad es 0.5gr. (500mg).

BALANZA

ANALITICA.-Esta balanza consta de dos platillos suspendidos de una astil dentro de un estuche de vidrio.

Se emplea para pesar cantidades pequeñas, cuando se requiere gran precisión. Su sensibilidad es de 0.5mg - 0.1mg.

PEACHIMETRO.-Es un aparato eléctrico que sirve para medir el pH de las soluciones, medios de cultivo, etc.

ESTUFA O

INCUBADORA.-Es un aparato metálico y eléctrico suministra la temperatura ideal para el desarrollo de las Bacterias (generalmente de 35 a 37 grados) sembrados en los medios de cultivo.

CENTRIFUGA.-Es un aparato metálico que sirve para separar en sedimento de la porción líquida de una sustancia.

Se utiliza en los Urocultivos para centrifugar a una velocidad de 2500 r.p.m. durante 5 minutos.

MICROSCOPIO

ELECTRONICO.-Es aquel que proporciona resoluciones (aumentos) de 700 mil diámetros (700 mm) o más en el cual un campo magnético permite enfocar los rayos

El de Barrido permite observar pedazos de tejido de mayor tamaño y nos da una imagen tridimensional.

El de Transmisión permite observar cortes ultrafinos o tinciones negativas.

MICROSCOPIO

FLUORESCENTE.-Es aquel que esté provisto de filtros que permiten observar con luz

ultravioleta, sustancias teñidas con colorantes fluorescentes. Con éste aparato se puede realizar dos tipos de pruebas: Fluorescencia Directa e Indirecta.

BAÑO

MARIA.-Es un aparato eléctrico que se usa con frecuencia en los laboratorios, el mismo que contiene agua y un termómetro para regular la temperatura. Sirve para incubar (inactivar) diferentes muestras: suero, autovacunas, una temperatura constante de 37 - 56 °C.

RESTRICCIONES DE LA

DR ERNESTO RONQUILLO

CLASIFICACION DE LAS MUESTRAS

CLINICAS.-Según la posibilidad de que las muestras clínicas para el cultivo

bacteriológico, estén contaminadas con la FLORA NORMAL se pueden dividir en tres áreas. Hay distintos procedimiento en cada caso para ACCEDER al

PATOGENO.

A.- MUESTRAS DE AREAS PROFUNDAS Y CERRADAS DEL CUERPO (DIRECTAS).

La muestra recogida contendrá solo el germen patógeno. Debe atravesarse la piel para llegar al patógeno utilizando medios quirúrgicos o POR ASPIRACION CON AGUJA. Asepsia previa. Ej. Sangre.

B.- MUESTRAS DE AREAS PROFUNDAS QUE COMUNICAN CON EL EXTERIOR (INDIRECTAS).

La muestra seguramente contendrá AMBOS TIPOS DE GERMENES: Patógenos y de la Flora normal, pues estos últimos están en "el paso" para acceder al patógeno. Ej. Orina por micción.

C.- MUESTRAS DE AREAS SUPERFICIALES DEL CUERPO.

La flora patógena y la no-patógena están ASOCIADAS en el lugar de la infección; ambos tipos son recogidos en la muestra. Los gérmenes no patógenos no deben tomarse en cuenta al interpretar los resultados del cultivo. El instrumento mas útil en la recolección de estos especímenes es la TORUNDA, un aplicador con la punta envuelta en algodón, fibra de poliester, alginato de calcio, o dacrón.

Ej. : Piel y membranas mucosas.

OBTENCION DE LAS MUESTRAS.

ORINA.

MATERIAL.

- Frasco de vidrio o de plastico estéril PROCEDIMIENTO.

1. - En la MUJER puede hacérselo en posición sentada o en cuclillas.

a.- Apartar los labios uretrales con los dedos índice y anular, desde arriba. b.- Lavar cuidadosamente la vulva con una esponja mojada con una solución jabonosa no bactericida. Un buen agente de limpieza es el jabón de lavar común. Repetir 3 veces. Se eliminan los restos del lavado con una gasa estéril.

2. - En el HOMBRE.

a.- Retraer el prepucio y lavar el glande de igual forma.

3. - En el INFANTE.

a.- Lavar los genitales de la misma manera. b.- Utilizar el Reflejo de Pérez.

c.- Si fracasa esta maniobra, colocar una bolsita esterilizada sobre los genitales, para recoger espontáneamente la orina.

En estos casos deberá recogerse la primera muestra de la mañana. En los dos primeros casos recoger la parte intermedia de la micción.

HECES

Las heces deberán ser frescas, y si tienen sangre o pus, éstas deberán seleccionarse para cultivo, pues es allí donde abundan los microorganismos patógenos.

PROCEDIMIENTO.-- Se debe utilizar para la toma de muestra un bajalenguas, cuchillo o cucharilla estériles para transferir al recipiente adecuado estéril, una porción del excremento. - El material fecal deberá ser recién emitido.

- De heces formadas se transfiere un pedazo del tamaño de una nuez, de heces pastosas o líquidos: 1 - 2 ml (una cucharilla cafetera).

FARINGE Y NASOFARINGE.

PROCEDIMIENTO.-- Se deberá tomar solo con una visión clara de la faringe, buena luz y utilizando un bajalengua. Se evitará rozar otras estructuras. Prevenir al paciente concurrir en ayunas sin lavarse los dientes con pasta dental.

