UNIVERSIDAD COMPLUTENSE DE MADRID
FACULTAD DE CIENCIAS FÍSICAS
Máster en Física Biomédica
TRABAJO DE FIN DE MÁSTER
Análisis Bidimensional Raman (2D-COSY) en Proteínas Modelo
Cristina Cabrero Fernández
Directores
Valentín García Baonza Álvaro Lobato Fernández
Curso académico 2017-18
MÁSTER FÍSICA BIOMÉDICA
FACULTAD DE CIENCIAS FÍSICASCURSO 2017 – 2018 TRABAJO FIN DE MÁSTER
INFORME DEL DIRECTOR
ALUMNO: CRISTINA CABRERO FERNÁNDEZ
TÍTULO DEL TFM: ANÁLISIS BIDIMENSIONAL RAMAN (2D-COSY) EN PROTEÍNAS MODELO DIRECTOR:ÁLVARO LOBATO FERNÁNDEZ, VALENTÍN GARCÍA BAONZA
Evaluación del director del trabajo (Marque X donde corresponda)
Criterio Bajo Regular Satisfactorio Muy
satisfactorio Excelente Calidad del trabajo
realizado X
Asistencia y
cumplimiento de la planificación del trabajo (plazos)
X
Capacidad de
aprendizaje autónomo X
Manejo de la
bibliografía X
Motivación, Creatividad e iniciativa
X
Responsabilidad e
implicación personal X
Conocimiento alcanzado en el campo de estudio
X
Estructura y contenido de la memoria
X
Completamente
nuevo Resultados
previos Bien
establecido El tema del TFM en el grupo de
investigación es: X
OBSERVACIONES:
Cristina Cabrero Fernández ha desarrollado en nuestro grupo un trabajo de investigación de enorme relevancia, tanto por la
novedad en su temática (la aplicación de la espectroscopía Raman de correlación bidimensional) como por la metodología
desarrollada (nuevos algoritmos de análisis espectral).
Las evaluaciones indicadas en la tabla reflejan fielmente el carácter excelente de este Trabajo de Fin de Máster.
Firma del director:
Fecha: 19/06/2018
Documento aprobado en Comisión del Máster de Física Biomédica el 1 de abril de 2016
Resumen.
En este trabajo se pretende demostrar la viabilidad de la espectroscopía Raman como técnica adecuada para el tratamiento espectral de proteínas modelo. Con el fin de aplicarse en el ámbito biomédico, se han desarrollado dos protocolos de cali- bración que permitan asegurar la transferibilidad de los espectros obtenidos, aspecto esencial en el diagnóstico clínico. Así mismo, se han combinado metodologías nu- méricas de tratamiento de la línea base (background) y correlación bidimensional (2D-COSY) para proceder con la interpretación de patrones asociados a sistemas modelo, en este caso proteínas con estructura secundaria hélice α y lámina β, que permitan la interpretación y diagnóstico de futuras patologías.
Abstract.
The aim of this work is to demonstrate the feasibility of Raman spectroscopy as an adequate technique for the spectral treatment of model proteins. Being focused on the biomedical field, two calibration protocols have been developed to ensure the transferability of the spectra obtained, an essential aspect in the clinical diagnosis.
Likewise, numerical methodologies for the treatment of baseline (background) and two-dimensional correlation (2D-COSY) have been combined to proceed with the interpretation of patterns associated with model systems, in this case proteins with secondary structure α helix and β sheet, that allow the interpretation and diagnosis of future pathologies.
Palabras clave.
Espectroscopía Raman.
Correlación bidimensional (2D-COSY).
Background
Calibración instrumental Proteínas.
Índice
1. Introducción. 1
2. Objetivos. 3
3. Fundamento teórico. 4
3.1. Espectroscopía Raman. . . 4
3.2. Correlación bidimensional (2D-COSY). . . 5
4. Parte experimental. 6 4.1. El material estudiado: Las proteínas . . . 6
4.2. El equipo utilizado. . . 7
5. Resultados y Análisis. 8 5.1. Pre-procesado espectral. . . 8
5.1.1. Estandarización de los espectros. . . 8
5.1.1.1. Calibración en el eje de frecuencias. . . 9
5.1.1.2. Calibración en el eje de intensidades. . . 10
5.2. Determinación del background. . . 12
5.3. Post-procesado espectral: Correlación Raman 2D. . . 15
6. Conclusiones. 20
7. Referencias. 21
1. Introducción.
En los últimos años, el diagnóstico preventivo de enfermedades se ha convertido en una de las principales prioridades de la sociedad, situándose el aspecto biomédico en pleno auge debido al desarrollo y mejora de técnicas para este fin.
