Respuesta de dos bovinos adultos inoculados con dos cepas de virus de estomatitis vesicular New Jersey

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(1)RESPUESTA DE DOS BOVINOS ADULTOS INOCULADOS CON DOS CEPAS DE VIRUS DE ESTOMATITIS VESICULAR NEW JERSEY* Gustavo Arbal~ez R ••. RESUMEN Debtdo a las cuanttosas perdtdas economlcas que ocaStOna la estomatttls vesIcular, especlalmente en la ganadena de leche y a la dtficuItad que esta mlsma enfermedad produce en las campaiias de control de la fiebre aftosa es necesano aclarar algunos aspectos bastcos de la presentactOn chntca de la estomatltls vesIcular y desarrollo de la enfermedad en bovmo~ adultos EI ensayo se reahzo 10 vItro e m VIVO de dos cepas de campo de estomatJtls vesIcular tlpo New Jersey, Identlficadas con los numeros 7486 y 7546 Se halla ron dtferenclas en el tItulo fiJador del complemento, !tempo de mfectlVtdad en celulas BHK21 y ruferen clas marcadas en patogentcldad en bovmos adultos La cepa de VIruS New Jersey 7546 despues de ser moculada vIa Intrader'11ohnguaJ a un bovlno adulto desencadeno lesJOnes locales severas ViremIa y leslo nes de generallzaclOn podal Fueron detectados ruve les de antlcuerpos neutrahzantes a los sels d las post moculaclOn, con tltulos altos y perslstentes hasta la finaJlzaclOn del expenmento Los ntveles de antlcuer pos locales fueron perslstentes en el bovmo Ifloculado con la cepa 7486. 2 INTRODUCCION La EstomatJtls VesIcular (EV) es una enfermedad VIral que afecta de preferencla a los bOVlflOS, equlflos y porclnos en los cuales produce una stntomato!ogla sImilar a la Flcbre Aftosa (I7) Debldo a las cuantlO sas perdldas economlcas que ocaslona especlaJrnente en la ganadena de leche y ala dlficultad que esta mls ma enfermedad produce en las campafias de control de la Flebre Aftosa, es necesano acJarar algunos as pectos baslcos de la presentaclOn chruea de la EV y desarrollo de Ja enfermednd en bovmos adultos mocu Indos con cepns de campo de VIruS de estomatltls vesl cular New Jersey via mtradermolmgual •. A pesar de que el presente expenmento se reahzo urucamente en dos bovmos adultos, debldo pnnclpal mente a la dtficultad de aloJamtento en condICiones aJsladas, es blologIcamente valIdo Sl se Ilene en cuen ta la alta senstbilidad de los mlsmos al VIruS de la Estomatltls Vesicular comparados con anunales Jove nes y a las pruebas realtzadas m VItro en el estudlO de las propledades flSlco qUlmlcas de las cepas Se dlo mayor unportancla a1 desarrollo de Viremia, leslOnes de generallzaclon y a 1a POslblhdad de eXIstencla de portadores. 3 REVISION DE LITERATURA EI VIruS de 1a EVes macllvo a una temperatura de 58° C durante 30 mmutos tguaJrnente por luz VIsIble y ultravlOleta por solventes de hPldos, por aCldo ace tlCO aI 5';f. en 30 mmutos y por el fenol al 0 5%(2) La teeruca de plaqueo de los VIrus ha sldo utthzada para caractenzar y separar las dlferentes cepas Las earaetenstlcas mas ,mportantes son tamailo (grande pequena meruana 0 dtmmuta) forma (redondeada 0 megular) y color (claro opaco 0 turblO)(4) Se ha observado que algunas cepas del \1rtJS de la EV serotlpo New Jersey productoras de placas pe quenas presentan reslstencla para produclr InfectiOn y efecto eltopatlco en celulas L (cepa 1929) wtnpa radas con cepas productoras de pIa cas grandes (4 23) En un estudlO prevlO parhendo de una cepa ongI nal de campo de Virus de EV New Jersey se atslaron dos upos de clones con morfologla de plaea grande y placa pequefla Se trabaJo con eJ VIrus productor de placa pequeila la cuaJ conservo esta caracteflSlica de morfologJa de pJacas en Lelulas DHK21 CI 13 hasta el pas3Je 70 slendo In anttgcntcldad en bovlnos Igual a 1a del VIruS de campo (20) En un ensayo antenor en bovmos moculados por VIa mtradermoJmgunJ y en las enCl3S con VIruS de 13 EV serotlpo New Jersey solo des..rroll3ron leslones. Controbuclon del Programa Naclonal de Enlermedades Veslculares DivisiOn Clenc as Veter nanas Instltuto Colomb ana AgropecuOrlo ICA M~dlco Veleronano M S Laborato"o de Investigaciones Medlcas Velennanas LlMV Aportodo Aereo 29143 Bogola. 491.

