Análisis molecular de la diversidad de Pseudomonas a lo largo del río Danubio

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(1)Título:. Análisis molecular de la diversidad de Pseudomonas a lo largo del río Danubio.. AUTOR:. Daniela Román Cáceres. Memoria del Trabajo de Fin de Máster. Máster Universitario en. Microbiología Avanzada. (Especialidad/Itinerario. Investigación). de la UNIVERSITAT DE LES ILLES BALEARS. Curso Académico. Fecha. Nombre Tutor del Trabajo. 2016-2017. 14 de septiembre de 2017. Jorge Lalucat Jo..

(2) Índice Resumen ......................................................................................................................................... 1.. Introducción....................................................................................................................... 1 1.1. Hipótesis ......................................................................................................................... 4 1.2. Objetivos ......................................................................................................................... 4. 2. Materiales y Métodos .......................................................................................................... 5 2.1. Microorganismos .......................................................................................................... 5 2.2. Selección de cepas. ..................................................................................................... 6 2.3. Secuenciación del gen rpoD...................................................................................... 6 2.3.1. Extracción de DNA bacteriano. ......................................................................... 7 2.3.2. Electroforesis en gel de agarosa. ..................................................................... 7 2.3.3. Reacción en cadena de la polimerasa PCR.................................................... 7 2.3.4. Purificación del producto de PCR .................................................................... 7 2.3.5 Secuenciación ......................................................................................................... 8 2.4. Análisis de las secuencias con las bases de datos NCBI y la propia del laboratorio. ............................................................................................................................. 8 2.5. Árboles filogenéticos .................................................................................................. 8 3. Resultados y Discusión ..................................................................................................... 9 3.1. Selección de microorganismos ................................................................................ 9 3.2. Identificación por la secuencia del gen rpoD ....................................................... 9 3.3. Análisis de las identificaciones obtenidas por los dos métodos .................. 14 4. Conclusiones ...................................................................................................................... 19 Bibliografía ............................................................................................................................... 20.

(3) Índice de Tablas y Figura. Tabla 1 Puntos de muestreo a lo largo del curso del río Danubio ................................. 1 Tabla 2 Número de aislados Pseudomonas spp. en los puntos de toma de muestras investigadas y las resistencias a antibióticos detectadas. ............................................. 3 Tabla 3 Especies y número de aislados cedidos por la Universidad de Graz para este estudio. ......................................................................................................................... 6 Tabla 4 Asignación a grupo filogenético o especie de las 100 cepas estudiadas de acuerdo a la semejanza en la secuencia del gen rpoD. El orden en la tabla se ha establecido de acuerdo a la topología del árbol filogenético correspondiente que se incluye como anexo. ................................................................................................... 10 Tabla 5 Número de cepas identificadas distribuidas en 19 especies de Pseudomonas. ................................................................................................................................... 13 Tabla 6 Cepas identificadas como nuevos taxones .................................................... 14 Tabla 7 En la tabla se indican las cepas en las que se ha visto que existe una discrepancia en la identificación por MALDI-TOF y por secuencia del gen rpoD. Se puede observar el número y afiliación de grupos que se consideraron en base al dendrograma obtenido por los perfiles proteicos de MALDI-TOF. La asignación a especie por rpoD se puede ver también en la tabla 4. ................................................ 15 Tabla 8 Cepas del grupo P. stutzeri y a las genomovares a que pertenecen .............. 18 Figura 1. Vista general de los puntos de muestreo JDS3 a lo largo del río Danubio…..2.

(4) Resumen. Se realizó el análisis molecular de la diversidad de Pseudomonas a lo largo del rio Danubio, mediante la secuenciación del gen rpoD de 100 cepas seleccionadas entre 615 aislados identificados como Pseudomonas mediante el método de MALDI-TOF facilitados por el grupo de investigación de la universidad de Graz. Los aislados fueron identificados mediante comparación con la base de datos del NCBI y con la base de datos de secuencias de rpoD de la UIB. Se compararon las identificaciones obtenidas por ambos métodos (MALDI-TOF y rpoD) para determinar la posibilidad de que existan nuevos taxones entre las bacterias aisladas. Las 100 cepas de estudio fueron cultivadas en medio LB donde se comprobó que eran cultivos puros. Se realizó la extracción de DNA, la amplificación del gen rpoD, secuenciación y análisis de las secuencias. De las 100 cepas estudiadas, únicamente 2 no se pudieron amplificar con los cebadores selectivos de rpoD diseñados para Pseudomonas por lo que se secuenció el gen RNA ribosómico 16S. La cepa JDS02PS025 se identificó como un miembro del género Arthrobacter con una similitud de 94 % con Arthrobacter koreensis. La otra cepa, JDS03PS007, se identificó como Brevundimonas terrae con una similitud de 99,2 % respecto a la cepa tipo de esta especie. Se pudieron identificar 57 cepas a nivel de especie por presentar más del 95% de similitud en la secuencia del gen rpoD. Se distribuyeron en 19 especies diferentes, siendo las más abundantes P. moraviensis y P. soli (8 cepas cada una de ellas). Por abundancia, la siguiente especie detectada fue P. stutzeri, con 6 cepas pertenecientes a la genomovar 1 y otra adicional a la genomovar 3. Las 41 cepas de Pseudomonas restantes no pudieron asignarse a ninguna especie descrita por tener menos del 95% de similitud en la secuencia del gen rpoD por lo que fueron consideradas como representantes de 17 nuevos taxones, dentro de los aislados del río Danubio. Al observar los resultados y comparar ambos métodos MALDI-TOF y rpoD se puede determinar la existencia de una buena correspondencia entre los agrupamientos de los perfiles proteicos y los grupos o subgrupos filogenéticos establecidos previamente en el género. No obstante, la identificación a nivel de especie por MALDI-TOF no es suficiente, porque la base de datos no incluye muchas especies de origen ambiental. Además, algunas especies de un mismo grupo o subgrupo filogenético no se pueden discriminar por MALDI-TOF..

(5) 1. Introducción Las bacterias del género Pseudomonas son comunes en hábitats naturales, son especies metabólicamente versátiles y desde un punto de vista nutricional son consideradas altamente heterogéneas. Las especies del género tienen una importancia relevante en los ciclos biogeoquímicos del carbono y del nitrógeno (García-Valdés & Lalucat, 2016). Algunas especies son consideradas patógenos importantes de animales y plantas; así también existen miembros que son conocidos por su papel beneficioso para las plantas, incluso se utilizan para la biorremediación y como agentes de control biológico, por lo que el estudio de la ecología de Pseudomonas en la biosfera es de gran interés (Yamamoto, 2000). En 2016, Kittinger y colaboradores realizaron un estudio centrado en el aislamiento, identificación y determinación de las resistencias a antibióticos de cepas ambientales del género Pseudomonas a partir de muestras tomadas a lo largo del curso del río Danubio (Kittinger et al., 20016). Éste es el segundo rio más largo de Europa, con una longitud de unos 2.800 km. Desde su nacimiento en las montañas de la Selva Negra de Alemania hasta el Mar Negro fluye a través de nueve países (Alemania, Austria, Eslovaquia, Hungría, Croacia, Serbia, Bulgaria, Ucrania y Rumanía) y drena una cuenca de aproximadamente 817,000 km2.. Tabla 1 Puntos de muestreo a lo largo del curso del río Danubio. Fuente: (Kittinger, 2016). Las muestras de agua de la expedición “Joint Danube Survey 3” (JDS3), (JDS3, 2015) proporcionaron una oportunidad excelente para evaluar la resistencia a antibióticos de 1.

(6) las bacterias a lo largo de un sistema fluvial conjunto. Las cepas se aislaron en medios selectivos y se determinaron sus resistencias a los antibióticos. Las bacterias primero fueron aisladas en diferentes agares selectivos: agar Endo, agar xilosa-lisinadesoxicolato (XLD) y agar Chromocult para coliformes, en condiciones de crecimiento 37°C durante 18-24h. Posteriormente se realizaron pruebas de susceptibilidad a los antibióticos para todas las especies de Pseudomonas identificadas. Se hicieron análisis de los siguientes antibióticos: Piperacilina / tazobactam (TZP), ceftazidima (CAZ), cefepima (FEP), meropenem (MEM), imipenem (IPM), amikacina (AN), gentamicina (GM), tobramicina (NN), ciprofloxacina (CIP), levofloxacina ) y sulfametoxazol / trimetoprim (SXT).. Figura 1. Vista general de los puntos de muestreo JDS3 a lo largo del río Danubio. Fuente: (Kittinger, 2016). La Identificación de las cepas a nivel de especie del género Pseudomonas se realizó por espectrometría de masas de las proteínas totales (MALDI-TOF-MS) según el protocolo descrito por (Jamal, 2014) y el análisis de los espectros se realizó con la base de datos VITEK-MS. Los picos de estos espectros se compararon con el patrón característico para la especie, género o familia del microorganismo, lo que lleva a la identificación del mismo. (Kittinger, 2016) Como resultado obtuvieron un total de 520 cepas de Pseudomonas. El menor número de aislados se obtuvo en el punto JDS68 con 32 cepas, y el más alto en el punto JDS28 2.