En este sentido, las técnicas ópticas han jugado un papel fundamental gracias a la posibilidad que ofrecen para realizar análisis no invasivos. Desde la observación di- recta a través de la vista realizada por Hipócrates en el s. V a.C., la detección óptica de patologías ha ido evolucionando, obteniéndose métodos cada vez más precisos que permiten obtener diagnósticos a nivel molecular con resolución nanométrica[1],[2]. En particular, una de las técnicas ópticas que está ganando relevancia es la microscopía Raman vibracional, postulándose como una firme candidata en el ámbito biomédico.
La microscopía Raman aporta una información detallada acerca de la estructura, conformación y composición de las macromoléculas1 que constituyen las muestras fisiológicas, a partir de los modos de vibración característicos de los enlaces químicos presentes. Así pues, cada espectro Raman constituye una “huella dactilar” única y específica de cada compuesto, capaz de distinguir entre tejidos enfermos y sanos.
Variaciones tanto en las frecuencias de vibración como en la distribución de intensi- dades espectrales permiten identificar de manera inequívoca un determinado proceso patológico[3]. Por ejemplo, para el caso de las enfermedades neurodegenerativas más comunes, el Alzhéimer y el Párkinson, los síntomas de las primeras etapas suelen ser comunes, diferenciándose por la presencia del péptido que causa la alteración mor- fológica del tejido cerebral: la β-Amiloide[4] y la α-Sinucleína[5], respectivamente. La presencia de estos péptidos introduce cambios en la forma de la banda asociada a estas estructuras (Amida I y Amida III), haciendo posible la detección precoz de las enfermedades neurodegenerativas.
1Se consideran como macromoléculas biológicas los ácidos nucleicos, las proteínas, los fosfolípidos y los polisacáridos.
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Del mismo modo, la naturaleza dispersiva de la técnica permite el uso de lon- gitudes de onda en el espectro visible. Esta característica hace que la microscopía Raman alcance una resolución comparable a la obtenida por técnicas ya asenta- das en este campo, como la fluorescencia, y superior a otras técnicas de diagnóstico, como la Resonancia Magnética Nuclear (RMN) y la espectroscopía infrarroja (IR)[6].
Desde que en 1993 se comenzaron a realizar los primeros estudios Raman en tejidos vivos[7], el número de aplicaciones no ha parado de crecer. El desarrollo ins- trumental ha permitido obtener equipos cada vez más compactos con capacidad para realizar análisis clínicos in situ de manera rápida, simple y mínimamente invasiva[8], haciendo así que la microscopía Raman pase de ser una técnica de investigación a una técnica con potencial tecnológico donde ya se disponen de dispositivos de campo, pequeños y portátiles, e idóneos para llevar a cabo aplicaciones en el ámbito clínico[9].
Sin embargo, a pesar de las ventajas que aporta la microscopía Raman, su trans- ferencia al entorno hospitalario es lenta y, todavía a día de hoy, constituye un desafío.
El análisis de las funciones de respuesta instrumental y la preparación de la muestra (pre-procesado espectral), junto con la interpretación estadística de los resultados (post-procesado espectral) constituyen la etapa limitante de la aplicación de esta técnica espectroscópica en los campos reales: in vitro, ex vivo e in vivo.
El pre-procesado espectral tiene un gran impacto en la calidad de los espectros adquiridos y su problemática se ha reconocido en varios campos, como la RMN y la espectroscopía IR. Tanto las características del equipo utilizado como la muestras biológicas dan lugar a un tipo de ruido comúnmente denominado línea base o back- ground, que puede distorsionar y reducir en gran medida la precisión de una medición espectral. Si bien es cierto que actualmente los instrumentos comerciales incorporan un procedimiento de calibración, aún no está claro si la comunidad bioespectroscó- pica ha adoptado un procedimiento estándar[1], haciendo necesario el desarrollo de nuevos protocolos de transferencia y estandarización que permitan realizar análisis clínicos independientemente de los equipos y muestras utilizadas para la calibración.
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Por otro lado, el análisis de los cambios sutiles en los perfiles espectrales aso- ciados a la presencia de enfermedades y procesos biológicos patológicos ha recaído principalmente en la utilización de métodos de análisis multivariante que utilizan cri- terios locales basados en el análisis de perfiles de una banda espectral concreta. Una consideración importante de este tipo de metodologías es que están basadas en los cambios que induce el proceso biológico en una vibración concreta, pudiendo verse modificados por la actuación de otros procesos competitivos dando lugar a resultados erróneos, con serias consecuencias cuando el diagnóstico del paciente es el resultado.
