ES 2 819 123 T3
51 Int. CI.:
A61K 38/37 (2006.01) C07K 14/755 (2006.01) C12N 15/11 (2006.01)
12
TRADUCCIÓN DE PATENTE EUROPEA T3
86 Fecha de presentación y número de la solicitud internacional: 27.01.2016 PCT/US2016/015092
87 Fecha y número de publicación internacional: 04.08.2016 WO16123200
96 Fecha de presentación y número de la solicitud europea: 27.01.2016 E 16744021 (3)
97 Fecha y número de publicación de la concesión europea: 15.07.2020 EP 3250226
Proteínas del factor VIII que tienen secuencias ancestrales, vectores de expresión, y usos relacionados con ellos
Título:
54
30 Prioridad:
30.01.2015 US 201562109964 P
45 Fecha de publicación y mención en BOPI de la traducción de la patente:
15.04.2021
73 Titular/es:
EMORY UNIVERSITY (50.0%)
Office of Technology Transfer, 1599 Clifton Road NE, 4th Floor
Atlanta, Georgia 30322, US y
GEORGIA TECH RESEARCH CORPORATION (50.0%)
72 Inventor/es:
SPENCER, H., TRENT;
DOERING, CHRISTOPHER, B.;
ZAKAS, PHILIP, M. y GAUCHER, ERIC
74 Agente/Representante:
PONS ARIÑO, Ángel
Aviso:En el plazo de nueve meses a contar desde la fecha de publicación en el Boletín Europeo de Patentes, de la mención de concesión de la patente europea, cualquier persona podrá oponerse ante la Oficina Europea de Patentes a la patente concedida. La oposición deberá formularse por escrito y estar motivada; sólo se considerará como formulada una vez que se haya realizado el pago de la tasa de oposición (art. 99.1 del Convenio sobre Concesión de Patentes Europeas).
2 DESCRIPCIÓN
Proteínas del factor VIII que tienen secuencias ancestrales, vectores de expresión, y usos relacionados con ellos Referencia cruzada a solicitudes relacionadas
5
La presente solicitud reivindica prioridad a la solicitud provisional de EE. UU. número 62/109.964 presentada el 30 de enero de 2015.
DECLARACIÓN CON RESPECTO A LA INVESTIGACIÓN CON FONDOS FEDERALES 10
La presente invención se realizó con el apoyo del gobierno con las subvenciones R01 HL092179 y U54 HL112309 otorgadas por el National Institutes of Health. El gobierno posee ciertos derechos sobre la invención.
INCORPORACIÓN POR REFERENCIA DE MATERIAL PRESENTADO COMO ARCHIVO DE TEXTO A TRAVÉS 15
DEL SISTEMA DE ARCHIVO ELECTRÓNICO DE LA OFICINA (EFS-WEB)
El listado de secuencias asociado con la presente solicitud se proporciona en formato de texto en lugar de una copia impresa, y por tanto se incorpora en la presente como referencia en la presente memoria descriptiva. El nombre del archivo de texto que contiene el listado de secuencias es 15072PCT_2016-01-27_ST25.txt. El archivo de texto es de 20
399 KB, fue creado el 27 de enero de 2016 y se presenta electrónicamente a través de EFS-Web.
Antecedentes
Las mutaciones en el gen del factor de coagulación VIII dan como resultado una proteína disminuida o defectuosa del 25
factor de coagulación (FVIII) que da lugar a la hemofilia A caracterizada por un sangrado incontrolado. El tratamiento de la hemofilia A generalmente implica una infusión intravenosa de varias semanas de por vida de productos con FVIII recombinante o derivado de plasma humano. Los pacientes tratados con productos de reemplazo de FVIII a menudo desarrollan anticuerpos neutralizantes que hacen que el tratamiento futuro sea ineficaz. Por tanto, existe la necesidad de identificar terapias mejoradas.
30
Las terapias génicas se basan generalmente en virus genéticamente modificados diseñados para suministrar transgenes funcionales al paciente para que sus propias células puedan biosintetizar una proteína carente o defectuosa. Se han realizado avances clínicos usando vectores víricos adenoasociados recombinantes (rAAV) para la expresión de factores sanguíneos en el hígado. McIntosh et al. notifican niveles terapéuticos de FVIII tras la 35
administración del vector rAAV que codifica una variante del factor VIII humano. Blood. 2013, 121(17):3335-44. Véanse también Brown et al. Molecular Therapy, Methods & Clinical Development (2014) 1, 14036; Doering et al. J. Biol. Chem.
2004, 279:6546-6552; Zakas et al., J Thromb Haemost, 2015, 13(1):72-81; y la publicación de solicitud de patente de EE. UU. US20040197875.
40
Las referencias citadas en el presente documento no constituyen una admisión de la técnica anterior.
Sumario
La presente divulgación se refiere a proteínas FVIII recombinantes o quiméricas, variantes y vectores que codifican 45
las proteínas que contienen una o más mutaciones ancestrales. En ciertas realizaciones, uno o más dominios proteicos comprenden secuencias de aminoácidos que se derivan de secuencias de aminoácidos reconstruidas de forma ancestral. En ciertas realizaciones, la divulgación se refiere a composiciones farmacéuticas que comprenden las proteínas o vectores y métodos relacionados de inducción de la coagulación de la sangre.
50
En ciertas realizaciones, las mutaciones en los dominios ancestrales son aquellas contenidas en SEQ ID NO: 2, 11, 20 y 29-38. En ciertas realizaciones, el dominio ancestral es una secuencia dentro del dominio A1, dominio A2, dominio de péptido de activación (ap), dominio A3, dominio C1 o dominio C2 que opcionalmente tiene un dominio de péptido de señalización (sp). En ciertas realizaciones, la variante de FVIII comprende un domino B eliminado.
55
En ciertas realizaciones, la variante de FVIII comprende un dominio A1, un dominio A2, una secuencia RHQR (SEQ ID NO: 245), un dominio A3, un dominio C1 y un dominio C2.
En ciertas realizaciones, la variante de FVIII comprende un dominio A1, un dominio A2, un dominio de péptido de activación (ap), un dominio A3, un dominio C1 y un dominio C2. En ciertas realizaciones, la variante de FVIII comprende 60
opcionalmente un domino B eliminado.
En ciertas realizaciones, la variante de FVIII comprende un enlazador de entre dos y cincuenta, o dos y veinticinco, o dos y quince aminoácidos entre el dominio A2 y el un dominio de péptido de activación (ap).
65
En ciertas realizaciones, el dominio de sp ancestral es SEQ ID NO: 3, 12 o 21 o sus variantes. En ciertas realizaciones, E16744021
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3 el dominio A1 ancestral es SEQ ID NO: 4, 13 o 22 o sus variantes.
En ciertas realizaciones, el dominio A2 ancestral es SEQ ID NO: 5, 14 o 23 o sus variantes. En ciertas realizaciones, el dominio B ancestral es SEQ ID NO: 6, 15 o 24 o sus variantes. En ciertas realizaciones, el dominio de ap ancestral es SEQ ID NO: 7, 16 o 25 o sus variantes. En ciertas realizaciones, el dominio A3 ancestral es SEQ ID NO: 8, 17 o 26 5
o sus variantes. En ciertas realizaciones, el dominio C1 ancestral es SEQ ID NO: 9, 18 o 27 o sus variantes. En ciertas realizaciones, el dominio C2 ancestral es SEQ ID NO: 10, 19 o 28 o sus variantes. En ciertas realizaciones, las variantes son aquellas que tienen más del 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad o similitud con los dominios.
En ciertas realizaciones, las variantes son aquellas que tienen una, dos o más sustituciones o sustituciones conservativas de aminoácidos. En ciertas realizaciones, las variantes son aquellas que tienen una, dos, tres, cuatro, 10
cinco, seis, siete, ocho, nueve o más sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos.
En ciertas realizaciones, la proteína FVIII recombinante tiene la SEQ ID NO: 39, 40 o 42 o sus variantes. En ciertas realizaciones, las variantes son aquellas que tienen más del 80, 85, 90, 95, 96, 97, 98 o 99 % de identidad o similitud con las proteínas que incluyen o que no incluyen el péptido de señalización. En ciertas realizaciones, las variantes son 15
aquellas que tienen una, dos o más sustituciones o sustituciones conservativas de aminoácidos. En ciertas realizaciones, las variantes son aquellas que tienen una, dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o más sustituciones, eliminaciones o adiciones de aminoácidos.