(7) con 117 cepas aisladas. Las especies más abundantes que se identificaron fueron Pseudomonas putida (66,0% / 344 aislados) y Pseudomonas fluorescens (27,1% / 141 aíslados). Las demás especies estuvieron representadas por menos de. cinco. aislamientos.. Tabla 2 Número de aislados Pseudomonas spp. en los puntos de toma de muestras investigadas y las resistencias a antibióticos detectadas.. Fuente: (Kittinger, 2016). Se considera que uno de los requisitos esenciales para una investigación detallada del papel que juega Pseudomonas en los ambientes naturales es disponer de un sistema preciso de identificación. Sin embargo, la identificación de las cepas de Pseudomonas por los métodos tradicionales fenotípicos no es totalmente satisfactoria y por ello, en el trabajo, recurrieron a la técnica de MALDI-TOF. En el estudio se concluyó que es una técnica conveniente para la discriminación de bacterias a nivel de especie y que es útil en la identificación bacteriana. Sin embargo, se necesita una base de datos completa con espectros de referencia para fines comparativos y las habitualmente utilizadas se basan en cepas de origen clínico y son incompletas. Yamamoto et al. (2000) propusieron el análisis de genes que codifican proteínas (gyrB y rpoD) para la discriminación de especies de Pseudomonas. Estos genes evolucionan. 3.

(8) mucho más rápidamente que los ribosómicos y por tanto proporcionan mayor resolución que el análisis de las secuencias del gen rRNA 16S (Yamamoto, 2000). Las secuencias de genes codificantes de proteínas, tales como gyrB, rpoB o el gen rpoD proporcionan una resolución superior al rRNA 16S y son conocidos por estar presentes en una sola copia en el genoma y son un buen marcador filogenético y proporcionan una identificación muy precisa a nivel de especie en la taxonomía actual del género (Mulet, Bennasar, Lalucat, & García-Valdés, 2009) El objetivo de este estudio es realizar una comparación de las identificaciones obtenidas en el estudio “Antibiotic Resistance Patterns of Pseudomonas spp. Isolated from the River Danube” mediante MALDI-TOF-MS, utilizando métodos moleculares basados en la secuenciación y análisis del gen rpoD de cepas aisladas en la campaña JDS3.. 1.1. Hipótesis Al analizar las secuencias del gen rpoD se obtendrá una identificación más precisa a nivel de especie de las cepas aisladas que la obtenida por MALDI-TOF utilizando como referencia la base de datos VITEK-MS diseñada sobre todo para bacterias de origen clínico.. 1.2. Objetivos 1) Secuenciar el gen rpoD de los aislados facilitados por el grupo de investigación de la Universidad de Graz. 2) Identificar los aislados mediante comparaciones con la base de datos del NCBI y con la base de datos de secuencias de rpoD de la UIB. 3) Comparar las identificaciones obtenidas por ambos métodos (MALDI-TOF y rpoD). 4) Determinar la posibilidad de que existan nuevos taxones entre las bacterias aisladas.. 4.

(9) 2. Materiales y Métodos 2.1. Microorganismos Las muestras fueron recolectadas durante la campaña JDS3 organizada por la Comisión Internacional para la Protección del Río Danubio (CIPD). La CIPD es un cuerpo transnacional, que ha sido establecido para aplicar el Convenio de Protección del Danubio (Kittinger, 2016). Las muestras se recogieron entre el 12 de agosto y el 26 de septiembre del año 2013, Se tomaron muestras de agua en 68 sitios de muestreo ubicados a lo largo del río Danubio (JDS3). Para cada sitio de muestreo, se tomaron muestras de agua en tres puntos de muestreo, a la izquierda, en el centro y en el lado derecho del curso del Danubio (Kittinger, 2016). Las muestras se recogieron en matraces de vidrio de 1l estériles, a 30 cm por debajo de la superficie del río, y a continuación fueron transportados al laboratorio donde se realizó el estudio. Las muestras se almacenaron a -80 ° C (Kittinger, 2016) con glicerol. Los puntos elegidos para la investigación de Kittinger se localizan directamente aguas abajo de las ciudades de Viena, Budapest, Novi Sad y Bucarest, además de otros cuatro puntos situados cerca del de partida de la expedición JDS3. En el estudio publicado se describen 520 cepas de Pseudmonas, pero en total se disponía de 615. Las 615 cepas fueron enviadas al laboratorio de microbiología de la Universidad de las Islas Baleares (UIB), donde se llevaron a cabo pruebas en medio LB para confirmar que se tenía cultivos puros y también se cultivaron en agar cetrimide como medio selectivo de Pseudomonas para comprobar el crecimiento. Las cepas se almacenaron a -80ºC en medio crioprotector. En la Tabla 3 se indica la identificación de los aislados obtenida por MALDI-TOF con la base de datos Vitek, tal como se describe en el trabajo original de Kittinger (2016).. 5.

(10) Tabla 3 Especies y número de aislados cedidos por la Universidad de Graz para este estudio.. Especie (identificación por MALDI-TOF y Número de aislados base de datos Vitek) Pseudomonas putida 406 Pseudomonas fluorescens 163 Pseudomonas oleovorans 12 Pseudomonas chlororaphis 8 Pseudomonas stutzeri 8 Pseudomonas mendocina 6 Pseudomonas chlororaphis/fluorescens 5 Pseudomonas viridiflava 3 Pseudomonas aeruginosa 2 Pseudomonas alcaligenes 1 Pseudomonas veronii 1 Total 615. 2.2. Selección de cepas. Además de las cepas, se cedieron también los perfiles proteicos de todas las cepas, lo que permitió la construcción de un dendrograma de semejanza en los perfiles de las 615 cepas. Este dendrograma permitió la agrupación de aquellas cepas con perfiles semejantes y se seleccionaron representantes de cada uno de los agrupamientos para su identificación posterior por rpoD. Inicialmente se tomó como criterio un 60% mínimo de semejanza para establecer los grupos. En total se pudieron distinguir 53 grupos tal como se indica en el anexo 1. También se tuvo en cuenta en la elección de las cepas a estudiar los puntos de muestreo del estudio de (Kittinger, 2016) para tener al menos dos representantes de cada punto a ser posible. Las 100 cepas elegidas para este trabajo se relacionan en la Tabla 4 del apartado de Resultados y Discusión.. 2.3. Secuenciación del gen rpoD Para realizar la secuenciación del gen rpoD de cada una de las 100 cepas elegidas se siguió los pasos que se describen con detalle en el anexo 2 y sigue la metodología descrita por Mulet et al. (2009). Las diferentes fases se resumen a continuación.. 6.

(11) 2.3.1. Extracción de DNA bacteriano. Las células se cultivaron en 5 ml de medio LB a partir de la colección de cepas conservada a -80°C. Para efectuar la extracción se utilizó el kit comercial “Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit”.. 2.3.2. Electroforesis en gel de agarosa. El gel de electroforesis se hizo para comprobar que se ha llevado a cabo correctamente la extracción del DNA bacteriano, para este paso el gel que se utiliza es agarosa al 1,5%.. 2.3.3. Reacción en cadena de la polimerasa PCR Para llevar a cabo la reacción en cadena de la polimerasa primero se procedió a hacer diluciones 1:30 de las extracciones de DNA para disminuir la concentración de DNA obtenida en el paso anterior. Utilizamos la técnica de PCR para llevar a cabo la amplificación del fragmento de DNA en estudio en este caso el gen rpoD, donde se necesita la dilución de DNA 1:30 y se procede a hacer la mezcla que contiene además del DNA un par de primers específicos para el género Pseudomonas, PsEG 30F, PsEG 790R, estos primers delimitan la región que queremos amplificar tal como se ha descrito en (Mulet, Bennasar, Lalucat, & GarcíaValdés, 2009) La electroforesis en gel de agarosa se repite después de realizar la PCR para confirmar su ejecución correcta. En este caso el gel que se utiliza es de agarosa al 1%.. 2.3.4. Purificación del producto de PCR Una vez obtenido el producto de PCR se realiza la purificación del producto de DNA para eliminar las sales añadidas en los procesos anteriores y la recuperación del material génico que se puede visualizar como un sedimento al final del proceso que contiene el DNA en estado puro. Los amplificados por PCR se purifican con el sistema Montage de 96 pocillos (Millipore) utilizando el protocolo descrito en el anexo 2. 7.

(12) 2.3.5 Secuenciación La secuenciación de DNA se realizó por el método descrito por Sanger et al. (1977) marcando el DNA con “BigDye” según se indica en el anexo 2.. 2.4. Análisis de las secuencias con las bases de datos NCBI y la propia del laboratorio. Para realizar el análisis de las secuencias obtenidas se acudió a la base de datos que posee la página del Centro Nacional para la Información Biotecnológica o National Center for Biotechnology Information (NCBI). Además, también se hizo una comparación con la base de datos propia del laboratorio donde se comparó los resultados de 98 secuencias obtenidas por medio de secuenciación de rpoD obtenidos contra 179 secuencias de cepas tipo de diferentes especies de Pseudomonas, de esta manera poder observar la similitud que poseen con cada grupo establecido de Pseudomonas y poder realizar una afiliación a especie con un porcentaje >95% y de lo contrario considerarlos como un nuevo taxon.. 2.5. Árboles filogenéticos Para generar los árboles filogenéticos de las secuencias del gen rpoD, se hizo primero un alineamiento de las secuencias de las 100 cepas estudias junto con cepas tipo de cada especie encontrada. Posteriormente se hizo también un alineamiento de las cepas afiliadas a los grupos de P.putida y P. stutzeri incluyendo todas las cepas de la base de datos propia del laboratorio. A continuación se construyó una matriz de distancias con las alineaciones realizadas tanto para el árbol filogenético de las 100 cepas como para las especies afiliadas a P.putida y P. stutzeri respectivamente. La matriz se calculó por el método de JukesCantor. Una vez obtenida la matriz de distancia se construyó el dendrograma por el método de neighbor-joining, usando el paquete informático MEGA5 (Tamura, 2011). 8.