(2) tlplcas en la boca, con sahvacl6n y fiebre Se detect6 'Vlrenua entre las 24 y 66 horas post moculaclOn (17, 19). De otro lado, bOVlnos moculados por vIa mtramus cular can el VIruS de la EV New Jersey, escanficando prevlamente en la lengua y la ubre, no desarrollaron smtomas chmcos de la enfermedad (I) Cuando los bovmos se mfectan por pnmera vez con el VIruS de la EV, desarrollan mveles de antlcuer pos neutrahzantes, los cuales no protegen a los anIma les contra una dcscarga de VIruS mtradermolmgual con la cepa homologa a los 30 dlas slgUlentes, a pesar de quelos tttulos sean altos (9 21) Algunos autores demuestran que los antlcuerpos clrculantes proporclOnan una protecclOn escasa de los ammales contra los Rhabdovlrus (Estomatltls VesIcular y RabJa) y el huesped puede desarrollar reslstencla a la mfecclOn por mecamsmos dlferentes a los medlados por antlcuerpos neutralIzantes (3, 21 23) La tmportancla de la mmumdad local ha sldo c1aramente demostrada despues de tnfecclones mducI das con rlunovlrus mfluenza y polIOVIrus EXlste fuerte eVldencla de que la actlVldad antIVIral en su perficles mucosas extemas es el resultado de la Stn tesls de antJcuerpos locales pnnclpalmente de mmu nogJobulma A (9, 18) 4 l\IATERIALES Y METODOS 41. CEPAS. Se utJlIzaron las cepas New Jersey 7486 y 7546 de epltelIo de campo, las cuales se procesaron segun me todologla empleada en el Programa de Enfennedades Veslculares del Laboratono de InvestlgaclOnes Medl cas Vetennanas (LIM V) deilCA Las cepas proceden tes de epltelto Imgual bovmo se emplearon sm nmgun tlPO de modlficaclOn en la moculaclon de los bovmos (l2) 42. TITULACION Y CARACTERIZACION DE PLACAS. Las cepas selecclOnadas se tltularon en mlcroplaca y medIante la tecmca de fiJaclon del complemento Se utJ!tzaron monocapas de culuvo celular de la Imea BHK21 en frascos plast\cos de 75 cm 2 para la caracte nzaclon de pJacas Se caractenzaron las placas forma das a partir del eplte\to lIngual de moculaclOn (Ep L I) Y eplteito itngual de refrescamlento (Ep L 2) aSI co mo las placas formadas procedentes de eplteito de leslones de generahzaclon (Ep G) Se detenruno un pH de 7 3 en el medlo de plaqueo, una temperatura de 37°C y un tlempo de mcubaclOn de 60 horas Se empleo Ia tecruca de Dulbecco (6 12) 43. ENSAYO EXPERIMENTAL EN BOVINOS ADULTOS. Dos bovlnos aduItos, mestizos, Hoistem, machos. IJbres de anltcuerpos contra la EV, fucron examma dos chrucamente durante 15 dlas antes de lruclar cl. 492. expenmento. para descartar la presencIa de cualqUler enfermcdad mfecto contagtosa EI bovmo Idcntlficado con el numcro 7603 se mocul6 con 2 ml de la cepa NJ 7546 vIa mtradermohngual, con un tItulo mfeccloso de 106.8 DICT SO/tnl (dosls mfectante cultlvo de teJldo 50 por ml) EI bOVlno 7843 se moculo en fonna sImilar con la cepa NJ 7486 con titulo mfeccloso de 106.9 DICT 50lml Los ammaIcs fueron aloJados durante cmco meses en umdades de alslarruento separados 44. AISLAMIENTO DE VIRUS DE SANGRE. Se tomo sangre de la vena yugular, prevIa desmfeccIon local cada doce horas durante qumce dlas