En ciertas realizaciones, la divulgación se refiere a la proteína FVIII recombinante o quimérica que tiene una o más 20
secuencias ancestrales o sus variantes tales como SEQ ID NOs: 44-244 y 247-277 en los dominios correspondientes.
En ciertas realizaciones, la divulgación se refiere a la proteína FVIII recombinante que tiene un dominio ancestral seleccionado entre un dominio de péptido de señalización (sp), dominio A1, dominio de péptido de activación (ap) y dominio A3 en donde uno o más aminoácidos en el dominio B son opcionalmente eliminados o el dominio B tiene una o más sustituciones de origen natural o no natural.
25
En ciertas realizaciones, la proteína FVIII recombinante o quimérica tiene la mutación E434V como se notifica en la Figura 1 del documento US20040197875, en donde la proteína tiene un dominio A2 que tiene TDVTF (SEQ ID NO:
43).
30
En ciertas realizaciones, la divulgación se refiere a ácidos nucleicos que codifican una proteína FVIII recombinante o quimérica divulgada en el presente documento.
En ciertas realizaciones, la divulgación se refiere a vectores que comprenden una secuencia de ácido nucleico promotora en combinación operable con una secuencia de ácido nucleico heterólogo que codifica una proteína FVIII 35
recombinante o quimérica divulgada en el presente documento. En ciertas realizaciones, el vector comprende un promotor específico del hígado y repeticiones terminales invertidas (ITR) del AVV 5' y 3'.
En ciertas realizaciones, la divulgación contempla la terapia génica lentivírica dirigida a células madre hematopoyéticas. En ciertas realizaciones, el vector es un vector retrovírico o lentivírico tal como un vector lentivírico 40
autoinactivante derivado de VIH-1. En ciertas realizaciones, el vector contiene un promotor constitutivo interno tal como EF1-alfa, PGK o UbC o un promotor específico de célula tal como GPIb-alfa, CD68 o RCL de la beta globina.
En ciertas realizaciones, la divulgación contempla composiciones farmacéuticas que comprenden una proteína FVIII recombinante o quimérica y un excipiente farmacéuticamente aceptable.
45
En ciertas realizaciones, la divulgación contempla métodos de inducción de la coagulación de la sangre que comprenden administrar una cantidad eficaz de una composición farmacéutica divulgada en el presente documento a un sujeto que lo necesite. En ciertas realizaciones, el sujeto está en riesgo de, se sospecha que, presenta síntomas de, o se le diagnostica un trastorno de la coagulación de la sangre, p. ej., en donde el sujeto es diagnosticado con 50
hemofilia A o hemofilia adquirida.
En ciertas realizaciones, la divulgación contempla una composición farmacéutica que comprende un vector de codificación de una proteína divulgada en el presente documento.
55
En ciertas realizaciones, la divulgación contempla un método de inducción de la coagulación de la sangre que comprende administrar una cantidad eficaz de una composición farmacéutica que comprende un vector que codifica una proteína divulgada en el presente documento a un sujeto que lo necesite, en donde el sujeto es diagnosticado con hemofilia A o hemofilia adquirida en condiciones tales que la proteína se expresa induciendo la coagulación de la sangre. En ciertas realizaciones, es poco probable que el sujeto responda a infusiones exógenas de FVIII.
60
En ciertas realizaciones, la divulgación se refiere a sistemas de expresión que comprenden ácidos nucleicos o vectores que comprenden ácidos nucleicos divulgados en el presente documento.
En ciertas realizaciones, la divulgación se refiere a métodos de inducción de la coagulación de la sangre que 65
comprenden administrar una cantidad eficaz de células alogénicas o autólogas transducidas ex vivo con un vector
4 para expresar un FVIII divulgado en el presente documento.
Breve descripción de las figuras
La Figura 1 muestra un árbol filogenético que se construyó para genes de FVIII de mamíferos usando secuencias 5
de aminoácidos conocidas. Los nodos intermedios ancestrales que fueron reconstruidos a través de la síntesis de genes están numerados dentro de los círculos. Estos genes con eliminación del dominio B se han optimizado por codones para la expresión de células humanas y se han subclonado en el plásmido de expresión de mamíferos ReNeo.
La Figura 2 muestra datos de la actividad de FVIII relativa donde las células HEK293T-17 se transfectaron de 10
manera transitoria con el plásmido de FVIII a través de PEI. Veinticuatro horas después de reemplazar el medio DMEM con Aim-V libre de suero, se analizó el sobrenadante para determinar la actividad de FVIII mediante un ensayo de coagulación de una fase y se mostró como el coeficiente de aumento medio sobre el FVIII humano a partir de dos experimentos separados. La actividad total se normalizó con respecto a los recuentos celulares tomados en el momento de la detección de FVIII y luego se normalizó con respecto a los niveles de actividad de 15
FVIII humano.
La Figura 3 muestra datos de actividad. Se generaron clones de BHK-M estables usando la selección G418 después de la transfección del plásmido de FVIII con Lipofectamine 2000. Se seleccionaron veinticuatro clones de cada tratamiento con FVIII. Se muestran los niveles de actividad de FVIII de los 4 clones de mayor producción determinados por coagulación de una fase y normalizados con respecto a los recuentos celulares. Las líneas 20
discontinuas indican el valor medio de cada tratamiento con FVIII. De las secuencias ancestrales de FVIII, la producción de los nodos 52, 53 y 68 de FVIII es significativamente diferente de la de FVIII humano. Es más, los nodos ancestrales 53 y 68 producen concentraciones significativamente más altas de FVIII en comparación con FVIII porcino.
La Figura 4 muestra la velocidad de desintegración del nodo 68 ancestral de InM de FVIlla determinada por el 25
ensayo cromogénico para Xase. Se recogió la proteína FVIII del clon principal de BHK-M productor y se purificó a partir de un medio libre suero usando cromatografía de intercambio iónico de una etapa. El FVIII se capturó con una columna SPHP HiTrap y se eluyó con una concentración creciente de NaCl. En comparación con la semivida del FVIII humano de 1,8 minutos, la proteína del nodo 68 ancestral muestra una semivida prolongada 9 veces de 16,2 minutos, n = 1. Cabe destacar que, el nodo 68 conserva el 75 % de identidad con el FVIII murino y el 71 % 30
de identidad con el FVIII porcino.
La Figura 5 muestra datos sobre la reactividad cruzada de anticuerpos monoclonales (MAb) anti-ratón humanos inhibidores contra An-53 (círculos negros) y An-68 (círculos blancos) mediante ELISA directo. Los MAb se seleccionaron por su alta potencia (≥ 1000 BU/mg) y especificidad para el dominio A2 o C2. Los grupos de epítopos dentro del dominio se enumeran entre paréntesis. La reactividad cruzada con FVIII ancestral se define como el 35
porcentaje de absorbancia en comparación con FVIII humano.
La Figura 6 muestra datos sobre la capacidad del mutante E434 en A2 para evadir la inhibición de 4A4.
La Figura 7 muestra un diagrama esquemático de un plásmido de FVIII del AAV. FVIII fue optimizado por codones humanos y se subclonó en un casete de expresión de AAV bajo el promotor HLP dirigido al hígado.
La Figura 8 muestra datos que comparan los niveles de An-53 (blanco) y ET3 (negro) de FVIII después de la 40
inyección hidrodinámica en ratones con dos dosis de ADN plasmídico de FVII de AAV. Los círculos representan 3 μg y los triángulos hacia abajo representan 0,75 μg por ratón. La actividad del FVIII se midió mediante un ensayo cromogénico de dos fases en comparación con un patrón FACT y las barras de error representan la desviación típica de 4 ratones.
La Figura 9 muestra el análisis SDS-PAGE de An-53 y An-68 después de un intercambio iónico de dos etapas.