(13) 3. Resultados y Discusión 3.1. Selección de microorganismos Se utilizó el medio LB de forma rutinaria para el cultivo de las 100 cepas objeto de este estudio. Los cultivos se incubaron a 30° durante 24-48h. Se comprobó que eran cultivo puro en placas de LB. La mayor parte de las cepas de estudio crecieron adecuadamente en placas de agar cetrimide (24-48h a 30°), con la excepción de las siguientes: . JDS02PS001. . JDS02PS004. . JDS02PS008. . JDS02PS025. . JDS38PS002. . JDS68PS028. 3.2. Identificación por la secuencia del gen rpoD Las secuencias obtenidas en el presente estudio se han depositado en la base de datos PseudoMLSA del área de Microbiología de la UIB (Bennasar, 2010).. De las 100 cepas estudiadas, únicamente 2 no se pudieron amplificar con los cebadores selectivos de rpoD diseñados para Pseudomonas. Con objeto de identificar estas cepas se secuenció el gen RNA ribosómico 16S. La cepa JDS02PS025 (que no había crecido en agar cetrimide) se identificó como un miembro del género Arthrobacter ya que la semejanza con la especie más próxima fue del 94 % con Arthrobacter koreensis. La otra cepa, JDS03PS007, se identificó como Brevundimonas terrae ya que la semejanza en la secuencia fue de 99,2 % respecto a la cepa tipo de esta especie.. La identificación de las 98 cepas restantes mediante la secuencia del gen rpoD se indica en la Tabla 4 donde se puede ver la identificación mediante Blast en la base de datos del NCBI y la identificación con la base de datos del laboratorio. Las relaciones filogenéticas se presentan en el árbol de la figura del anexo 3.. 9.

(14) Tabla 4 Asignación a grupo filogenético o especie de las 100 cepas estudiadas de acuerdo a la semejanza en la secuencia del gen rpoD. El orden en la tabla se ha establecido de acuerdo a la topología del árbol filogenético correspondiente que se incluye como anexo.. Cepa. Cepa tipo/cepa más Identificación cercana por por MALDI- secuencia de rpoD en TOF/Vitek las bases de datos del NCBI. JDS59PS023. P. veronii. P veronii LMG 17761T. 99. JDS59PS024. P. chlororaphis. P. fragi. 97. JDS03PS010. P. fluorescens P. monhii. 98. P. mohnii. JDS10PS004. P. fluorescens P. koreensis. 99. JDS10PS005. P. fluorescens P. koreensis. 99. JDS28PS053. P. chlororaphis. 95. JDS38PS032. P. chlororaphis. JDS02PS012 JDS02PS013 JDS02PS015 JDS28PS098 JDS36PS101 JDS38PS017 JDS38PS022. P. koreensis (SE23 with 95%). similitud %. P. koreensis P. moraviensis (98 % P. fluorescens with SE23 ) P. moraviensis (97 % P. fluorescens with SE18 ). 96. P. fluorescens P. moraviensis P. moraviensis (99 % P. fluorescens with rDWA35 ). 96. P. chlororaphis. P. koreensis P. moraviensis (98 % P. fluorescens with SE18) P. moraviensis (98% P. fluorescens WITH SE23 Mulet et al., 2016). 96 96. 97. 100 96. Cepa tipo/cepa más cercana por secuencia de rpoD en las bases de datos del laboratorio P. veronii. Similitud %. P. fluorescens SG*. P. veronii. P. fragi G*. P. fragi. 98,4. P. jesseni SG. P. mohnii. P. koreensis. 98,9. P. koreensis SG. P. koreensis. P. koreensis. 98,6. P. koreensis SG. P. koreensis. P. koreensis. 95. P. koreensis SG. P. koreensis. P. koreensis. 95,5. P. koreensis SG. P. koreensis. P. moraviensis. 96,5. P. koreensis SG. P. moraviensis. P. moraviensis. 96,2. P. koreensis SG. P. moraviensis. P. moraviensis. 96,2. P. koreensis SG. P. moraviensis. P. moraviensis. 97,5. P. koreensis SG. P. moraviensis. P. moraviensis. 97,3. P. koreensis SG. P. moraviensis. P. moraviensis. 96,6. P. koreensis SG. P. moraviensis. P. moraviensis. 97,7. P. koreensis SG. P. moraviensis. P. fragi. 98,7. Asignación a Afiliación Grupo o Subgrupo especie filogenético. 96. a. 97. JDS49PS011. P. fluorescens P. moraviensis. 97. P. moraviensis. 97,1. P. koreensis SG. P. moraviensis. JDS02PS007. P. fluorescens P. protegens P. protegens (and 99% P. fluorescens with rDWA51a Sanchez) P. protegens (and 99% P. fluorescens with rDWA51a Sanchez) P. protegens (and 99% P. fluorescens with rDWA51a Sanchez) P. protegens (and 99% P. fluorescens with rDWA51a Sanchez) P. protegens (and 99% P. fluorescens with rDWA51a Sanchez) P. protegens (and 99% P. fluorescens with rDWA51a Sanchez) P. protegens (and 99% P. fluorescens with rDWA51a Sanchez). 99. P. protegens. 99,2. P. chlororaphis SG. P. protegens. P. protegens. 94,6. P. chlororaphis SG. nuevo taxon 01. P. protegens. 94,5. P. chlororaphis SG. nuevo taxon 01. P. protegens. 94,5. P. chlororaphis SG. nuevo taxon 01. P. protegens. 94,3. P. chlororaphis SG. nuevo taxon 01. P. protegens. 94,7. P. chlororaphis SG. nuevo taxon 01. P. protegens. 92,1. P. chlororaphis SG. nuevo taxon 01. P. protegens. 94,3. P. chlororaphis SG. nuevo taxon 01. JDS02PS006. JDS02PS016. JDS02PS020. JDS10PS002. JDS28PS081. JDS08PS001. JDS67PS009. 95. 95 95. 95. 95 95. 95. 10.

(15) JDS08PS004. P. fluorescens P. saponiphila. 97. P. saponiphila. 97,8. P. chlororaphis SG. P. saponiphila. JDS28PS082. P. fluorescens P. saponiphila. 97. P. saponiphila. 97,3. P. chlororaphis SG. P. saponiphila. JDS49PS007. P. chlororaphis. 92. P. mediterranea. 91,8. P. corrugata SG. nuevo taxon 02. 92,5/92,8. P. corrugata SG. nuevo taxon 03. JDS67PS006. P. mediterranea CFBP 5447T. P. fluorescens P. kilonensis P. entomophila ( 94% P. putida with Pp CFBP 5934). 99. JDS36PS069. P. putida. P. monteilli. JDS28PS088. P. putida. JDS22PS037. JDS02PS002. P. kilonensis/P. terrae P. entomophila. 95,2. P. putida G. P. entomophila. 99. P. monteilli. 98,6. P. putida G. P. monteilli. P. monteilli. 99. P. monteilli. 98,6. P. putida G. P. monteilli. P. putida. P. mosselli. 99. P. mosselii. 98,9. P. putida G. P. mosselii. JDS22PS042. P. putida. 99. P. mosselii. 99,8. P. putida G. P. mosselii. JDS10PS007. P. putida. P. putida. 95,8. P. putida G. P. putida. JDS10PS010. P. putida. P. mosselli P. putida (100% with Pp S13.1.2) P. soli (98% with CCUG 64951 Mulet et al, 2016) P. soli (97% with CCUG 64951 Mulet et al., 2016) P. soli (97% with CCUG 64951 Mulet et al., 2016) P. soli (97% with CCUG 64951 Mulet et al., 2016) P. soli (97% with CCUG 64951 Mulet et al., 2016) P. soli (97% with CCUG 64951 Mulet et al., 2016) P. soli (95% with CCUG 64951 Mulet et al, 2016) la seq es regular P. soli (94% with CCUG 64951). P. soli. 97. P. putida G. P. soli. P. soli. 95,9. P. putida G. P. soli. P. soli. 96,2. P. putida G. P. soli. P. soli. 95,9. P. putida G. P. soli. P. soli. 95,9. P. putida G. P. soli. P. soli. 96,4. P. putida G. P. soli. P. soli. 94,4. P. putida G. P. soli. P. soli. 95,9. P. putida G. P. soli. P. alkylphenolia. 94,4. P. putida G. nuevo taxon 04. P. alkylphenolia. 91,8. P. putida G. nuevo taxon 05. P.donghuensis GenomaAJJP01. 91,7. P. putida G. nuevo taxon 06. P. entomophila/P. mosselii. 92,8/93,1. P. putida G. nuevo taxon 07. P. entomophila/P. mosselii. 92,3/92,4. P. putida G. nuevo taxon 07. P. entomophila/P. mosselii. 91,9/91,7. P. putida G. nuevo taxon 08. P. entomophila/P. mosselii. 91,7/91,6. P. putida G. nuevo taxon 08. P. entomophila/P. mosselii. 91,4/91,2. P. putida G. nuevo taxon 08. P. entomophila/P. mosselii. 92,1/91,6. P. putida G. nuevo taxon 08. P. entomophila/P. mosselii. 91,9/91,7. P. putida G. nuevo taxon 08. P. entomophila/P. mosselii. 90,7/90,7. P. putida G. nuevo taxon 08. JDS22PS025. JDS22PS028. JDS22PS032. JDS22PS044. JDS28PS091. JDS02PS019. P. putida. P. putida. P. putida. P. putida. P. putida. P. putida. 94. 96. 97. 96 96 96 96 96. 94. JDS03PS001. P. putida. JDS63PS023. P. viridiflava. P. alkylphenolia. 95. JDS63PS070. P. chlororaphis. P. alkylphenolia. 93. JDS63PS042. P. chlororaphis. 88. JDS28PS080. P. putida. P. vranovensis P. entomophila L48T (and 94% with SE6 Mulet et al., 2016). JDS28PS096. P. putida. JDS02PS021. P. putida. JDS22PS026. JDS22PS029. JDS22PS031. P. putida. P. putida. P. putida. JDS22PS036. P. putida. JDS22PS039. P. putida. P. entomophila (93% SE6) P. entomophila (100% P. sP. CCUG 58741; VIII Mulet 2016) P. mosselii (99% with CCUG 58741 Mulet et al, 2016) P. mosselii (99% with CCUG 58741 Mulet et al, 2016) P. entomophila (99% with CCUG 58741 Mulet et al, 2016) P. entomophila P. mosselii (97% with CCUG 58741 Mulet et al, 2016). 93. 93 93. 92. 92 91 92 92. 90. 11.

