3. Técnicas de microscopía
con luz visible
Técnicas de microscopía con luz visible
●
Microscopías de campo claro y campo oscuro
●
Microscopía de polarización
●
Microscopía de contraste de fases
●
Microscopía de contraste interferencial
Microscopía de campo claro
Se contrasta el objeto que se observa del medio que le rodea o las diferentes partes del mismo objeto gracias a que la luz que lo atraviesa con respecto a la que no lo atraviesa presenta diferencias
en su longitud de onda (diferencias de color) y/o de amplitud (diferencias de intensidad)
Microscopía de campo claro
Int. del fondo – Int. de la muestra
% contraste = x 100
Int. del fondo
Microscopía de campo oscuro
La imagen se forma sólo con los rayos difractados por el objeto.
(Es el mismo principio que nos permite ver las estrellas de noche o las partículas de polvo en un rayo de luz cuando entramos en una sala oscura.)
Especialmente indicada para muestras con poco contraste.
Microscopía de campo oscuro
3. Técnicas de microscopía con luz visible
objetivo
muestra
condensadora diafragma
Microscopía de campo oscuro
La luz se hace incidir muy oblicuamente sobre la preparación.
Los rayos que la atraviesan o no, pero que siguen más o menos la trayectoria inicial no son recogidos por el objetivo.
Sólo la luz que es difractada por el objeto, o que el objeto refleja casualmente, llega al objetivo.
De esta manera la imagen del objeto aparece clara sobre un fondo oscuro.
Microscopía de campo oscuro
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Esta iluminación está especialmente indicada para preparaciones delgadas y sin teñir.
Microscopía de campo oscuro
Microscopía de campo oscuro
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Es especialmente útil para observar células en suspensión.
Permite encontrar fácilmente el plano focal correcto a bajos aumentos en muestras pequeñas y con poco contraste.
Microscopía de campo oscuro
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Es necesario emplear un objetivo con una A.N. algo inferior a la A.N. que ilumina la condensadora de campo oscuro para evitar que luz directa entre en la imagen.
La eficacia de este sistema también depende de que el haz luminoso sea intenso y no dispersado, ya que sólo se va a utilizar parte de la luz.
Para ello se usa una fuente luminosa homogénea y brillante como un filamento incandescente.
Microscopía de polarización
3. Técnicas de microscopía con luz visible
LUZ POLARIZADA:
Las ondas electromagnéticas son de naturaleza transversal, es decir, el vector de vibración es perpendicular a la dirección del desplazamiento.
Microscopía de polarización
3. Técnicas de microscopía con luz visible
LUZ POLARIZADA:
Si se restringe la vibración de los vectores eléctricos a un solo plano mediante un filtro se obtiene luz linealmente polarizada respecto a un solo plano de vibración.
Microscopía de polarización
3. Técnicas de microscopía con luz visible
LUZ POLARIZADA:
Los polarizadores son filtros que contienen moléculas poliméricas de cadena larga orientadas en una única dirección.
Microscopía de polarización
3. Técnicas de microscopía con luz visible
LUZ POLARIZADA:
Si ahora un rayo polarizado incide sobre una segunda lámina polarizadora, la intensidad y la amplitud de la onda que atraviese la segunda lámina dependerán del ángulo de incidencia respecto a la dirección de polarización.
● Si las dos láminas son paralelas en sus direcciones
de polarización, se transmite toda la luz.
● Si las dos láminas son perpendiculares, el rayo no
Microscopía de polarización
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Polarización cruzada
Microscopía de polarización
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Birrefringencia:
Existen materiales que poseen doble refringencia. Esta propiedad es indicativa de anisotropía óptica, es decir, que el comportamiento de la luz al atravesarlos no es el mismo independientemente de la dirección en la que incide.
Microscopía de polarización
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Birrefringencia:
La luz que entra en un material birrefringente se descompone en dos rayos.
Cada uno está determinado por un índice de refracción y cada uno vibra sólo en una dirección (polarizados) pero a ángulos rectos uno del otro.
Originalmente los polarizadores se hacían de calcita y se conocen como “Prismas de Nicol”.
Microscopía de polarización
3. Técnicas de microscopía con luz visible
La técnica explota las propiedades ópticas de la anisotropía para revelar información detallada acerca de la estructura y composición de los materiales.
La finalidad es conseguir contrastar las diferentes estructuras observadas aprovechando que entre ellas pueda haber alguna que sea capaz de cambiar el plano de polarización de la luz, es decir, que haya alguna sustancia birrefringente ella misma.
Microscopía de polarización
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Los microscopios de polarización incorporan dos láminas polarizadoras.
La primera llamada polarizador se sitúa después de la fuente luminosa, generalmente en el soporte de filtros de la subplatina.
