La migración de un fibroblasto involucra eventos que se
repiten cíclicamente
ver animación: “clutch hypothesis”
1. Polimerización de actina en el lamelipodio. Arp2/3
2. Adhesión mediada por integrinas
3. Contracción mediada por miosina II
1-3. Protrusión del frente de avance. Nucleación
(Arp2/3, azul) y elongación de filamentos con actina-ATP (rojo); terminación por capping
(proteínas CapZ, amarillo). La polimerización de actina empuja la membrana (protrusión).
La protrusión del lamelipodio depende de una red dinámica de actina
4, Desensamble de la red de filamentos detrás del frente de avance. Fragmentación
y desensamble de la actina-ADP (en blanco) mediado por cofilina y gelsolina.
En el lamelipodio la red dendrítica de actina experimenta un
“treadmilling”,
con
un ensamble neto en el frente de avance y un desensamble neto por detrás.
Los monómeros de actina se adicionan entre el extremo más y la membrana plasmática. La energía térmica hace que los filamentos se curven dejando lugar suficiente para la adición de una subunidad de actina. La fuerza elástica hace que el filamento “vuelva”. La acción concertada de muchos filamentos y su entrecruzamiento en una red genera fuerza suficiente para empujar la membrana hacia delante.
Alberts et al MBC 4th Ed
5, 6. La unión de profilina a actina-ADP promueve
el intercambio del ADP por ATP en la actina la cual
es reutilizada en el frente de avance.
desensamble
ensamble
fuerza de
empuje
La interacción entre proteínas adaptadoras de unión a actina e
integrinas conecta citoesqueleto de actina con el sustrato
Alberts et al MBC 6th Ed
(B) Si no hay interacción entre filamentos de actina y adhesiones focales el ensamblado de actina mueve los filamentos hacia atrás (flujo retrógrado).
(C) La interacción entre proteínas adaptadoras e integrinas conecta el citoesqueleto de actina al sustrato. Miosina genera fuerzas de contracción que se transmiten al a través de las adhesiones focales para generar tracción sobre la matriz extracelular. La polimerización de actina mueve el frente de avance hacia adelante
(A) Ensamblado de filamentos en el frente de avance. Formación de adhesiones focales.
Para que las protrusiones que forma la actina en el margen de avance puedan mover la
célula hacia adelante se requiere de la interacción firme entre la red dendrítica de actina y
las adhesiones focales que conectan la célula al sustrato
Las fibras de estrésse anclan a las integrinas de las adhesiones focalesmediante proteínas
adaptadoras comovinculina, talina y paxilina.
Fascículos contráctiles
de microfilamentos o
fibras de estrés
le
permiten a la célula traccionar sobre el substrato
La miosina asociada a las fibras de estrés les permite ejercer fuerzas de tracción sobre las adhesiones focales actina integrinas a-actinina fibra de estrés vinculina talina Adhesión foc al
fibras de estrés. Microscopía de fluorescencia
focos de adhesión (flechas). Microscopía de reflexión
focos de adhesión (verde) y fibras de estrés (rojo). Microscopía de fluorescencia
Talin
Vinculin α-actinin Paxilin
Integrin αV Actin
La microscopía de super resolución permite estudiar la arquitectura de las
adhesiones focales
Las integrinas están separadas de actina por un core de proteínas organizadas en estratos: (i)
señalización a través de integrinas, (ii) transducción de fuerzas, (iii) regulatorio de actina.
En la tecnica de iPALM (interferometric photoactivated
localization microscopy), la localización de sondas
fotoactivables brinda resolución a nanoescala en 3D
El anclaje de las fibras de estrés a las adhesiones focales es determinado
por
vinculina
y otras proteínas
La unión de vinculina a
PIP2 induce un cambio conformacional que le pemite exponer sitios de interacción con actina y con otras proteínas que unen actina como talina y a-actinina. Z am ir & G ei ge r, J CS 20 01
Durante la migración, la fuerza dependiente de
Miosina II
contribuye a
la translocación del núcleo en la dirección de avance
La miosina se asocia a los
filamentos de actina en la
región
de la
lamela más
cercana al núcleo.
miosina núcleo adhesionesF-actina
miosina II
miosina II
La actividad contráctil de
miosina II
y
F-
actina
se traduce
en fuerzas de
tracción
sobre el substrato
contracción mediada
por miosina II
La fuerzas de tracción sobre el sustrato pueden visualizarse sembrando las células sobre un
substrato deformable. Durante la migración de la célula hacia adelante, las fuerzas contráctiles
que se ejercen en el frente y en la parte trasera de la célula provocan que la membrana se
arrugue. La inhibición de la miosina elimina las fuerzas de tracción.
contracción inhibida
La migración celular es el resultado del
balance entre la fuerza mecánica que
genera el citoesqueleto y la resistencia que
oponen las adhesiones focales.