(16) JDS02PS023. JDS08PS005 JDS28PS032 JDS59PS015. P. hunanensis (99% P. sP. CFBP 2461; 98% P. sP. V289) P. japonica JCM P. fluorescens 21532T (99% with FBF35 Farid) P. japonica JCM P. viridiflava 21532T (1er hit) P. japonica (99%with P. viridiflava FBF35) P. putida. P. hunanensis/W2Ago4. 88.6/99,8. P. putida G. nuevo taxon 09. P. japonica/S12. 81,5/99,4. P. putida G. nuevo taxon 10. 82,5. P. putida G. nuevo taxon 11. 89. 84. 84. P. japonica. 85. P. japonica/S12. 82,5/81,9. P. putida G. nuevo taxon 11. JDS63PS080. P. oleovorans. P. stutzeri gv1. 98. P. japonica/S12. 82,5/82,8. P. putida G. nuevo taxon 12. JDS10PS001. P. putida. Pp KT2440. 98. P. monteilli/Pp KT2440. 94,7/98,8. P. putida G. nuevo taxon 13. JDS10PS008. P. putida. Pp KT2440. 97. P. monteilli/Pp KT2440. 94,6/97,5. P. putida G. nuevo taxon 13. JDS10PS011. P. putida. Pp KT2440. 97. P. monteilli/Pp KT2440. 94,4/97,7. P. putida G. nuevo taxon 13. JDS36PS066. P. putida. Pp KT2440. 98. P. monteilli/Pp KT2440. 93,9/99,2. P. putida G. nuevo taxon 13. JDS36PS067. P. putida. Pp KT2440. 99. P. monteilli/Pp KT2440. 93,6/99,2. P. putida G. nuevo taxon 13. JDS28PS089. P. putida. Pp KT2440. 98. P. monteilli/Pp KT2440. 93,9/97,8. P. putida G. nuevo taxon 13. JDS28PS094. P. putida. Pp KT2440. 99. P. monteilli/Pp KT2440. 94,3/99,1. P. putida G. nuevo taxon 13. JDS10PS012. P. putida. 93. P. monteilli/Pp BH. 92,9/97,1. P. putida G. nuevo taxon 14. JDS36PS064. P. putida. P. monteilli Pp KT2440 (93% with SE22). P. monteilli/V222. 90.2/91.0. P. putida G. nuevo taxon 15. JDS02PS022. P. putida. P plecoglossicida (100% with W619). 91. P. plecoglossicida/W619. 89,7/100,0 P. putida G. nuevo taxon 16. JDS08PS006. P. putida. P. plecoglossicida (98% with W619). 91. P. plecoglossicida/W619. 89,7/ 98,0. P. putida G. nuevo taxon 16. JDS28PS079. P. putida. P. plecoglossicida (99% with Pp W619). 91. P. plecoglossicida/W619. 89,7/100,0 P. putida G. nuevo taxon 16. JDS28PS084. P. fluorescens. P. plecoglossida. 98. P. plecoglossicida/W619. 89,6/ 99,8. P. putida G. nuevo taxon 16. JDS28PS085. P. fluorescens P. plecoglossida (W619 with 99%). 90. P. plecoglossicida/W619. 89,6/100,0 P. putida G. nuevo taxon 16. JDS28PS086. P. putida. P. plecoglossicida (99% with Pp W619). 91. P. plecoglossicida/W619. 89,7/100,0 P. putida G. nuevo taxon 16. JDS36PS040. P. mendocina. P. plecoglossicida/W619. 89,7/100,0 P. putida G. nuevo taxon 16. JDS02PS005. P. mendocina. Pp W619 P. guguanensis (and 100% with SD142 Scotta). 91. 100. P. guguanensis. 99,2. P. oleovorans G. P. guguanensis. 99. JDS02PS003. P. oleovorans. P. sihuiensis. 95. P. sihuensis. 95,8. P. oleovorans G. P. sihuensis. JDS02PS026. P. mendocina. 95. P. sihuensis. 95,8. P. oleovorans G. P. sihuensis. JDS03PS009. P. mendocina. P. sihuiensis P. sihuiensis strain KCTC 32246T. P. sihuensis. 95,8. P. oleovorans G. P. sihuensis. JDS28PS118. P. mendocina. P. sihuiensis. 98. P. sihuensis. 98,4. P. oleovorans G. P. sihuensis. JDS63PS013. P. oleovorans. P. sihuiensis. 98. P. sihuensis. 98,1. P. oleovorans G. P. sihuensis. JDS68PS008. P. oleovorans. P. sihuiensis. 98. P. sihuensis. 98,4. P. oleovorans G. P. sihuensis. JDS68PS019. P. oleovorans. P. sihuiensis. 98. P. sihuensis. 97,8. P. oleovorans G. P. sihuensis. JDS03PS008. P. oleovorans. P. oleovorans. 99. P. oleovorans. 99,8. P. oleovorans G. P. oleovorans. JDS36PS078. P. oleovorans. P. oleovorans. 99. P. oleovorans. 100. P. oleovorans G. P. oleovorans. JDS38PS002. P. oleovorans. P. oleovorans. 99. P. oleovorans. 100. P. oleovorans G. P. oleovorans. JDS68PS018B P. oleovorans. P. oleovorans (Morfo A y B son iguales. 99. P. oleovorans. 99,7. P. oleovorans G. P. oleovorans. JDS68PS025. P. oleovorans. P. oleovorans. 99. P. oleovorans. 99,7. P. oleovorans G. P. oleovorans. JDS68PS028. P. oleovorans. P. oleovorans. 99. P. oleovorans. 99,7. P. oleovorans G. P. oleovorans. 95. 12.

(17) JDS68PS031. P. oleovorans. P. oleovorans. 99. P. oleovorans. 99,7. P. oleovorans G. P. oleovorans. JDS63PS008. P. mendocina. P. alcaliphila. 93. P. alcaliphila. 93,5. P. oleovorans G. nuevo taxon 17. JDS28PS114. P. aeruginosa. P. citronellolis. 96. P. citronellolis. 99,5. P. aeruginosa G. P. citronellolis. JDS28PS093. P. aeruginosa. P. nitroreducens (1er hit). 96. P. nitroreducens. 95,5. P. aeruginosa G. P. nitroreducens. JDS63PS055. P. alcaligenes. P. resinovorans. 98. P. resinovorans. 98,1. P. aeruginosa G. P. resinovorans. JDS63PS033. P. stutzeri. P. stutzeri WM88 gv3. 99. 94,7/99,1. P. stutzeri G. P. stutzerigv3. JDS02PS001. P. stutzeri. P. stutzeri gv1. 99. P. stutzeri CCUG11256Tgv1. 99,1. P. stutzeri G. P. stutzeri gv1. JDS02PS004. P. stutzeri. P. stutzeri gv1. 99. P. stutzeri CCUG11256Tgv1. 98,3. P. stutzeri G. P. stutzeri gv1. JDS02PS008. P. stutzeri. P. stutzeri gv1. 99. P. stutzeri CCUG11256Tgv1. 99,1. P. stutzeri G. P. stutzeri gv1. JDS03PS002. P. stutzeri. P. stutzeri gv1. 99. P. stutzeri CCUG11256Tgv1. 99,2. P. stutzeri G. P. stutzeri gv1. JDS03PS003. P. stutzeri. P. stutzeri gv1. 99. P. stutzeri CCUG11256Tgv1. 99,2. P. stutzeri G. P. stutzeri gv1. JDS68PS016. P. stutzeri. P. stutzeri gv1. 99. P. stutzeri CCUG11256Tgv1. 97,5. P. stutzeri G. P. stutzeri gv1. P.kunmingensis/DSM50227gv3. 16S rRNA JDS02PS025. P. stutzeri. Arthrobacter koreensis. 94. Arthrobacter koreensis. JDS03PS007. P. fluorescens Brevundimonas terrae. 99. Brevundimonas 145(T). terrae. 94 KSL-. 99,2. *G o SG: grupo o subgrupo filogenético basado en la secuencia de 4 genes dentro del género Pseudomonas (Mulet, Bennasar, Lalucat, & García-Valdés, 2009).. Se pudieron identificar 57 cepas a nivel de especie por presentar más del 95% de similitud en la secuencia del gen rpoD. Se distribuyeron en 19 especies diferentes, siendo las más abundantes P. moraviensis y P. soli (8 cepas cada una de ellas). Por abundancia, la siguiente especie detectada fue P. stutzeri, con 6 cepas pertenecientes a la genomovar 1 y otra adicional a la genomovar 3 (Tabla 5).. Tabla 5 Número de cepas identificadas distribuidas en 19 especies de Pseudomonas. P. citronellolis P. entomophila P. fragi P. guguanensis P. koreensis P. mohnii. 1 1 1 1 4 1. P. monteilli P. moraviensis P. mosselii P. nitroreducens P. oleovorans P. protegens. 2 8 2 1 7 1. P. putida P. resinovorans P. saponiphila P. sihuensis P. soli P. stutzeri gv1. 13. 1 1 2 7 8 6. P. stutzeri gv3 P. veronii. 1 1.