Se dlspuso de tubos estenles con hepanna (I 000 UI/ml) y frascos plasllcos de 25 cm 2 que conte man 4 x 106 celulas de la Imea BHK21 en monocapa La sangre se moculo en volumenes de I ml por frasco Las muestras posltlvas se confirmaron por la prueba de fiJaclOn del complemento con el respectlvo suero homologo 45. NIVELES DE ANTICUERPOS NEUTRALIZANTES. Fueron tomadas muestras de sangre cad a tercer dla en volumenes de 5 ml durante el pnmer mes y luego cada qumce dlas hast a finahzar el expenmento A parttr de la sangre se obtuvo el suero en condiciones de estenhdad, medIante centnfugaclOn a 1 500 g du rante 10 mmutos (12) Fueron colectadas con la copa de probang muestras de hquldo de la fannge y porclon proxImal del esofago cada ocho dlas durante el pruner mes y luego cada tremta dlas hasta la fmahzaclon del expenmento Una parte de la muestra se UttllZO para el mtento de 31slamlento del VIruS y otra parte para la Investl gaclOn de anttcuerpos locales EI hqUldo esofagofanngeo se proceso segun tecruca estandanzada en el Programa NaclOnal de Enfermedades Veslculares (LIMV). sm preVlo tratamlento con tncloro. tn!luoro etano (TTE)(9 , 12) 5 RESULTADOS 5 1 TITULACION Y CARACTERIZACION DE PLACAS La Tabla 1 muestra los tltulos tnfeccloso y fiJador del complemento de las dos cepas uultzadas La morfologla de placa fue muy slmuar en las dos cepas de Estomatttls selecclonadas para este estudlo. con un dlarnetro aproxtmado de 2 mm Se observo que las placas fonnadas a partir de epItelto podal (IeslOnes de general!zacI6n) y BHK5 tuvleron un dlarnetro de 4 mm (FIguras 1 y 2) 52. EXAMEN CLiNICO EN BOVINOS ADULTOS. La fiebre fue detectada desde las 12 y 24 horas post tnfecC16n en los bOVlnos tnoculados con las cepas.

(3) TABLA 1 T,lUlae,on de las cepas de Estoma t1ts VeSIcular 1 po New Jerse v a Pdrt r de ep l e i 0 I ngual bovlno. No Reglstro. Titulo Infeccloso por mi'. ... Tlempo de Infectlvldad en c61ulas BHK. UFC 50. 7486. 10. 69. 20 horas. 1/8. 7546. 68 10. 18 horas. 1/64. UFP/ml. Titulo tnfeccloso expresado en logarttmo base 10 Unldades fl)adoras de complem ento 50 •••. Unldades formadoras de placa por ml. FIGURA 1 Caracteroza cIOn de pl acas de la ceps NJ 7486 epltello lingual 1 BHK 1 8HK5 V Ep. L 2. <,~ ~/ -"' -. \ ", .. ~.. :1. i, If 'I. !. :\:. ..:"'J. . ::. ~' ~~;'. ·, .1 .. '.\Ii·...'t ' 1. Ii. ~~" .. I,. I. ~ _ _- ,L",.-",,",_ _ _. _ .. _ ; ._. .-"':. -- .. ~. ··--'T-. ,~j. FIGURA 2 C.,acteroz. cion de placas de fa cepa NJ 7546 Ep L 1 BHKl. BHKS. Ep. L. 2. Ep. gencra hz8c on. 493.

(4) ~. to ~. Bov,no 7G03 (Cella 7546) 40. Bov no 7843 (Cepa 7486). r.. 40. "8. ... .". ~. 393. c. .. ~. ----...,/---r.. 39. o. •. !!. •. ~ !:! ~. !!. Q). "'-. Temperatura maxama normal. -------------------------------------------------------". J. d. E. Q). "". -~/. •. •. 37. o. 12. 24. 36. 48. 60. 72. 84. 96. 108. 120. 132. 144. 156. 168. 180. 192. Horas post InocutaclOn. FIGURA 3. Fleg,stro de temperaturd de an,males Inoculados con las Cepas 7546 y 7486 del. VlrllS. de la Estomat,tlS VeSIcular Tlpo New Jersey. 204. 216. 228. 240.