La segunda, denominada analizador, se dispone entre el objetivo y el ocular.
Ambas tienen que girar fácilmente y ser capaces de fijación. También conviene que estén graduadas para que se pueda apreciar el ángulo que se giran.
Microscopía de polarización
Microscopía de polarización
3. Técnicas de microscopía con luz visible
● Cuando el polarizador se dispone de forma que su
dirección de polarización es perpendicular a la del analizador el campo aparece totalmente oscuro en ausencia de la preparación.
● Al colocar la muestra aquellas zonas de la
preparación que no sean capaces de variar el plano de polarización de la luz que las atraviesa aparecerán completamente oscuras.
Mientras que las que sí sean capaces aparecerán más o menos claras según la magnitud de la variación en el plano de polarización que sufra la luz al atravesarlas.
Microscopía de polarización
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Dominios de nucleación
Microscopía de polarización
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Microscopía de contraste de fases
3. Técnicas de microscopía con luz visible
● La mayoría de los detalles de las células vivas son
indetectables mediante la microscopía de campo claro porque hay muy poco contraste entre las estructuras ya que tienen similar transparencia y son incoloras.
● A no ser que el medio de montaje sea
Microscopía de contraste de fases
3. Técnicas de microscopía con luz visible
● Es una técnica de aumento de contraste
especialmente indicada para la observación de muestras transparentes o sin teñir.
Permite observar muestras vivas sin que previamente haya que matarlas, fijarlas y teñirlas.
● Así, la dinámica de los procesos biológicos se
puede observar y grabar con elevado contraste y los pequeños detalles de la muestra se ven con gran claridad.
Microscopía de contraste de fases
3. Técnicas de microscopía con luz visible
● Se basa en el hecho de que cuando interfieren
ondas que tienen un determinado desfase se produce una interferencia constructiva (con mayor amplitud) o destructiva (con menor amplitud).
Microscopía de contraste de fases
3. Técnicas de microscopía con luz visible
+
=
+
=
Interferencia constructiva Interferencia destructivaMicroscopía de contraste de fases
3. Técnicas de microscopía con luz visible
● El objetivo es manipular el desfase de dos haces
de luz para trasladar esas pequeñas variaciones de fase a los correspondientes cambios de amplitud que se visualizan como diferencias de contraste.
● Pequeñas diferencias de fase se convierten en
Microscopía de contraste de fases
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Luz incidente
Microscopía de contraste de fases
3. Técnicas de microscopía con luz visible
● El contraste de fases básicamente es un método de
iluminación que trata una determinada porción de la luz (la que ha sufrido difracción al atravesar el objeto) de forma diferente al resto (la que no ha sufrido ninguna alteración) para, a continuación, provocar que la primera porción de la luz interfiera con el resto, de manera que resulte una imagen visible de una muestra transparente.
Microscopía de contraste de fases
3. Técnicas de microscopía con luz visible
La formación de la imagen es un resultado de la interferencia de la luz directa y la luz difractada.
La luz directa (sin desviar) se proyecta por el objetivo y se extiende de forma homogénea en el plano imagen en el diafragma del ocular. Allí la luz difractada causa interferencia y reduce la intensidad dando lugar a áreas más o menos oscuras.
Microscopía de contraste de fases
Microscopía de contraste de fases
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Luz de la fuente Anillo anular Lente condensadora Muestra Lente objetivo Placa de fase
Microscopía de contraste de fases
3. Técnicas de microscopía con luz visible
● El primer paso es separar la luz directa de la luz
difractada. Para ello se coloca, en el plano focal de la condensadora, un diafragma anular que proyecta en el infinito la imagen de un haz anular.
Este cono de luz hueco pasa a través de la muestra sin desviarse y la débil luz difractada por la muestra se extiende en todo el plano focal posterior del objetivo.
Microscopía de contraste de fases
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Luz de la fuente Anillo anular Lente condensadora Muestra Lente objetivo Placa de fase
Microscopía de contraste de fases
3. Técnicas de microscopía con luz visible
● Después se acelera la luz que no se ha desviado
mediante una lámina colocada en el plano focal posterior del objetivo, que contiene un anillo, llamado anillo de fase.
Este anillo es más fino que el resto de la lámina de forma que la luz que pase a través de él (la luz no difractada) viaja una distancia más corta al atravesar el objetivo que la luz difractada.
Microscopía de contraste de fases
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Luz de la fuente Anillo anular Lente condensadora Muestra Lente objetivo Placa de fase
Microscopía de contraste de fases
3. Técnicas de microscopía con luz visible
● Así, cuando la luz directa y la luz difractada llegan
al plano imagen están desfasadas en ½ λ y cuando interfieren lo hacen destructivamente y los detalles de la muestra aparecen oscuros sobre un fondo más claro.
