Medición del coeficiente de difusión en una monocapa lipídica con y sin presencia de dominios por método experimental y por simulación Monte Carlo

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(1)Universidad de los Andes Facultad de Ciencias Departamento de Física Tesis. Medición del coeciente de difusión en una monocapa lipídica con y sin presencia de dominios por método experimental y por simulación Monte Carlo. Juan Daniel Flórez Weidinger para la obtención del título. Físico Director:. Dr. Chad Leidy. 2. Semestre del 2007.

(2) Agradezco especialmente a Chad Leidy y a Carlos Álvarez por su amistad, dirección y. colaboración en el proyecto, a mis padres por su apoyo y cariño, a mi hermano por su. ejemplo y enseñanzas y a ni novia Melanie por su paciencia y compañía.. Dedicado a todos los que me han ayudado, aconsejado y acompañado durante el. transcurso de esta tesis y a lo largo de la carrera de física.. Bogotá, 29 de Noviembre del 2007.

(3) Resumen Esta tesis de pregrado en la carrera de Física presenta un modelo energético para una membrana lipídica de una sola capa, en el cual los componentes disponen de un grado de libertad de orden interno, sólido y líquido. Se describe el programa escrito en C++ aplicado al modelo, que permite efectuar a éste simulaciones tipo Monte Carlo. Paralelamente se explica la aproximación empleada para medir fenómenos cinéticos en la simulación, con base en Kinetic Monte Carlo. Luego de describir el método usado para calibrar el sistema, el programa permite medir el coeciente de difusión y su dependencia del porcentaje de lípidos en fase sólida. Se intenta acto seguido encontrar con estos datos el límite de percolación. En la parte experimental del sistema, usando la mezcla de lípidos DOPC/BSM/CHOL se generan membranas que muestran separación de fase líquida ordenada y líquida desordenada, controlando el porcentaje de área cubierto por los dominios ordenados variando la temperatura. Se realizan mediciones con FRAP del coeciente de difusión en la membrana, que permitan compararlo con los resultados de las simulaciones, para evaluar la validez tanto del modelo propuesto como del programa escrito..

(4) Índice general 1. Introducción. 1. 1.1.. Modelación de Fenómenos Naturales. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 1. 1.2.. Objetivo de la Tesis. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 3. 2. Conceptos Generales 2.1.. 6. Bases necesarias de biofísica de membranas. . . . . . . . . . . . . . . . . .. 6. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 6. 2.1.1.. Lípidos. 2.1.2.. Membranas Lipídicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 7. 2.1.3.. Dominios Lipídicos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 9. 2.1.4.. Colesterol . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 10. 2.1.5.. Sondas Fluorescentes . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 11. 2.1.6.. Difusión dentro de la membrana. 12. . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 2.2.. Teoría del coeciente de difusión. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 13. 2.3.. Medición experimental del coeciente de difusión por FRAP . . . . . . . .. 14. 2.4.. Simulaciones computacionales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 18. 2.4.1.. Tipos de simulación. 18. 2.4.2.. Teoría de la simulación Monte Carlo. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 3. Parte Experimental. 20. 24. 3.1.. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 24. 3.2.. Diseño experimental. 24. 3.3.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 3.2.1.. Diseño basado en Langmuir Trough . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 25. 3.2.2.. Diseño actual . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 26. 3.2.3.. Protocolo elaboración de membranas apoyadas. . . . . . . . . . . .. 26. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 29. 4. Parte Computacional. 38. 4.1.. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 4.2.. Modelo propuesto . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 39. 4.3.. Programa en C++. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 41. 4.3.1.. Características de la simulación . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 41. 4.3.2.. Descripción de las clases usadas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 45. 4.3.3.. Descripción de las funciones de medida sobre el sistema. 52. i. . . . . . .. 38.

(5) 4.3.4. 4.4.. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 54. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. Desarrollo de la simulación. 57. 5. Discusión. 65. 5.1.. Introducción . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 5.2.. Análisis de los resultados obtenidos . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 65. 5.3.. Conclusión . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 71. A. Diseño del aparato experimental basado en Langmuir Trough B. Diagrama de clases para el programa en C++ C. CD adjunto con el programa en C++. ii. 65. 73 77 78.

(6) 1 Introducción 1.1. Modelación de Fenómenos Naturales La mayoría de los fenómenos de la naturaleza permiten ser modelados para hacer predicciones de su comportamiento. Estos modelos son de suma importancia, por un lado porque de ellos se puede desarrollar una amplia gama de aplicaciones para la vida diaria, y por otra parte porque aportan al conocimiento cientíco del mundo que nos rodea. Los modelos pueden ser desde muy sencillos, como el de un péndulo simple, hasta bastante complejos con muchos parámetros importantes, como los pronósticos climáticos. Hay muchas formas de aproximarse a un fenómeno para poder desarrollar un modelo, pero en general estas se reducen a tres: Modelación Experimental, Modelación Teórica y Modelación Computacional. A continuación se describen brevemente estos tres tipos de acercamiento.. Modelación Experimental Es la forma más antigua de modelar un fenómeno y se aplica ampliamente obteniéndose muy buenos resultados. En este tipo de modelación se crea un sistema experimental semejante al del fenómeno que se quiere estudiar, en el cual se puedan controlar las condiciones del sistema. Para llegar al modelo se observa en el sistema experimental cuáles son las consecuencias de variar una condición manteniendo las otras jas, y se analiza con ello la correlación de ésta con las demás. Esto se hace para la mayor cantidad de variables posibles, de tal forma que se obtenga una estadística conable. Con estos datos se elabora un modelo del sistema que describa su comportamiento dependiendo de los valores iniciales de las condiciones. Con el modelo se pueden hacer predicciones del sistema real, comprobando así su exactitud.. Modelación Teórica Aquí se aplica el uso de las leyes fundamentales de la física para poder modelar el sistema. Para esto se toma como base el sistema en el cual se presenta el fenómeno y se limita la cantidad de grados de libertad, obteniendo un subsistema del sistema real. Usando los principios mencionados, al reducir el sistema lo suciente, éste se vuelve analíticamente soluble, haciendo posible describir su comportamiento en un cierto número de ecuaciones. Como esta solución es un elemento del subsistema, también lo va a ser del sistema real. Es posible aumentar la precisión del modelo agregando grados de libertad, ya sea. 1.

(7) directamente o como una perturbación. Nuevamente el modelo se puede comparar con el sistema real con experimentos y predicciones.. Modelación Computacional A partir de la proliferación de computadores cada vez con mejores propiedades, éstos se usan como herramienta en la elaboración de los modelos. Por un lado son frecuentemente empleados experimentalmente para crear, controlar y monitorear los sistemas analizados y para elaborar las estadísticas de los datos obtenidos. Por otra parte, en la modelación teórica sirven para resolver las ecuaciones resultantes en la creación del modelo. Finalmente, para ambas aproximaciones, se pueden realizar simulaciones con los modelos obtenidos y comparar los resultados con observaciones del fenómeno. Sin embargo, si se restringe el uso de los computadores a la función anterior se desprecia su gran potencial como método de aproximación a un fenómeno. Se pueden proponer nuevos modelos, nuevos tipos de interacciones en el sistema, el aumento de los grados de libertad, incluir acoples, variar o despreciar algunas constantes, etc. Los límites se establecerán únicamente por los recursos computacionales empleados. Se pueden proponer sistemas que sean demasiado complicados de realizar experimentalmente o imposibles de resolver analíticamente. La modelación por computador permite plantear cualquier tipo de modelo sin necesidad de tener que demostrar o calcular de antemano su ecacia. Hay que tener en cuenta que al aumentar la complejidad del sistema, proponiendo nuevos factores, se está agregando de igual forma la disponibilidad de estados que pueden no ser compatibles con los del sistema real, de tal forma que los resultados del modelo pueden llegar a perder relación con el fenómeno analizado. Por esto es siempre necesario, una vez propuesto el modelo computacional y la física dentro de él, comparar rutinariamente los resultados de simulaciones con el sistema real por medio de observaciones y predicciones, de tal forma que se dena si la inclusión o exclusión de algún elemento del modelo lo hace semejante o no a la realidad. En igual forma se pueden ajustar los parámetros del programa y escalar las magnitudes. Una vez se encuentre una similitud, se puede elaborar un modelo a partir de los elementos propuestos en la simulación. Para aclarar la diferencia entre los tres tipos de modelación, se va a usar un ejemplo basado en K.Binder [1]. Supongamos que queremos hacer un modelo de las oscilaciones de una masa atada a un resorte. Si usamos un acercamiento experimental, se crean varios sistemas con diferentes tipos de resortes y de masas, se hacen oscilar todos y se observa en cada uno de ellos las relaciones que hay entre las variables. Con los datos recopilados se puede llegar a describir el comportamiento de las oscilaciones en forma de un modelo. Usando un acercamiento teórico, describimos las fuerzas que actúan en el sistema restringiéndolas a un solo eje y no consideramos cualquier tipo de fricción con su entorno y/o intercambio de energía entre la masa y el resorte. De las soluciones a las ecuaciones. 2.