De este modo, el diagnóstico correcto implica la utilización de metodologías capaces de analizar patrones espectrales en su conjunto, como la correlación bidimiensional (2D-COSY). La posibilidad de analizar cambios simultáneos en el espectro hace esta metodología idónea para el tratamiento de espectros Raman en la aplicación bio- médica. Sin embargo, pese a su utilidad, la falta de estudios sistemáticos para la interpretación de los patrones bidimensionales ha provocado que esta técnica toda- vía esté en desarrollo y no haya sido totalmente explotada en la microscopía Raman.
En este trabajo, pretendemos abordar la problemática del pre-procesado espec- tral proponiendo pautas genéricas que permitan asegurar la transferibilidad necesa- ria de los espectros para el diagnóstico clínico. Por otro lado, profundizaremos en la interpretación de los patrones espectrales obtenidos mediante la metodología de correlación bidimensional (2D-COSY) en sistemas modelos.
2. Objetivos.
A continuación, se exponen los objetivos marcados en el presente trabajo:
Propuesta de un método de calibración en intensidad y frecuencia Raman para estandarizar los espectros correspondientes a las muestras analizadas.
Desarrollo de un programa para el análisis del background que asegure la trans- feribilidad espectral así como un correcto análisis de los patrones espectrales.
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Desarrollo de un programa de correlación bidimensional 2D-COSY y posterior interpretación de los patrones asociados a los cambios conformacionales de las proteínas con estructuras modelo secundarias α-hélice y β-lámina.
3. Fundamento teórico.
3.1. Espectroscopía Raman.
La espectroscopía Raman[10]se basa en el análisis de la luz dispersada por un ma- terial como consecuencia de su excitación con una fuente de radiación láser. Cuando la luz incide sobre el sistema, la mayor parte de la radiación es dispersada a la misma energía (dispersión Rayleigh o elástica). Sin embargo, aproximadamente uno de cada 106-108 fotones es dispersado con una energía distinta al incidente, dando lugar al fenómeno de dispersión inelástica o dispersión Raman, que es precisamente la que contiene información sobre los modos de vibración moleculares. Estas frecuencias actúan como pequeños sensores microscópicos sobre los cambios estructurales y del entorno, permitiendo así la detección de los procesos bioquímicos que tienen lugar durante el desarrollo de una enfermedad[11], entre otros.
Actualmente, el diagnóstico de muchas patologías y enfermedades se basa en la detección de cambios estructurales asociados a la estructura secundaria de las pro- teínas. Esto se traduce en una modificación de la disposición y localización espacial de los enlaces peptídicos, así como en cambios en sus frecuencias de vibración, ejer- ciendo una gran influencia sobre los átomos involucrados. Las señales más comunes que se encuentran en el espectro Raman de estos enlaces se recogen en la Tabla 1 y la Figura 1.
Las bandas Amida I y Amida III muestran diferencias en su perfil y frecuencia de vibración cuando están en α-hélice y β-lámina. Los valores típicos de estas bandas para las estructuras α son de 1662-1655 y 1272-1264 cm−1, y de 1674-1672 y 1242- 1227 cm−1 para la estructura β.
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Figura 1: Asignación de las bandas del espectro Raman en una proteína[12].
Intervalo de Asignación
Frecuencia (cm−1) Modos normales Contribución
410-784
Tensión
Aminoácidos S-S, C-S
973-1010
Tensión Fenilalanina C-O, C-C Anillos aromáticos
1199-1235
Tensión Amida III C-C, C-H, C=S lámina β
1424-1498 Flexión CH2
C-H CH3
1649-1800
Tensión Amida I
C=C, C=O hélice α
Tabla 1: Frecuencias Raman más significativas de las proteínas[8].
3.2. Correlación bidimensional (2D-COSY).
La correlación bidimensional[13] se basa en el análisis de las fluctuaciones es- pectrales que se originan como consecuencia de la aplicación de una perturbación externa, como puede ser la producida por el desarrollo de una determinada enferme- dad. Como resultado del análisis se obtienen dos mapas de correlación, uno síncrono Φ que representa los cambios simultáneos y otro asíncrono Ψ con información acerca de los cambios secuenciales que ocurren durante la acción de la perturbación.
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A partir del primero, caracterizado por su simetría con respecto a la diagonal, es posible observar la evolución inducida por los procesos biológicos en el comporta- miento de las vibraciones involucradas en los espectros analizados, de gran utilidad en el diagnóstico clínico.