● El efecto final es la imagen de una muestra que
tuviera variaciones de densidad en lugar de variaciones de índice de refracción.
Microscopía de contraste de fases
3. Técnicas de microscopía con luz visible
AJUSTE DEL MICROSCOPIO:
● La correspondencia entre las placas de fase de los
objetivos y los diafragmas anulares de la condensadora ha de ser exacta. A cada placa le corresponde un diafragma anular y el centrado de ambos ha de ser exacto.
● El centrado se realiza con una lente de Bertrand
que permite enfocar el diafragma anular del condensador.
Microscopía de contraste de fases
3. Técnicas de microscopía con luz visible
AJUSTE DEL MICROSCOPIO:
● La iluminación de Köhler debe estar ajustada y el
diafragma de apertura completamente abierto para trabajar en modo contraste de fases.
Microscopía de contraste de fases
3. Técnicas de microscopía con luz visible
AJUSTE DEL MICROSCOPIO:
● Para centrar las placas con el diafragma anular se
inserta la lente de Bertrand y se enfoca.
Se gira el disco de la condensadora para insertar el diafragma anular que corresponda y se hacen coincidir con unos tornillos de ajuste
Microscopía de contraste de fases
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Limitaciones:
● Las imágenes presentan “halos” alrededor de los
detalles.
● Puede empeorar la resolución.
● No funciona bien con muestras gruesas porque los
desplazamientos de fase ocurren en áreas ligeramente por debajo o por encima del plano de foco.
Microscopía de contraste de fases
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Pescado cteonide
Microscopía de contraste interferencial
Nomarski
DIC
Microscopía de contraste interferencial
3. Técnicas de microscopía con luz visible
El principio es el mismo que en el caso de una placa de fases:
La interacción de los rayos difractados por el objeto con rayos que no lo hayan atravesado de manera que se puedan apreciar diferencias de amplitud derivadas de esta interacción.
● Pequeñas diferencias de fase se convierten en
Microscopía de contraste interferencial
3. Técnicas de microscopía con luz visible
● El dispositivo consiste en la separación de los rayos
provenientes del condensador en dos haces que viajan en direcciones ligeramente diferentes.
● Después de atravesar el objeto los dos haces son
recombinados.
● El diferente desfase causado por el objeto en los haces
Microscopía de contraste interferencial
3. Técnicas de microscopía con luz visible
● Si la iluminación es monocromática la imagen
presentará un contraste de intensidad con el fondo.
● Si la iluminación es policromática, como la variación de
fase introducida por el objeto depende de la longitud de onda, el resultado será una imagen de colores sobre un fondo elegible (mediante el ajuste de la diferencia de camino entre los haces).
● Esta técnica elimina los efectos de halo de la
Microscopía de contraste interferencial
3. Técnicas de microscopía con luz visible
● Los sistemas de contraste diferencial interferencial
desarrollados por Nomarski emplean un filtro de polarización para producir luz vibrando sólo en un plano perpendicular a la dirección del haz de luz.
● Este haz pasa a través de un prisma de Wollaston
modificado que separa el haz de luz en dos rayos perpendiculares el uno al otro (de modo que no pueden causar interferencia).
● Los dos rayos pasan a través de la lente
condensadora y emergen como dos haces paralelos que están extremadamente juntos, pero que tienen una ligera diferencia de caminos.
Microscopía de contraste interferencial
Microscopía de contraste interferencial
3. Técnicas de microscopía con luz visible
● El haz separado entra en la muestra y ambos
haces son desviados de acuerdo con su interacción con las características de la muestra (grosor, forma e índice de refracción).
● Los dos haces de luz alterados individualmente por
sus interacciones con la muestra pasan a través del objetivo y se recombinan por el prisma combinador de haces de Wollaston modificado, después de atravesar el objetivo.
● Esto elimina el corte o distancia y la diferencia de
Microscopía de contraste interferencial
3. Técnicas de microscopía con luz visible
● Como resultado de haber atravesado la muestra,
los caminos de los dos haces paralelos no son de la misma longitud (hay una diferencia de camino óptico) para las diferentes áreas de la muestra.
● Para que ambos haces puedan interferir, las
vibraciones de los haces de diferente longitud de caminos se deben llevar al mismo plano y eje.
● Para ello se coloca un segundo polarizador (el
analizador) a continuación del prisma de Wollaston recombinador.
Microscopía de contraste interferencial
Microscopía de contraste interferencial
3. Técnicas de microscopía con luz visible
● El haz de luz pasa a través del analizador cruzado
con el primer polarizador que los lleva al mismo plano y eje.
● Así ocurre una diferencia interferencial entre los
dos haces originalmente independientes que se observan como diferencias en intensidad y color.