(5) NJ 7546 y NJ 7486 respectivamente (FIgura 3) Las vesiculas Imguales fueron eVldentes a las 18 horas post-mfecclon, las cuales confluyeron a las 36 horas para formar otras de mayor tamano, al reventar estas, drenaron un hqUldo claro, ltgeramente VlSCOSO Despues del desprenduruento del eplteho, los anunales rechazaron el ahrnento y la sa\Jvacl6n fue profusa EI bomo 7843 presento clcatnzaclon completa de la mucosa Imgual a los doce dlas post-mfecclon y a los qumce d13s el bomo 7603 53. FIGURA 4 BOVinO Inocula do con 01 ViruS de I. EstomatiU, Ve. slcular NJ 7546 mlembro anterior Izquierdo vc:lculas y oro,lo. nas en la regibn planter observadas a los cmco dIes post Inocula· cl6n. AISLAMIENTO DEL VIRUS DE LA SANGRE. I. La Tabla 2 muestra los resultados de aJSlarruento. I. del VlfUS de la sangre. I. I. TABLA 2. Aisiamiento de virus de c~lulas BHKl a partir de muestras de sangre completa de bovlnas macula dos con el VirUS de la Estomatltls Vesicular tlPO New Jersey. .~"'. ·--1I. ...). BOVINOS Tlsmpo post Infscelbn ihoresl. 7843. 7603. ECP. ECp·. 12 24. 36 48. +. +. +. +. 60. ..... FC. :. ,-:I. ' " . _t. ~,.oi:J. +. +. +. +. 72. 84. 96 108 120. /-. =. 360 •. Efecto cllopitlco. ... FIJeclbn del. 54. complsr"~nto. LESIONES DE GENERALIZACION ,.. A las 27 horas post-moculaclon en el bomo moeu. lado can la cepa NJ 7546, se observ6 senSlbilidad a la palpaclon en la regJon mterwgJtal y parte postenor del menudJIlo del mlembro antenor derecho, con aumento de la temperatura local A las 24 horas SI gutentes se apreclaron vesfculas en los sttlOS menclo nados y a los 9 dias post-mfeccl6n, todos los ffilembros aparecteron afectados en forma surular con des· prendJIDlento parcial de los case as, 10 cual ocastono una COJera severa y postract6n del anJffial durante un mes (Flguras 4 y 5) A las stete semanas se not6 recuperact6n completa de todos los mtembros afectados EI bovUlo moculado can In cepa 7486 no exlubl6 leslones pod ales. .... . '.. ..\. ~',' .. ~ .~i. .i. . ... . _._ ._ ---_ . .--. . ".- _-. FIGURA 5 BOVinO ,lnoculedo con el ViruS ds Estomotrtls Vesl euler NJ 7546 ~'Iombro posterior Ilqulerdo desprendlmtento dolcMco. 495.

(6) 55. detectaron tftuios de nntlcuerpos neutra1lZantes en el suero en los dos bovmos (Figuras 6 y 7). Los mveles de antlcuerpos permanecleron est abIes hasta las siete semnnas. con cafdas menDs aprecJablcs en los meses slgUlentes. NIVELES DE ANTICUERPOS NEUTRALlZANTES. A partIr del sexto dla despues de la moculacl6n. se. / /. ". .. 2. .!!!. /. ,,. /. 'tJ. /. ,/. .;. /. :;;. /. /. 'i. 'tJ. \. UI. ~. \. I/'). ..... \ \. co. ..a.. \ \. \. ,. U. \. .!!!. c 0. u. \ \. ..E :::. 1 \ \. /. /. ~. ....to. -N. /. 0 C. /. '>0 J:>. /. .'. Ci. / /. 'tJ. /. 0. /. 8. ~to. ... 0. '". .'". II. 0. c. ~. '"uco. ~. ~ U. :!'". 0. .. 'S! 0. ".. ~. a:. T I I. ..... ..... "". "". c a. c a.. .. ... ..E .::. til. "". "". "". II. 1;. !l CD. ..so!;.. \. 'l:~. \ \ \. ... 'a! en .. .!!! Q. ..... .. ..c. 'D. .2>>- at. \. ~. II. 'i c. I::. \. •. II. ~. B. \. I. 0. 'D. 'tJ. M. \. :0 ;:. ..=.. .... 0. 'D. '0". u M 0. I. ,,. .!!!. .=. 1 1 /. 0. 'tJ. en'". CD. Z. c! .... Xl. .. ... =., ., -. ..".-'" .... a.!! . '..... .. u. c~. a. ... til. I. " U. II E. E~ <tw. M. ui. <t. c:. :::I. u:". IOl 001' S31NlfZIWlun3N SOdll3nOl!NIf 01n111.