(18) El resto de cepas de Pseudomonas, 41 cepas, no podían asignarse a ninguna especie descrita por tener menos del 95% de similitud en la secuencia del gen rpoD por lo que fueron consideradas como representantes de 17 nuevos taxones, que requieren estudios taxonómicos más precisos para confirmar la asignación a alguna especie conocida o para proponerlos como especies nuevas... Tabla 6 Cepas identificadas como nuevos taxones Nuevo Taxon. Número de cepas. Nuevo Taxon. Número de cepas. nuevo taxon 01. 7. nuevo taxon 09. 1. nuevo taxon 02. 1. nuevo taxon 10. 1. nuevo taxon 03. 1. nuevo taxon 11. 2. nuevo taxon 04. 1. nuevo taxon 12. 1. nuevo taxon 05. 1. nuevo taxon 13. 7. nuevo taxon 06. 1. nuevo taxon 14. 1. nuevo taxon 07. 1. nuevo taxon 15. 1. nuevo taxon 08. 6. nuevo taxon 16. 7. nuevo taxon 17. 1. 3.3. Análisis de las identificaciones obtenidas por los dos métodos Un aspecto interesante a considerar es la correlación que debe existir entre la agrupación de las cepas por sus perfiles proteicos de MALDI-TOF y por la secuencia del gen rpoD (Scotta, Gomila, Mulet, Lalucat, & García-Valdés, 2013). Además de las 41 cepas que por rpoD no pueden identificarse a nivel de especie y que son posibles representantes de especies nuevas aun no descritas, se detectaron tan solo 16 cepas cuya identificación por MALDI-TOF coincidía con la identificación por rpoD (P. veroni -1 cepa, P. putida -1 cepa, P. oleovorans -7 cepas y P. stutzeri -7 cepas) tal como se muestra en la Tabla 7. Cuarenta y una cepas se habían asignado por MALDITOF a una especie errónea y 42 corresponden a probables nuevos taxones. Esta importante discrepancia podemos atribuirla a que la base de datos utilizada para comparar los perfiles proteicos de las cepas (Vitek) está diseñada para la identificación de cepas procedentes de muestras clínicas y es incompleta. Muchas especies detectadas son típicamente ambientales y no están representadas en las bases de datos comerciales.. 14.

(19) Tabla 7 En la tabla se indican las cepas en las que se ha visto que existe una discrepancia en la identificación por MALDI-TOF y por secuencia del gen rpoD. Se puede observar el número y afiliación de grupos que se consideraron en base al dendrograma obtenido. por los perfiles proteicos de MALDI-TOF. La asignación a. especie por rpoD se puede ver también en la tabla 4. Para mayor claridad, esta misma tabla se presenta también como anexo ordenándola por grupos de MALDI-TOF, por la identificación por MALDI-TOF/Vitek y por la identificación por la secuencia de rpoD.. Cepa. JDS59PS023 JDS59PS024 JDS10PS004 JDS10PS005 JDS28PS053 JDS38PS032 JDS02PS012 JDS02PS013 JDS02PS015 JDS28PS098 JDS36PS101 JDS38PS017 JDS38PS022 JDS49PS011 JDS03PS010 JDS02PS007 JDS02PS006 JDS02PS016 JDS02PS020 JDS10PS002 JDS28PS081 JDS08PS001 JDS67PS009 JDS08PS004 JDS28PS082 JDS49PS007 JDS67PS006 JDS02PS002 JDS10PS007. Grupos por MALDITOF 46 28 29 29 29 29 29 29 29 29 29 29 29 29 27 27 27 27 27 27 27 27 27 27 27 32 27 4 10. Identificación por MALDI-TOF P. veroni P. chlororaphis P. fluorescens P. fluorescens P. chlororaphis P. chlororaphis P. fluorescens P. fluorescens P. fluorescens P. fluorescens P. fluorescens P. fluorescens P. fluorescens P. fluorescens P. fluorescens P. fluorescens P. fluorescens P. fluorescens P. fluorescens P. fluorescens P. fluorescens P. fluorescens P. fluorescens P. fluorescens P. fluorescens P. chlororaphis P. fluorescens P. putida P.putida 15. Identificación por rpoD P.veronii P. fragi P. koreensis P. koreensis P. koreensis P. koreensis P. moraviensis P. moraviensis P. moraviensis P. moraviensis P. moraviensis P. moraviensis P. moraviensis P. moraviensis P. mohnii P. protegens nuevo taxon 01 nuevo taxon 01 nuevo taxon 01 nuevo taxon 01 nuevo taxon 01 nuevo taxon 01 nuevo taxon 01 P. saponiphila P. saponiphila nuevo taxon 02 nuevo taxon 03 P. entomophila P. putida.

(20) JDS10PS001 JDS10PS008 JDS10PS011 JDS36PS066 JDS36PS067 JDS28PS089 JDS28PS094 JDS10PS012 JDS36PS064 JDS36PS069 JDS28PS088 JDS22PS037 JDS22PS042 JDS10PS010 JDS22PS025 JDS22PS028 JDS22PS032 JDS22PS044 JDS28PS091 JDS02PS019 JDS03PS001 JDS28PS080 JDS28PS096 JDS02Ps021 JDS22PS026 JDS22PS029 JDS22PS031 JDS22PS036 JDS22PS039 JDS63PS023 JDS63PS070 JDS63PS042 JDS02PS023 JDS08PS005 JDS28PS032 JDS59PS015 JDS63PS080 JDS02PS022 JDS08PS006 JDS28PS079 JDS28PS084 JDS28PS085 JDS28PS086 JDS36PS040 JDS02PS005. 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 5 5 51 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 39 35 35 8 29 37 37 38 8 8 8 29 29 8 8 42. P.putida P.putida P.putida P.putida P.putida P.putida P.putida P.putida P.putida P.putida P.putida P.putida P.putida P.putida P.putida P.putida P.putida P.putida P.putida P.putida P.putida P.putida P.putida P.putida P.putida P.putida P.putida P.putida P.putida P. viridiflava P. chlororaphis P. chlororaphis P. putida P. fluorescens P. viridiflava P. viridiflava P. oleovorans P. putida P. putida P. putida P. fluorescens P. fluorescens P. putida P.putida P. mendocina 16. nuevo taxon 14 nuevo taxon 14 nuevo taxon 14 nuevo taxon 14 nuevo taxon 14 nuevo taxon 14 nuevo taxon 14 nuevo taxon 15 nuevo taxon 16 P. monteilli P. monteilli P. mosselii P. mosselii P. soli P. soli P. soli P. soli P. soli P. soli P. soli P. soli nuevo taxon 07 nuevo taxon 07 nuevo taxon 08 nuevo taxon 08 nuevo taxon 08 nuevo taxon 08 nuevo taxon 08 nuevo taxon 08 nuevo taxon 04 nuevo taxon 05 nuevo taxon 06 nuevo taxon 09 nuevo taxon 10 nuevo taxon 11 nuevo taxon 11 nuevo taxon 13 nuevo taxon 17 nuevo taxon 17 nuevo taxon 17 nuevo taxon 17 nuevo taxon 17 nuevo taxon 17 nuevo taxon 17 P. guguanensis.

(21) JDS02PS003 JDS02PS026 JDS03PS009 JDS28PS118 JDS63PS013 JDS68PS008 JDS68PS019 JDS03PS008 JDS36PS078 JDS38PS002 JDS68PS018B JDS68PS025 JDS68PS028 JDS68PS031 JDS63PS008 JDS28PS114 JDS28PS093 JDS63PS055 JDS63PS033 JDS02PS001 JDS02PS004 JDS02PS008 JDS03PS002 JDS03PS003 JDS68PS016. 41 41 41 41 42 42 42 41 42 42 42 42 42 42 43 49 49 44 2 1 1 1 1 1 1. P. oleovorans P. mendocina P. mendocina P. mendocina P. oleovorans P. oleovorans P. oleovorans P. oleovorans P. oleovorans P. oleovorans P. oleovorans P. oleovorans P. oleovorans P. oleovorans P. mendocina P. aeruginosa P. aeruginosa P. alcaligenes P. stutzeri P. stutzeri P. stutzeri P. stutzeri P. stutzeri P. stutzeri P. stutzeri. P. sihuensis P. sihuensis P. sihuensis P. sihuensis P. sihuensis P. sihuensis P. sihuensis P. oleovorans P. oleovorans P. oleovorans P. oleovorans P. oleovorans P. oleovorans P. oleovorans nuevo taxon 19 P. citronellolis P. nitroreducens P. resinovorans P. stutzeri P. stutzeri P. stutzeri P. stutzeri P. stutzeri P. stutzeri P. stutzeri. Cabe destacar que todas las cepas de P. stutzeri aparecían agrupadas en el dendrograma de los perfiles de MALDI-TOF (grupos 1 y 2) por lo que ésta es una muy buena herramienta para detectar rápidamente y con fiabilidad cepas de la especie.En el dendrograma de P. stutzeri se observó la diversidad dentro de la especie que se refleja en el nivel genético, se tomó en cuenta las secuencias de referencia de cepas de P. stutzeri que se han agrupado en genomovares, de 1 a 22. Las relaciones filogenéticas de las 7 cepas afiliadas a P. stutzeri que se detectaron en este estudio pertenecen a las genomovares 1 y 3 que se pueden observar en el dendrograma en el anexo 4.. 17.