- Se dispondrá de dos hisopos, preferentemente humedecidos en tripticasa de soja. - Con los hisopos se tocará el fondo de la garganta, amígdalas, fosas tonsilares y cualquier otro lugar donde exista inflamación, exudado o ulceración. El frote debe ser enérgico, de lo contrario será un espécimen deficiente para el cultivo.

- Uno de los hisopos se usará para hacer tinciones, y el otro para hacer cultivo. El estreptococo del grupo A es la única causa bacteriana común de faringitis, por ello la estrategia diagnóstica en cultivos de garganta tiene por finalidad identificar en forma selectiva este agente.

ESPUTO.

PROCEDIMIENTO.

- El material se recogerá en un frasco estéril de boca ancha.

- Que la expectoración se efectúe, si el paciente está en condiciones de hacerlo después de cepillarse los dientes y enjuagarse concienzudamente.

- Se recogerá una expectoración de la primera hora de la mañana, que está mas limpia, inmediatamente después de una tos profunda en que se expectoren secreciones de los pulmones.

- La muestra se procesará enseguida.

HEMOCULTIVOS.

El hemocultivo consiste en cultivar una cierta cantidad de sangre de un paciente. Como la sangre es líquida orgánico estéril, el hallazgo de microorganismos en ella indicará infección, generalmente de carácter grave. Es esencial un cumplimiento escrupuloso de las normas para la recogida aséptica de las muestras.

PROCEDIMIENTO.

- La toma de la muestra se realiza en la vena superficial de la parte interna de la flexura del codo. Se limpia previamente la zona desinfectándola con yodo y alcohol. Se repite el mismo procedimiento en el tapón de goma del frasco del hemocultivo, manteniendo su contacto por un minuto.

- No palpar el sitio de punción luego de desinfectada la zona. La punción puede efectuarse con aguja y jeringa, o con los instrumentos de doble aguja que existen especialmente para este fin.

- Inocular la sangre directamente en medio de cultivo a la cabecera de la cama. - Ante una bacteremia de origen desconocido es conveniente tomar dos muestras e incubarlas aeróbica y anaerobicamente.

- Después de la extracción de sangre se taponará la herida con algodón y alcohol 70. La cantidad de muestra y el número a tomar dependerá de la edad y circunstancias del paciente.

EXUDADO OTICO

Las infecciones externas del oído frecuentemente son secundarias a heridas al rascarse las partes externas, con algún objeto punzante, infecciones por virus que se infectan secundariamente, alergias, prácticas de natación.

- La toma se realiza después de haber limpiado y desinfectado concienzudamente el pabellón auricular.

- Si hay supuración la toma se realiza con hisopo. Si existe forúnculo, se efectúa con aguja y jeringa.

Se realizan las preparaciones microscópicas y se siembra en los medios adecuados.

EXUDADOS VAGINAL Y URETRAL.

Las enfermedades de transmisión sexual (ETS) pueden causar con Exudado Vaginal o con Ulceras y/o tumoraciones.

PROCEDIMIENTO.

- Cuando hay sospecha de infección vaginal o uterina, se introducirá él especuló con el mínimo de lubricante que permita la comodidad de la paciente (a veces basta el agua tibia), ya que la mayor parte de los lubricantes son bacteriostáticos.

- Para investigar la presencia de Gonococo, nunca se tomarán muestras de vulva ni de vagina, pues difícilmente son positivas. La muestra se tomará con ayuda de un especuló, después de haber extraído el tapón mucoso que recubre el cérvix, de endocérvix, introduciendo la punta en un hisopo a través de un catéter de luz estrecha colocado en la abertura cervical. De este modo se evita tocar la mucosa cervical reduciendo la posibilidad de contaminación.

En el caso de las niñas en la pubertad que presentan epitelio vaginal apto para el desarrollo del gonococo, se tomará la muestra de dicho sitio.

- Casi la mitad de las mujeres afectadas de gonorrea alojan gonococos en el conducto anal; por lo tanto se hará un cultivo rectal.

En el caso de las infecciones genitales en el hombre: Una suave presión del pene permite obtener una muestra útil para el cultivo y el frotis coloreado con el Gram.

TECNICAS DE SIEMBRA BACTERIANA.

CONTENIDO

Siembra o inoculación es extender una pequeña cantidad de muestra sobre la superficie de la placa con agar, con un sistema de actuación preestablecido y con la ayuda de una asa de alambre fino o de plástico desechable. Este sistema de

separación recibe el nombre de SIEMBRA POR AGOTAMIENTO EN SUPERFICIE. Las bacterias bien aisladas unas de otras crecerán como pequeñas masas de

microorganismos, alcanzando unos 2 a 3 mm de diámetro al cabo de una incubación de 18 a 24 horas, denominadas COLONIAS, que a simple vista pueden verse en la superficie del agar. Cada colonia está formada por billones de gérmenes y

constituyen todos los descendientes de un solo microorganismo que fue a parar a dicho lugar.

MATERIAL A UTILIZAR: - Mechero de alcohol.

- Tubo de ensayo con él inoculó o muestra. - Caja de petri con el medio de cultivo estéril. - Asa de inoculación

INOCULACION DE MEDIOS DE CULTIVO EN TUBOS.

Los medios se pueden distribuir en tubos ya sea como caldos o en forma de agar. El agar puede ser semisólido o sólido, generalmente formando un plano inclinado. Para la inoculación de especímenes se emplea generalmente el asa; para la transferencia de cultivos puros de placas a tubos, la aguja es, habitualmente el instrumento elegido.

PROCEDIMIENTO.

- Flamee el asa como se ha descrito anteriormente y déjela enfriar.