(8) se obtiene un modelo del sistema, el cual puede ser ampliado agregando factores que fueron previamente excluidos. Finalmente, usando el procedimiento computacional, tomamos la masa en la mano intentando recrear un movimiento que se asemeje lo mejor posible al movimiento real. Teniendo en cuenta que podemos estar incluyendo movimientos no naturales del resorte, comparamos los resultados con los del sistema real, y conociendo el movimiento que nosotros mismos creamos, podemos elaborar el modelo. Llevar a cabo un procedimiento computacional tiene muchas ventajas sobre los otros métodos, a saber:. Se puede hacer con bajo presupuesto y repetidas veces. Una vez se tiene el modelo para un fenómeno, se puede modicarse fácilmente para describir otro. Toma generalmente menos tiempo el correr una simulación con ciertos valores iniciales que diseñar un experimento real en las mismas condiciones. Todas las variables se pueden controlar y cambiar sencillamente. Se aumenta la determinación experimental, ya que se pueden examinar sistemas a nivel microscópico. Se pueden analizar fenómenos y correlaciones que son muy difíciles de calcular teóricamente.. Es por esto que las simulaciones por computador han tomado en general un rol principal en la investigación teórica, especialmente en las áreas de física de sistemas complejos y de física de la materia blanda condensada. En muchos casos es la única forma de hacer un progreso cuantitativo en el estudio de los fenómenos [2].. 1.2. Objetivo de la Tesis El objetivo de la tesis de grado es crear una simulación tipo Monte Carlo sobre un modelo energético de una membrana lipídica. La simulación mide el coeciente de difusión de los lípidos en la membrana con y sin presencia de dominios lipídicos. En la parte experimental de la tesis se crea un protocolo para la elaboración de membranas apoyadas en las cuales se puede medir difusión por FRAP y se exponen los resultados de las mediciones. Finalmente se contrastan los resultados obtenidos en la simulación por computador con mediciones. 3.

(9) experimentales encontradas en la literatura, de tal forma que se establece el éxito de la simulación y la validez del modelo propuesto. El programa que se desarrolla es una herramienta en todos los aspectos anteriormente mencionados para su aplicación en el laboratorio de Biofísica de la Universidad de los Andes. Es la base para iniciar la investigación computacional sobre las membranas lipídicas. Por esto, el programa es fácilmente entendible y reproducible sin necesidad de consultar a su autor; también es posible modicarlo o reutilizarlo sin inconvenientes para otros tipos de aplicaciones o investigaciones en membranas. Medir el coeciente de difusión en una membrana lipídica, además de usarse para determinar la validez del modelo y ajustar el sistema computacional, tiene una relevancia biológica gigantesca. Como se verá más detenidamente en el siguiente capítulo sobre la biofísica de membranas, la interacción de una célula con su entorno es mediada por la membrana celular, la cual está compuesta por lípidos. La velocidad, la sensibilidad y la amplitud de la reacción de la célula con su entorno dependen fuertemente de la constante de difusión dentro de la membrana [3]. Se han hallado en las membranas celulares dominios lipídicos, donde la constante de difusión puede cambiar por un par de órdenes de magnitud con respecto al resto de la membrana, modicando la respuesta general de la célula [4]. Entender y modelar el comportamiento del coeciente de difusión de la membrana, dependiendo de sus componentes y los dominios que presenta, es a la vez analizar y modelar varias características de los procesos dinámicos llevados a cabo por la célula a través de su membrana. Este conocimiento cientíco tiene muchas aplicaciones, entre otras, en el diseño de medicinas que se deban incluir a la membrana celular, como los anestésicos [5][6]. Para un entendimiento integral de la tesis, ésta se ha dividido en varios capítulos. En el capítulo 2 se exponen los conocimientos y fórmulas básicas necesarias para el desarrollo de la tesis. En él se hace un breve resumen de los principales postulados de la biofísica de membranas, se explica la ecuación de difusión y la teoría necesaria para poder analizarlo experimentalmente por medio de FRAP. Se naliza con una breve exposición sobre las simulaciones computacionales y se desarrolla la teoría de las simulaciones tipo Monte Carlo. El capítulo 3 se trata la parte experimental de la tesis. Primero se describe un diseño experimental basado en un Langmuir Trough desarrollado anteriormente para medir el coeciente de difusión en una membrana lipídica, el cual tuvo que ser abandonado por problemas en su construcción. Seguido a esto se expone el diseño denitivo que se empleó para las mediciones de difusión, describiendo el protocolo obtenido para elaborar las membranas in Vitro. Al nal se muestran los resultados obtenidos en las mediciones del coeciente de difusión usando FRAP. En el capítulo 4 se muestra la parte computacional de la tesis. Se inicia estableciendo el modelo energético que se usa para los componentes de la membrana lipídica. Luego. 4.

(10) se expone el programa desarrollado en C++ para correr las simulaciones sobre el modelo, mostrando en orden las características globales de la simulación, la descripción de las clases usadas y de las funciones de medida sobre el sistema y nalmente cómo es el desarrollo especíco de la simulación. El capítulo termina mostrando los resultados obtenidos al ejecutar el programa. Como parte nal, en el capítulo 5 se comparan los resultados computacionales del coeciente de difusión con mediciones experimentales realizadas en la literatura, estableciendo así el éxito del modelo. Se termina la tesis enumerando propuestas de mejoras que se pueden hacer al programa y futuras aplicaciones que éste puede tener sin necesidad de grandes modicaciones.. 5.

(11) 2 Conceptos Generales 2.1. Bases necesarias de biofísica de membranas Tanto en la parte experimental como en la computacional se tratan constantemente las membranas lipídicas, por lo que es necesario hacer un breve resumen de los conocimientos biofísicos necesarios para formar la base teórica de la tesis. Primero se habla de los lípidos, moléculas biológicas de las que están compuestas las membranas. Luego se pasa a las membranas lipídicas en sí, describiendo el fenómeno de los dominios lipídicos que se presenta en ellas y cómo el colesterol puede potenciar este comportamiento. Finalmente se reseña el uso de las sondas uorescentes para el análisis de las membranas lipídicas, puesto que van a ser usadas en la parte experimental de la tesis.. 2.1.1.. Lípidos. Todos los organismos vivos están construidos con las mismas moléculas orgánicas con base en estructuras de carbón. El primer grupo de estas moléculas corresponde a los cientos de azúcares diferentes, que constituyen la principal fuente de energía de una célula. Estos se pueden conectar entre sí para formar polisacáridos y ser almacenados o cumplir roles estructurales. El segundo grupo de moléculas son los 20 aminoácidos, que combinados en millones de formas diferentes forman proteínas, los principales bloques de construcción de la célula. Cinco nucleótidos forman el tercer grupo, cuya combinación secuencial almacena información en el ADN y ARN. El cuarto y último grupo corresponde a los ácidos grasos, que a diferencia de los otros grupos, no cuentan con la propiedad de unirse covalentemente para formar polímeros. Los ácidos grasos son una larga cadena de hidrocarburos, más comúnmente de 14 a 22 carbonos. Los carbonos de esta cadena pueden estar unidos por enlaces simples o dobles, cambiando su forma espacial en cada caso. Cada enlace doble recibe el nombre de una insaturación, y el ácido graso se puede caracterizar nombrando la cantidad de carbonos que contiene y las posiciones de sus instauraciones. Esta larga cadena es altamente hidrofóbica, haciéndola insoluble en agua. Los lípidos están compuestos por uno o más ácidos grasos y por una cabeza carboxila hidrofílica, es decir, que se puede disolver en agua. Por los diferentes tipos de cabeza que pueden tener y la alta variedad de las cadenas, la diversidad de lípidos es muy amplia.. 6.