45
CS: cadena sencilla; CP: cadena pesada; CL: cadena ligera; CLe: cadena ligera escindida; A1 y A2: dominios A de FVIII
Discusión detallada 50
Antes de que la presente divulgación se describa con más detalle, debe entenderse que la presente divulgación no se limita a las realizaciones particulares descritas, y, como tal, por supuesto, puede variar. También debe entenderse que la terminología usada en el presente documento únicamente tiene el fin de describir realizaciones particulares y no se pretende que sea limitante, dado que el alcance de la presente divulgación estará limitado únicamente por las reivindicaciones adjuntas.
55
A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende comúnmente una persona normalmente experta en la materia a la cual pertenece la presente divulgación. Aunque también pueden usarse en la puesta en práctica o el ensayo de la presente invención cualquier método y material similar o equivalente a los que se describen en la presente divulgación, a 60
continuación se describen los métodos y materiales preferidos.
La mención de cualquier publicación es para su divulgación antes de la fecha de presentación y no debe interpretarse como admisión de que la presente divulgación no tiene derecho a preceder a dicha publicación en virtud de la divulgación anterior. Además, las fechas de publicación proporcionadas pueden ser diferentes de las fechas de 65
publicación reales que pueden necesitar su confirmación independientemente.
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Tal como será evidente para los expertos en la materia tras la lectura de la presente divulgación, cada una de las realizaciones individuales descritas e ilustradas en el presente documento tiene características y componentes discretos que fácilmente pueden separarse o combinarse con las características de cualquiera de las otras realizaciones sin apartarse del alcance o espíritu de la presente divulgación. Cualquier método citado puede llevarse 5
a cabo en el orden de los eventos citados o en cualquier otro orden que sea posible lógicamente.
Las realizaciones de la presente divulgación emplearán, a menos que se indique lo contrario, técnicas de medicina, química orgánica, bioquímica, biología molecular, farmacología y similares, que están dentro de las habilidades de la técnica. Dichas técnicas se explican con todo detalle en la bibliografía.
10
Debe destacarse que, como se usa en la memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular
"un", "una", y "el/la" incluyen referentes en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario. En la presente memoria descriptiva y en las reivindicaciones que se presentan a continuación, se hará referencia a varios términos que se definirán por tener los siguientes significados a menos que sea evidente una intención contraria.
15
Antes de describir las diversas realizaciones, se proporcionan las siguientes definiciones y deben usarse a menos que se indique lo contrario.
Como se usa en el presente documento, una secuencia de "origen no natural" es aquella para la que ningún organismo 20
se produce o alguna vez se ha producido durante el curso de eventos naturales. Una proteína es de origen no natural si se sustituyen uno o más aminoácidos de manera que la secuencia completa de aminoácidos nunca se produjo debido al curso de eventos naturales.
Como se usa en el presente documento, "mutaciones ancestrales" se refieren a alteraciones en la secuenciación de 25
ácidos nucleicos que da como resultado sustituciones de aminoácidos en la proteína correspondiente cuando se compara con la secuencia de consenso humana, es decir, SEQ ID NO: 1. Se puede identificar una posición de la sustitución de aminoácidos por referencia a posiciones numéricas dentro de SEQ ID NO: 1 con o sin referencia a la proteína que tiene el péptido señal. Con respecto a las mutaciones, es común referirse al sistema de numeración anterior en donde FVIII no contiene el péptido señal ya que normalmente se escinde durante el procesamiento celular.
30
Como se usa en el presente documento, una "mutación ancestral única" se refiere a una mutación ancestral que tampoco se encuentra en la secuencia de ningún primate o mamífero conocido.
Los términos "proteína" y "polipéptido" se refieren a compuestos que comprenden aminoácidos unidos mediante enlaces peptídicos y se usan indistintamente.
35
Como se usa en el presente documento, cuando "secuencia de aminoácidos" se menciona en el presente documento, se refiere a una secuencia de aminoácidos de una molécula proteica. Se puede deducir una "secuencia de aminoácidos" a partir de la secuencia de ácido nucleico que codifica la proteína. Sin embargo, términos como
"polipéptido" o "proteína" no pretenden limitar la secuencia de aminoácidos a la secuencia de aminoácidos deducida, 40
sino que incluyen modificaciones postraduccionales de las secuencias de aminoácidos deducidas, tales como eliminaciones, adiciones y modificaciones de aminoácidos tales como glucosilaciones y adición de restos lipídicos.
La expresión "ácido nucleico" se refiere a un polímero compuesto por nucleótidos o polinucleótidos. La expresión se usa para designar una sola molécula o una colección de moléculas. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios 45
o bicatenarios o autocomplementarios, y pueden incluir regiones codificantes y regiones de varios elementos de control.
La expresión "una secuencia de ácido nucleico que codifica" un polipéptido especificado se refiere a una secuencia de ácido nucleico que comprende la región codificante de un gen o, en otras palabras, la secuencia de ácido nucleico 50
que codifica una proteína. La región codificante puede estar presente en forma de ADNc, ADN genómico o ARN.
Cuando está presente en forma de ADN, el oligonucleótido, el polinucleótido o el ácido nucleico puede ser monocatenario (es decir, cadena sentido) o bicatenario. Los elementos de control adecuados tales como potenciadores/promotores, uniones de corte y empalme, señales de poliadenilación, etc. pueden colocarse muy cerca de la región codificante del gen si es necesario para permitir el inicio adecuado de la transcripción y/o el procesamiento 55
correcto del transcrito de ARN primario. Como alternativa, la región codificante utilizada en los vectores de expresión de la presente divulgación puede contener potenciadores/promotores endógenos, uniones de corte y empalme, secuencias de intervención, señales de poliadenilación, etc., o una combinación de elementos de control tanto endógenos como exógenos.
60
El término "recombinante" cuando hace referencia a una molécula de ácido nucleico se refiere a una molécula de ácido nucleico que está comprendida por segmentos de ácido nucleico unidos entre sí mediante técnicas de biología molecular. El término "recombinante" cuando hace referencia a una proteína o a un polipéptido se refiere a una molécula proteica que se expresa usando una molécula de ácido nucleico recombinante.
65
El término "quimera", cuando se usa en referencia a un polipéptido o polinucleótido, se refiere al producto de expresión
6
de dos o más secuencias codificantes obtenidas de diferentes genes, que se han clonado en conjunto y que, después de la traducción, actúan como una única secuencia polipeptídica de manera que la secuencia polipeptídica única o entera, o la secuencia de nucleótidos, no es de origen natural. Los polipéptidos quiméricos también se denominan polipéptidos "híbridos". Las secuencias codificantes incluyen aquellas obtenidas de la misma especie de organismos o de diferentes especies de organismos.
5
La expresión "ácido nucleico heterólogo" se refiere a un ácido nucleico que no se encuentra en su entorno natural (es decir, ha sido alterado por la mano del hombre). Por ejemplo, un ácido nucleico heterólogo incluye un gen de una especie introducido en otra especie. Un ácido nucleico heterólogo también incluye un gen nativo en un organismo que ha sido alterado de alguna manera (p. ej., mutado, añadido en múltiples copias, ligado a una secuencia promotora o 10
potenciadora no nativa, etc.). Los ácidos nucleicos víricos heterólogos se distinguen de los genes víricos endógenos en que las secuencias de genes heterólogos normalmente se unen a secuencias de nucleótidos que comprenden elementos reguladores tales como promotores que no se encuentran asociados de forma natural con el gen de la proteína codificada por el gen heterólogo o con secuencias de genes víricos en el cromosoma, o están asociados con porciones del cromosoma que no se encuentra en la naturaleza (p. ej., genes expresados en loci donde el gen no se 15
expresa normalmente).