- Quite el tapón de rosca (o el algodón) del tubo y tome con el asa una porción del espécimen.

- Quite el tapón del tubo que se va a inocular

RESIEMBRA BACTERIANA .

Es la TRANSFERENCIA de colonias bacterianas de la caja de petri a tubos u otra caja que contienen medios de cultivo esterilizados. Con éste método las cepas que interesan se aíslan en CULTIVO PURO. Para ello tocamos la colonia seleccionada con el extremo de una aguja esterilizada y transferimos los microorganismos

adheridos a la aguja, al medio de cultivo deseado para su mejor proliferación.

MATERIAL.

- Asa y aguja de inoculación

- Caja de Petri con colonias a transferir. - Mechero de alcohol

- Caja de Petri o tubo (según el caso) con medio de cultivo estéril.

CARACTERISTICAS MORFOLOGICAS DE LAS COLONIAS EN LOS MEDIOS DE CULTIVO

Los microbiólogos utilizan diversas características de las colonias bacterianas que se desarrollan en la superficie de los medios de cultivo de agar con dos finalidades: - Efectuar la IDENTIFICACION PRESUNTIVA BACTERIANA PRELIMINAR. - COMO GUIA EN LA SELECCION DE PRUEBAS a fin de determinar las características diferenciales para la identificación final.

CRITERIOS UTLIZADOS.

1. - Tamaño (diámetro en mm.) 4. - Elevación. 7. - Superficie. 2. - Forma. 5. - Borde (margen). 8. - Densidad. 3. - Consistencia. 6. - Color. 9. - Olor.

FORMA: Puntiforme, circular, filamentosa, irregular, rizoide, fusiforme.

BORDE de las colonias: Plano, elevado, convexa, acojinada, umbiliforme, umbilicada.

COLOR: Blanco, amarillo, negro, naranja, . SUPERFICIE: Brillante, mate, etc.

DENSIDAD: Opaca, translúcidas, transparentes, etc.

CONSISTENCIA: Butirosa, viscosa, membranosa, quebradiza, mucoide.

MATERIAL.

- Medios de cultivo con las distintas siembras bacterianas. - Fuente de luz.

- Lupa.

La interpretación de cultivos primarios es una habilidad especial que se debe adquirir trabajando con un microbiólogo bien capacitado y generalmente se logra dominar sólo luego de muchos meses o años de experiencia.

Como ejemplo podemos cita las características de las colonias en placas de agar de 3 bacilos Gram negativos distintos. Cada una de ellas es típica de su especie aunque son frecuentes las variaciones:

- Las colonias E. Coli son planas con un borde recortado.

- Las colonias de Klebsiella pneumoniae tienen un borde completamente liso y una superficie elevada y mucoide.

- Las colonias de P. Aeruginosa presentan una superficie irregular que recuerda una superficie metálica golpeada repetidamente con un martillo.

Colonias en agar sangre que muestran zonas evidentes de hemólisis. El gran tamaño de las colonias comparado con las zonas de hemólisis sugiere una especie

hemolítica de Staphylococcus.

Colonias puntiformes B - hemolíticas: sugieren especies de Streptococcus. El reducido tamaño de las colonias bacterianas comparado con el gran tamaño de la zona de hemólisis B, es altamente sugestivo de esta especie.

Colonias lisas diseminadas con pigmentación verde definida, sugieren la presencia de pseudomonas aeruginosa.

MUESTRAS IMPORTANTES DE VARIAS ZONAS Y TIPOS DE INFECCIÓN Zona/tipo de infección tipo de muestra

Líquido Tejido Torunda otros

Tracto urinario Vejiga

Riñón

Orina

orina Biopsia renal Tracto gastrointestinal Intestino Boca Hígado Tracto biliar Abdomen Lavados Bilis Pus Aspirado peritoneal Líquido ascítico Biopsia hepática

Torunda rectal heces

Tracto respiratorio Nariz Nasofaringe Faringe Pulmón Espacio pleural Oído Ojo Lavados (V) Esputo Lavado alveolar Líquido pleural Biopsia pulmonar Torunda nasal Torunda pernasal Torunda faríngea Torunda auricular Torunda ocular

“placa de tos”: el paciente tose directamente en una placa de agar

Tracto genital Uretra

Vagina Cerviz

endometrio Biopsia endometrial

Torunda uretral Torunda vaginal alta Torunda cervical

Microscopia directa y cultivo en la clínica

Piel y tejidos blandos Piel Herida Líquido vesicular (V) Pus Biopsia cutánea(M)

Raspados(H) Torunda cutánea(portador) torunda de herida

Placas de impresión

Hueso y articulación Osteomielitis

articulación Pusaspirado Hueso* Septicemia

Fiebre de origen desconocido

Endocarditis

Sangre

Sangre

Sangre Válvula cardíaca*

Extensión de sangre para parásitos palúdicos *recogido en la operación (V) muestras para virología (H)muestras para hongos (M)muestras para microbacterias

CLASIFICACIÓN DE MUESTRAS CLÍNICAS

A.

A.- MUESTRAS TÉCNICAS PARA VENTAJAS Y OBTENIDAS ADECUADA RESTRICCIONES DIRECTAMENTE RECOLECCIÓN DE LA TÉCNICA: Sitios profundos DE MUESTRAS:

sin comunicación:

Tejidos u órganos Asepsia de la piel Normalmente estériles

Líquidos orgánicos: Aspiración con aguja Los resultados (+): Sangre, linfa, pleural Son diagnósticos Peritoneal, articular Biopsia quirúrgica Pericárdico, etc. Los resultados (-) Absceso profundo Excluyen la infección.