(7) 6. Suero. L(qu.do esofago f.rlngeo. ~ (!J. a. ;. 5. en. ... w 2. < N :::; o:t a::. .... 4. j. w. z. en. aQ. a:. w j u. ,. 3. t:. 2. o:t. I. a..J. I I. j. I. I-. i=. I I. 2 I. I. I. //. 1 -. /. /. /. /". '. ............. ............ I. I. I. -----. /. --.,. -..... ............... . . . . . .J. "'"". /. .I. ,. /. I 3. 5. 9. 11. 13. 15. 17. Olas. 2. 3. " , "-. "-. "-. ,,. ,. '. 4. 5. Meses T.ompo post lnoeulael6n. llo. ~. FIGURA 7 Antlcuerpos neutraltzantes S~rtco. y locales de liquldo .50l.go far/ngoo dol bovina 7843 Inoculado can 10 Cop. 7486 dol Vesicular t.po New Jersay. VtrUS. do la Estomatlt.s.

(8) 56. NIVELES DE ANTIC'UERPOS LOr ALES. A los sels d las post lOoculacI6n sc detectaron mve les de antJcuerpos locales a partir delllqUldo esofago fanngeo en el bovlflo 7843 y a los llueve dlas en el bovlOo 7603 (Flguras 6 y 7) EI bovlno 7603 presen to un tltulo de I 0 log al final del expenmento mlentras que en el bovmo 7843 los tltulos de antJ cuerpos desaparecleron eompletamen te haem los cuatro meses 57. ENSA YO DE PORT ADORES. De nmguna de las muestras de ltquldo esofagofa nngco colectadas durante los cmco meses de expen mentaclon, se logro 31slar VIruS de EstomatJtls en celu las BHK21 confimlaclOn hecha por la prueba de fiJa cion del complemento 6 DlSCUSION. En los ensayos III vJtro e III VIVO de las dos cepas de Estomatltls VesIcular tlpo New Jersey la numero 7546 mostro menor tJempo de InfectlVldad en l-elulas BHK21 y mayor titulo fiJador del complemento co rrelaclOnadas con la sevendad de las leslones producl das en un bovlno adulto lfloculado VIa mtradermohn gual Hasta el momenta no se ha encontrado relaclOn entre estas vanables y la patogemcldad de las cepas de estomatltls vesIcular en bovlnos La mayor vlrulen cIa y patogemcldad observadas con la cepa 7546 pue de deberse a factores relaclOnados con el huesped ya que solo se Inoculo un anImal con cada uno de los VIruS (24) EI penodo de IIIcubaclOn de la enfennedad en los bovlnos 1II0cuiados Via mtradennohngual fue de 24 36 horas post mfecclon para los bovlnos 7603 Y 7843 respecuvamente La Vlfemla detectada a las 24 horas post lnoculaclOn fue de corta duraclOn en el bovlno 7603 y apareclo muy tardlamente en el bo vmo 7843 y conshtuye un aspecto muy Import ante SI se hene en cuenta la POslblhdad de transmlslOn de la enfennedad por artropodos y hematofagos (10 14) Sm embargo esta POslblhdad ha sldo obJetada por 10nkers (14) puesto que en la mayona de los traba lOS expenmentales se ha comprobado que la VIremIa es eflmera y debll Ademas no se Ita regtstrado el als lamlento del VIruS New Jersey de artropodos hem a tofagos en areas donde la enfennedad se presenta en fonna enzootJca y eplzoottca 10 cual es comun con el mus de Estomatltls tlpo IndIana (17) Las leslones de generahlaclOn podal estuvleron asocIadas con el aJslamlento del VlfUS de la sangre 10 cual pennlte suponer que el VIruS se dlsemlno por VIa sangumea y postenonnente se localtzo en el epltelto podal ocaslOnando las leslOnes caractenshcas proplas de las enfennedades veslculares (15 16) Este hecho revlste gran tmportancla pues no solo llIlphca p~rdl das economlcas en la ganadena de came y leche, smo tam bIen una lenta recuperaclon de los antmales afec tad os (7). 