(12) Algunos ejemplos de los tipos de cabezas que pueden tener los lípidos son Phosphaditylcholine, Phosphaditylethanolamine o Phosphaditylserine. Algunos ácidos grasos comunes son Lauric Acid, con 12 carbonos, Myristic Acid, de 14, u Oleic Acid, con 18 carbonos y una instauración cis en la posición 9. Juntando cabezas y colas, se pueden obtener lípidos como 1,2-Dioleoyl-sn -Glycero-3-phosphocholine, 1,2-Dimyristoyl-sn- Glycero-3phosphocholine o 1,2-Dierucoyl-sn-Glycero -3-phosphoethanolamine. Estas son apenas tres referencias de la amplia gama de lípidos encontrados en la naturaleza. Para no escribir siempre la descripción química entera se usa una notación compacta, la cual determina inequívocamente el lípido en uso. Para los ejemplos citados, su notación compacta es respectivamente DOPC, DMPC y DEPE. Con el objetivo de tener un estándar mundial para la nomenclatura de los lípidos se han creado manuales internacionales, como el de la IUPAC-IUB [7]. Tres lípidos diferentes están retratados en la gura 2.1. Se puede ver cómo su conguración espacial es completamente diferente entre si, dependiendo del tipo de cabeza y de colas. Cada uno de estos lípidos, por su forma espacial, cantidad de enlaces, componentes, entre otros, tiene diferentes propiedades físicas, como peso molecular, calor especíco o temperatura de transición.. Figura 2.1:. La cantidad de carbonos, el tipo de cabeza y las instaturaciones dan una amplia gama de lípidos. En la imagen se muestran de izquierda a derecha DSPE, DSPC y SOPC. Tomado de [8].. 2.1.2.. Membranas Lipídicas. Los lípidos se pueden agregar de formas no covalentes para constituir las membranas lipídicas, la estructura celular más abundante. Las membranas se encuentran en los lisosomas, en el aparato de Golgi, en la mitocondria, delimitando a la célula y en muchos. 7.

(13) lugares más, tomando siempre un rol principal en todos los procesos que estos organelos desempeñan. Estando los lípidos en el agua buscan la conguración más estable maximizando su entropía. Inicialmente alrededor de los lípidos hay orden en alto grado, ya que el agua se organiza de tal forma que encapsula sus partes hidrofóbicas. La conguración más estable se presenta cuando las cabezas polares son las únicas expuestas al agua. Como se puede ver en la gura 2.2, las fuerzas hidrofóbicas que se desarrollan tienden a agrupar los lípidos, formando capas o vesículas. En cada caso la cantidad de estados disponibles del agua aumenta, ya que se disminuye la cantidad de moléculas jas que rodean los lípidos. Este nivel de desorden del agua supera al nivel de orden alcanzado por la creación de la membrana, convirtiéndose en la conguración más estable.. Figura 2.2:. a) Las fuerzas hidrofóbicas tienden a aglomerar los lípidos en capas. b) Al haber sucientes lípidos se forman vesículas de una o dos capas de lípidos. Como en sistemas reales de membranas se acostumbra mantener constante la presión y la temperatura, las funciones de estado en biofísica de membranas se suelen describir usando la energía de Gibbs. El sistema llega al equilibrio cuando ésta llega a un mínimo. Esto a la vez quiere decir que si el cambio de energía de Gibbs es negativo durante un proceso, éste va a ser favorecido pues va a aproximar al sistema al equilibrio. Observando la ecuación de la energía de Gibbs hacemos:. G(T, p) = U + pV − T S = H − T S ∆G(T, p) = ∆H − T ∆S Donde H es la entalpía del sistema. Para cadenas CH3 − (CH2 )n − CH3 , al pasar de un entorno polar. simples de hidrocarburos del tipo (como el agua) a uno apolar (como. en el interior de la membrana), el cambio de la energía de Gibbs es aproximadamente [9]:. J J ∆G ≈ −8795 mol nCH3 − 3799 mol nCH2. 8.

(14) Se puede ver que tiene un valor negativo, por lo que se sabe que la agregación de los lípidos es un proceso netamente espontáneo. Las membranas biológicas están formadas por una doble capa de lípidos, donde las cabezas hidrofílicas apuntan hacia fuera de la membrana y los ácidos grasos hidrofóbicos permanecen en su interior. Esto crea una barrera para el paso de partículas hidrofílicas, que no pueden ingresar fácilmente al interior de la membrana. Existen proteínas con las mismas propiedades anpáticas que los lípidos de la membrana, por lo que se pueden incluir en ellas y actuar como receptores o cumplir otras funciones. El empaquetamiento no covalente de los lípidos y las proteínas dentro de la membrana permite su libre movimiento en el plano de ésta, haciéndola una estructura muy dinámica. Ya que la membrana y sus proteínas juegan un papel mediador entre la célula y su entorno, es importante investigar sus propiedades biofísicas para entender así los procesos que se llevan a cabo en la célula.. 2.1.3.. Dominios Lipídicos. Tal como cualquier compuesto, las membranas sufren transiciones de fase al cambiar la temperatura de su entorno. Por un lado, cuando la membrana está a baja temperatura, los lípidos se ordenan en su supercie en una conguración hexagonal. Según aumenta la temperatura este orden se va perdiendo, hasta que a altas temperaturas no se tiene uno especíco. A este fenómeno se le tiene el nombre de transición de fase entre sólido y líquido. Por otro lado, cuando la membrana está a baja temperatura, los enlaces entre los carbonos de las cadenas de los lípidos tienden a estar en su mayoría en conguración trans. Según se aumenta la temperatura este orden se empieza a perder, formándose isomerizaciones. A este tipo de transformación se le llama transición de fase de ordenado a desordenado. Estas transiciones de fase están dibujadas en la gura 2.3. Básicamente las membranas tienen dos fases principales, sólido-ordenado (denominada fase gel) y líquida-desordenada (denominada fase uida). La membrana interactúa de una forma diferente con el entorno dependiendo de la fase en que se encuentre. Esto debido a que la densidad de empaquetamiento cambia, modicando la difusión en el medio y cambiando así la velocidad de respuesta de la membrana. También cambian otras propiedades físicas importantes como la curvatura de la membrana, la exibilidad o la probabilidad de ciertas proteínas membranales de incluírse, lo que puede llevar a la membrana a alcanzar la concentración de reactivos crítica para desencadenarse una respuesta dentro de la célula. Entre más larga sea la cadena de hidrocarburos y mayor cantidad de insaturaciones tenga, más calor va a ser requerido para que ocurra una transición. Cuando la membrana está. 9.

(15) Figura 2.3:. Por los grados de libertad que tiene los lípidos éstos pueden hacer transiciones de fase tanto en orden espacial como interno. Tomado de [3]. compuesta por dos o más tipos de lípidos diferentes, las transiciones de fase se llevan a cabo a diferentes temperaturas. Esto quiere decir que, a unas condiciones externas especícas, los compuestos de la membrana pueden estar en diferentes fases al mismo tiempo. Dado que los lípidos que están en el mismo estado tienen una mayor anidad entre sí y que estos se pueden desplazar libremente en el plano de la membrana, es posible ver la formación de dominios lipídicos. Así, teniendo la célula una cierta composición de diferentes tipos de lípidos en su membrana, puede interactuar al mismo tiempo de formas diferentes con el exterior formando dominios que cumplan los roles separadamente. Igualmente, la célula puede regular su respuesta dadas las condiciones que el entorno le imponga, aumentando o disminuyendo espontáneamente el tamaño de sus dominios.. 2.1.4.. Colesterol. El colesterol es un lípido que a diferencia de los otros mencionados anteriormente tiene un anillo esteroide como esqueleto de sus cadenas de hidrocarbonos y su cabeza está formada por un grupo hidroxilo simple. En la gura 2.4 se muestra una representación estructural de una molécula de colesterol. El colesterol se incluye en la membrana por las mismas fuerzas de interacción con el agua de los lípidos normales. Por un lado, una vez dentro de la membrana, podría agregarse a la fase sólida ordenada dadas las interacciones más cercanas que obtiene por la forma de su parte hidrofóbica. Por otro lado, por el bajo empaquetamiento que se presenta en la fase líquida desordenada, preferiría agregarse a ésta para mantenerse a un menor costo energético en la membrana. Por esto, al tener colesterol como componente, se induce un nuevo tipo de fase; la líquida ordenada.. 10.