B.

B. MUESTRAS TÉCNICAS PARA VENTAJAS Y OBTENIDAS RECOLECCIÓN RESTRICCIONES INDIRECTAMENTE: ADECUADA DE DE LA TÉCNICA: SITIOS MUESTRAS:

PROFUNDOS CON

COMUNICACIÓN -Eludir las áreas -Pueden estar

Contaminantes contaminadas con F.N -Exudados inflamatorios -Pruebas cuantitativas -Más cómodas de -Esputo, orina. -Aspiración: obtener.

-Endocervix, vesícula Suprapúbica, -Correlación de -Fístulas. transtraqueal. hallazgos clínicos y microbiológicos.

C. MUESTRAS DE TÉCNICAS PARA VENTAJAS Y ZONAS DE PIEL RECOLECCIÓN RESTRICCIONES Y MUCOSAS: ADECUADA DE DE LA TEORÍA MUESTRAS:

-Piel: Lesiones, heridas, -Utilizar medios de -Zonas usualmente absesos. cultivos selectivos contaminadas.

-Membranas mucosas: -Investigar agentes -Restringir la búsqueda a Orificios del cuerpo etiológicos específicos. gérmenes patógenos que (faringe, intestino), Ej: estreptococo B.H no se hallan en el sitio uretas, oído, etc. GA.(Faringe) Tifoidea infectado.

-Material de colostomia (heces) conocido -No apropiado para (exud.uretal) cultivos anoeróbicos. -Ignorar la F.N.

1. Flamear el asa y tomar con ella 2. Luego de flamear el asa, una porción delgada de la muestra. se repite el procedimiento Colocarla en el agar y distribuirla previo, giro de 90° a la izq en el 1/4 superior. en el 1/4 siguiente, partiendo

de la zona última anteriormente sembrada.

3. El proceso se repite por tercera vez como en 2 hasta cubrir la superficie

INOCULACIÓN DE MEDIOS EN TUBO

MEDIOS LÍQUIDOS Caldo de Tioglocolato

MEDIOS INCLINADOS Agar de Soya, Trypticase

O en agar nutritivo base inclinada

MEDIOS

ESPECIALES INCLINADOS Agar TSI

AUTOR:DRA JOSEFINA RAMIREZ

ESTUDIO MICROBIOLOGICO DE COLECCIONES

SUPURATIVAS

OBJETIVO:

Al finalizar la clase práctica el alumno será capaz de:

1. - Seleccionar que medio de cultivo se necesita para el estudio de las colecciones supurativas.

2. - Escoger el medio de cultivo para realizar el estudio de las colecciones supurativas.

3. - Interpretar los resultados.

MATERIALES.

- Muestra del material supurativo a estudiarse.

- Medio de transporte, el cual se escogerá dependiendo de la cepa que se va a estudiar.

- Lámina porta objeto. - Asa de inoculación - Mechero.

- Solución salina o agua destilada. - Colorantes.

- Microscopio.

- Medios de Cultivo, uno sólido (agar Sangre) y otro líquido (caldo de Thioglicolato).

CONTENIDOS: OBTENCION DE LA MUESTRA:

Este párrafo está indicado en el capitulo de toma de muestra

MEDIO DE

TRANSPORTE.-Si la muestra no puede ser sembrada inmediatamente, o hay que

mandarla a un laboratorio distante , esta debe colocársela en un medio de transporte como el de Staurt o el de Amies, así como también si se sospecha de la presencia de anaerobios sería mejor utilizar el medio de Cary Blair.

METODOLOGIA

OBSERVACION

una coloración verde azulada recuerda a pseudomonas, y un olor fétido se relacionaría con anaerobios o coliformes.

OBSERVACION

MICROSCOPICA:.-Es indispensable para realizar una extensión fina y homogénea del pus y teñirla con el método de Gram o de Ziehl-Neelsen, pues su observación microscópica nos dirá los pasos a seguir y los medios de cultivo a utilizar.

SIEMBRA DE LAS MUESTRAS:

.-Los principales productores de pus son los microorganismos que crecen bien en casi todos los medios ordinarios; por lo tanto , el plan

sintetizador bastará con sembrar el producto patológico en dos medios de cultivo, uno sólido (que puede ser agar sangre, el mismo que permite aislar la mayoría de las bacterias aerobias y anaerobias o el medio de Lowenstein- Jensen si se sospecha una Etiología tuberculosa), y uno líquido como es el caldo de tioglicolato que tiene funciones de

enriquecer el crecimiento de anaerobios estrictos y facultativos. A las 24 horas de incubación a 35 °C se efectuaran las oportunas resiembras en medios sólidos.

VENTAJAS

Este examen es el que nos permite en poco tiempo y con una simple observación obtener una orientación diagnóstica

DESVENTAJAS

La de contar con todo el material requerido. como por ejemplo: un medio de transporte.

INTERPRETACION DE RESULTADOS: OBSERVACION DE LAS

COLONIAS:.-Colonias gamma hemolíticas de 4,5 mm. Blancas, opacas de bordes rizados en agar sangre (Bacillus antracis).

Colonias gamma hemolíticas de 1 a 2 mm. En agar sangre (streptococos no hemolíticos))

Colonias gamma hemolíticas pequeñas transparentes, relucientes de margen ondulado en agar sangre (yersinia pestis)

Colonias puntiformes (24 horas) En el medio de Francis (Francisella talurensis)

AUTOR:DR CARLOS MOSQUERA

MUESTRAS ESPECIALES PARA EL

DIAGNOSTICO BACTERIOLOGICO

INTRODUCCION:

El establecimiento del diagnóstico en las enfermedades infecciosas dependen en gran parte de la selección de la muestra, del tiempo en que se colecta y del cuidado que en ello se pone. Estos factores son con frecuencia de importancia para el éxito en el diagnóstico etiológico de las enfermedades infecciosas.