(22) Tabla 8 Cepas del grupo P. stutzeri y a las genomovares a que pertenecen Cepa JDS02PS001 JDS02PS004 JDS68PS016 JDS02PS008 JDS03PS002 JDS03PS003 JDS63PS033. Cepa tipo CCUG11256Tgv1 A95/69gv1 A95/69gv1 CCUG11256Tgv1 CCUG11256Tgv1 CCUG11256Tgv1 DSM50227gv3. Porcentaje 99,1 99 98,3 99,3 99,3 99,2 99,1. Asignación genomovar 1 genomovar 1 genomovar 1 genomovar 1 genomovar 1 genomovar 1 genomovar 3. Para P. putida primero se observó la organización de las cepas tipo dentro del grupo; para ser utilizado como base para poder considerar la existencia de nuevos taxones dentro del mismo. Existen 12 representantes de los 17 nuevos taxones que hemos considerado como posibles nuevas especies. Se puede observar en el anexo 4. Las agrupaciones por los perfiles de proteínas en el dendrograma están obviamente de acuerdo con la identificación por VITEK de las cepas, pero la identificación se limita a unas pocas especies. En el caso de las cepas identificadas como P. stutzeri, los resultados del análisis por la secuencia del gen rpoD son perfectamente concordantes, e incluso diferencia a las cepas de las 2 genomovares detectadas. No obstante, en el caso de las cepas inicialmente identificadas como P. putida se distribuyen en 5 agrupamientos, aunque todos menos 1 en la misma rama del dendrograma: grupos 4 (1 cepa), 5 (17 cepas), 8 (6 cepas), 10 (12 cepas) y 51 (1 cepa). La identificación por rpoD nos demuestra que en realidad se trata de cepas pertenecientes a 5 especies reconocidas distintas y a 7 posibles taxones nuevos, aunque todos dentro de la rama filogenética de P. putida y los agrupamientos del dendrograma no reflejan exactamente las especies a las que se asignan las cepas. Por tanto, la identificación por los perfiles de proteínas por MALDI-TOF no es suficientemente discriminativa a nivel de especie, aunque sí da una buena idea de los grupos filogenéticos que se distinguen en el género Pseudomonas tal como se puede ver en el anexo 5.. Otro ejemplo es el grupo 29 de MALDI-TOF cuyas cepas se identificaron inicialmente como P. fluorescens, pero en realidad demostramos por la secuencia del gen rpoD que incluye a todas las cepas asignadas a las especies P. koreensis, P. moraviensis y 2 posible nuevos taxones. Todas ellas pertenecen al subgrupo filogenético de P. koreensis, dentro del grupo de P. fluorescens.. 18.

(23) 4. Conclusiones . Se realizó la secuenciación del gen rpoD de las 100 cepas elegidas para este estudio con el uso de cebadores diseñados que son selectivos en la detección de Pseudomonas, no hubo problema en la secuenciación de 98 cepas, sin embargo 2 de ellas no pudieron ser amplificados y se realizó por secuenciación del gen RNA ribosómico 16S. La cepa JDS02PS025 se identificó como un miembro del género Arthrobacter con una similitud 94 % con Arthrobacter koreensis. La otra cepa, JDS03PS007, se identificó como Brevundimonas terrae con una similitud de 99,2 % respecto a la cepa tipo de esta especie. Por tanto, se ha confirmado que los cebadores selectivos diseñados para el género Pseudomonas han sido útiles en la asignación de cepas al género, no amplificando cepas de oros géneros. Muy probablemente las 2 cepas de otros géneros se deban a una contaminación en el proceso de envío de cepas de un laboratorio a otro.. . Se compararon las identificaciones obtenidas por los métodos de MALDI-TOF y rpoD. Existe una buena correspondencia entre los agrupamientos de los perfiles proteicos y los grupos o subgrupos filogenéticos establecidos previamente en el género. No obstante, la identificación a nivel de especie por MALDI-TOF no es suficiente, porque la base de datos no incluye muchas especies de origen ambiental. Además, algunas especies de un mismo grupo o subgrupo filogenético no se pueden discriminar por MALDI-TOF.. . Al realizar la comparación de las secuencias con la base de datos del NCBI y con la base de datos propia del laboratorio se revisó la similitud que poseen las secuencias estudiadas con cada grupo establecido de Pseudomonas tomando en cuenta un porcentaje >95% para poder hacer una afiliación a especie. Se observó que 41 cepas no cumplían con este requisito teniendo una similitud por debajo del 95% por lo que se consideran representantes de nuevas especies bacterianas que deben estudiarse con más detalle desde el punto de vista taxonómico. El hecho de que se hayan detectado 17 posibles nuevas especies dentro de los aislados del río Danubio indica que la diversidad de especies dentro del género es muy superior a la que actualmente conocemos.. 19.

(24) Expresiones de Gratitud Quiero dar las gracias a Magdalena Mulet y a Jorge Lalucat por sus conocimientos y valiosa colaboración durante todo el trabajo.. Bibliografía. Bennasar, A. M.-V. (2010). Database PseudoMLSA: a database for multigenic sequence analysis of Pseudomonas species. García-Valdés, E., & Lalucat, J. (2016). Pseudomonas: Molecular Phylogeny and Current Taxonomy. Springer International Publishing. Jamal, W. A. (2014). Real-time comparative evaluation of bioMerieux VITEK MS versus Bruker Microflex MS, two matrix-assisted laser desorption-ionization time-of-flight mass spectrometry systems, for identification of clinically significant bacteria. BMC microbiology, 289. JDS3. (2015). Joint Danube Survey 3. A Comprehensive Analysis of Danube Water Quality. Vienna: ICPDR – International Commission for the Protection of the Danube River. Kittinger, C. L. (2016). Antibiotic resistance patterns of Pseudomonas spp. Isolated from the River Danube. Frontiers in microbiology,, 7. Mulet, M. G.-V. (2008). Phylogenetic analysis and siderotyping as useful tools in the taxonomy of Pseudomonas stutzeri: description of a novel genomovar. . International journal of systematic and evolutionary microbiology, 2309-2315. Mulet, M., Bennasar, A., Lalucat, J., & García-Valdés, E. (2009). An rpoD-based PCR procedure for the identification of Pseudomonas species and for their detection in environmental samples. Molecular and cellular probes, 140-147. Scotta, C., Gomila, M., Mulet, M., Lalucat, J., & García-Valdés, E. (2013). Whole-cell MALDI-TOF mass spectrometry and multilocus sequence analysis in the discrimination of Pseudomonas stutzeri populations: three novel genomovars. Microbial ecology, 522-532. Tamura, K. P. (2011). MEGA5: molecular evolutionary genetics analysis using maximum likelihood, evolutionary distance, and maximum parsimony methods. Molecular biology and evolution, 2731-2739. Yamamoto, S. K. (2000). Phylogeny of the genus Pseudomonas: intrageneric structure reconstructed from the nucleotide sequences of gyrB and rpoD genes. Microbiology, 2385-2394.. 20.

(25) ANEXOS.

(26) Anexo 1 Selección de las 100 cepas de estudio y la distinción de los 53 grupos dentro de la identificacion realizada por MALDI-TOF. JDS02PS001 JDS02PS004 JDS03PS002 JDS03PS003 JDS02PS008 JDS63PS033 JDS68PS016 JDS02PS002 JDS22PS001 JDS36PS003 JDS36PS046 JDS36PS073 JDS38PS018 JDS02PS019 JDS03PS001 JDS28PS019 JDS28PS034 JDS28PS038 JDS10PS009 JDS36PS105 JDS28PS049 JDS22PS025 JDS22PS043 JDS22PS044 JDS22PS022 JDS22PS046 JDS28PS010 JDS10PS006 JDS36PS030 JDS28PS112 JDS28PS091 JDS63PS100 JDS28PS026 JDS22PS017 JDS22PS024 JDS36PS014 JDS22PS019 JDS22PS028 JDS36PS055 JDS28PS108 JDS28PS103 JDS38PS030.

(27) JDS28PS030 JDS36PS063 JDS02PS021 JDS10PS019 JDS22PS031 JDS22PS036 JDS22PS023 JDS22PS029 JDS28PS006 JDS68PS020 JDS10PS030 JDS36PS072 JDS22PS039 JDS36PS047 JDS10PS003 JDS22PS045 JDS10PS013 JDS28PS025 JDS36PS109 JDS63PS014 JDS22PS026 JDS28PS015 JDS36PS002 JDS22PS014 JDS36PS083 JDS22PS030 JDS36PS034 JDS28PS054 JDS28PS029 JDS28PS037 JDS22PS033 JDS28PS036 JDS22PS041 JDS22PS042 JDS28PS022 JDS36PS062 JDS22PS003 JDS22PS020 JDS63PS093 JDS28PS007 JDS28PS044 JDS28PS110 JDS36PS035 JDS22PS032 JDS22PS037 JDS28PS045 JDS28PS069.












(39) JDS67PS010 JDS22PS013 JDS28PS114 JDS28PS093 JDS02PS025 JDS10PS010 JDS03PS004 JDS03PS007 JDS10P32e. JDS22PS002 JDS36PS036.