(16) Figura 2.4:. Esquema molecular del colesterol. Se puede apreciar el anillo esteroide como esqueleto. Tomado de [10]. Esta fase tiene muchas funciones siológicas importantes, como por ejemplo la capacidad de evitar congelamiento, por lo que una célula puede necesitar incluir este tipo de dominio en su membrana. Aunque depende mucho del organismo y la función de la célula, en promedio el 20 % del peso de las membranas in Vivo está compuesto por colesterol [11]. Como el colesterol aumenta la formación de dominios en la membrana, esta molécula se suele emplear experimentalmente cuando se quiere investigar alguna función que tenga que ver con mezcla de fases. También se han hecho muchos estudios sobre su inuencia en la elasticidad de la membrana, su uidez, entre muchos otros aspectos. Para la simulación computacional que se explicará más adelante nos concentramos únicamente en la separación de fases líquida desordenada y sólida ordenada, dejando por fuera la inuencia del colesterol. Una futura aplicación del programa puede ser incluir una molécula como ésta, y analizar sus efectos sobre la simulación de la membrana.. 2.1.5.. Sondas Fluorescentes. Como las membranas lipídicas tienen apenas un par de nanómetros de espesor, para poder estudiarlas ópticamente en el laboratorio es necesario el uso de una sonda uorescente [19]. Ésta consiste usualmente en una molécula que se agrega naturalmente a la membrana por ser hidrofóbica y por tener una anidad a los lípidos que la componen. Para poder usar las sondas en la investigación es necesario un microscopio de uorescencia. La molécula uorescente reacciona a la entrada de luz de cierta longitud de onda y reenvía la luz a una longitud de onda especíca. Lo que hace el microscopio es emitir una luz uorescente que pueda excitar las moléculas de la sonda y por medio de un ltro permite registrar apenas un rango pequeño de longitudes de onda. Escogiendo un ltro. 11.

(17) que deje pasar la longitud de onda especíca reemitida por la sonda que se está usando, es posible detectarla incluida entre los lípidos, logrando ver la membrana en si. Se pueden escoger sondas que preeran estar en una fase lipídica más que en otra, haciendo que los dominios donde no puedan incluirse se vean como una mancha oscura bajo el microscopio. De esta forma es posible detectar los dominios lipídicos. La sonda después de estar activa bajo la lámpara uorescente por un cierto tiempo pierde su intensidad de emisión de luz por un fenómeno conocido como fotoblanqueamiento. Este efecto no es tan remarcado normalmente, ya que las sondas que no emiten luz se difunden en la membrana, manteniendo un tono promedio que disminuye más lentamente. Si se concentra el foco de luz en un área muy pequeña, la difusión no alcanza a emparejar el brillo de la membrana instantáneamente, demorando un tiempo en hacerlo después de apagar la lámpara. Este fenómeno se puede usar para medir el coeciente de difusión dentro de la membrana, como se explicará más adelante. Ejemplos de sondas uorescentes que se suelen usar experimentalmente para membranas son el 1-Oleoyl-2- [6-[(7-nitro-2-1,3- benzoxadiazol-4-yl)amino] hexanoyl]-sn-Glycero-3Phosphocholine (acortado a NBD), que es excitado con luz de una longitud de onda de 460nm y la emite a 534nm y 1,2-Dioleoyl-sn-Glycero-3-Phosphoethanolamine-N(Lissamine Rhodamine B Sulfonyl) (acortado a Rodamina), que se excita a 550nm y emite a 590 nm. [10]. 2.1.6.. Difusión dentro de la membrana. Como ya se había mencionado, los lípidos son libres de moverse dentro del plano de la membrana. Así mismo, las proteínas membranales y otros compuestos también se pueden difundir en este plano. Muchas funciones de las proteínas de las membranas dependen de la concentración en la que se encuentren. Un ejemplo de esto son algunos tipos de poros, unos canales que se forman a través de la membrana donde pueden pasar compuestos que generalmente no podrían traspasar el potencial hidrofóbico. Estos están compuestos por varias proteínas sueltas e independientes, y sólo en el momento de formar una agregación pueden cumplir su función. Otro ejemplo son los receptores de membrana, otro tipo de proteínas que al unirse a un compuesto especíco mandan una señal de alerta a la célula. Para que esa señal sobrepase el umbral necesario para la activación, debe haber sucientes receptores juntos que se unan al compuesto. Estos dos ejemplos muestran la importancia que hay en el hecho que los compuestos se puedan mover por la membrana. Por esto es importante analizar el coeciente de difusión en la misma, pues su potencial de reacción depende altamente de éste.. 12.

(18) Al momento de formarse dominios, hay lípidos y compuestos que se incorporan a éstos, mientras que otros se ven completamente excluidos. Para los segundos, los dominios representan obstáculos en el camino. Según aumenta el tamaño de los obstáculos, a un lípido le es mucho más difícil encontrar un camino de percolación de un punto al otro a través de éstos, disminuyendo el coeciente de difusión. Las membranas con dominios muestran un fenómeno llamado límite de percolación [3]. Éste es el punto en la temperatura, presión o concentración de compuestos, donde los dominios aumentan tanto que cierran el camino a las partículas que no estén en su misma fase, cambiando drásticamente su coeciente de difusión. Esto se puede ver como un cambio de pendiente de la relación entre el coeciente de difusión y uno de los parámetros mencionados.. 2.2. Teoría del coeciente de difusión Como se vio en la sección anterior, el coeciente de difusión es muy importante para la membrana, por lo que se va a analizar más detalladamente este fenómeno. Para hacer esto, se hace uso de la ecuación de difusión, la cual se va a derivar a continuación usando la notación de Gould [12]. El procedimiento se hace para difusión en un solo eje, ya que extenderlo a tres dimensiones (o a dos en el caso de la membrana) es automático. Se empieza con la ley de Fick de la difusión:. N(x,t) ẋ = −D Donde. N. ∂N(x,t) dx. es la concentración de partículas en un lugar del espacio en cierto tiempo,. la velocidad y. D. ẋ. es. es el coeciente de difusión. Esta ecuación describe el ujo de partículas. dependiendo del gradiente de su concentración, dada cierta constante de proporcionalidad. D. Ahora, se toma la ecuación de continuidad de masa:. dN(x,t) dt. =−. ∂(N(x,t) ẋ) ∂x. Esta ecuación expresa que el cambio en el tiempo de la concentración de partículas en un sector es igual al ujo de partículas fuera de esta zona. Juntando ambas ecuaciones se obtiene:. dN(x,t) dt. =D. 13. ∂ 2 N(x,t) ∂x2.

(19) Si se dene. N0. como la cantidad de partículas en el origen en. ecuación para tiempos mayores que. 0. t = 0,. la solución a esta. es: 2. N(x,t) =. −x √N0 e 4Dt 2 πDt. Por otro lado, el desplazamiento medio cuadrado de las partículas respecto a un punto inicial. 0. se puede igualar al segundo momento de la distribución de partículas en el. espacio, dada por la concentración de partículas. D. E. N,. [x(t) − x(0)]2 = E[x2 ] =. obteniendo:. 1 N0. ´. x2 N(x,t) dx. Si se juntan las últimas dos ecuaciones, se obtiene:. D. E. [x(t) − x(0)]2 = 2Dt. Reorganizando y pensando en tiempos que son superiores al tiempo promedio entre colisiones, se puede hallar el valor de la constante de difusión por medio del análisis de la pendiente del desplazamiento medio cuadrado respecto al tiempo. Esto en el caso de dos dimensiones se convierte en:. D=. 1 4. lı́mt→∞. h[x(t)−x(0)]2 i t. En el laboratorio hacerle seguimiento a una sola partícula para hallar su desplazamiento medio cuadrado con relación al tiempo requiere de recursos experimentales muy elevados. En las simulaciones computacionales en cambio, esto es sencillamente realizable, donde lo único que se requiere en el algoritmo es que la partícula reporte su posición cada cierto tiempo. Después de un largo intervalo de movimientos, cuando el sistema llega al equilibro, la pendiente del desplazamiento cuadrado se debe estabilizar, y de ella se puede medir el coeciente de difusión en la membrana.. 2.3. Medición experimental del coeciente de difusión por FRAP Vimos que seguir experimentalmente la trayectoria de los lípidos en la membrana es muy complejo, por lo que es necesario hacer uso de otras técnicas para poder medir el coeciente de difusión. Una de estas técnicas de uso frecuente es la llamada FRAP, que viene de las iniciales en inglés de Fluorescent Recovery After Photobleaching. Como se mencionó en la primera. 14.