OBJETIVOS:

Al finalizar la clase el alumno estará en capacidad de:

1.- Demostrar como se toman correctamente las muestras para su estudio bacteriológico.

2.- Identificar las características morfológicas de las Bacterias.

Predecir cómo y cuándo solicitar un examen para su estudio bacteriano. 3.- Demostrar la acción patógena de las Bacterias sobre el organismo. 4.- Explicar las condiciones de como preservar y enviar las muestras para su estudio bacteriológico.

LIQUIDO CEFALORRAQUIDEO (LCR).

Los principales agentes etiológicos que podemos encontrar en un LCR son los siguientes:

Neisseria meningitidis, Haemophilus influenzae, Estreptococos neumoniae, Estafilococos áureas, Enterobacterias, Mycobacterium tuberculosis.

MATERIALES:

Se requiere el siguiente material: - Tubos de ensayo estériles. - Equipo para punción lumbar. - Asa de inoculación.

PROCEDIMIENTO:

La muestra se obtiene por punción lumbar previa desinfección del área y debe ser enviada inmediatamente al laboratorio , la muestra no debe ser refrigerada , si ni se la procesa en el momento debe ser incubada o dejada a temperatura ambiente .

medios de cultivo a utilizar si se busca bacilo tuberculoso se realiza tinción Ziehl Neelsen y se siembra en medio de Lowenstein Jensen . En el caso de Neisseria meningitidis, se siembra en agar Chocolate o Tayer Martin a 35 °C en atmósfera de 5 a 10% de CO2, para luego realizar la reacción bioquímica en agar CTA (Cisteína trípticasa) adicionado de los respectivos carbohidratos.

LIQUIDO SINOVIAL

El estafilococo aureus es el agente etiológico más común de la artritis séptica, sin embargo pueden aislarse otros agentes como el Haemophilus influenzae, Estreptococos viridans, etc.

MATERIALES:

- Jeringa estéril.

- Tubo de ensayo estéril.

PROCEDIMIENTO:

La muestra se obtiene por aspiración con una jeringa estéril, la muestra debe ser colocada en frascos para transporte en anaerobios para

preservar la viabilidad de los anaerobios.

Puede ser útil inocular un frasco para hemocultivo con parte de la muestra , sobre todo si el especimen no puede ser llevado

inmediatamente al laboratorio.

Las muestra muy purulentas se inoculan directamente en diversas placas de agar, incluyendo alguno que permita el desarrollo de

microorganismos exigentes como: A. Chocolate, A. Sangre, y en un medio enriquecido como el caldo de thioglicolato.

Si se sospecha de tuberculosis se inoculará en el medio de Lowenstein Jensen.

LIQUIDO ASCITICO

La E. coli es la bacteria que se encuentra con mayor frecuencia seguida por el Estreptococo neumoniae y otros Estreptococos del grupo A.

Aunque también pueden aislarse Enterobacterias, Estafilococos, etc.

MATERIALES

- Equipo para paracentesis. - Tubos de ensayo estériles. - Asa de Inoculación.

PROCEDIMIENTO

La muestra se obtiene por aspiración percutánea (paracentesis) o en el momento de una cirugía y se envía al laboratorio para examen directo y cultivo.

peritonitis. Como en todo material que se presume que contiene

anaerobios, éstas muestras deben ser inoculadas lo más rápido posible.

LIQUIDO PLEURAL

Las Bacterias que pueden ser aisladas del líquido pleural incluyen aquellas relacionadas con neumonías, como Estreptococos neumoniae, Estafilococos aureus. H. influenzae, Enterobacterias, bacilo tuberculosos y anaerobios.

MATERIALES

- Tubos de ensayo estériles. - Jeringuilla estéril.

- Equipo para toraconcentesis. - Asa de inoculación.

PROCEDIMIENTO

La muestra se recoge por aspiración (toraconcentesis) y transportada al laboratorio lo mas pronto posible.

Para el aislamiento de la mayoría de las Bacterias es suficiente una muestra de 1 - 5 ml, pero cuanto sea mayor el volumen habrá mejores probabilidades de aislamiento de algunos patógenos como el

Mycobacterium tuberculosis.

Las muestras que se reciben en frascos para transportes de anaerobios o jeringas deben ser inoculadas tan pronto como sea posible en los

medios de cultivo para aerobios y anaerobios de rutina.

Además deben examinarse frotis teñidos con Gram y Ziehl Neelsen

LAVADO GASTRICO (HELICOBACTER PYLORI) MATERIALES

- Tubos de ensayo estériles. - Asa de inoculación.

- Colorantes para tinción de Gram.

PROCEDIMIENTO

La muestra se obtendrá a través de endoscopía digestiva para obtener la secreción gástrica , una vez obtenida la muestra debe ser enviada al laboratorio inmediatamente para poder neutralizar la acidez.

De la secreción se hará frotis directo para ser teñidos con Gram a fin de identificar bacilos Gram negativos curvos, para posteriormente realizar la prueba de la ureasa.

LAVADO BRONQUIAL

MATERIALES

Tubos de ensayo estériles. Asa calibrada.

Cepillo bronquial

PROCEDIMIENTO

La muestra se obtiene a través de un cepillo bronquial protegido por un catéter.