(40) Anexo 2. Protocolos. 1. Extracción de DNA bacteriano.. Materiales: . 1,5 ml tubos de centrifuga. . Baño de agua a 80°C. . Baño de agua a 37°C. . Isopropanol. . Etanol 70%. . Baño de agua a 65°C. Método: . Añadir 600µl de solución Nuclei Solution, pipetear suavemente hasta que las células se resuspendan.. . Incubar a 80°C por 5 minutos para lisar las células, luego enfriar a temperatura ambiente.. . Añadir 6µl de RNase Solution al lisado celular, invertir los tubos de 2-5 veces para mezclar.. . Incubar a 37°C durante 60°C minutos, enfriar las muestras en temperatura ambiente.. . Añadir 200µl de Protein Precipitation Solution a las células lisadas tratadas con RNase.. . Incubar las muestras en hielo por 5 minutos.. . Centrifugar a 13,000-16,000 x g por 5 minutos.. . Transferir el sobrenadante que contiene el DNA a un tubo limpio de 1,5ml y añadir 600µl de isopropanol.. . Mezclar suavemente por inversión hasta visualizar hebras finas de DNA.. . Centrifugar a 13,000-16,000 x g por 5 minutos.. . Vierta cuidadosamente el sobrenadante y drene el tubo sobre papel absorbente limpio. Añadir etanol 70% y suavemente invertir el tubo varias veces para lavar el pellet de DNA..

(41) . Centrifugar a 13,000-16,000 x g por 2 minutos, cuidadosamente aspirar el etanol.. . Drenar el tubo y limpiar con papel absorbente y secar al aire de 10-15 minutos.. . Añadir 50 µl de H2O mili, incubar el DNA a 65°C durante 1 hora.. . Almacenar el DNA de 2-8°C. 2. Gel Electroforesis. Verter un Gel de Agarosa estándar: . Medir 1 g de agarosa (1% de gel surgido) o 1,5 g de agarosa (gel de agarosa al 1,5%) Nota: Los geles de agarosa se usan comúnmente en concentraciones de 0,7% a 2% dependiendo del tamaño de Las bandas necesitaban ser separadas. Simplemente ajustar la masa de agarosa un volumen dado para hacer geles de otras concentraciones de agarosa (e 2 g de agarosa 100 mL de TAE hará un gel al 2%). . Mezclar el polvo de agarosa con 100 mL 1xTAE en un frasco de microondas (pero no microondas para 1-3 min hasta que la agarosa se disuelve completamente sobre la solución ya que parte del tampón se evaporará y por lo tanto alterará el porcentaje final de agarosa en el gel. Muchas personas prefieren microondas en pulsos, girando el frasco ocasionalmente como la solución se calienta.. . Dejar que la solución de agarosa se enfríe, aproximadamente 10 minutos.. . Verter la agarosa en una bandeja de gel con el peine del pocillo en su lugar Nota: Vierta lentamente para evitar las burbujas que interrumpen el gel Cualquier burbujas pueden ser empujadas lejos del peine de pozo o hacia los lados / bordes del gel con la punta de la pipeta. . Dejar reposar a temperatura ambiente durante 20-30 minutos, hasta que se haya solidificado completamente.. Carga de muestras y funcionamiento de un gel de agarosa: . Añadir tampón de carga a cada una de sus muestras (0,5 μl de tampón 3Hl Pto extracción de ADN purificado: 0,5 μl de tampón Nota: El tampón de carga tiene dos propósitos: 1) Un tinte visible que ayuda con la carga de gel y también le permite medir hasta qué punto el gel se ha ejecutado mientras está ejecutando su gel; 2) contiene.

(42) un alto porcentaje de glicerol, por lo que aumenta la densidad de su muestra de ADN lo que hace que se deposite en el fondo del pocillo de gel, en lugar de difundir en el tampón . Una vez solidificado, colocar el gel de agarosa en la caja de gel (Unidad de electroforesis). . Rellenar la caja de gel con 1xTAE hasta que el gel se cubra cuidadosamente cargando una escala de peso molecular (3 μl de 1kb DNA Ladder, Genecraft o 3 μl de 100 bp DNA Ladder, Biotools) en el primer carril del gel. . Cargar cuidadosamente sus muestras en los pocillos adicionales del gel. Nota: Al cargar la muestra en el pozo.. Correr el gel . Ejecutar el gel a 100v hasta que la línea de tinte aproximadamente 75-80% de la forma en el gel aproximadamente 20-30 min, dependiendo de la concentración del gel y el voltaje.. . Se debe retirar cuidadosamente el gel de la caja de gel.. Visualizar los fragmentos de ADN . Colocar el gel en un recipiente lleno con 100 ml de tampón de TAE y 5 μl de Et Br, durante 15 a 30 min. . Usando luz UV visualizar los fragmentos de ADN..

(43) 3. Reacción en cadena de la polimerasa PCR. Las condiciones utilizadas para la PCR son de acuerdo a los cebadores utilizados.. Materiales. 1 muestra. H2O mQ. 62,5. Tampón. 10. dNTPs. 16. Primer1. 5. Primer2. 5. Taq pol. 0,5. DNA. 1. Condiciones para PCR rpoD 94°C. 5 min. 94°C. 1 min. 50-55°C. 1 min. 72°C. 1.5 min. 72°C. 10 min. 30-40 cicles. Condiciones para PCR 16S 94°C. 5 min. 94°C. 1 min. 50-55°C. 1 min. 72°C. 1.5 min. 72°C. 10 min. 30 cicles.

(44) 4. Purificación del producto de PCR. . Añadir 250 ul de agua miliQ al producto de PCR en un nuevo eppendorf.. . Pasar todo el volumen al pocillo de Montage- 96 pocillos (Millipore), y aplicar el vacío para drenar la mezcla (entre 5-12 min). Mantener el vacio 30 seg más después de drenar.. . Añadir 200 ul de agua miliQ y repetir el segundo paso.. . Añadir 25 ul de agua miliQ, resuspender con ayuda de la pipeta y recuperar en un nuevo eppendorf.. 5. Marcaje con BigDye Las condiciones utilizadas para realizar el marcaje. Reactivo DNA purificado H2O miliQ Buffer 5X (Applied Biosystems) Primer (10 uM) BigDye 3.1 (Applied Biosystems) Volumen Total. Cantidad (µl) por muestra 3 3,25 1,25 0,5 2 10.

(45) Anexo 3 Relaciones filogenéticas de las cepas de esudio. Cepa. Identificacion MALDI-TOF. rpoD Blast. Similitud. rpoD base de datos UIB. Similitud. Grupo. Afiliación. JDS02PS001. P. stutzeri. P. stutzeri gv1. 99. P. stutzeri. 99,1. P. stutzeri G. P. stutzeri gv1. JDS02PS004. P. stutzeri. P. stutzeri gv1. 99. P. stutzeri. 98,3. P. stutzeri G. P. stutzeri gv1. JDS03PS002. P. stutzeri. P. stutzeri gv1. 99. P. stutzeri. 99,2. P. stutzeri G. P. stutzeri gv1. JDS03PS003. P. stutzeri. P. stutzeri gv1. 99. P. stutzeri. 99,2. P. stutzeri G. P. stutzeri gv1. JDS02PS008. P. stutzeri. P. stutzeri gv1. 99. P. stutzeri. 99,1. P. stutzeri G. P. stutzeri gv1. JDS63PS033. P. stutzeri. P. stutzeri WM88 gv3. 99. P.kunmingensis. 94,7/99,1. P. stutzeri G. P. stutzerigv3. JDS68PS016. P. stutzeri. P. stutzeri gv1. 99. P. stutzeri. 97,5. P. stutzeri G. P. stutzeri gv1. JDS02PS002. P. putida. P. entomophila ( 94% with Pp94 CFBP 5934) P. entomophila. 95,2. P. putida G. P. entomophila. JDS02PS019. P. putida. P. soli (95% with CCUG 64951 al, soli 2016) la seq es regular 94Mulet et P.. 94,4. P. putida G. P. soli. JDS03PS001. P. putida. P. soli (94% with CCUG 64951) 93. 95,9. P. putida G. P. soli. P. putida. P. soli (97% with CCUG 64951 al.,soli 2016) 96Mulet et P.. 95,9. P. putida G. P. soli. P. putida. P. soli (97% with CCUG 64951 al.,soli 2016) 96Mulet et P.. 95,9. P. putida G. P. soli. P. putida. P. soli (97% with CCUG 64951 96Mulet et P. al.,soli 2016). 96,4. P. putida G. P. soli. P. putida. P. soli (97% with CCUG 64951 al.,soli 2016) 96Mulet et P.. 96,2. P. putida G. P. soli. P. putida. P. entomophila (100% P. sP. 92 CCUG 58741; VIII Mulet 2016) P. entomophila. 91,9/91,7. P. putida G. nuevo taxon 08. JDS22PS031. P. putida. P. entomophila (99% with CCUG Mulet et al, 2016) entomophila 92 58741 P.. 92,1/91,6. P. putida G. nuevo taxon 08. JDS22PS036. P. putida. P. entomophila. P. entomophila. 91,9/91,7. P. putida G. nuevo taxon 08. P. putida. P. mosselii (99% with CCUG 91 58741 Mulet al, 2016) P.et entomophila. 91,4/91,2. P. putida G. nuevo taxon 08. P. putida. P. mosselii (97% with CCUG 90 58741 Mulet al, 2016) P.et entomophila. 90,7/90,7. P. putida G. nuevo taxon 08. P. putida. P. mosselii (99% with CCUG 92 58741 Mulet al, 2016) P.et entomophila. 91,7/91,6. P. putida G. nuevo taxon 08. P. putida. P. mosselli. 99,8. P. putida G. P. mosselii. JDS22PS001 JDS36PS003 JDS36PS046 JDS36PS073 JDS38PS018. P. soli. JDS28PS019 JDS28PS034 JDS28PS038 JDS10PS009 JDS36PS105 JDS28PS049 JDS22PS025 JDS22PS043 JDS22PS044 JDS22PS022 JDS22PS046 JDS28PS010 JDS10PS006 JDS36PS030 JDS28PS112 JDS28PS091 JDS63PS100 JDS28PS026 JDS22PS017 JDS22PS024 JDS36PS014 JDS22PS019 JDS22PS028 JDS36PS055 JDS28PS108 JDS28PS103 JDS38PS030 JDS28PS030 JDS36PS063 JDS02PS021 JDS10PS019. 92. JDS22PS023 JDS22PS029 JDS28PS006 JDS68PS020 JDS10PS030 JDS36PS072 JDS22PS039 JDS36PS047 JDS10PS003 JDS22PS045 JDS10PS013 JDS28PS025 JDS36PS109 JDS63PS014 JDS22PS026 JDS28PS015 JDS36PS002 JDS22PS014 JDS36PS083 JDS22PS030 JDS36PS034 JDS28PS054 JDS28PS029 JDS28PS037 JDS22PS033 JDS28PS036 JDS22PS041 JDS22PS042 JDS28PS022 JDS36PS062 JDS22PS003 JDS22PS020 JDS63PS093 JDS28PS007. 99. P. mosselii.