Gracias a sus ventajas, como la simplificación de la representación de espectros y la mejora de la resolución espectral, la correlación bidimensional se ha converti- do en una técnica versátil, apta para cualquier tipo de espectroscopía. De hecho, el gran avance experimentado en el campo de la resonancia magnética nuclear im- pulsó su desarrollo en otros, como las espectroscopías ópticas y, en particular, la espectroscopía Raman. Sin embargo, aunque esta técnica es idónea para realizar comparaciones simultáneas entre tejidos de pacientes enfermos y sanos, no ha sido plenamente desarrollada hasta la fecha en este campo, debido a la falta de sistema- tización en los estudios realizados hasta el momento.
4. Parte experimental.
4.1. El material estudiado: Las proteínas
Las proteínas estudiadas en este trabajo han sido, considerando su estructura secundaria[12]:
Constituidas principalmente por hélices α: Albúmina de suero bovino ≥ 96 % en forma de polvo liofilizado (Bovine serum albumin, BSA, Laboratorios Sigma-Aldrich). Se trata de la proteína más abundante en el plasma sanguíneo.
Constituidas principalmente por láminas β: Pepsina de mucosa gástrica de cerdo > 250 unidades/mg sólido (Porcine gastric mucin pepsine, PGMP, La- boratorios Sigma-Aldrich). Se trata de una enzima que hidroliza los enlaces peptídicos para dar lugar a oligopéptidos de menor tamaño.
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4.2. El equipo utilizado.
A la hora de realizar estudios espectroscópicos en el ámbito biomédico, la elección del equipo adecuado para el entorno de trabajo es un factor fundamental. Desde el punto de vista instrumental, la longitud de onda de excitación es esencial en la rela- ción señal/ruido de los espectros Raman, ya que la intensidad de la luz dispersada es inversamente proporcional a la cuarta potencia de la misma. Sin embargo, desde un punto de vista biomédico, los láseres en la región visible asociada al azul-verde provocan una mayor señal de fluorescencia debido a la emisión de las muestras en esta región al ser excitadas en este rango de frecuencias. De este modo, los láseres rojos (633 y 785 nm) son las fuentes óptimas para la excitación Raman, con una señal asociada al background moderada al evitar la fluorescencia de las muestras[3].
En la Figura 2 se muestra el espectrómetro i-Raman Plus (BWTek) utilizado en este trabajo. Al tratarse de un aparato portátil y ligero, resulta idóneo para el ámbito clínico, proporcionando soluciones tanto cualitativas como cuantitativas de alta precisión. Este espectrómetro Raman portátil de fibra óptica cuenta con un sistema de excitación láser de 785 nm y 200 mW de potencia nominal, presentando un rango espectral de 150 a 3250 cm−1 con una resolución de 4-5 cm−1. El sistema de detección es una CCD refrigerada termoeléctricamente de 2048 x 156 píxeles.
La excitación y recolección de la radiación dispersada se realiza con una sonda basada en un sistema de fibra óptica de 1.5 m acoplada a un accesorio (BAC100) que garantiza una distancia adecuada para un enfoque óptimo de la muestra, con un tamaño 85 µm2. El espectrómetro está acoplado a un microscopio confocal con objetivos intercambiables 10x, 20x y 50x de larga distancia y pletina xyz móvil.
Figura 2: Espectrómetro i-Raman Plus (BWTek), con un láser de 785 nm[14].
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5. Resultados y Análisis.
Como ya se ha mencionado, la finalidad de este trabajo consiste en conseguir una transferibilidad de espectros que permita establecer comparaciones con independen- cia del equipo utilizado, buscando la aplicabilidad en el diagnóstico de patologías en el ámbito biomédico. Para ello, en primer lugar, se expondrán los protocolos de calibración necesarios para estandarizar los espectros medidos, sobre el eje de fre- cuencias y el de intensidad. Acto seguido, se describirá el programa de background desarrollado y se analizará la autoconsistencia del mismo con el fin de corroborar su transferibilidad. Por último, se abordará un caso práctico de correlación bidi- mensional entre dos proteínas que difieren en su estructura secundaria: la BSA, principalmente constituida por hélice α, y la PGMP, donde predomina la lámina β.
5.1. Pre-procesado espectral.
5.1.1. Estandarización de los espectros.
La calibración de un equipo es un factor crucial a la hora de realizar diagnósticos clínicos, dado que permite establecer relaciones de comparación y reproducibilidad de las medidas, así como determinar la presencia de patologías. En particular, los espec- trómetros Raman difieren entre sí en la sensibilidad de sus detectores y las pérdidas ópticas asociadas a la excitación, siendo necesario obtener espectros independientes de los equipos utilizados. De este modo, la corrección en frecuencias e intensidades resulta fundamental, dado que incluso una variación sutil de la posición y la altura de la banda podría modificar el perfil asociado, dando lugar a una interpretación errónea que, en el ámbito sanitario, se traduciría en un mal diagnóstico. Aunque en numerosos estudios se utiliza un estándar interno[15], los cambios en la configuración del sistema de medida anulan esta corrección, siendo válido únicamente para aquellos espectros obtenidos con el equipo para el que se determinó. Por este motivo, y dado que la finalidad de la calibración es obtener espectros comparables entre sí, aquí se proponen dos protocolos de calibración utilizando distintas sustancias, dependiendo de si la corrección se aplica al eje de frecuencias o de intensidades.