498. En relaclon con la respuesta mmunol6glca humoml y local, los ntvclcs de antlcucrpos seroneutrahzantes, se dctectaron dcsde los sels dlas en los dos antmalcs, slendo sostemdos los mveles en cl bovmo moculado COli la ccpa 7546 En cuanto a los anhcuorpos locales, el comporta (mcnto fue slmtiar en los dos ammales, pero en el bo VIIlO moculado con la eepa 7486, desaparecleron a los cuatro meses nllentras que en 01 anllndl moculado con la cepa 7546, pennanecleron hasta los cmco me ses de expenmentaclOn Se observo que los valores mmullltanos son perststcntes en cl ammal severamen te afectado A pesar dc que la Itteratura reglstra que los antlcuerpo~ neutrahzantes son poco proteetlvos contra el VIruS de la Estomatltls Vcslcular, Castaneda y colaboradorcs (3) y Lobo y colaboradores (16) ob servaron relaclOn entre los tltulos de neutraitlaclon y la reslstencla a la enfennedad natural La negatlVldad de las mucstras de Itquldo esofago farmgeo 31 mtento de aJslamlento de virus de £:stomatitis Vesicular constJluye un hecho expen mental en contra de la eXIstencla de portadores Aun que es probable que los antlcuerpos locales neutralt zaron al VlfUS este no fue poslble 3!slarlo despues de que dlchos antlcuerpos deJaron de ser detectados (9 8) EI mterferon pudo haber )ugado un papel Impor tante en la negattVIdad aI mtento de alslamlento del VIruS ya que el ViruS de I:. V es altamente senSIble al tnterferon La eXlstencla de portadores del vuus de la EV debena esclarecerse con estudlOs postenores, mvolucrando un numero mayor de bovtnos 7 CONCLUSIONES Se reproduJo la enfennedad en dos bovtnos adultos moculados vIa tntraderrnolmgual con dos cepas de EV New Jersey Se comprobo la presentaclon de VIremia en los bo vmos moculados, la cual estuvo relaclOnada con el dc sarrollo de leslones podales generaltzantes severas en todos los mlembros en el bovmo 7603 La mmumdad humoral (antlcuerpos neutraltzan tes) y local (antlcuerpos neutrahzantes detectados en el hqUldo esofago fanngeo) fue de larga duraclon pe TO mas sostemda en el bQvmo severamente afecta do No se demostro la eXlstencla de portadores duran te los CinCO meses de expenmentaclon. 8 SUMMARY Response of adult cattle moculated With two str3!ns of vesIcular stomatitIs New Jersey Type Due to the economIc beses caused by the vesicular stomatitIs VIruS mamly III d3!ry cattle and the dIfficul tIes that thIs desease produces m the campamg agmsnt foot and mouth dIsease VIruS, It IS a purpose to clanfy some baSIC aspects of the chmc presentatIon of veSI cular stomatllts and the development of the disease m adult cattle.