(20) sección de este capítulo, la sonda uorescente que se agrega a la membrana pierde la capacidad de reemitir luz después de ser iluminada cierto tiempo con la lámpara del microscopio. La idea de la técnica es concentrar el foco de luz en un área pequeña de la membrana durante un cierto tiempo, de tal forma que en este sector toda la sonda pierda su efectividad lumínica. Al enfocarse un área mayor de la membrana, la zona donde ocurrió el fotoblanqueamiento se ve como una mancha oscura. Con el paso del tiempo esta zona desaparece, pues la sonda que no ha perdido su efectividad y la que si lo ha hecho se difunden dentro y fuera del área respectivamente. De esta forma, al medir cómo se recupera la intensidad de luz dentro del área con el tiempo, se puede llegar a una fórmula que determine el coeciente de difusión en el sistema. A continuación se deriva la formula necesaria. Generalmente se hace el cálculo para zonas de FRAP con una distribución gaussiana de fotoblanqueamiento, sin embargo experimentalmente este no suele ser el caso. Por ejemplo, en el microscopio de uorescencia del laboratorio de biofísica de la Universidad de los Andes el área del hueco es homogénea y circular. Para llegar a la fórmula se expone un truco para el cálculo desarrollado por D.M Soumpasis [13]. En éste no se mira la difusión de la sonda dentro del hueco, sino de la sonda que ha sufrido fotoblanqueamiento saliendo de él. Lo bueno de este método es que sirve también para medir difusión de mezclas con proteínas y para tiempos cortos. La intención no es demostrar cada paso y hacer cada cálculo, sino explicar de dónde viene la fórmula obtenida. Sea. C0. la concentración total de la sonda en la membrana, la cual se asume constante. en el tiempo.. Ck (r, t) es la concentración de la Ĉk (r, t) es de la sonda que sufrió. uorescentes y. sonda que aún tiene sus características fotoblanqueamiento. En cada momento,. el total de la sonda se mantiene constante, dando la condición:. C0 = Ĉk (r, t) + Ck (r, t) Asumiendo isotropía, si se hace FRAP en un área circular de radio. w. con una distribu-. ción constante alrededor del origen, se obtiene la siguiente distribución inicial de sonda blanqueada:. ". Ĉk (r, 0) = Donde. K. C0 (1 − e−K ) = const r ≤ w 0 r>w. es el parámetro de blanqueo de la sonda. En cualquier momento, asumiendo. una membrana lo sucientemente grande, la concentración de sonda blanqueada en un punto muy lejano del origen siempre va a ser. 0,. pues al momento que ésta se difunda ra-. dialmente lo suciente para llegar a esta distancia, su concentración va a ser despreciable. Obtenemos otra condición de frontera:. 15.

(21) Ĉk (∞, t) = 0 Una expresión para la concentración de sonda blanqueada que involucre tiempo y espacio y que cumpla las condiciones de frontera dadas se puede expresar por medio de la siguiente integral radial:. 1 Ĉk (r, t) = 2Dt. ˆ∞. r2. r0 (Ĉk (r0 , 0)e− 4Dt )I0 (. rr0 − r0 2 0 )e 4Dt dr 2Dt. 0 Donde. D. I0. es el coeciente de difusión, e. es una función de Bessel modicada. Usando. la siguiente identidad integral:. +β 2 1 − α24γ αβ e Iv ( ) = 2γ 2γ. ˆ∞. 2. sJv (sα)Jv (sβ)e−γs ds 0. Identicando:. γ = Dt v=0 α=r β = r0 Y usando la relación:. ´w. rJ0 (sr)dr =. 0 Con. J0 , J1. w s J1 (ws). funciones de Bessel, podemos reescribir la expresión de la concentración de. sonda blanqueada con respecto al tiempo y el espacio en forma de una integral en una sola dimensión:. ˆ∞ −K. Ĉk (r, t) = wC0 (1 − e. 2. e−Dts J0 (sr)J1 (sw)ds. ) 0. Ya conociendo cómo se distribuyen las partículas que han sufrido fotoblanqueamiento, nos es posible describir el patrón de intensidad de luz dentro de la zona de FRAP con respecto al tiempo, que es lo que podemos medir experimentalmente.. 16.

(22) Si. F−. y. F0 (K). son respectivamente las intensidades de uorescencia antes y justo de-. spués del fotoblanqueamiento, de la fórmula anterior podemos llegar a la expresión de la intensidad de uorescencia dentro de la zona donde se hizo FRAP:. ˆ∞ FK (t) = F− − 2[F− − F0 (K)]. Dtx2 1 2 J1 (x)e− w2 dx x. 0 Esta ecuación se puede simplicar si primero la derivamos con respecto al tiempo, obteniendo:. 2D dFK (t) = 2 [F− − F0 (K)] dt w. ˆ∞. xJ12 (x)e−. Dtx2 w2. 1 w2 w2 dx = [F− − F0 (K)] e− 2Dt I1 ( ) t 2Dt. 0 Y luego integrando desde. t. hasta innito, punto donde asumimos que la intensidad de la. uorescencia dentro del área del FRAP se recupera completamente. Esto signica que la membrana es lo sucientemente grande para que no disminuya la uorescencia total por el experimento. Manteniendo esta hipótesis,. F (∞) = F , w2. FK (t) = [F− − F0 (K)]e− 2Dt [I0 (. la ecuación se expresa como:. w2 w2 ) + I1 ( )] 2Dt 2Dt. Teniendo la ecuación que describe la recuperación de la uorescencia después de fotoblanqueamiento, se compara con la curva que se mide experimentalmente. Se puede ver que para ciertos parámetros de la constante de difusión y el ancho del hueco ambas curvas cuadran bastante bien. Si se soluciona la ecuación anterior para. D. en el tiempo donde se. ha recuperado la mitad de la intensidad inicial, haciendo uso de una serie de potencias para llegar a una aproximación, se llega a una ecuación sencilla para medir el coeciente de difusión, que es:. D = 0,224. w2 t1/2. Para conocer experimentalmente el coeciente de difusión de una membrana por medio de FRAP, es necesario hacer fotoblanqueamiento en una zona, gracar la recuperación de la sonda en esa zona con el tiempo e identicar el momento donde se ha recuperado la mitad de la sonda. Conociendo el ancho del hueco que se creó, con la fórmula se puede calcular el coeciente de difusión. Un ejemplo de los resultados obtenidos al analizar la recuperación de la intensidad se ve en la gura 2.5.. 17.

(23) Figura 2.5:. Ejemplo de un experimento de FRAP modicado de [13]. La intensidad está normalizada entre 0 y 1. Se encuentra el tiempo en el cual la intensidad se recupera un 50 % y junto al ancho de la zona de FRAP se puede calcular el coeciente de difusión. Con los resultados se traza la línea contínua usando la epxresión de la recuperación de la intensidad derivada. Se puede ver que cuadra con las medidas realizadas (puntos).. 2.4. Simulaciones computacionales Cumpliendo los objetivos de la tesis, se hace un programa computacional para correr simulaciones sobre un modelo de una membrana. Hay varias formas de hacer simulaciones para este n, cada cual con sus puntos positivos y negativos. En general, los diferentes tipos de simulación se pueden clasicar en dos grupos principales: Simulación Determinista o Simulación Estocástica. A continuación se explica brevemente de qué se trata cada una de ellas. A renglón seguido se hace énfasis en las simulaciones tipo Monte Carlo, explicando la teoría detrás de éstas. Será este tipo de simulación el que se va a aplicar en el programa escrito para la tesis.. 2.4.1.. Tipos de simulación. El primer tipo de simulación que se explicará es la simulación determinista. En ésta, los movimientos de las partículas están determinados completamente por las ecuaciones de. 18.