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5.1.1.1 Calibración en el eje de frecuencias.
Como se ha expuesto anteriormente, la frecuencia Raman se asocia a enlaces concretos que tienen lugar en la muestra analizada y pueden ser indicativos de la presencia de una determinada patología. Por este motivo, su correcta determinación resulta fundamental, siendo necesario realizar una calibración con el fin de captar las variaciones sufridas y evitar así los posibles errores sistemáticos en la determinación de las frecuencias de vibración. Los sistemas de detección CCD se corresponden con una matriz bidimensional de píxeles, donde las filas se corresponden con los píxeles sobre los que se produce la acumulación de la señal y las columnas hacen referencia al intervalo de longitudes de onda detectadas. Este sistema de detección implica la transformación de “número de píxel” (columna) en longitud de onda o frecuencia Raman. En general, los equipos comerciales de espectroscopía Raman incorporan un calibrado interno que permite dicha transformación. Sin embargo, las horas de uso y/o cambios en las configuraciones de medida, pueden hacer que dichos cali- brados internos no sean válidos y se produzcan diferencias de varios cm−1. Por ello, es aconsejable que para cada conjunto de medidas se realice al menos un calibrado píxel-frecuencia Raman que nos permita maximizar la resolución del equipo.
En este caso, la sustancia calibrante elegida fue el neón, al ser una fuente de emisión estable caracterizada por un espectro de con bandas estrechas y tabuladas.
(a) Espectro de emisión del neón. (b) Relación píxel-frecuencia.
Figura 3: Calibración del eje de frecuencias haciendo uso de una lámpara de neón.
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El protocolo de calibración consiste en la adquisición del espectro de emisión del neón (véase la Figura 3). Una vez registrado, se determina la posición del píxel al que aparece cada banda de emisión y se representa frente a la frecuencia Raman, calculada como la diferencia entre la frecuencia de emisión tabulada del neón y la del láser de excitación. La representación de los valores bibliográficos de estos desplazamientos relativos de las bandas de emisión (en cm−1) frente al valor medido (en píxeles) se ajustan a un polinomio de segundo grado, obteniendo una desviación estándar del ajuste de 3 cm−1. De este modo, transformamos el eje de abscisas de nuestros espectros a unidades de frecuencia (o desplazamiento) Raman en cm−1, asegurando así la transferibilidad espectral.
5.1.1.2 Calibración en el eje de intensidades.
La distribución de intensidades en un espectro Raman contiene información tan- to de la composición como de las variaciones estructurales producidas, fruto de un proceso bioquímico. Así pues, estos patrones de intensidad constituyen, junto con las frecuencias de vibración, las huellas dactilares que permiten discriminar el estado de un paciente. Es por ello que un diagnóstico correcto implica la utilización de patro- nes que no dependan de factores externos, como las características instrumentales del equipo utilizado. En general, los sistemas de detección CCD cuentan con una eficiencia cuántica directamente relacionada con la sensibilidad del dispositivo, que se ve afectada por diversos factores entre los que se encuentran la longitud de onda con la que se han realizado las medidas y la propia configuración instrumental del equipo utilizado. Dicha respuesta instrumental puede inducir cambios significativos en los análisis de intensidad, siendo necesario corregirla para obtener patrones de intensidad capaces de asegurar diagnósticos inequívocos.
Toda corrección de intensidad implica el uso de patrones que produzcan una se- ñal lo suficientemente lineal en el rango de longitudes de onda estudiadas, con el fin de obtener la contribución del equipo. Por ello, aquí proponemos el borato de zinc amorfo, Zn3(BO3)2, como calibrante[16]. Esta sustancia, común y barata, se caracteri- za por una respuesta instrumental de alta intensidad constante en aproximadamente todo el intervalo visible, siendo idónea para la corrección de los espectros Raman.