Los términos "variante" y "mutante", cuando se usan en referencia a un polipéptido, se refieren a una secuencia de aminoácidos que difiere en uno o más aminoácidos de otro polipéptido, normalmente relacionado. La variante puede tener cambios "conservativos", en donde el aminoácido sustituido tiene propiedades estructurales o químicas 20
similares. Un tipo de sustituciones de aminoácidos conservativas se refiere a la intercambiabilidad de residuos que tienen cadenas laterales similares. Por ejemplo, un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales alifáticas es glicina, alanina, valina, leucina e isoleucina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales de hidroxilo alifático es serina y treonina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen amida es asparagina y glutamina; un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales aromáticas es fenilalanina, tirosina y triptófano; un 25
grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales básicas es lisina, arginina e histidina; y un grupo de aminoácidos que tienen cadenas laterales que contienen azufre es cisteína y metionina. Son grupos de sustitución de aminoácidos conservativa preferidos: valina-leucina-isoleucina, fenilalanina-tirosina, lisina-arginina, alanina-valina y asparagina- glutamina. Más raramente, una variante puede tener cambios "no conservativos" (p. ej., reemplazo de una glicina con un triptófano). Las variaciones menores similares también pueden incluir eliminaciones o inserciones (en otras 30
palabras, adiciones) de aminoácidos o ambas. Puede encontrarse orientación para determinar qué y cuántos residuos de aminoácidos pueden sustituirse, insertarse o eliminarse sin afectar a la actividad biológica usando programas informáticos bien conocidos en la técnica, por ejemplo, el software DNAStar. Las variantes se pueden probar en ensayos funcionales. Las variantes preferidas tienen menos del 10 %, y preferentemente menos del 5 %, y aún más preferentemente menos del 2 % de cambios (ya sean sustituciones, eliminaciones, etc.).
35
En ciertas realizaciones, la expresión "porcentaje de identidad de secuencia" se calcula al comparar dos secuencias alineadas de manera óptima a lo largo de la ventana de comparación, determinando el número de posiciones en las que la base de ácido nucleico idéntica (p. ej., A, T, C, G, U, o I) ocurre en ambas secuencias para obtener el número de posiciones coincidentes, dividiendo el número de posiciones coincidentes entre el número total de posiciones en la 40
ventana de comparación (es decir, el tamaño de la ventana) y multiplicando el resultado por 100 para producir el porcentaje de identidad de secuencia.
En ciertas realizaciones, la "identidad" de secuencia se refiere al número de aminoácidos o nucleótidos que coinciden exactamente (expresado como un porcentaje) en un alineamiento de secuencia entre dos secuencias del alineamiento 45
calculado usando el número de posiciones idénticas dividido por el número mayor de la secuencia más corta o el número de posiciones equivalentes excluyendo los segmentos protuberantes en donde los espacios internos se cuentan como una posición equivalente. Por ejemplo, los polipéptidos GGGGGG y GGGGT tienen una identidad de secuencia de 4 de 5 u 80 %. Por ejemplo, los polipéptidos GGGPPP y GGGAPPP tienen una identidad de secuencia de 6 de 7 u 85 %. En ciertas realizaciones, cualquier mención de la identidad de secuencia expresada en el presente 50
documento puede sustituirse por la similitud de secuencia. El porcentaje de "similitud" se usa para cuantificar la similitud entre dos secuencias del alineamiento. Este método es idéntico para determinar la identidad, excepto que determinados aminoácidos no tienen que ser idénticos para tener una coincidencia. Los aminoácidos se clasifican como coincidencias si se encuentran entre un grupo con propiedades similares de acuerdo con los siguientes grupos de aminoácidos: aromático - F Y W; hidrófobo - A V I L; cargado positivamente: R K H; cargado negativamente - D E;
55
polar - S T N Q.
Las expresiones "vector" o "vector de expresión" se refieren a un ácido nucleico recombinante que contiene una secuencia codificante deseada y secuencias de ácido nucleico apropiadas necesarias para la expresión de la secuencia codificante ligada operativamente en un organismo huésped o sistema de expresión particular, p. ej., celular 60
o libre de células. Las secuencias de ácido nucleico necesarias para la expresión en procariotas por lo general incluyen un promotor, un operador (opcional) y un sitio de unión a ribosoma, a menudo junto con otras secuencias. Se sabe que las células eucariotas utilizan promotores, potenciadores y señales de terminación y poliadenilación.
Los "sistemas de expresión" de proteínas se refieren a sistemas in vivo e in vitro y libres de células. Los sistemas para 65
la expresión de proteínas recombinantes utilizan normalmente células que se transfectan con un vector de expresión E16744021
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de ADN que contiene la plantilla. Las células se cultivan en condiciones tales que traduzcan la proteína deseada. Las proteínas expresadas se extraen para su posterior purificación. Los sistemas de expresión de proteínas in vivo que usan células procariotas y eucariotas son bien conocidos. Asimismo, algunas proteínas se recuperan usando desnaturalizantes y procedimientos de replegamiento de proteínas. Los sistemas de expresión de proteínas in vitro y libres de células normalmente usan extractos de células enteras compatibles con la traducción o composiciones que 5
contienen componentes suficientes para la transcripción, la traducción y, opcionalmente, modificaciones postraduccionales, como la ARN polimerasa, factores proteicos reguladores, factores de transcripción, ribosomas, cofactores de ARNt, aminoácidos y nucleótidos. En presencia de un vector de expresión, estos extractos y componentes pueden sintetizar proteínas de interés. Los sistemas libres de células normalmente no contienen proteasas y permiten el etiquetado de la proteína con aminoácidos modificados. Algunos sistemas libres de células 10
incorporaron componentes codificados para la traducción en el vector de expresión. Véase, p. ej., Shimizu et al., Cell- free translation reconstituted with purified components, 2001, Nat. Biotechnol., 19, 751-755 y Asahara & Chong, Nucleic Acids Research, 2010, 38(13): e141.
En ciertas realizaciones, la divulgación se refiere a los vectores recombinantes que comprenden un ácido nucleico que 15
codifica un polipéptido divulgado en el presente documento o una proteína quimérica del mismo.
En ciertas realizaciones, el vector recombinante comprende opcionalmente un origen de replicación asociado a mamífero, humano, insectos, de virus, bacterias, plásmido bacteriano, levadura o gen tal como un gen o gen retrovírico o LTR, TAR, RRE, PE, SLIP, CRS lentivírico y segmento de nucleótido INS o gen seleccionado entre tat, rev, nef, vif, 20
vpr, vpu y vpx o genes estructurales seleccionados entre gag, pol y env.
En ciertas realizaciones, el vector recombinante comprende opcionalmente un elemento de vector génico (ácido nucleico) como una región marcadora seleccionable, operón lac, un promotor de CMV, un promotor híbrido de B-actina de pollo/potenciador de CMV (CAG), promotor tac, promotor de ARN polimerasa de T7, promotor de ARN polimerasa 25
de SP6, promotor de SV40, secuencia del sitio de entrada al ribosoma interno (IRES), elemento regulador post- regulador de marmota de acción en cis (WPRE), región de unión al armazón (SAR), repeticiones terminales invertidas (ITR), codificación de etiqueta FLAG, región de codificación de etiqueta c-myc, región de codificación de etiqueta de afinidad metálica, región de codificación de etiqueta de péptido de unión a estreptavidina, región de codificación de etiqueta poliHis, región de codificación de etiqueta HA, región de codificación de etiqueta MBP, región de codificación 30
de etiqueta GST, región de codificación de poliadenilación, una señal de poliA beta globina, una señal de poliadenilación de SV40, origen de replicación de SV40, origen de replicación de Col E1, origen de f1, origen de pBR322 u origen de pUC, sitio de reconocimiento de proteasa TEV, sitio loxP, región de codificación de recombinasa Cre o un sitio de clonación múltiple que tiene 5, 6 o 7 o más sitios de restricción dentro de un segmento continuo de menos de 50 o 60 nucleótidos o que tiene 3 o 4 o más sitios de restricción con un segmento continuo de menos de 20 35
o 30 nucleótidos.