(24) la mecánica clásica. Esto hace que el sistema evolucione elmente al modelo propuesto, mostrando lo que pasaría si el sistema fuese real. Para este tipo de simulación es necesario determinar todas las condiciones iniciales del sistema por completo, determinando así también indirectamente el resultado de la simulación Uno de los ejemplos más conocidos de este tipo de simulaciones es la llamada Dinámica Molecular. En esta se le asignan las posiciones y los momentos a las partículas del modelo que se quiere simular de forma aleatoria y luego, usando mecánica clásica se calculan sus trayectorias. Así se puede saber la posición exacta de una partícula en cualquier momento del tiempo, al igual que la energía del sistema, su nivel de desorden, etc, teniendo la certeza que los resultados son completamente coherentes con las leyes del modelo que se esté implementando. Lo positivo de este tipo de simulaciones está en que se puede obtener una gran cantidad de datos del sistema, ya que su comportamiento es bastante real. Estos datos suelen ser bastante conables y son fácilmente accesibles haciendo un monitoreo de la evolución del sistema. Lo negativo de una simulación determinista es el requerir bastante tiempo y de experiencia en simulaciones para poder llevarla a cabo. Paralelamente, dada la gran cantidad de cálculos por hacer para cada molécula en cada movimiento, este tipo de simulaciones requiere de amplios recursos computacionales. Es por esto que sólo se pueden modelar pequeños lapsos de tiempo, perdiendo el acceso a fenómenos a largo plazo. El segundo tipo de simulaciones son las estocásticas. En este otro tipo de simulaciones la evolución del sistema no se calcula para cada partícula dependiendo de sus interacciones momentáneas, sino que se le asigna un valor aleatorio dentro de cierto rango. Una vez realizado un movimiento, se verica con el modelo si el paso encajaría con los parámetros establecidos, y dependiendo de esto, se le da cierta probabilidad de aceptación o devolución al estado inicial. Este tipo de simulaciones se les suele llamar Monte Carlo, debido a los números aleatorios que se usan constantemente en el sistema. En este caso no podemos saber si la partícula estaría ahí dadas las interacciones que tiene con su entorno, o si realmente debería haber tomado otro rumbo. Lo único que se sabe es que el sistema evoluciona tomando diferentes estados disponibles, sin importar si estos estarían conectados en un sistema real o no. Las partículas dentro del sistema dependen únicamente de la conguración anterior, por lo que se dene la simulación Monte Carlo como un proceso de Markov. Lo positivo de este tipo de simulación es la gran reducción en la cantidad de cálculos a realizar, logrando cubrir una gran gama de conguraciones posibles. Además, por la hipótesis ergódica [18], el tiempo que pasa el sistema en cada estado disponible depende del tamaño de esta fase, por lo que en promedio se obtendrán resultados coherentes con los realizados determinísticamente.. 19.

(25) Negativo de una simulación tipo Monte Carlo es que, al evolucionar el sistema de una forma aleatoria entre dos estados disponibles diferentes, no se puede tener acceso directo al tiempo que fue necesario para pasar de un estado al otro. Así mismo se pierden en primera instancia todos los fenómenos dinámicos del sistema, conociendo directamente sólo los fenómenos conguracionales, como formación de dominios o agregación de proteínas membranales.. 2.4.2.. Teoría de la simulación Monte Carlo. Entre los dos tipos de simulaciones presentadas, para esta tesis se escogió la estocástica, por ser más sencilla de dominar en un semestre permitiendo al mismo tiempo extraer los datos necesarios. Una simulación Monte Carlo es mucho más que poner unas partículas a moverse aleatoreamente bajo ciertas condiciones. Tiene un gran trasfondo teórico con el que se demuestra que el resultado obtenido es en realidad un promedio físico-estadístico, haciendo que mediciones sobre el sistema sean conables. La teoría sobre simulaciones Monte Carlo se describe a fondo en muchos libros [14][15]. A continuación se dará un breve resumen adaptado de Binder [1] de los conceptos fundamentales que hacen de esta técnica una de las más usadas computacionalmente. Supongamos que el sistema se compone de los cuales tienen. R. N. objetos, ya sean lípidos o esferas rígidas,. grados de libertad disponibles a ellos, tales como posición u orden. interno. De esto podemos pensar en un espacio de fases donde las. N. R-dimensional. con. M. puntos,. partículas se pueden distribuir.. Al mismo tiempo el sistema tiene denido un Hamiltoniano que describe las interacciones entre estas. N. partículas, omitiendo cualquier término cinético. La existencia del. Hamiltoniano hace que algunos de los puntos en el espacio de fase sean más probables que otros, así que si queremos hacer un promedio termodinámico de un observable. A(x),. tendríamos que solucionar la integral:. ´ hAi =. Ω. −. A(x)e ´. −. e. HN (x) kB T. HN (x) kB T. dx. dx. Ω Donde. Ω. indica que se debe hacer la integral sobre todo el set de estados disponibles de. las partículas. Para el sistema que se quiere modelar, resolver esta integral es imposible, ya que serían demasiados los estados posibles que tocaría calcular. Muchos de estos estados son muy. 20.

(26) poco probables, por lo que escasamente contribuyen a la integral. De esta forma, lo mejor sería poder sacarlos de ella. Para lograrlo, se dene una probabilidad de escoger los puntos del espacio de fases que se van a incluir, obteniendo un sampleo que depende de la importancia del punto dentro de la integral. Si además asumimos que la cantidad de puntos accesibles es discreta, cambiamos la integral por una sumatoria, obteniendo:. M P. hAi =. ν. −. A(xv )P −1 (xv )e M P ν. Donde. P. −. P −1 (xv )e. HN (x) kB T. HN (x) kB T. representa esa probabilidad de tomar en cuenta el punto del espacio de fases,. y la sumatoria se realiza sobre todos los diferentes estados disponibles. Si la probabilidad de escoger un punto del espacio de fases es la misma probabilidad de encontrar ese punto en el sistema en equilibrio, ésta se cancela con la probabilidad termodinámica determinada por el Hamiltoniano en el exponente. Esto quiere decir, que si hacemos un sampleo dependiendo de la importancia del punto en el equilibrio, el promedio termodinámico se convierte en un promedio común y corriente de la forma:. M 1 X Ā = A(xv ) M ν Como no se puede saber de antemano cuál es la probabilidad de cada punto en el sistema en equilibrio, es necesario hacer evolucionar esta probabilidad a través de un movimiento aleatorio de tal forma que converja al equilibrio. Es en este punto donde aplica una simulación tipo Monte Carlo, en el cual las. N. partículas pasan de una conguración en. el espacio de fases a la otra en un proceso de Markov, deniendo una probabilidad de transición de un punto al otro. W (xv → x0v ).. Esta probabilidad de transición hará converger la probabilidad de hallar una partícula en la simulación Monte Carlo en una posición de equilibrio y de la misma manera el sistema en sí, si se cumple la condición de balance detallado, la cual expresa la dualidad entre el proceso de transición de un estado al otro y su proceso reverso:. Peq (xv )W (xv → x0v ) = Peq (x0v )W (x0v → xv ) Reorganizando los términos obtenemos:. 21.