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El protocolo de estandarización consiste en la medida de la luminiscencia (en unidades de desplazamiento Raman) del borato de zinc con la mejor relación se- ñal/ruido posible. Para este trabajo, las condiciones de medida consistieron en rea- lizar 20 acumulaciones con un tiempo de adquisición de 18 segundos, utilizando un objetivo de 50x en el microscopio y el 100 % de la potencia del láser (Figura 4a). Una vez determinada la respuesta instrumental, la corrección de los espectros se realiza dividiendo la intensidad píxel a píxel del espectro de la muestra a corregir entre la correspondiente al borato de zinc amorfo normalizado.
(a) Respuesta instrumental.
(b) BSA sin corregir. (c) BSA corregida.
Figura 4: Calibración de la intensidad mediante el Borato de Zinc.
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En la Figura 4 se muestra el efecto de la corrección de intensidad para la proteína BSA. Como se observa, el espectro corregido se presenta una distribución de inten- sidad más constante, independiente del instrumento. Concretamente, en la región espectral de 3000 cm−1 asociada a las tensiones C-H, aumenta considerablemente su intensidad. Sin embargo, dado que la sensibilidad del equipo es muy pequeña en esta región, la corrección instrumental provoca una relación señal/ruido muy baja.
En el caso de la región espectral comprendida entre los 300-1600 cm−1, correspon- diente a las bandas Amida I y III, y por tanto de especial relevancia en el ámbito biomédico, se observa cómo la corrección del borato modifica la distribución de in- tensidades correspondientes a estas bandas. Este cambio manifiesta los errores que se pueden producir en los análisis multivariantes de estas bandas de vibración al no considerar este factor.
5.2. Determinación del background.
Otro de los problemas asociados al análisis de espectros Raman es la determina- ción del background, que constituye una contribución de intensidad generalmente no lineal con la longitud de onda, y que altera el patrón de intensidad espectral, lo que puede concurrir en diagnósticos erróneos en el ámbito clínico. Entre las fuentes que introducen incertidumbres está la dispersión debida a procesos que compiten con la dispersión Raman, como la fluorescencia presente en algunas biomoléculas que en- mascara la débil señal biológica Raman asociada al rango de frecuencias estudiada, y la presencia de inhomogeneidades tanto espaciales como composicionales de las muestras o las propias sustancias presentes, como las utilizadas en la preparación de las disoluciones reguladoras de pH.
Dada la diversa naturaleza de las contribuciones, la corrección exacta del back- ground es una tarea muy compleja, y a menudo arbitraria, en la que los métodos estadísticos pueden inducir errores al prefijar determinados modelos que no tengan los criterios espectroscópicos que impidan la distorsión de la señal espectral. Así pues, la corrección del background se ha convertido, en muchos casos, en una tarea artesanal que depende en gran medida de los conocimientos del usuario que la realice.
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Sin embargo, un análisis de este fondo espectral con fines biomédicos no requiere necesariamente la eliminación de todas y cada una de las contribuciones del mismo, sino la capacidad de producir resultados que introduzcan las mínimas modificaciones espectrales, asegurando la relación señal/ruido y generando resultados autoconsis- tentes que, aunque introduzcan errores sistemáticos, no den lugar a diagnósticos equívocos al no distorsionar las bandas vibracionales.
Con este fin, hemos diseñado un software de análisis y corrección de background automático basado en criterios espectroscópicos, entre los que se encuentran la posi- ción y la anchura de las bandas. Dado que el background espectral no es una función fija, el algoritmo se basa en un análisis del ruido previo con la finalidad de separar el propio ruido de la señal propiamente dicha, asegurando así que las correcciones no produzcan una modificación de las mismas. Para ello, el algoritmo define el ruido espectral como la diferencia entre puntos consecutivos y establece un umbral (deno- minado noise threshold ) que permite determinar qué píxeles se consideran ruido y cuáles señal.
En la Figura 5 representamos un ejemplo del ruido definido para un espectro de pentanol junto con un análisis de la distribución del mismo.
Figura 5: Determinación del background mediante una corrección de primer orden.
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El ruido definido presenta así una distribución gaussiana, que permite el filtrado de la señal. Una vez determinado el ruido y la señal, se calcula la segunda deriva- da correspondiente al espectro filtrado para mejorar su resolución. Este análisis por derivadas tiene dos misiones fundamentales: por un lado, determinar el número de contribuciones, la posición y anchura de las mismas, y por otro, establecer como background todo aquello que da lugar a una segunda derivada de pendiente constan- te o nula, y cuyos píxeles pertenecen al ruido en un intervalo de frecuencias superior a la resolución del equipo. Posteriormente, la substracción del background se realiza mediante una aproximación lineal, asegurando que dicha aproximación no modifica las posiciones y/o anchuras de las bandas.