A través de las actividades de protrusión y retracción las células
sensan la rigidez del substrato y adaptan la respuesta migratoria
Lo et al. Biophys J. 2000
redireccionamiento de la migración en respuesta al incremento de tensión ejercido por una micropipeta. Note la formación de una nueva lamela orientada hacia la región tensionada por la micropipeta.
micro pipeta
tensión
redireccionamiento de la migración en respuesta a la tensión del substrato. En este experimento una célula sembrada en el borde un substrato que exhibe un gradiente de rigidez es filmada a distintos tiempos.
lamela
lamela
La migración direccionada de las células hacia regiones mas rígidas del substrato se denominadurotaxis
Note que la célula produce una lamela (flecha) y migra hacia la región mas rígida (stiff) del substrato.
En este experimento las células estan adheridas a un substrato deformable (poliacrilamida).
Experimentos con
trampas láser
revelan un flujo retrógado del
citoesqueleto de actina en la lamela y lamelipodio
Choquet et al, Cell 1997
Con la ayuda de una trampa láser puede posicionarse una microesfera cubierta con fibronectina sobre
el borde de la lamela (a). Después de apagar la trampa láser se puede medir la velocidad y trayectoria de la microesfera determinando su posición en función del tiempo (gráfico en b).
microesfera microesfera actina integrinas a video disponible MBC
a
b
El flujo retrógrado de actina es determinado por la fuerza de empuje causada por la
polimerización de actina y por la tracción generada por miosina. El movimiento retrógrado de
la microesfera hacia el centro de la célula requiere del anclaje de las integrinas a los filamentos
de actina.
miosina force
actina vinculina actina vinculina
Las GTPasas
rho, rac y cdc42
controlan la actividad de varias
proteínas reguladoras de la organización tridimensional de la actina
rho activo P-miosina formación de fibras de estrés
rac activo PIP2 formación de lamelipodio cdc42 activo formación de filopodios
células quiescentes
Fibroblastos quiescentes microinyectados con mutantes de GTPasas constitutivamente activas. Se muestra el citoesqueleto de actina y los focos de adhesión (vinculina). La microinyección de rho activo induce la formación de fibras de estrés; Rac induce la formación de un lamelipodio; Cdc42 induce la formación de filopodios
La actividad de
rho, rac y Cdc42
es regulada
por señales extracelulares
La señalización de diversos receptores de superficie convergen en la activación de rho, rac y Cdc42
La transducción de señales a través de rho, rac y cdc42 resulta en la activación temprana de la polimerización de actina en el margen de avance y la formación tardía de focos de adhesión
ácido lisofosfátídico (LPA) > mitógeno, activador de rho
Rac-GTP promueve la extensión de la lamela de avance a través de la activación de los complejos Arp2/3.
La extensión de la lamela de avance (protrusión) requiere
de la activación de la GTPasa
rac
dirección del movimiento
(del Pozo, Kiosses, Schwartz)
(-) nivel de activación (+)
localización de rac activo mediante FRET
integrinas
factores
de crecimiento
↑Rac ↑Scare/WAVE ↑Arp2/3 ↑polimerización de actina
lamela de avance
interaction = FRET no interaction = no FRET Rac-GDP Rac-GTP efector efectorBershadsky et al Curr. Biol., 1996
Rho
se activa cuando se depolimerizan los microtúbulos, como consecuencia
se forman fibras de estrés y adhesiones focales
microtúbulos
vinculina
F-actina
control + nocodazol
↑Rho
nocodazol
↑Rho K
↑miosina II
Fibras de estrés
actividad contráctil
ensamble de
adhesiones focales
Mecanismos de regulación de la actividad de la
miosina II
Integrinas Rho Rho kinasa MLC-Pi + actina contractilidad MLC fosfatasa
En células musculares esqueléticas la actividad de la miosina II (MLC) es regulada por fosforilación mediada por MLCK. MLCK es activada por calcio y calmodulina. En células musculares lisas y no musculares, ej. fibroblastos, la activación de MLC depende de la Rho kinasa.
Rho kinase
Rho kinase
VIDEO 11
La
quimiotaxis
es la migración celular dirigida por el gradiente de un
agente químico que difunde
La unión del quimioatractante a su receptor resulta en la activación de Rac en el frente de la célula y de Rho en la cola, manteniendo la polaridad funcional de la célula migratoria con la formación de una protrusión en el margen de avance y contracción en la cola.