(27) x0v ). −. Peq (x0v ). H(x0v ) kB T. W (xv → e − kδHT B = e = = H(x ) − k Tv W (x0v → xv ) Peq (xv ) e B Esto quiere decir que la taza de transiciones debe depender del cambio de energía que se tenga al momento de cambiar de punto en el espacio de fases. Si asumimos que un cambio donde la energía baje, volviéndose más estable, va a ser físicamente siempre aceptado, podemos normalizar lo anterior a la probabilidad de transición:. ". W (xv →. x0v ). =. − kδHT. e. B. 1. δH > 0 d.l.c.. Insertando esta probabilidad de transición en la ecuación del balance detallado, se puede ver que la probabilidad de escoger una partícula para tomar parte en el promedio estadístico va a converger a la probabilidad de hallar la partícula en equilibrio. Una demostración formal de la validez del balance detallado se puede encontrar en las referencias dadas. Recapitulando, una simulación Monte Carlo lo que hace es tomar un número jo de partículas y moverlas aleatoriamente por los puntos disponibles del espacio de fases del sistema con cierta probabilidad de transición de un punto al otro. Debido a lo mencionado anteriormente, usando cierta probabilidad de transición, se conseguirá que el sistema entre en equilibrio. Entonces, al hacer un promedio estadístico de un observable de nuestro interés sobre el sistema de partículas al cual llegó la simulación, se obtendrá un promedio físico estadístico que puede ser contrastado con datos reales. Para los análisis dinámicos sobre el sistema, como la difusión, es necesario tener una medida del tiempo, la cual luego toca escalar experimentalmente con un sistema real. Se ha descubierto que Monte Carlo hace un promedio temporal del modelo con cinética estocástica en cambio de un promedio del ensamble [1]. Esto quiere decir que se pueden simular fenómenos cinéticos que no están relacionados hacia el equilibrio térmico. Aunque para el análisis de fenómenos dinámicos se sigue usando preferiblemente dinámica molecular, cada vez más frecuentemente se emplea una nueva forma de simulación llamada KMC, Kinetic Monte Carlo. Ahí se tiene un conteo de tiempo que no modica la evolución del sistema, pero si se basa en éste para llevarse a cabo. El tiempo que transcurre entre dos conguraciones depende inversamente de la probabilidad que se realiza una transición, haciendo que el paso entre dos estados disponibles demasiado diferentes demore mucho tiempo, mientras que una transición suave se lleve a cabo en un tiempo muy corto. Esta técnica ha sido aplicada en muchos sistemas de diferentes índoles, demostrando que los resultados obtenidos son coherentes con los que se pueden apreciar experimentalmente. 22.

(28) [16][17]. Más adelante se describirá con mayor detalle cómo se emplearon los conceptos de KMC al programa que se escribió para la tesis.. 23.

(29) 3 Parte Experimental 3.1. Introducción Para determinar la concordancia del modelo y escalar los valores obtenidos computacionalmente es necesario contrastar los resultados con datos experimentales. Para tal n se diseñó un experimento en el cual se pudiese medir el coeciente de difusión en una membrana lipídica con presencia de dominios. La idea es variar controladamente el tamaño de los dominios y analizar su repercusión en el coeciente de difusión, el cual se mide usando FRAP. Con los datos obtenidos se modela el comportamiento del coeciente de difusión, buscando el límite de percolación explicado en el capítulo 2. El límite de percolación también deberá ser visto en la simulación, dando un argumento de validez al modelo. Durante el tiempo en que se trabajó en la tesis fue muy difícil obtener un sistema experimental adecuado sobre el cual se pudiera medir difusión. Una vez se logró un sistema sucientemente grande y homogéneo hubo problemas con el FRAP, imposibilitándose obtener datos conables. Como resultado nal, se tienen dos mediciones del coeciente de difusión en las membranas obtenidas. Esto no basta para crear una estadística y mucho menos para calibrar el modelo computacional, por lo que se hace uso de artículos publicados anteriormente para este n. Por otro lado, los dos resultados obtenidos sí permiten reportar cómo fue el desarrollo experimental, explicar la técnica usada para medir el coeciente de difusión y exponer los posibles errores que pudieron afectar las mediciones.. 3.2. Diseño experimental Para poder hacer mediciones del coeciente de difusión por medio de FRAP es necesario obtener una membrana con un área lo sucientemente grande para que se pueda hacer fotoblanqueamiento sin afectar demasiado la uorescencia de la membrana en total, pues de lo contrario no aplicaría la ecuación derivada en el capítulo anterior. Al mismo tiempo, la membrana tiene que ser lo más homogénea posible, signicando que no debe tener sectores con vesículas lipídicas adheridas u otras imperfecciones que puedan interrumpir el camino de percolación, modicando el resultado del coeciente. Por último, la membrana. 24.

(30) no debe tener mucha mugre adentro, pues ésta suele absorber bastante sonda uorescente, emitiendo una gran cantidad de luz al mirarse en el microscopio, interriendo con las mediciones de la intensidad de la uorescencia después del fotoblanqueamiento (el brillo de la mugre no permite identicar bien su recuperación en la zona analizada). Para lograr un sistema que cumpliera con estas condiciones se trabajó primeramente en un diseño experimental basado en un Langmuir Trough, sin embargo al progresar la tesis éste fue cambiado a otro con base en explotación de vesículas sobre vidrio. A continuación se explica de qué trata cada diseño y por qué fue necesario hacer el cambio.. 3.2.1.. Diseño basado en Langmuir Trough. El primer sistema donde se puede hacer FRAP se viene desarrollando desde el semestre anterior al de la tesis, en las materias de física Laboratorio Intermedio y Electrónica . Este diseño se basa en un Langmuir Trough [8]. Irving Langmuir descubrió que al comprimir una monocapa se maniestan las diferentes fases que se pueden observar en un modelo de tres dimensiones. Para conseguir estas transiciones de fase, Langmuir diseñó un aparato que lleva su nombre. En éste se esparce la mezcla de los lípidos en una interfaz aire-agua, se deja que se genere la monocapa lipídica por fuerzas hidrofóbicas y se comprime lateralmente con una barrera disminuyendo el área disponible para la monocapa. Si se tiene una mezcla de lípidos, según se va comprimiendo aparecen los dominios y su tamaño va a aumentando. Un diseño preliminar del aparato fue construido y probado en una investigación realizada para Laboratorio Intermedio . Se hizo una modicación del sistema original (que mide la formación de dominios por medio de un tensiómetro) por un sistema óptico, que funciona por medio de sondas uorescentes bajo el microscopio. Aunque el aparato construido fue bastante rústico, empleando materiales sencillos y de uso común, se obtuvieron unas buenas imágenes de dominios y un aumento bastante predecible de su tamaño con la disminución del área por lípido. Continuando con la misma idea en la tesis, se perfeccionó el aparato y se mandó a construir en el taller de Ingeniería Mecánica de la Universidad de los Andes con medidas especícas para el microscopio del laboratorio de Biofísica. En el diseño la cinta de teón empleada fue remplazada por bloques de teón y el empuje manual de la barra compresora se cambió a un empuje por medio de un motor DC, al cual se le maneja la velocidad de empuje con mayor precisión usando un circuito electrónico semi-digital diseñado en el proyecto nal de Electrónica . Una vez estuviese construido el sistema, se mediría FRAP en la membrana que se forma en la interfaz agua-aire. Para aumentar la cantidad y el tamaño de los dominios sólo sería necesario variar el área que cubre la membrana. Al momento de realizar la construcción aparecieron algunos problemas. Por un lado hubo un atraso debido al cierre temporal del taller para su trasteo. Luego surgieron dicultades. 25.

(31) para conseguir los motores lineales necesarios para el aparato sin que éstos excedieran el presupuesto disponible. Finalmente se encontró en la literatura que generar las monocapas en la interfase aire-agua en un Langmuir Trough podía ser bastante complejo y requería de mucho tiempo y práctica para obtener buenos resultados. Estos inconvenientes llevaron a la solución alterna de abandonar este diseño experimental y pensar en otro que cumpliera con los estándares requeridos y que se pudiera realizar en un semestre. Aún así, para futuras aplicaciones, el diseño con base en Langmuir Trough con las medidas necesarias para encajar en el microscopio de uorescencia invertido del laboratorio de Biofísica, está incluido en este escrito en el. 3.2.2.. ANEXO A.. Diseño actual. Para remplazar el diseño basado en Langmuir Trough se trabajó en tres sistemas diferentes que se basan en la formación de membranas apoyadas por explotación de vesículas. En la primera técnica se hacen vesículas gigantes por medio de electroformación con la mezcla de lípidos y luego se dejan explotar sobre vidrio o MICA (un material atómicamente plano) para generar la membrana. La segunda técnica consiste en hacer vesículas unilamelares por sonicación y explotarlas sobre el vidrio o la MICA, obteniendo la membrana. Finalmente, el tercer método es una mezcla de los primeros dos, donde primero se crea una capa usando vesículas pequeñas unilamelares y luego una sobre la anterior por explotación de vesículas gigantes. Para variar la cantidad de dominios y su tamaño, se aumenta la temperatura de la membrana obtenida colocando el sistema entero en una incubadora durante cierto tiempo. El calor aumenta su libertad de movimiento y la cantidad de lípidos en la fase del dominio, realizándose un reordenamiento dentro de la membrana, lo que a la vez causa un aumento del tamaño y la cantidad de éstos. Al nal del semestre se consiguió dominar la segunda técnica. A continuación se expone el protocolo denitivo para la elaboración de membranas apoyadas por medio de explotación de vesículas unilamelares, el cual se puede retomar para futuros experimentos; también se describe el procedimiento a seguir para medir el coeciente de difusión sobre ellas por medio de FRAP.. 3.2.3.. Protocolo elaboración de membranas apoyadas. Para la elaboración de la membrana apoyada que muestre dominios, basándose en Groves [21], se llegó a la siguiente concentración de lípidos:. 38.7 % DOPC. 26.