(9) Two strams of vesicular stomatitis VirUS Identdled as NJ 7546 and 7486 were used for III I'IVO and III 1'/ fro studies The strams showed shght differences In <.omplclllent fixatIOn titer mfectlVlty m BI-IK21 cells and remarkable differences m virulence and pathoge OIC1ly m adult cdttlc The bovme moculated with the stram Nl 7146 developed severe local leSions Viremia and foot. leslOnes HJgh titer of neutralwng antlbodlCS were detected SIX days post moculatlon and thc tltcrs pemsted up to the end of the expenment The levels of local antibodies were persistent m the bovme moculated With the stram NJ 7546 and they were not detected m the bovme moculated With the NJ 7486 stratns four months post moculatlon. 9 REFERENCIAS mBLIOGRAFICAS. ARANGO S JONKERS A DUENAS A ESTUPINAN J Leuc tos bov nos cult vo y postble papel en la patogenes s de estomattt s yes cula boy na Rev sta ICA IColomb al v 10 no 2 p 215222 1975. 2. BUXTON A. 3. CASTANEDA J LAWERMAN L HANSON R Evaluat on of v rus neutraltzat,on tests and assoctatton of tndtces to cattle res stence En Annual Meet ng of the Amer can Vetertnary Med,cal Assoc at on 68 th New York 1963 Proceed ngs p 445-467 1964. 4. COOPER R The plaque assay 01 an mal V!fuses Advances tn V rus Research IEstados Un dos) v 8 no 2 p 319374 1969. 5. COTTON W VeSIcular stomatotls Veteronary MediCine Estados Unldosl v 22 no 4 p 169175 1927. 6. DULBECCO R ProductIon of plaques In monolayer t ssue cui lures by Single parttcles of an antmal v rus Proceedtngs 01 the Nalure Academv of Sc ence IEstados Untdosl v 88 no 3 p 747752 1952. 7. ELLIS E KENDALL H The publ c health and econom c effects of yes cular stomatllls n a herd of da ry callie Journal Amerocan Veter nary Med cal Assoclalton IEstados Unodosl v 44 no 4 p 377 380 1964. 8. FERREIRA M Prueba de m croneutral,zaclon para estud 0 de antlcuerpos de la Itebre aftosa BoletI" Centro Panamer cano de F,ebre Aftosa IBras II no 21 22 p 17 20 1976. 9. GERBER J MARRON E KUCERA C Local and slstem c cellular a nd ant body mmune response 01 caTtle 10 nlect ons bov ne rh nOI'aque I s v ruS vacc nes adm n stered Intranasaliy a ntramuscularv Ame, can Journal Veteronary Research IEstados Un dosl v 39 no 5 p 753 760 1978. 10. HANSON R The na tural hIstory 01 yes cular stomatt s Bacter ologV Rev eVIl (Estados Untdos) v 16 no 3 p 179204 1952. 11. FRASER G An mal m crob,ologu London Black VIIell SctenltflC v 2 p 549-572 1959. - BRANDL Y C Ep zootlologV of veSIcular stomatlt s Amer can Journal Healtn I Estados Un dos) v 47 no 2 p 205209 1957. 12. INSTITUTO COLOMBIANO AGROPECUARIO Programa Enfermedades Ves culares Bogota Colomb a Manual de Tecn cas del Pr09 ama de Enfermedades Vps culares Bogota ICA 1978 251 p. 13. JOHNSON K TESH R PERALTA P Epldem 0103Y of ves cular stomalll s v rus Journal of the Amerocan Veter narv Me d,cal Assoc at Ion (Estados Un dos) v 155 no 12 p 21332140 1969. 14. JONKERS A The eplZoot ology of the veSIcular slomat {s v rus Amer can Journal EpIdemIology (Estados Un dosl v 86 no 5 p 286291 1957. 15. LAI S McKERCHER P MOORE D GILLESPIE J Pathogenes s of Veter nary Research (Estados Unodos l v 40 p 463468 1978. 16. LOBO C A ARBELAEZ G DE GERARDINO A ESTUPINAN J LOPEZ M Ensayos de vacunas cont,a la estomat I , veSIcular I Preparaclon expertmenlal RevlSta ACOVEZ (Colomb.' v 3 no 9 p 3239 1979. 17. MASON J La epldem,ologl. de la estomalltlS ves cular Bolettn Cfnlro Panamer cano de F ebre Aftosa (Bras p 1-48 1978. 18. MATSUMOTO M McKERCHER P WUSBAUM K Secretary ant body response on cattle onlected w th fool and moutn dIsease VirUS Amertcsn Journal Veler nary Research IEstados Un dosl v 39 no "1 p 1081 1087 1978. 19. REBELIN W The cvtopalhogenesls of veSIcular 1I0ma!'! s v"us nlectlon n cattle Amerocan Journal Veter nary Resea ch (Estados Umdosl v 19 no 70 p 6673 1958. $VII. ne veSIcula' d sease tn p g' Amerocan Journal 01. n no. 29-30. 499.

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