Un "marcador seleccionable" es un ácido nucleico introducido en un vector recombinante que codifica un polipéptido que confiere un rasgo adecuado para la selección o identificación artificial (gen indicador), p. ej., beta-lactamasa confiere resistencia a antibióticos, lo que permite que un organismo exprese beta-lactamasa para sobrevivir en 40
presencia de antibiótico en un medio de cultivo. Otro ejemplo es la timidina quinasa, que hace que el huésped sea sensible a la selección de ganciclovir. Puede ser un marcador detectable que permite distinguir entre células deseadas y no deseadas en función de la presencia o ausencia de un color esperado. Por ejemplo, el gen lac-z produce una enzima beta-galactosidasa que confiere un color azul en presencia de X-gal (5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D- galactósido). Si la inserción recombinante inactiva el gen lac-z, entonces las colonias resultantes son incoloras. Puede 45
haber uno o más marcadores seleccionables, p. ej., una enzima que puede complementar la incapacidad de un organismo de expresión para sintetizar un compuesto particular requerido para su crecimiento (auxotrófico) y uno capaz de convertir un compuesto en otro que sea tóxico para el crecimiento. URA3, una orotidina-5' fosfato descarboxilasa, es necesaria para la biosíntesis de uracilo y puede complementar a los mutantes de ura3 que son auxotróficos para uracilo. URA3 también convierte el ácido 5-fluoroorótico en el compuesto tóxico 5-fluorouracilo.
50
Los marcadores seleccionables adicionales contemplados incluyen cualquier gen que imparta resistencia antibacteriana o exprese una proteína fluorescente. Los ejemplos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes genes:
ampr, camr, tetr, blasticidinr, neor, hygr, abxr, gen de neomicina fosfotransferasa tipo II (nptll), p-glucuronidasa (gus), proteína verde fluorescente (gtf), egfp, yfp, mCherry, p-galactosidasa (lacZ), lacZa, lacZAM15, cloranfenicol 55
acetiltransferasa (cat), fosfatasa alcalina (phoA), luciferasa bacteriana (luxAB), gen de resistencia a bialafos (bar), fosfomanosa isomerasa (pmi), xilosa isomerasa (xylA), arabitol deshidrogenasa (atlD), UDP-glucosa: galactosa-1- fosfato uridiltransferasa (galT), subunidad α de la antranilato sintasa insensible a la retroalimentación (OASA1D), 2- desoxiglucosa (2-DOGR), benciladenina-N-3-glucurónido, treonina desaminasa de E. coli, glutamato 1-semialdehído aminotransferasa (GSA-AT), D-amino acidoxidasa (DAAO), gen de tolerancia a la sal (rstB), proteína similar a la 60
ferredoxina (pflp), gen de trehalosa-6-P sintasa (AtTPS1), lisina racemasa (lyr), dihidrodipicolinato sintasa (dapA), triptófano sintasa beta 1 (AtTSB1), deshalogenasa (dhlA), gen manosa-6-fosfato reductasa (M6PR), higromicina fosfotransferasa (HPT) y D-serina amonialasa (dsdA).
Una "etiqueta" se refiere a un compuesto o composición detectable que se conjuga directa o indirectamente con otra 65
molécula, tal como un anticuerpo o una proteína, para facilitar la detección de esa molécula. Los ejemplos específicos,
8
no limitantes, de etiquetas incluyen etiquetas fluorescentes, enlaces enzimáticos e isótopos radiactivos. En un ejemplo, un "receptor de etiqueta" se refiere a la incorporación de un polipéptido heterólogo en el receptor. Una etiqueta incluye la incorporación de un aminoácido radiomarcado o la unión covalente a un polipéptido de restos biotinilo que pueden detectarse mediante avidina marcada (por ejemplo, estreptavidina que contiene un marcador fluorescente o actividad enzimática que puede detectarse mediante métodos ópticos o colorimétricos). Se conocen en la técnica y pueden 5
usarse diversos métodos de etiquetado de polipéptidos y glucoproteínas. Los ejemplos de etiquetas para polipéptidos incluyen, pero no se limitan a, los siguientes: radioisótopos o radionucleótidos (tales como 35S o 131I), etiquetas fluorescentes (tales como isotiocianato de fluoresceína (FITC), rodamina, fósforos de lantánidos), etiquetas enzimáticas (tales como la peroxidasa de rábano picante, beta-galactosidasa, luciferasa, fosfatasa alcalina), marcadores quimioluminiscentes, grupos biotinilo, epítopos de polipéptidos predeterminados reconocidos por un 10
indicador secundario (tales como secuencias de pares de cremalleras de leucina, sitios de unión para anticuerpos secundarios, dominios de unión a metales, etiquetas de epítopo) o agentes magnéticos, tales como quelatos de gadolinio. En algunas realizaciones, las etiquetas se unen mediante brazos espaciadores de diversas longitudes para reducir el posible impedimento estérico.
15
En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos divulgados en el presente documento pueden ser parte de cualquier elemento genético (vector) que se pueda suministrar a una célula huésped, p. ej., ADN desnudo, un plásmido, fago, transposón, cósmido, episoma, una proteína en un vehículo de suministro no vírico (p. ej., un transportador basado en lípidos), virus, etc. que transfieren las secuencias portadas sobre los mismos. En ciertas realizaciones, un vector puede ser un vector de virus adenoasociado o virus adenoasociado humano (que contiene genes o secuencias de AAV), p.
20
ej., que tiene secuencias de ácido nucleico derivadas de serotipos o combinaciones de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9. En ciertas realizaciones, las secuencias de ácido nucleico derivadas de serotipos de AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 pueden ser al menos uno o dos o más genes o fragmentos de genes de más de 1000, 500, 400, 300, 200, 100, 50 o 25 nucleótidos continuos o secuencias de nucleótidos con más de 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 99 % de identidad con el gen o fragmento. En ciertas realizaciones, 25
un vector puede ser un vector basado en lentivirus (que contiene genes o secuencias lentivíricos), p. ej., que tiene secuencias de los ácidos nucleicos derivadas de pseudotipos VSVG o GP64 o de ambos. En ciertas realizaciones, las secuencias de los ácidos nucleicos derivadas de los pseudotipos VSVG o GP64 pueden ser al menos uno o dos o más genes o fragmentos de genes de más de 1000, 500, 400, 300, 200, 100, 50 o 25 nucleótidos continuos o secuencias de nucleótidos con más de 50, 60, 70, 80, 90, 95 o 99 % de identidad con el gen o fragmento.
30
El vector seleccionado puede suministrarse por cualquier método adecuado, incluyendo inyección intravenosa, transducción ex vivo, transfección, electroporación, suministro en liposomas, técnicas de fusión de membranas, microgránulos recubiertos con ADN de alta velocidad, infección vírica y fusión de protoplastos. Se eliminan normalmente los motivos de ADN de CpG porque pueden conducir a la metilación y silenciamiento de genes. Véase 35
Bird, DNA methylation and the frequency of CpG in animal DNA, 1980, Nucleic Acids Res, 8: 1499-1504. La eliminación de CpG también ayuda al vector a evadir la detección inmunitaria, potenciando la seguridad y la eficacia del vector.
Véase J Clin Invest. 2013, 123(7):2994-3001, titulado "CpG-depleted adeno-associated virus vectors evade immune detection".
40
Factores de coagulación de la sangre
El sistema de coagulación de la sangre es una cascada proteolítica. Los factores de coagulación de la sangre están presentes en el plasma como un zimógeno, en otras palabras, en forma inactiva, que al activarse sufre una escisión proteolítica para liberar el factor activo de la molécula precursora. El objetivo final es producir trombina. La trombina 45
convierte el fibrinógeno en fibrina, que forma un coágulo.
El factor X es la primera molécula de la vía común y se activa mediante un complejo de moléculas que contienen el factor IX activado (FIXa), factor VIII, calcio y fosfolípidos que se encuentran sobre la superficie de las plaquetas. El factor VIII es activado por la trombina, y facilita la activación del factor X por FlXa. El factor VIII (FVIII), contiene 50
múltiples dominios (A1-A2-B-ap-A3-C1-C2) y circula en la sangre en forma inactiva unido al factor von Willebrand (VWF). El dominio C2 está implicado en la unión de FVIII a VWF. La trombina escinde el FVIII causando disociación con el VWF, conduciendo, finalmente a la formación de fibrina a través del factor IX (FIX). La hemofilia A congénita está asociada con mutaciones genéticas en el gen FVIII y da como resultado una coagulación alterada debido a niveles de FVIII circulantes inferiores a lo normal. La hemofilia B se asocia de manera similar con mutaciones genéticas en el 55
gen FIX.