(32) 38.7 % PSM 20.3 % Colesterol 2.1 % DOTAP 0.2 % TR-DPP DOPC tiene su transición de fase a -20ºC, mientras que BSM a 41ºC. El colesterol se incluye para reforzar la formación de dominios. En este caso, a temperatura ambiente, las fases accesibles son la líquida desordenada y la líquida ordenada, donde DOPC está en la primera y BSM y CHOL componen la segunda. DOTAP es un lípido cargado positivamente, el cual debe fortalecer la explotación de las vesículas contra el vidrio. La sonda uorescente usada es Texas red dipalmitoyl- phosphatidylethanolamine, TR-DPP, que se agrega en la membrana a las fases líquidas. Por el contenido de colesterol en la membrana, ésta preere incluirse en las zonas líquidas desordenadas, junto al DOPC. Los dominios se forman de fase líquida ordenada y crean un obstáculo al movimiento de la sonda durante la difusión. En la gura 3.1 se puede ver el diagrama de fases para los tres componentes principales de la mezcla, modicado del artículo de S.Keller [20]. Podemos ver en la gura b) que a temperatura ambiente debe poderse observar separación de fases líquida ordenada y desordenada, marcada por los puntos negros. Si se sube la temperatura, a), aumenta la cantidad de lípidos en líquida ordenada, por lo que hay un reordenamiento de los dominios persistentes. Esto conlleva a un aumento de su tamaño. Todos los lípidos fueron comprados en Avanti Polar Lipids [10]. Son retirados de la Figura 3.1:. nevera a menos 20 grados centígrados en estado sólido (polvo), se dejan en un desecador por 20 minutos para evitar la entrada de humedad, y luego son pesados y disueltos en cloroformo puro a 2 mg por mL para ser almacenados separadamente en viales de vidrio. La sonda uorescente es cubier-. Diagrama de fases para la mezcla ternaria Colesterol, DOPC y PSM a a) 37 y b) 23 grados. Los puntos y cuadrados blancos indican uniformidad de fase líquida y sólida respectivamente. Los puntos negros indican coexistencia de fases uidas, y los cuadrados negros coexistencia de fases líquida y sólida.. ta con aluminio para evitar fotoblanqueamien-. to. Se extrae con una jeringa de precisión Hamilton las cantidades necesarias de las diluciones para obtener los porcentajes previamente mencionados y se guarda la mezcla en. 27.

(33) otro vial, el cual también es recubierto con papel aluminio. Este último es almacenado en el congelador a menos 10 grados centígrados mientras se realizaban los experimentos. Para preparar la solución para la bicapa sencilla se lava previamente un tubo de ensayo con agua y jabón y nalmente con etanol puro. Después de secarse bien, se adicionan 0.6 mililitros de la mezcla de lípidos y se envuelve el tubo con papel aluminio. El contenido se seca con gas de nitrógeno y luego es llevado a la bomba de vacío hasta el día siguiente, usualmente 12 horas. Al retirar el tubo de la bomba de vacío se le adicionan 2 mililitros de agua nanopura. Se sumerge el tubo en un baño maría por 1 minuto y luego se revuelve con un shaker por 30 segundos, repitiendo este ciclo mínimo 15 veces. Finalmente se sumerge el tubo en un sonicador por 40 minutos, observado que el nivel del líquido de la muestra concordara con un nodo de vibración de la supercie del líquido del sonicador. Para comprobar el éxito de la sonicación la muestra debe quedar transparente. Lo contrario indica que aún hay vesículas multilamelares presentes, las cuales difractan la luz, generando opacidad. Para generar la membrana se usa una lámina previamente lavada con solución Piraña. La solución Piraña se usa para eliminar todo tipo de mugre orgánico de la lámina. Está compuesta por ácido sulfúrico y peróxido de hidrógeno a concentración 3:1. La reacción que se genera al hacer la mezcla es altamente exotérmica, por lo que es necesario mezclar los compuestos lentamente por goteo. El vidrio que se quiera lavar se deja por mínimo 20 minutos en la solución Piraña y acto seguido, ésta debe ser desechada después de diluirla en agua 10 a 1. El contenido del tubo de ensayo se vierte sobre una lámina, que se debe encontrar en el interior de una caja de Petri. Se crea una burbuja de la mezcla sobre la supercie. No es necesario tener barreras físicas para limitar la muestra sobre la lámina siempre y cuando se tenga mucho cuidado de no sacudirla y no verter demasiada mezcla. El contenido se deja ahí por 1 hora. Pasado ese tiempo se llena la caja de Petri con agua, sumergiendo la lámina completamente. Esto lava la muestra, eliminando el exceso de vesículas unilamelares. Si se quiere calentar la muestra para aumentar el tamaño de los dominios se tapa la caja de Petri y se lleva a la incubadora o al horno por el tiempo que se desee. En este caso es necesario envolver la caja de Petri con papel aluminio para evitar fotoblanqueamiento. Al estar sumergida en agua la membrana no se puede desecar. Para el momento que se vaya a medir sobre la membrana, se sumerge una laminilla lavada con solución Piraña en la caja de Petri y se encaja con el área de la lámina donde se puso la muestra. Luego ambas son retiradas cuidadosamente de la caja de Petri y son secadas con papel absorbente y aire comprimido. Entre la lámina y la laminilla queda almacenada agua que no permite que la muestra se deshidrate durante el experimento. Es necesario tener cuidado con ésta área al momento de secar el resto de la lámina.. 28.

(34) Una vez preparada la membrana en la lámina, ésta se puede llevar al microscopio para su análisis. El procedimiento experimental para medir la constante de difusión por medio de FRAP se basa en la fórmula derivada en el capítulo anterior y es el siguiente:. Se toman fotos antes de hacer fotoblanqueamiento de la zona, de tal forma que sirvan como referencia para la intensidad de uorescencia inicial. Se enfoca el rayo de luz a un aumento del microscopio mayor, creando una zona redonda blanqueada de ancho. w.. Cada cierto tiempo se toma una foto del sistema para ver cómo se ha recuperado la intensidad de la sonda en el área blanqueada. Con esas fotos se pinta una gráca de intensidad de uorescencia en el hueco con respecto al tiempo. Se estima el tiempo en el cual se recupera la mitad de la intensidad de la uorescencia. Se usa la ecuación para determinar el coeciente de difusión.. Es importante tener la lámpara prendida el menor tiempo posible, de tal forma que no se haga más fotoblanqueamiento de la sonda durante las mediciones y no se modique la curva de intensidad de uorescencia con el tiempo. Anterior al experimento de FRAP es necesario tomar fotos bajo el microscopio de un estándar al cual se le conozca la dimensión, como una regla microscópica, de tal forma que se pueda medir el ancho del hueco. w.. 3.3. Resultados La sonda escogida se distribuye por la fase líquida desordenada, por lo que los dominios líquidos ordenados se pueden ver como manchas oscuras en el plano de la membrana. Estas manchas pueden ser causadas por otros agentes que no sean dominios, por lo que es necesario revisar que lo son calentando la muestra y observando si cambian de tamaño. La gura 3.2 a) muestra una foto a un aumento de 100x de las membranas apoyadas generadas usando el protocolo descrito. Los candidatos a dominios son los pequeños huecos que se pueden observar repartidos en la membrana. En una membrana que fue calentada durante 90 minutos en una incubadora a 36.4ºC se obtuvieron fotos como las expuestas en la gura 3.2 b). Se puede ver claramente cómo los huecos tienden a aumentar su tamaño drásticamente. También toman una forma ovaloide denida, lo que es poco probable si fuese el caso de. 29.