Como se ha mencionado, la validez de este método ha de corroborarse asegurando su autoconsistencia. Para ello, hemos aplicado el algoritmo a 450 espectros de la BSA medidos con diferentes relaciones señal/ruido en muestras distintas. En la Figura 6 se muestra el histograma de puntos de background obtenidos junto con un espectro, representado en píxel, en los que se han indicado los puntos definidos como background en rojo, observándose la perfecta correlación entre dichos puntos y las posiciones más probables del histograma.
Figura 6: Resultado final tras aplicar la corrección del background.
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5.3. Post-procesado espectral: Correlación Raman 2D.
El diagnóstico Raman de un proceso patológico involucra el análisis de los pa- trones espectrales que se originan como consecuencia de los cambios bioquímicos inducidos durante el mismo. Estos cambios, ya sean estructurales o composiciona- les, producen una modificación sutil en los perfiles y frecuencias de banda de los espectros, que a menudo son difíciles de detectar y hacen necesaria la utilización de métodos estadísticos que permitan su identificación.
En el ámbito biomédico, la correlación bidimensional permite comparar patrones espectroscópicos de muestras distintas, facilitando el análisis de resultados y abrien- do un gran abanico de posibilidades para futuras aplicaciones en este campo. De hecho, su utilidad queda patente en la aplicación directa que lleva asociada, per- mitiendo, por ejemplo, la comparación entre tejidos pertenecientes a pacientes con enfermedades neurodegenerativas y sanos[17], y tratándose de una técnica rápida que permite relacionar la variación de unos parámetros con respecto a otros.
Sin embargo, a pesar a de la utilidad que ofrece la correlación bidimensional, la interpretación de estos diagramas de correlación no ha sido plenamente desarrollada en el campo de la espectroscopía Raman, haciendo necesaria la sistematización y estudio de sistemas modelo que permitan su implementación. Es por ello que en este trabajo hemos realizado una comparación entre dos proteínas modelo, la BSA y la PGMP, con una estructura secundaria principalmente constituida por hélices α y láminas β, respectivamente. En la Figura 7, se muestran los espectros Raman asociados a estas dos proteínas, tras haber realizado las correcciones mostradas en las secciones previas. En este caso, la única diferencia a la hora de llevar a cabo las medidas reside en el tiempo de adquisición (60 y 25 segundos para la BSA y la PGMP, respectivamente), realizándose 20 acumulaciones con un objetivo del microscopio correspondiente a 50x y el 100 % de la potencia del láser (200 mW).
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(a) BSA (b) PGMP
Figura 7: Espectros Raman corregidos para las proteínas objeto de este trabajo.
Como puede observarse en la Figura 7, ambos espectros muestran claras dife- rencias, con respecto a la posición de las bandas y su intensidad. Las regiones que experimentan un mayor cambio se localizan en los intervalos 1200-1400 cm−1 y 1600- 1800 cm−1, correspondiéndose con la Amida III y Amida I, respectivamente, y cuya frecuencia y perfil espectral están asociados a la estructura α y β de estas proteí- nas. Otra de las regiones que presentan una gran variación es la del entorno de los 1000 cm−1. Esta banda de vibración esta asociada al péptido fenilalanina, y aunque este residuo no esta directamente involucrado en la formación de ninguna de las es- tructuras secundarias, muestra una mayor intensidad en el caso de la proteína BSA como consecuencia de la disposición tridimensional de los demás residuos peptídicos.
La correlación 2D-COSY es de gran utilidad en este campo, dado que permite observar la evolución asociada a los espectros obtenidos en función de su estructura secundaria y por tanto aporta información no solo de diagnóstico, sino del grado de desarrollo de un determinado proceso bioquímico. Con este fin, se ha desarrollado un código Matlab introduciendo varios espectros a los que se ha ido incrementando el porcentaje de estructura secundaria correspondiente a la lámina β.
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En la Figura 8 se muestra el mapa síncrono resultante de la variación en la estructura secundaria, caracterizada por ser simétrica con respecto a la diagonal. El espectro horizontal superior es el asociado a la proteína constituida únicamente por hélices α (BSA), mientras que el vertical es el de la proteína compuesta por láminas β (PGMP). En vista de los resultados, se observa una mayor variabilidad espectral en el entorno de correlación de las amidas consigo mismas (1200-1800 cm−1) y en los de la fenilalanina con las amidas (1000,1200-1800 cm−1).
Figura 8: Correlación bidimensional (2D-COSY) entre la BSA y la PGMP.