Se coloca dentro de una cánula doble un cepillo pequeño que recoge 0.01 a 0.001mg de secreciones. El extremo de la cánula exterior se obtura con un tapón de polietilenglicol, una vez que la cánula se ha insertado en el área apropiada, se empuja la cánula interior que

desaloja al tapón a medida que es extraída, luego se extiende el cepillo hacia el exterior de la cánula interna.

La muestra obtenida se suspende en 1 ml de caldo agitando en un vortex y luego se inocula en los medios de cultivo usando una asa calibrada de 0.01 ml.

TEJIDOS

Entre las Bacterias que podemos aislar de material de biopsia o de tejido tenemos: Mycobacterium tuberculoso, Brucella, Listeria

monocytogenes.

MATERIALES

- Frasco plástico con boca ancha y tapa de rosca.

- Solución salina estéril.

PROCEDIMIENTO

Las muestras del tejido deben ser obtenidas luego de una cuidadosa preparación de la piel, ya que es importante que las biopsias se extraigan en condiciones asépticas.

AUTOR: DR JUAN MORENO PINCAY

TECNICAS DE PREPARACION DEL FROTIS Y

SU FIJACION

OBJETIVOS:

- Elaborar el frotis.

- Reconocer los pasos ordenados para la realización de un frotis. - Utilizar adecuadamente el asa de inoculación.

- Aprender a flamear el asa de inoculación y la lamina portaobjeto. - Usar adecuadamente los dedos de la mano para coger el asa y par a taponar el tubo de ensayo.

- Sostener adecuadamente el tubo de ensayo en el momento de tomar la muestra bacteriana.

CONTENIDO.-Antes de realizar cualquier tipo de tinción bacteriana

previamente debemos realizar un frotis . Pero -Qué es un frotis?, No es otra cosa que el extendido de una suspensión bacteriana en una lámina portaobjeto limpia de tal forma que se forme una película uniforme y fina en el tercio medio de la placa.

Los frotis preferentemente deben realizarse tomando muestras de cultivos frescos o directamente de los focos infecciosos. El frotis se lo puede realizar con el asa de inoculación o con un hisopo, para realizar un frotis es necesario que el estudiante tenga conocimientos previos de los materiales utilizados en bacteriología, este frotis dejaría de ser importante sino se continúa con el procedimiento de tinción.

Es importante recordar que para efectuar un buen frotis este debe quedar del mas fino espesor posible para poder individualizar microscópicamente una célula bacteriana de otra.

MATERIALES A UTILIZAR.

-Cultivos, caldos y agares - Asa de inoculación

- Hisopos - Mechero

- Solución salina o fisiológica - Una tubera o gradilla - Papel filtro

TECNICA

1.- Limpiar un portaobjeto aplicando la llama a una de las superficies, colocarlo sobre la mesa con el lado tratado hacia arriba.

2.- Tomar el asa de transferencia o de inoculación como si fuera un lápiz con el pulgar y el índice.

3.- Insertar el asa de inoculación en un ángulo de 60° en la punta de llama del mechero de Bunsen o del alcohol, calentar al rojo toda el asa. 4.- Tomar el tubo de ensayo que contiene solución salina con la mano libre, quitar el tapón de algodón ó tapa con los dedos de la mano que sujeta el asa de inocular y que está libre.

5.- Calentar el borde del tubo haciéndolo pasar por el cono superior de la llama.

6.- Insertar el asa esterilizada dentro de la solución salina y extraer 2 o 3 asadas y llevarlas al centro de la lámina porta objeto.

7.- Esterilizar el asa nuevamente y tomar una muestra de colonias bacteriana siguiendo el procedimiento anterior tratando en lo posible coger el tubo de ensayo del fondo.

8.- Llevar las muestras de colonias bacterianas al centro de la lámina donde previamente estaba la solución salina ,sin olvidar de tapar los tubos de ensayo.

9.- Hacer un extendido con el asa de inoculación realizando movimientos circulares que abarquen el tercio medio de la placa, dejar que el frotis seque al aire.

10.- Pasar varias veces el frotis por el mechero para fijarlo.

11.- Esterilizar el asa de inoculación antes y después de utilizarla. 12.- El frotis también se puede fijar con fijador de Schaudinn de 5 minutos a 50°C o una hora a temperatura ambiente sin sufrir daños el frotis.

El estudiante durante la ejecución de la técnica utilizará correctamente los cinco dedos de la mano; el meñique y el anular para el tapón, el índice y pulgar para el asa y el dedo medio de apoyo.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS

La realización de un frotis tiene la ventaja de favorecer a las técnicas de tinción para ellos es importante que el espesor sea lo mas fino posible. Una de las desventajas es que al fijar la placa ciertas proteínas

plasmáticas se coagula y se adhiere al porta objeto.

Cuando la fijación se hace con alcohol metílico; en 2o3 minutos está lista la placa.

La realización de un frotis tiene importancia si se realiza la tinción; cuando se observa al microscopio las Bacterias están muertas ya sea por la fijación o por los mismos colorantes que se vayan a utilizar. Si el medio de cultivo donde se toma la muestra es líquido la extensión que se consigue es fina y homogénea, si la muestra es tomada de un medio de cultivo sólido la calidad del frotis dependerá mucho de la habilidad del estudiante al realizar la suspensión y posteriormente el frotis.