N-formil péptido
extensión de un nuevo lamelipodio polarización del citoesqueleto miosina II
migración Arp2/3
La polaridad de las células migratorias involucra la actividad
coordinada de las GTPasas
rho, rac y Cdc42
Ridley et al, Science 2003
Protrusión y formación de adhesiones. Señales
extracelulares activan a la GTPasaRac. Rac activa a las proteínas WASP/Scar y éstas a los complejos
Arp2/3. Los complejos Arp2/3 activos se asocian a filamentos pre-existentes y nuclean actina. Este proceso da lugar a nuevos filamentos de actina (ramas). Arp2/3 WAVE/WASP Rac/Cdc42 Rho Myosin II
Retracción de la parte posterior.
Señales que regulan la actividad de Rho, miosina II, niveles de Ca2+ y el transporte
Los MTs contribuyen a polarizar
las células durante la migración
Señales extracelulares que estimulan receptores de membrana inducen la polarización de la célula reorientando el centro organizador de microtúbulos (MTOC) hacia el margen de avance o ¨leading edge¨ (a). Los extremos (+) de los microtúbulos dinámicos, que alternan entre estados de crecimiento yacortamiento, son capturados y estabilizados en el citoesqueleto cortical de la membrana de avance.
Material necesario para el avance de las células, y moléculas recicladas, emplean los microtúbulos para su transporte.
La presencia de MTs en proximidad de la membrana puede ser visualizada
por microscopía de campo evanescente o TIRFM
En TIRFM la luz de un láser es proyectada en forma oblicua sobre el cubreobjeto, con un ángulo de incidencia mayor a un valor crítico (qc), lo cual permite reflejar la totalidad de la luz en la interfase del vidrio (álto índice de refracción) y la célula (bajo índice de
refracción), generar un campo de excitación evanescente que decae exponencialmente con la distancia de la interfaz (~ 100-200 nm) y excitar las moléculas fluorescentes.
En la periferia celular los extremos (+) de los microtúbulos contactan y
regulan a los focos de adhesión a la matriz extracelular
Secuencia que muestra el contacto de un microtúbulo (en rojo) con un foco de adhesión (en verde)
Fibroblastos transfectados con una proteína que se localiza en focos
de adhesión fusionada a GFP (verde). Las células transfectadas
fueron microinyectadas con tubulina conjugada a rodamina (en rojo)
y examinadas por microscopía de campo evanescente.
Krylyshkina et al JCB 2003 contactos repetidos de MTs
Proteínas fluorescentes que se unen al extremo (+) de los microtúbulos
también permiten visualizar los contactos con los focos de adhesión
CLIP170 es una proteína que solo se asocia al extremo (+) de microtúbulos con cap de tubulina-GTP (en estado de crecimiento).
Krylyshkina et al JCB2003
Se muestra una célula co-transfectada con zyxina-DsRed (para marcar focos de adhesión) y GFP-CLIP170. Las flechas señalan los extremos (+) de 3 extremos de MTs (verde) que se elongan en dirección de focos de adhesión (rojo). (A) Imágenes confocales y (B) TIRFM. La polimerización de microtúbulos se dirige hacia el campo evanescente donde +TIPs se anclan en un filamento de actina. La depolimerización se asocia con la pérdida de +TIPs y resulta en el desprendimiento del microtúbulo del filamento de actina y del sustrato.
El contacto de microtúbulos con focos de adhesión provoca su desensamble
Ezratty 2005 Nat Cell Biol
En una célula migratoria se forman pequeños
complejos focales en el márgen de avance (Front) independiente de microtúbulos. A medida que estos crecen y la célula avanza, el contacto de los microtúbulos cerca de la región perinuclear y en la región posterior de la célula modula la actividad de Rho provocando el desensamble de adhesiones focales. El desensamble de los focos de adhesión y la contracción mediada por actina y miosina permiten que la célula avance.
Secuencia que muestra la desaparición de un foco de adhesión marcado con GFP-b1-integrina (rojo) después de ser contactado por MTs (en verde).
Migración colectiva
1) las células permanecen conectadas físicamente y funcionalmente de manera que la
unión célula-célula se conserva durante el movimiento
2) la polaridad multicelular y la organización
“supracelular” del citoesqueleto de actina
generan fuerzas de tracción y protrusión para la migración y mantienen las uniones
célula-célula
3) el grupo de células en movimiento modifica el tejido a lo largo del camino de migración
- formación de tejidos y órganos durante el desarrollo de organismos
multicelulares
- cierre de heridas, renovación de tejidos y angiogénesis en adultos
- propagación de tumores
angiogénesis invasión
migración de células individuales
polarización de células líderes
A pesar de experimentar una
reorientación de la polaridad baso-apical
epitelial hacia una polarización en el
frente de avance, las células líderes
retienen características epiteliales y
permanecen unidas a las células vecinas.