En la Figura 9 se muestra la región 1200-1600 cm−1, asociada a las bandas Amida III y I. Debido a la gran variación mostrada, se deduce que en este intervalo la estructura secundaria juega un papel fundamental. Al comparar la Amida I asociada a la BSA con la correspondiente a la PGMP, se observa un patrón de correlación siempre positivo con dos direcciones de variabilidad simétricas situadas a 45◦ de la diagonal principal. Estos ejes de variabilidad indican que el incremento de porcentaje de estructura β lleva asociado un ensanchamiento, disminución de la intensidad y cambio en la frecuencia Raman de estos modos de vibración.
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Análogamente, el patrón bidimensional entre las bandas de vibración Amida III muestra la presencia de dos máximos de correlación. La variabilidad de los mismos es máxima a lo largo de la diagonal y refleja la disminución de anchura que experimen- tan estos modos de vibración a medida que aumenta la proporción de lámina β. Así mismo, las correlaciones cruzadas entre las bandas Amida I y Amida III muestran máximos de correlación positivos, que se extienden a lo largo de una de las variables espectrales al mantener constante la otra. Esta variabilidad positiva a lo largo de una variable espectral indica que el aumento de lámina β provoca un ensanchamiento simultaneo de ambas bandas pero de forma asimétrica siendo más pronunciado en la banda Amida I que en la banda Amida III. Cabe destacar que, en comparación con los mapas mostrados en bibliografía[13], los patrones aquí mostrados presentan unas formas distintas, dado que tratan cambios muy sutiles asociados a la variabilidad del espectro y, por tanto, constituyen un marco de referencia para abordar sistemas más complejos.
Figura 9: Correlación bidimensional (2D-COSY) en la región 1200-1600 cm−1.
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Figura 10: Correlación bidimensional (2D-COSY) en la región 800-1200 cm−1.
Por otro lado, la Figura 10 muestra el diagrama de correlación correspondiente a la región espectral comprendida entre 850 y 1150 cm−1. Esta región, asociada a la señal de la fenilalanina, muestra un patrón de correlación muy intenso que se extiende de forma equivalente a lo largo de las dos variables espectrales. Dicha variación espectral es indicativa de un aumento de la anchura y disminución simultánea de la intensidad de esta banda, como consecuencia del incremento de estructura β. Del mismo modo, la correlación positiva existente entre de la banda de la fenilalanina y las bandas Amida I y Amida III indican que los cambios asociados a este residuo peptídico ocurren de manera simultánea al cambio conformacional α-β, y por tanto, la variación del mismo está asociada al cambio en la estructura tridimensional de la proteína. Este resultado está en concoordancia con los mostrados por los algoritmos genéticos y las redes neuronales[8], en los que determinan esta banda como uno de los patrones espectrales característicos para la formación de estructuras amiloides.
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6. Conclusiones.
La espectroscopía Raman es una técnica que se está implementando cada día más en el ámbito hospitalario, gracias a las ventajas que aporta en el diagnóstico de enfermedades, principalmente. En particular, el hecho de poder obtener espectros con dispositivos portátiles la convierte en una técnica no invasiva y cómoda para poder realizar análisis in vivo e in situ. A pesar de la casuística presente, sobretodo debido a la dependencia de los espectros con los dispositivos utilizados, en este trabajo se han propuesto diversos protocolos para minimizar estos problemas, así como la presentación de casos prácticos con aplicación directa en el área clínica.
Para lograr la normalización de los espectros, que permita comparar unos con otros independientemente del instrumento utilizado para realizar las medidas, se han planteado dos protocolos de calibración, uno para el eje de frecuencias y el otro para el de intensidades. Este factor resulta muy relevante, dado que una variación sutil podría traducirse en una asignación de bandas incorrectas.Así mismo, la obtención de un buen espectro se corresponde con la relación señal/ruido existente en el espec- tro. Por este motivo, se ha desarrollado un programa con el lenguaje Python para determinar los puntos de background que distorsionan el espectro, a partir de la diferencia entre puntos consecutivos y el cálculo de la segunda derivada, de manera que se puedan ubicar las posiciones correspondientes a las bandas. De este modo, el programa también realiza un histograma para mostrar aquellos píxeles asociados a una mayor frecuencia de aparición de background, siendo útil en la realización de test clínicos para determinar la presencia de enfermedades neurodegenerativas.
Por último, y como aplicación directa de esta técnica en el ámbito médico, se utiliza la correlación bidimensional 2D-COSY para comparar los patrones asociados a la introducción de una perturbación en el sistema. En este caso se estudió la varia- ción de la componente lámina β en una proteína, de manera que se pudiera ver cómo cambiaba el espectro asociado, pudiendo relacionarse las regiones asociadas a esta estructura secundaria. Así mismo, este procedimiento podría extrapolarse al diag- nóstico clínico, mediante la comparación de muestras correspondientes a pacientes sanos y con enfermedades neurodegenerativas.
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