Una opción de tratamiento para un paciente diagnosticado con hemofilia A es la administración exógena de FVIII recombinante, a veces denominada terapia de reemplazo de FVIII. En algunos pacientes, esta terapia puede conducir al desarrollo de anticuerpos que se unen a la proteína FVIII administrada. Posteriormente, los conjugados unidos FVIII- 60
anticuerpo, generalmente conocidos como inhibidores, interfieren o retrasan la capacidad de FVIII para causar la coagulación de la sangre. Los autoanticuerpos inhibitorios también se producen a veces espontáneamente en un sujeto que no está genéticamente en riesgo de tener hemofilia, denominada hemofilia adquirida. Los ensayos de anticuerpos inhibitorios se realizan generalmente antes del tratamiento exógeno con FVIII para determinar si la terapia anticoagulante será eficaz.
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Históricamente, se ha usado un "ensayo Bethesda" para cuantificar la dosificación inhibitoria de la concentración de anticuerpos de unión a factor VIII. En el ensayo, se preparan diluciones en serie de plasma de un paciente, p. ej., antes de someterse a cirugía, y cada dilución se mezcla con un volumen igual de plasma normal como fuente de FVIII.
Después de incubar durante un par de horas, se miden las actividades del factor VIII en cada una de las mezclas diluidas. Tener concentraciones de inhibidor de anticuerpos que evitan la actividad de coagulación de factor VIII 5
después de múltiples diluciones repetidas indica un mayor riesgo de sangrado incontrolado. Se cree que es poco probable que los pacientes con títulos de inhibidores después de aproximadamente diez diluciones respondan a infusiones exógenas de FVIII para detener el sangrado. Un título Bethesda se define como el valor recíproco de la dilución que da como resultado una inhibición del 50 % de la actividad de FVIII presente en el plasma humano normal.
Un título Bethesda superior a 10 se considera el umbral de respuesta a la terapia de reemplazo de FVIII.
10
En ciertas realizaciones, la divulgación se refiere a métodos de inducción de la coagulación de la sangre que comprenden administrar una cantidad eficaz de una proteína recombinante o quimérica divulgada en el presente documento o una partícula vírica o cápside que comprende un vector que comprende un ácido nucleico que codifica un factor de coagulación de la sangre como se divulga en el presente documento a un sujeto que lo necesite.
15
En ciertas realizaciones, el sujeto es diagnosticado con hemofilia A o hemofilia adquirida o es poco probable que responda a infusiones exógenas de FVIII.
En ciertas realizaciones, la proteína, cápside o vector se administra en combinación con un agente inmunosupresor, 20
p. ej., ciclosporina, tacrolimus, sirolimus, ciclofosfamida, metotrexato, azatioprina, mercaptopurina, fluorouracilo, ácido micofenólico, dactinomicina, fingolimod, anticuerpo o proteína de unión a receptores de linfocitos T, muromonab-CD3, anticuerpo o proteína de unión al receptor de IL-2, basiliximab, daclizumab, IFN-beta recombinante, anticuerpo o proteína de unión a TNF-alfa, infliximab, etanorcept, adalimumab o combinaciones de los mismos.
25
En ciertas realizaciones, las células modificadas se vuelven a administrar en combinación con irradiación, busulfán y/o globulina anti-timocitos, p. ej., cuando se usa terapia génica lentivírica dirigida a células madre hematopoyéticas.
El tratamiento de pacientes con inhibidores de FVIII también se ha logrado mediante métodos de inducción de tolerancia inmunitaria (ITI) que generalmente implican la infusión diaria de FVIII hasta que disminuyen los niveles de 30
inhibidor/anticuerpo circulante. Sin embargo, un 20-30 % de los pacientes no se vuelven tolerantes después de una terapia de inducción de tolerancia inmunitaria (ITI). La persistencia de los inhibidores de FVIII se asocia con riesgos de morbilidad y mortalidad aumentados. En ciertas realizaciones, la divulgación se refiere a métodos de inducción de tolerancia inmunitaria que comprenden administrar una cantidad eficaz de una proteína recombinante o quimérica divulgada en el presente documento o un vector o una cápside como se divulga en el presente documento a un sujeto 35
que lo necesite.
Transferencia de genes mediada por vectores
En ciertas realizaciones, la divulgación se refiere a métodos para tratar a un sujeto diagnosticado con un rasgo genético 40
que da como resultado la expresión de una proteína no funcional mutada o truncada mediante la administración de una cantidad eficaz de un vector divulgado en el presente documento. En ciertas realizaciones, el vector está configurado para expresar una proteína funcional del hígado. En ciertas realizaciones, el vector está configurado para expresar una proteína en cualquier célula, tal como células madre hematopoyéticas u otros hematocitos in vivo o mediante transducción ex vivo.
45
Como se usa en el presente documento, el promotor específico de hígado se refiere a las secuencias en la dirección 5' del sitio de inicio de la transcripción de la proteína a producir. Mcintosh et al. notifican un vector rAAV que codifica una variante del factor VIII humano usando un promotor híbrido específico del hígado (PHH). Blood. 2013, 121(17):3335-44. Brown et al. notifican el suministro de un vector vírico adenoasociado dirigido al hígado de un FVIII 50
modificado por bioingeniería. Molecular Therapy, Methods & Clinical Development (2014) 1, 14036.
En ciertas realizaciones, el vector comprende una secuencia de un ácido nucleico vírico de más de 10, 20, 30, 40, 50, 100 o 200 nucleótidos. En ciertas realizaciones, la secuencia de un ácido nucleico vírico es un segmento del virus adenoasociado humano (hAAV) de los serotipos 1, 2, 3B, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o combinaciones o variantes de los mismos, 55
que generalmente comprende una repetición terminal invertida de AAV.
El virus adenoasociado (AAV), familia de los parvovirus, es un virus icosaédrico con genomas de ADN lineal monocatenario. El ciclo de vida de AAV incluye una fase latente en la que los genomas de AAV, después de la infección, se integran específicamente en el sitio en los cromosomas del huésped y una fase infecciosa en la que, 60
después de la infección por adenovirus o por virus del herpes simple, los genomas integrados se rescatan, replican y empaquetan posteriormente en virus infecciosos. Las propiedades de no patogenicidad, el amplio intervalo de infectividad del huésped, incluyendo las células que no se dividen, y la posible integración cromosómica específica en el sitio hacen que el AAV sea una herramienta atractiva para la transferencia de genes.
65
Las secuencias de los ácidos nucleicos y promotores divulgadas en el presente documento son útiles en la producción
10
de vectores rAAV y también son útiles como vectores de suministro antisentido, vectores de terapia génica o vectores de vacuna. En ciertas realizaciones, la divulgación proporciona vectores de suministro de genes y células huésped que contienen las secuencias de los ácidos nucleicos que se divulgan en el presente documento.
En ciertas realizaciones, la divulgación se refiere a partículas de virus, p. ej., cápsides, que contienen las secuencias 5
de los ácidos nucleicos que codifican los promotores y las proteínas divulgados en el presente documento. Las partículas víricas, las cápsides y los vectores recombinantes son útiles en el suministro de un gen heterólogo u otras secuencias de los ácidos nucleicos a una célula diana. Los ácidos nucleicos se pueden utilizar fácilmente en una variedad de sistemas de vectores, cápsides y células huésped. En ciertas realizaciones, los ácidos nucleicos están en vectores contenidos dentro de una cápside que comprende proteínas de protección terminal, incluyendo las proteínas 10
de la cápside de AAV vp1, vp2, vp3 y las regiones hipervariables.
El virus adenoasociado (AAV) tiene un ciclo de vida bifásico que consta de una fase productiva y una latente. En presencia de un virus auxiliar, adenovirus (Ad) o herpesvirus (HSV), el AAV sufre una infección productiva. Al carecer de un virus auxiliar, el AAV infecta de forma latente por integración en el genoma del huésped. El AAV es capaz de 15
experimentar una integración específica de sitio en el genoma humano. La capacidad de integrarse en el sitio específicamente es una de las características atractivas para usar este virus como vector para la terapia génica humana.