Las líderes presentan estructuras
protusivas dinámicas: filopodios y ruffles.
En un grupo cohesivo de células que
migran, las líderes sensan señales del
ambiente e interaccionan con la matriz
extracelular en el frente y la parte
posterior está comprometida en la
formación de uniones intercelulares. Las
uniones adherentes restringen la
localización de adhesiones focales al
frente de la célula a través de la inhibición
de su formación.
Polarización e células líderes
En las células líderes hay una regulación positiva de Rac1 e integrinas
La distribución de la forma activa de Rac puede investigarse usando como
sonda PAK-PBD-GFP. La sonda se localiza en el frente de avance de las células
líderes de células MDBK que migran colectivamente. Además las células líderes
muestran una señal de Rac más polarizada que las células que las siguen. La
integrina ß1 se localiza en los lamelipodios de las células líderes.
La interacción de moléculas de superficie en los sitios de contacto célula-célula resultan en la
activación de RhoA y la inhibición de Rac en los sitios de contacto. Esto se traduce en la
catástrofe de microtúbulos, el desensamblado de focos de adhesión (círculos blancos) y la
contracción de actomiosina en los sitios de contacto. En el frente de la célula líder, hay
activación de Rac y polimerización de microtúbulos y filamentos de actina, y estabilización de
adhesiones focales (círculos rojos).
Proteínas de superficie involucradas en los contactos célula-célula
regulan la actividad de GTPasas
Interacción de patógenos
intracelulares con microtúbulos
y microfilamentos
El transporte de virus como influenza, herpes y vaccinia hacia la
periferia celular durante la salida depende de microtúbulos
Partículas que exceden los 20 nm requieren del movimiento dependiente de energía para viajar a través del citosol. Algunos virus interaccionan con motores moleculares (ej. kinesinas) para mover la progenie que se ensambla en el citosol hacia la membrana plasmática y propagar la infección.
El virus vaccinia contiene un motivo de secuencia conservado que
media la interacción con la cadena liviana de kinesina1
El transporte del virus hacia la periferia de
la célula requiere de un motivo de unión a
kinesina-1 en una de las proteínas de
membrana del virus. Las imágenes de
inmunofluorescencia en (A) muestran que
los virus (azul) asociados a microtúbulos
(verde)
reclutan
kinesina-1
(rojo).
El
movimiento del virus sobre microtúbulos
puede seguirse usando video microscopía
(B).
El
movimiento
del
virus
puede
inhibirse
reversiblemente
usando
nocodazol
para
depolimerizar
los
Lodish MBC2004
Motilidad dependiente de la polimerización de actina
de patógenos intracelulares
La bacteria intracelular Listeria
monocytogenes utiliza la
maquinaria celular de
polimerización de actina para
impulsar su movimiento
intracelular y propagar de una
célula infectada a las células
vecinas.
Visualización del movimiento de L. monocytogenes dentro de la célula
empleando microscopía de fluorescencia. La bacteria se visualiza en rojo, y la actina polimerizada en el polo caudal se visualiza como una cometa en verde
La proteína
ActA
localizada en el polo caudal de la bacteria Listeria monocytogenes
se une y activa proteínas del huesped, como
Arp2/3
,
VASP
y
profilina
, induciendo la
nucleación y polimerización de actina. La rápida polimerización de actina en el polo
caudal de la bacteria le permite moverse en el citosol de la célula huesped.
La proteína ActA de Listeria se une y activa el complejo ARP2/3
Cameron et al, Nature RMCB 2001
ActA es un homólogo de las proteínas eucariotas de la
familia WASP/WAVE
Las proteínas de la familia WASP son las
principales
reguladoras
del
complejo
Arp2/3 en la célula eucariota. WASP se
une simultáneamente a un monómero de
actina y al complejo ARP2/3 activándolo
para la nucleación de filamentos de
actina.
Patógenos intracelulares activan el complejo Arp2/3
para adquirir motilidad dependiente de la polimerización
de actina
La proteína ActA en la superficie de Listeria une y activa el complejo Arp2/3 en la célula
huésped. La proteína IcsA de Shigella une N-WASP para activar el complejo Arp2/3. La
forma extracelular de vaccinia dispara una cascada de señalización que culmina con el
reclutamiento de N-WASP y la activación del complejo Arp2/3.
L
iste
ria
Sh
ig
e
lla
va
cci
n
ia
F- actina
Sca2 en la superficie de Rickettsia imita la actividad de
las forminas para elongar filamentos de actina
Gouin , Welch & Cossart (2005) Curr Opin Microbiol