RESTRICCIONES DEL METODO

En realidad la única restricción que tiene el método en la clase de práctica de Bacteriología es cuando se quiere utilizar fijadores como el de Schaudinn o alcohol metílico que no hay en stock de nuestro

laboratorio, pero la fijación la hacemos a fuego lento con el mechero

METODOS FISIOLOGICOS DE IDENTIFICACIONDE LA

MOTILIDAD BACTERIANA BACTERIANA

OBJETIVOS:

1.- Discriminar el movimiento bacteriano del Browmiano mediante la observación microscópica .

2.- Reconocer la motilidad bacteriana producido en un medio de cultivo. 3.- Realizar una suspensión bacteriana .

4.- Ejecutar la técnica de lámina y laminilla, gota pendiente y en tubo capilar cerrado.

CONTENIDO:

La motilidad o movilidad bacteriana es una de las propiedades o características de muchas especies bacterianas de avanzar mediante propulsión por flagelos (filamento, gancho y complejo basal de la compleja estructura de un flagelo).

El filamento helicoidal lo tenemos como una hélice, el gancho como una unión , y el cuerpo basal como un cilindro o anillo de un motor.

La motilidad bacteriana es una prueba presuncial de que las Bacterias poseen flagelos aunque no indica número ni disposición de los mismos. Estos movimientos flagelares son en látigos, circular y en rotación a un promedio de 40 revoluciones por segundo.

El examen directo de los organismos vivos (Bacterias) pueden tener gran utilidad para determinar relaciones de tamaño, forma, movilidad y reacciones.

TIPOS DE MOTILIDAD BACTERIANA

Tenemos la que se realiza en fresco para una observación microscópica y la que se observa en medios de cultivos macroscópicamente.

En fresco tenemos tres métodos:

a) El de lamina y laminilla. b) El de gota pendiente. c) En tubo capilar cerrado.

En medios de cultivos tenemos:

a) En agar Motilidad.

b) En agar Mac Conkey. y agar sangre c) En agar Edwars-Ewing.

MATERIALES:

- 4 Láminas porta objeto excavada. - 4 Láminas porta objeto.

- 4 Laminillas cubre objeto. - 1 Recipiente con vaselina . - 1 Recipiente con xilol. - Plastilina .

- 1 Tubo de ensayo con solución salina. - Aplicadores de madera.

- Asa y aguja de inoculación. - 2 Tubos capilares.

- Mechero.

- Medios de cultivo sembrado y estériles.

- Microscopio.

-TECNICA:

OBSERVACION MICROSCOPICA:

ENTRE LAMINA Y LAMINILLA.- (entre porta y cubre objeto)

como (10X) o (40X). Esta técnica puede ser utilizada para observación microscópica de anaerobios siempre y cuando se observe con rapidez la parte central del montaje.

GOTA

PENDIENTE.-Untar una capa débil de vaselina en los bordes de la concavidad de la lámina excavada, colocar una gota de suspensión bacteriana en el centro de la laminilla cubre objeto, luego invertir cuidadosamente la lámina porta objeto excavada sobre la laminilla de tal modo que en el centro de la concavidad corresponda a l de la gota .

Luego observar con objetivo seco el borde de la gota y a continuación todo el campo.

EN TUBO CAPILAR

CERRADO.-Con ésta técnica podemos observar Bacterias mótiles anaerobias principalmente.

Se llena un tubo capilar con una suspensión bacteriana, cerrando inmediatamente los dos extremos con plastilina, luego se observa al microscopio con el objetivo de 40X

OBSERVACION MACROSCOPICA MOTILIDAD EN MEDIOS DE CULTIVO:

EN AGAR

MOTILIDAD.-Técnica.- Se siembra con la aguja de inoculación en medio de cultivo semisólido tanto en picadura como en profundidad, tratando en lo

posible que la aguja no penetre mas de 1 cm del fondo del tubo. Incubar por 24 horas a una temperatura de 35 - 37 °C, luego se realiza la

interpretación de los resultados.

La motilidad es positiva cuando hay crecimiento de Bacterias mótiles lo que permite que el sitio de picadura se ensanche y se deforme y el medio de cultivo se torna turbio.

La motilidad es negativa cuando el medio de cultivo está claro y el sitio de la picadura no ha sufrido transformación.

EN AGAR MAC CONKEY, O AGAR SANGRE(FENOMENO DE SWARMING)

Técnica.- Sembramos punteando la parte central del agar Mac Conkey, incubamos por 24 horas a una temperatura de 35 - 37 °C.

contrario el desarrollo bacteriano se difunde rápidamente sobre toda la superficie formando anillos concéntricos de dispersión con ondulaciones características en el medio(fenómeno conocido como el de Swarming).

VENTAJAS Y DESVENTAJAS VENTAJAS DE LA OBSERVACION EN

FRESCO.-Se observa la bacteria viva y en movimiento, la forma y posibles alteraciones morfológicas ocurridas al moverse la bacteria; no se expone a observar deformaciones causadas por la fijación y los colorantes.

DESVENTAJAS DE LA OBSERVACION EN

FRESCOS.-La rápida desecación nos impide una observación prolongada, también nos impide ver ciertas estructuras como cápsulas, flagelos esporas que solo es posible observarlos con métodos de tinción especial. En cuanto a la observación en medios de cultivo si bien es cierto que podemos

observar las distintas reacciones que se producen en el medio lo que nos hace sospechar de acuerdo a las características que hay motilidad

bacteriana tiene la desventaja que no podemos observar directamente la bacteria.

RESTRICCIONES DEL METODO

En un tubo capilar aunque es un método sencillo de realizar no

AUTOR JUAN MORENO

TECNICAS DE COLORACION DE BACTERIAS

OBJETIVOS:

Elaborar diferentes tinciones correctamente.