Las repeticiones terminales invertidas (ITR) en los AAV son elementos cis usados para la integración dirigida. La 20
integración específica de sitio mediada por AAV tradicional usa las proteínas Rep78/68 de AAV y las ITR que contienen el sitio de unión a Rep (RBS) y AAVS1, que es una secuencia presente en el sitio de integración. Véase Linden et al.
(1996) titulado "The recombination signals for adeno-associated virus site-specific integration". Proc Natl Acad Sci USA 93(15):7966-7972.
25
Los vectores AAV generalmente contienen un casete de expresión transgénica entre las ITR que reemplaza los genes rep y cap. Las partículas del vector se producen por la cotransfección de células con un plásmido que contiene el genoma del vector y una construcción de empaquetamiento/auxiliar que expresa las proteínas rep y cap en trans.
Durante la infección, los genomas de los vectores AAV ingresan al núcleo celular y pueden persistir en múltiples estados moleculares. Un resultado común es la conversión del genoma de AAV a un episoma circular de doble cadena 30
mediante síntesis de la segunda cadena o apareamiento con la cadena complementaria.
Las ITR de AAV, y otros componentes de AAV seleccionados descritos en el presente documento, pueden seleccionarse fácilmente entre cualquier serotipo de AAV, incluyendo, sin limitación, AAV1, AAV2, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV7, AAV8, AAV9 y variantes de función de los mismos. Estas ITR u otros componentes de AAV pueden 35
aislarse fácilmente utilizando técnicas disponibles para los expertos en la materia a partir de un serotipo de AAV. Tal AAV puede aislarse u obtenerse de fuentes académicas, comerciales o públicas (p. ej., la Asociación Americana de Cultivo Tipo, Manassas, Va.). Como alternativa, las secuencias de AAV pueden obtenerse a través de medios sintéticos u otros adecuados por referencia a secuencias publicadas tales como las disponibles en la bibliografía o en bases de datos tales como, p. ej., GenBank, PubMed o similares.
40
En ciertas realizaciones, la presente divulgación proporciona ácidos nucleicos divulgados en el presente documento como proteínas codificadas o en donde los ácidos nucleicos son parte de un casete de expresión o transgén. Véase, p. ej., la publicación de solicitud de patente de EE. UU. 20150139953. En ciertas realizaciones, el casete de expresión se compone de un transgén y secuencias reguladoras, p. ej., un promotor y repeticiones terminales invertidas (ITR) 45
del AVV 5' y 3'. En una realización deseable, se utilizan las ITR del serotipo 2 u 8 del AAV. Sin embargo, se pueden seleccionar ITR de otros serotipos adecuados. Un casete de expresión se empaqueta generalmente en una proteína de la cápside y se suministra a una célula huésped seleccionada.
En ciertas realizaciones, la divulgación proporciona un método para generar un virus adenoasociado (AAV) 50
recombinante que tiene una cápside de serotipo del AAV, o una porción de la misma. Tal método implica el cultivo de una célula huésped que contiene una secuencia del ácido nucleico que codifica una proteína de la cápside del serotipo de virus adenoasociados (AAV); un gen rep funcional; un casete de expresión compuesto por repeticiones terminales invertidas (ITR) de AAV y un transgén; y suficientes funciones auxiliares para permitir el empaquetamiento del casete de expresión en la proteína de la cápside del AAV. Véase, p. ej., la publicación de solicitud de patente de EE. UU.
55
20150139953.
Los componentes para el cultivo en la célula huésped para empaquetar un casete de expresión de AAV en una cápside de AAV pueden proporcionarse a la célula huésped en trans. Como alternativa, uno cualquiera o más de los componentes (p. ej., casete de expresión, secuencias rep, secuencias cap y/o funciones auxiliares) pueden 60
proporcionarse mediante una célula huésped estable que se ha modificado por ingeniería para contener uno o más de los componentes requeridos utilizando métodos conocidos por los expertos en la materia. Lo más adecuadamente, dicha célula huésped estable contendrá el(los) componente(s) bajo el control de un promotor inducible. Sin embargo, el componente o componentes requeridos pueden estar bajo el control de un promotor constitutivo. En otra alternativa más, una célula huésped estable seleccionada puede contener componente o componentes seleccionados bajo el 65
control de un promotor constitutivo y otros componente o componentes seleccionados bajo el control de uno o más E16744021
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promotores inducibles. Por ejemplo, puede generarse una célula huésped estable que se deriva de células 293 (que contienen funciones E1 auxiliares bajo el control de un promotor constitutivo), pero que contiene las proteínas rep y/o cap bajo el control de promotores inducibles. Un experto en la materia puede generar incluso otras células huésped estables.
5
La introducción en la célula huésped del vector se puede lograr por cualquier medio conocido en la técnica o como se ha divulgado anteriormente, incluyendo transfección, infección, electroporación, suministro en liposomas, técnicas de fusión de membranas, microgránulos recubiertos con ADN de alta velocidad, infección vírica o fusión de protoplastos, entre otros. Uno o más de los genes adenovíricos pueden integrarse de manera estable en el genoma de la célula huésped, expresarse de manera estable como episomas o expresarse de manera transitoria. Todos los productos 10
génicos pueden expresarse de manera transitoria, en un episoma o integrarse de manera estable, o algunos de los productos génicos pueden expresarse de manera estable mientras que otros se expresan de manera transitoria. Es más, los promotores para cada uno de los genes adenovíricos pueden seleccionarse independientemente de un promotor constitutivo, un promotor inducible o un promotor adenovírico nativo. Los promotores pueden estar regulados por un estado fisiológico específico del organismo o la célula (es decir, por el estado de diferenciación o en células en 15
replicación o quiescentes) o por factores añadidos exógenamente, por ejemplo.
La introducción de las moléculas (como plásmidos o virus) en la célula huésped se puede lograr utilizando técnicas conocidas por el experto en la materia. En una realización preferente, se usan técnicas de transfección convencionales, p. ej., transfección o electroporación con CaPO4, y/o infección por vectores híbridos de adenovirus/AAV en líneas 20
celulares tales como la línea celular de riñón embrionario humano HEK 293 (una línea celular de riñón humano que contiene genes E1 de adenovirus funcionales que proporcionan proteínas E1 de acción en trans).
Un experto en la materia comprenderá fácilmente que las técnicas de AAV pueden adaptarse para su uso en estos y otros sistemas de vectores víricos para el suministro de genes in vitro, ex vivo o in vivo. En ciertas realizaciones, la 25
divulgación contempla el uso de ácidos nucleicos y vectores divulgados en el presente documento en una variedad de sistemas de vectores rAAV y no rAAV. Tales sistemas de vectores pueden incluir, p. ej., lentivirus, retrovirus, poxvirus, virus vaccinia y sistemas adenovíricos, entre otros.
Por ejemplo, en ciertas realizaciones, la divulgación contempla la expresión de FVIII por vectores lentivíricos mediante 30
administración in vivo o transducción ex vivo. Las células CD34+ alogénicas o autólogas pueden aislarse y mezclarse ex vivo con un vector lentivírico que tenga ácidos nucleicos que codifiquen una proteína FVIII divulgada en el presente documento en condiciones tales que el vector lentivírico se integre en los ácidos nucleicos de las células, p. ej., ADN, lo suficiente para producir o permitir la producción de la proteína FVIII codificada. Las células se infunden o se vuelven a infundir en un sujeto, en donde el sujeto recibió opcionalmente un tratamiento mieloablativo, en condiciones tales 35
que las células madre hematopoyéticas o las células o hematocitos resultantes expresan la proteína. Véase Cartier et al. Science. 2009, 326(5954):818-23. Sanber et al. notifican la construcción de líneas celulares de empaquetamiento estables para la producción de vectores lentivíricos clínicos. Sci Rep. 2015, 5:9021. Hu et al. notifican la producción de partículas de vector de virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 con replicación defectuosa usando vectores de adenovirus dependientes de auxiliares. Véase Mol Ther Methods Clin Dev. 2015, 2:15004.