● Las diferencias en la intensidad de la luz o el color
observado dependen de variaciones en los índices de refracción y/o grosor de las muestras.
Microscopía de contraste interferencial
3. Técnicas de microscopía con luz visible
● Cuando el segundo prisma se coloca de forma que
produzca la imagen más gris se produce la visión tridimensional más evidente de la muestra.
Rotando la muestra 180º se consigue que las zonas que aparecían elevadas aparezcan hundidas y viceversa.
● Con una fuente de luz blanca, la luz de diferentes
colores tiene diferentes longitudes de camino después de atravesar la muestra.
Algunas áreas generan interferencia constructiva para un color y destructiva para otros.
Microscopía de contraste interferencial
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Contraste de fases Contraste interferencial Alga spirulina
Microscopía de contraste interferencial
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Contraste de fases Contraste interferencial Cianobacteria
Microscopía de contraste interferencial
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Contraste de fases Contraste interferencial Glóbulos rojos
Aplicaciones
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Según la configuración del microscopio:
● Microscopios derechos:
● Preparaciones de cortes histológicos y cortes semifinos,
frotis, células vivas, muestras microbiológicas, láminas geológicas delgadas, probetas de ciencia de materiales de tamaño reducido, …
● Microscopios invertidos:
● Preparaciones de cortes histológicos y cortes semifinos,
frotis, células cultivadas dentro de cámara de cultivo, plancton y microorganismos en suspensión, microorganismos cultivados en placa de Petri, micromanipulación de células y embriones, probetas de ciencia de materiales, trabajo con subplatinas especiales,
Aplicaciones
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Según el tipo de iluminación:
● Microscopía de campo oscuro:
● Está especialmente indicada para muestras con
poco contraste:
espiroquetas, flagelatos, suspensiones celulares, técnicas de flujo celular, parásitos, conteo de granos de autorradiografía, ...
Aplicaciones
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Según el tipo de iluminación:
● Microscopía de luz polarizada:
● Estudio de todas aquellas estructuras en las que se
prevé una cierta ordenación que las hará, probablemente, anisótropas, tales como las paredes de celulosa de las células vegetales, las fibras musculares, etc.
● Casos de interés clínico como la detección de
diferentes sustancias minerales en los tejidos: sílice y asbestos en los tejidos pulmonares, mica y almidón en granulomas postoperatorios, etc.
Aplicaciones
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Según el tipo de iluminación:
● Microscopía de luz polarizada:
● Estudio de moléculas biológicas altamente
ordenadas como DNA, almidón, madera y urea.
● Numerosos cristales, estructuras fibrosas (naturales
y artificiales), pigmentos, lípidos, proteínas, huesos y depósitos de amiloide exhiben birrefringencia y por tanto ofrecen información bajo luz polarizada.
Aplicaciones
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Según el tipo de iluminación:
● Microscopía de luz polarizada:
● Aplicaciones geológicas, principalmente para el
estudio de minerales en secciones rocosas delgadas.
● Minerales naturales e industriales, materiales
compuestos tales como cementos, cerámicas, fibras minerales y polímeros.
● Identificación de fibras de asbestos, estudio de la
formación rocosa, polímeros naturales y sintéticos, fibras de nylon, etc.
Aplicaciones
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Según el tipo de iluminación:
● Microscopía de contraste de fases:
● Obtención de imágenes de elevado contraste de
muestras transparentes:
Células vivas (generalmente en cultivo) microorganismos, secciones finas de tejido, patrones de litografía, fibras, dispersiones de látex, fragmentos de vidrio y partículas subcelulares (incluyendo el núcleo y otros orgánulos).
● Secciones en parafina o resina sin teñir y muestras
Aplicaciones
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Según el tipo de iluminación:
● Microscopía de contraste de fases:
● En investigación médica y biológica especialmente
en los campos de citología e histología:
● Visualización de componentes celulares internos
como las membranas, núcleo, mitocondrias, cromosomas, aparato de Golgi y gránulos del citoplasma en células animales y vegetales.
● Diagnóstico de células tumorales y para ver el
crecimiento, dinámica y comportamiento de una gran variedad de células vivas en cultivo.
Aplicaciones
3. Técnicas de microscopía con luz visible
Según el tipo de iluminación:
● Microscopía de contraste de fases:
● Aplicaciones químicas e industriales: mineralogía,
cristalografía y morfología de polímeros. Microcristales sin color, polvo, partículas sólidas y polímeros cristalinos que tienen un índice de refracción que difiere sólo ligeramente del medio de inmersión.
● Productos comerciales como arcillas, grasas,
aceites, jabones, pinturas, pigmentos, alimentos, drogas, tejidos y otras fibras.
● Examen de superficies: circuitos integrados,