Reconocer los pasos ordenados para la realización de cualquier método de tinción enseñado.

Seleccionar una técnica específica para la tinción de esporas cápsulas. Identificar Bacterias ácido resistentes y no ácido resistentes.

CONTENIDO:

Las Bacterias poseen la propiedad de fijar ciertas sustancias colorantes, de ahí que cuando éstas se tiñen podemos observar algunas de las estructuras bacterianas que no se observaban en fresco, como por ejemplo cápsulas, esporas, flagelos, membranas, etc.

Hay algunos tipos de colorantes químicos como: los ácidos, básicos y neutros. Los colorantes ácidos tienen carga iónica negativa no tiñen a la célula bacteriana y son usados para impartir el fondo de contraste al frotis, por ejemplo: la eosina. Los colorantes básicos tienen ión de carga positiva y tiñen las células bacterianas uniformemente, por ejemplo: violeta de genciana, azul de metileno.

Los colorantes neutros son sales complejas que poseen ambas cargas iónicas como el eosinato de azul de metileno.

Todo procedimiento de tinción parte de un frotis las sustancias químicas que se usan para teñir Bacterias se la conoce como colorante.

Se cree que la bacteria se tiñe debido a un intercambio iónico entre colorantes y elementos activos de la superficie o del interior de la célula bacteriana.

Hay algunas hipótesis que sugieren que las Bacterias Gram positivas contienen un complejo proteínico ribonucleasa-Mg en su pared y que el mismo forma un

cristal violeta-yodo. En cambio las Bacterias Gram positivas por la composición química propia de su pared al ser tratada con el alcohol se deshidrata reduciendo por lo tanto la permeabilidad y por ende el complejo cristal violeta-yodo no es extraído.

Todas las bacterias Gram negativas son constantes en su reacción: las Gram positivas son variables, dependiendo de algunos factores (Cultivos jóvenes, Cultivos viejos, y técnicas).

CLASIFICACION DE LOS METODOS DE TINCION.

Se clasifican en simples, compuestos y especiales .

Los métodos de tinción simples son aquellos en los que se utiliza un solo colorante. Métodos de tinción compuestos son aquellos en los que se utilizan más de un colorante.

Los métodos de tinción especiales son aquellos donde se utilizan colorantes o reactivos para estudiar ciertas estructuras específicas de las Bacterias como por ejemplo gránulos metacromáticos, flagelos, cápsulas, esporas, membranas.

METODOS DE TINCION SIMPLE:

Tenemos el método de Violeta de Genciana, el de Azul de Metileno, el de Fucsina fenicada básica, y el Azul de Metileno alcalino de Loeffler.

METODOS DE TINCION COMPUESTA:

Tenemos el método de Gram, el método de Preston-Morrel, el método de Ziehl-Neelsen, el método de Kinyoun, método Albert.

METODOS DE TINCIONES ESPECIALES:

Método de Wirtz-Conklin, método de Tinta China, método de Hiss, método de tinción de Fontana tribondeau, método de Fleming-modificado, método de Leifson ;rojo congo para leptopiras.

MATERIALES

- Colorantes.

- Láminas porta objetos. - Laminillas cubre objetos.

- Medios de cultivos con colonias bacterianas. - Papel filtro.

- Vaso de Coplín. - Pinza porta lámina. - Asa de inoculación.

- Tubo de ensayo con solución salina. - Tinta china.

- Mechero - Reactivos. - Microscopio.

METODO DE VIOLETA DE GENCIANA: TECNICA:

1.- Realizar un frotis y cubrir la preparación con violeta de genciana por un minuto, lavar con agua destilada, luego de secar al medio ambiente o con papel filtro y queda lista para ser observada con objetivo de inmersión.

Las Bacterias con este método se van a observar en el microscopio de color violeta o morada.

METODO DE AZUL DE METILENO: TECNICA:

1.- Realizar un frotis y cubrir la preparación con azul de metileno durante un minuto, lavar con agua destilada, luego secar al medio ambiente o con papel filtro y queda lista para ser observada con el lente de inmersión.

Las Bacterias con éste método se van a observar de color azul.

METODO DE FUCSINA FENICADA BASICA: TECNICA:

1.- Realizar un frotis y cubrir la preparación con fucsina fenicada basica durante un minuto lavar con agua destilada, luego secar al medio ambiente o con papel filtro y queda lista para ser observada con el lente de inmersión.

Las Bacterias con éste método se van a observar de color rosado

METODO DE AZUL DE METILENO ALCALINO DE LOEFLER: TECNICA:

1.- Realizar un frotis y cubrir la preparación con azul de metileno alcalino de Loffler durante un minuto, lavar con agua destilada, luego secar al medio ambiente o con papel filtro y queda lista para ser observada con el lente de inmersión.

Las Bacterias con éste método se van a teñir de color azul, es importante señalar que con éste método se tiñe bien el bacilo DIFTERICO, las granulaciomnes metacromáticas del bacilo se observan en el microscopio de una coloración azul oscuro y el cuerpo del bacilo en un azul pálido.

METODO DE GRAM.

1.- Realizar un frotis y cubrir la preparación con violeta de genciana durante un minuto luego lavar con agua.

2.- Cubrir la preparación con Licor de Gram que actúa como mordiente, durante un minuto, luego lavar con agua.

3.- Decolorar la preparación con alcohol 70° ó alcohol cetona hasta eliminar el exceso de violeta genciana, luego lavar.