40
Productos terapéuticos
Las proteínas recombinantes o quiméricas y las partículas de los virus, cápsides o vectores que codifican las proteínas que se divulgan en el presente documento pueden suministrarse, p. ej., al hígado a través de la arteria hepática, la 45
vena porta o intravenosamente para producir niveles terapéuticos de proteínas terapéuticas o de factores de coagulación en la sangre. Las proteínas recombinantes o quiméricas y la cápside o el vector se suspende preferentemente en un transportador fisiológicamente compatible, pueden administrarse a un paciente. Un experto en la materia puede seleccionar fácilmente transportadores adecuados a la vista de la indicación. Por ejemplo, un transportador adecuado incluye una solución salina, que puede formularse con una variedad de soluciones 50
tamponantes (p. ej., solución salina tamponada con fosfato). Otros transportadores a modo de ejemplo incluyen solución salina estéril, lactosa, sacarosa, fosfato cálcico, gelatina, dextrano, agar, pectina, aceite de sésamo y agua.
Opcionalmente, las composiciones de la divulgación pueden contener otros excipientes farmacéuticamente aceptables, tales como conservantes o estabilizantes químicos. Conservantes a modo de ejemplo adecuados incluyen 55
clorobutanol, sorbato de potasio, ácido sórbico, dióxido de azufre, galato de propilo, los parabenos, etil vainillina, glicerina, fenol y paraclorofenol. Estabilizantes químicos adecuados incluyen gelatina y albúmina.
Las partículas, cápsides o vectores de virus recombinantes se administran en cantidades suficientes para transfectar las células y proporcionar niveles suficientes de transferencia y expresión génica para proporcionar un beneficio 60
terapéutico sin efectos adversos indebidos, o con efectos fisiológicos médicamente aceptables, que se pueden determinar por los expertos en las materias médicas. Las vías de administración convencional y farmacéuticamente aceptables incluyen, pero no se limitan a, suministro directo a un órgano deseado (p. ej., el hígado (opcionalmente a través de la arteria hepática) o el pulmón), oral, inhalación, intranasal, intratraqueal, intraarterial, intraocular, intravenosa, intramuscular, subcutánea, intradérmica y otras vías de administración parenteral. Las vías de 65
administración pueden combinarse, si se desea.
12
Las dosificaciones de las proteínas recombinantes o quiméricas y de las partículas, cápsides o vectores víricos dependerán principalmente de factores tales como la afección a tratar, la edad, el peso y la salud del paciente y, por lo tanto, pueden variar entre los pacientes. Por ejemplo, una dosificación de un ser humano terapéuticamente eficaz de la proteína está generalmente en el intervalo de aproximadamente 0,1 ml a aproximadamente 100 ml de solución 5
que contiene concentraciones de aproximadamente 1x109 a 1x1016 genomas, vectores víricos o células modificadas por genes producidas por transducción ex vivo.
Las proteínas terapéuticas codificadas por los ácidos nucleicos (p. ej., operativamente en combinación con los promotores) notificadas en el presente documento incluyen las utilizadas para el tratamiento de la hemofilia, incluida 10
la hemofilia A (incluyendo el factor VIII y sus variantes, tal como la cadena ligera y cadena pesada del heterodímero y con el dominio B eliminado; patente de EE. UU. N.º 6.200.560 y patente de EE. UU. N.º 6.221.349). El gen del factor VIII codifica 2351 aminoácidos y la proteína tiene seis dominios, designados desde el extremo amino al carboxilo terminal como A1-A2-B-A3-C1-C2 [Wood et al, Nature, 312:330 (1984); Vehar et al., Nature 312:337 (1984); y Toole et al, Nature, 342:337 (1984)]. El factor VIII humano se procesa dentro de la célula para producir un heterodímero que 15
comprende principalmente una cadena pesada que contiene los dominios A1, A2 y B y una cadena ligera que contiene los dominios A3, C1 y C2. Tanto el polipéptido de cadena única como el heterodímero circulan en el plasma como precursores inactivos, hasta que se activan mediante la escisión por trombina entre los dominios A2 y B, que libera el dominio B y da como resultado una cadena pesada que consiste en los dominios A1 y A2. El dominio B se elimina en la forma procoagulante activada de la proteína. Adicionalmente, en la proteína nativa, dos cadenas polipeptídicas ("a"
20
y "b"), que flanquean el dominio B, están unidas a un catión de calcio divalente.
La administración de solamente la cadena defectuosa se contempla en pacientes porque la mayoría de las personas con hemofilia contienen una mutación o eliminación en una sola de las cadenas (p. ej., cadena pesada o ligera). Por tanto, en ciertas realizaciones, la divulgación se refiere a proteínas recombinantes o quiméricas de una cadena ligera 25
que contiene los dominios A3, C1 y C2 o una cadena pesada que consiste en los dominios A1 y A2. En algunas realizaciones, la proteína terapéutica o codificada por los ácidos nucleicos (p. ej., operativamente en combinación con promotores) notificadas en el presente documento comprende la cadena pesada del factor VIII que codifica la secuencia señal de 19 aminoácidos, así como la secuencia de poliadenilación de beta globina humana o la secuencia de poliadenilación de la hormona de crecimiento (hGH). En realizaciones alternativas, los dominios A1 y A2, así como 30
5 aminoácidos del extremo N-terminal del dominio B y/u 8 aminoácidos del extremo C-terminal del dominio B, así como los dominios A3, C1 y C2. Todavía en otras realizaciones, la proteína o los ácidos nucleicos que codifican el factor VIII es una cadena pesada y una cadena ligera que se proporcionan en una proteína o ácido nucleico único separado por 42 ácidos nucleicos /14 aminoácidos del dominio B. Véase la patente de EE.UU. N.º 6.200.560.
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Como se usa en el presente documento, una cantidad terapéuticamente eficaz es una cantidad de proteína o vector que produce cantidades suficientes de factor VIII para disminuir el tiempo que tarda la sangre de un sujeto en coagularse. Por lo general, los hemofílicos graves que tienen menos del 1 % de los niveles normales del factor VIII tienen un tiempo de coagulación de la sangre total de más de 60 minutos en comparación con aproximadamente 10 minutos para los no hemofílicos.
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Las proteínas recombinantes o quiméricas o vectores pueden contener una secuencia de aminoácidos o ácido nucleico que codifica fragmentos del factor VIII que en sí mismo no es biológicamente activo, sin embargo, cuando se administra al sujeto mejora o restaura el tiempo de coagulación de la sangre. Por ejemplo, la proteína del factor VIII comprende dos cadenas polipeptídicas: una cadena pesada y una cadena ligera separadas por un dominio B que se escinde 45
durante el procesamiento. La transducción conjunta de células receptoras con las cadenas pesada y ligera del factor VIII conducen a la expresión de factor VIII biológicamente activo. La administración de solamente la cadena defectuosa se contempla en pacientes porque la mayoría de los hemofílicos contienen una mutación o eliminación en una sola de las cadenas (p. ej., cadena pesada o ligera).
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Por tanto, en ciertas realizaciones, la divulgación se refiere a vectores divulgados en el presente documento que tienen ácidos nucleicos que codifican una cadena ligera que contiene los dominios A3, C1 y C2 o una cadena pesada que consiste en los dominios A1 y A2.
Factor VIII de coagulación de bioingeniería a través de la reconstrucción de proteínas ancestrales 55
El desarrollo de terapias transformadoras para la hemofilia A se ha visto obstaculizado por el tamaño, la inestabilidad, la inmunogenicidad y la ineficacia biosintética del factor VIII (FVIII) de coagulación. Mediante el estudio de ortólogos de FVIII de especies de vertebrados existentes, se descubrieron propiedades moleculares, celulares y bioquímicas únicas que pueden superar las limitaciones del FVIII humano. Este enfoque facilitó el desarrollo de FVIII porcino 60
recombinante para la hemofilia A adquirida y ha permitido el mapeo de baja resolución y la bioingeniería de determinantes de secuencia funcional en FVIII humano.
Se construyó un árbol filogenético de FVIII de mamífero con las correspondientes secuencias de nodos ancestrales (An) mediante inferencia bayesiana usando modelos basados tanto en ADN como en aminoácidos en PAML Versión 65
4.1 (Figura 1). Inicialmente, se seleccionaron 14 secuencias de An de FVIII para su reconstrucción y posterior E16744021
24-09-2020