(46) JDS28PS044 JDS28PS110 JDS36PS035 JDS22PS032. P. putida. P. soli (97% with CCUG 64951 al.,soli 2016) 96Mulet et P.. 95,9. P. putida G. P. soli. JDS22PS037. P. putida. P. mosselli. 99. P. mosselii. 98,9. P. putida G. P. mosselii. P. putida. P. entomophila (93% SE6). 93. P. entomophila. 92,3/92,4. P. putida G. nuevo taxon 07. P. putida. P. entomophila L48T (and 94% et al., 2016) 93with SE6P.Mulet entomophila. 92,8/93,1. P. putida G. nuevo taxon 07. P. putida. P plecoglossicida (100% with91 W619). P. plecoglossicida. 89,7/100,0. P. putida G. nuevo taxon 16. P. putida. P. plecoglossicida (98% with W619) 91. P. plecoglossicida. 89,7/ 98,0. P. putida G. nuevo taxon 16. P. mendocina. Pp W619. P. plecoglossicida. 89,7/100,0. P. putida G. nuevo taxon 16. JDS28PS086. P. putida. P. plecoglossicida (99% with Pp 91 W619) P. plecoglossicida. 89,7/100,0. P. putida G. nuevo taxon 16. JDS28PS079. P. putida. P. plecoglossicida (99% with Pp 91 W619) P. plecoglossicida. 89,7/100,0. P. putida G. nuevo taxon 16. JDS28PS045 JDS28PS069 JDS22PS021 JDS36PS029 JDS22PS015 JDS22PS004 JDS22PS009 JDS22PS016 JDS22PS008 JDS22PS038 JDS36PS085 JDS22PS035 JDS28PS096 JDS22PS027 JDS22PS040 JDS28PS111 JDS36PS070 JDS28PS080 JDS28PS087 JDS38PS027 JDS02PS022 JDS28PS005 JDS08PS006 JDS28PS016 JDS68PS017 JDS28PS042 JDS36PS040. 100. JDS38PS004 JDS36PS081 JDS36PS088 JDS36PS082 JDS36PS026 JDS63PS099 JDS28PS074. JDS38PS039 JDS63PS062 JDS28PS040 JDS38PS007 JDS36PS043 JDS28PS043 JDS36PS011 JDS36PS056 JDS63PS040 JDS36PS041 JDS36PS005 JDS36PS059 JDS38PS024 JDS38PS033 JDS28PS061 JDS63PS027 JDS36PS042 JDS36PS013 JDS28PS116 JDS68PS021 JDS28PS001 JDS63PS028 JDS38PS031 JDS28PS070 JDS63PS053 JDS63PS017 JDS28PS109 JDS63PS024 JDS63PS004 JDS36PS012 JDS28PS039 JDS28PS041 JDS02PS023 JDS36PS100 JDS63PS041 JDS36PS103 JDS63PS038 JDS63PS085 JDS63PS066 JDS36PS099 JDS63PS016 JDS10PS023 JDS63PS054 JDS38PS019 JDS49PS002 JDS63PS050 JDS63PS094.

(47) JDS68PS029 JDS63PS068 JDS63PS026 JDS08PS007 JDS10PS028 JDS10PS007. P. putida. P. putida (100% with Pp S13.1.2) 96. P. putida. P. putida. Pp KT2440. 98. P. putida. Pp KT2440. P. putida. P. putida. 95,8. P. putida G. P. putida. P. monteilli. 94,7/98,8. P. putida G. nuevo taxon 13. 97. P. monteilli. 94,6/97,5. P. putida G. nuevo taxon 13. Pp KT2440. 97. P. monteilli. 94,4/97,7. P. putida G. nuevo taxon 13. Pp KT2440. 98. P. monteilli. 93,9/97,8. P. putida G. nuevo taxon 13. JDS63PS057 JDS68PS009 JDS28PS062 JDS67PS014 JDS36PS094 JDS38PS021 JDS36PS108 JDS36PS106 JDS59PS025 JDS59PS039 JDS59PS048 JDS63PS086 JDS59PS016 JDS63PS001 JDS63PS067 JDS63PS092 JDS63PS084 JDS63PS095 JDS68PS010 JDS63PS011 JDS36PS090 JDS63PS047 JDS63PS056 JDS63PS090 JDS63PS009 JDS36PS001 JDS28PS018 JDS28PS068 JDS38PS042 JDS28PS071 JDS59PS002 JDS59PS009 JDS28PS076 JDS63PS071 JDS63PS021 JDS63PS005 JDS68PS030 JDS63PS029 JDS63PS059 JDS63PS069 JDS63PS072 JDS67PS016 JDS63PS044 JDS63PS097 JDS63PS102 JDS67PS019 JDS63PS006 JDS68PS004 JDS67PS011 JDS67PS012 JDS67PS020 JDS68PS005 JDS67PS024 JDS68PS022 JDS67PS005 JDS63PS022 JDS63PS088 JDS68PS011 JDS10PS001 JDS59PS013 JDS68PS007 JDS28PS004 JDS28PS009 JDS10PS008 JDS10PS022 JDS36PS024 JDS36PS031 JDS68PS001 JDS10PS011 JDS68PS026 JDS28PS094 JDS10PS025 JDS28PS013 JDS28PS011 JDS38PS001 JDS28PS089 JDS59PS007 JDS28PS003 JDS36PS079 JDS28PS017 JDS38PS034 JDS38PS012.

(48) JDS68PS006 JDS28PS033 JDS67PS013 JDS28PS050 JDS59PS008 JDS28PS073 JDS36PS015 JDS36PS033 JDS36PS102 JDS59PS003 JDS59PS004 JDS59PS010 JDS36PS067. P. putida. Pp KT2440. 99. P. monteilli. 93,6/99,2. P. putida G. nuevo taxon 13. P. putida. P. monteilli. 99. P. monteilli. 98,6. P. putida G. P. monteilli. P. putida. P. monteilli. 99. P. monteilli. 98,6. P. putida G. P. monteilli. JDS36PS095 JDS38PS028 JDS59PS041 JDS36PS051 JDS36PS039 JDS36PS044 JDS36PS007 JDS36PS008 JDS59PS046 JDS59PS040 JDS59PS012 JDS63PS087 JDS59PS038 JDS59PS027 JDS38PS041 JDS63PS065 JDS63PS076 JDS59PS011 JDS38PS040 JDS38PS044 JDS38PS043 JDS59PS042 JDS10PS020 JDS36PS004 JDS28PS051 JDS28PS058 JDS28PS063 JDS28PS100 JDS38PS036 JDS59PS006 JDS28PS092 JDS36PS061 JDS36PS022 JDS63PS039 JDS36PS028 JDS36PS054 JDS36PS068 JDS28PS077 JDS63PS101 JDS38PS005 JDS36PS021 JDS59PS001 JDS63PS010 JDS36PS060 JDS57PS002 JDS63PS007 JDS59PS047 JDS68PS002 JDS36PS084 JDS38PS037 JDS28PS048 JDS28PS088 JDS36PS027 JDS36PS069 JDS28PS099 JDS36PS020 JDS36PS010 JDS36PS019 JDS36PS093 JDS38PS025 JDS59PS031 JDS59PS005 JDS59PS036 JDS38PS003 JDS36PS080 JDS38PS010 JDS36PS023 JDS28PS117 JDS59PS021 JDS36PS018 JDS28PS095 JDS36PS065 JDS36PS006 JDS36PS089 JDS67PS021.

(49) JDS38PS008 JDS36PS025 JDS36PS032 JDS10PS012. P. putida. P. monteilli. 93. P. monteilli/Pp BH. 92,9/97,1. P. putida G. nuevo taxon 14. JDS36PS064. P. putida. JDS36PS066. P. putida. Pp KT2440 (93% with SE22) 91. P. monteilli/V222. 90.2/91.0. P. putida G. nuevo taxon 15. Pp KT2440. P. monteilli. 93,9/99,2. P. putida G. nuevo taxon 13. P. fluorescens. P. protegens (and 99% with rDWA51a Sanchez) 95 P. protegens. 94,6. P. chlororaphis. nuevo taxon 01. P. fluorescens. P. protegens (and 99% with rDWA51a 95 Sanchez) P. protegens. 92,1. P. chlororaphis. nuevo taxon 01. P. fluorescens. P. protegens (and 99% with rDWA51a Sanchez) P. protegens 95. 94,5. P. chlororaphis. nuevo taxon 01. P. fluorescens. P. protegens. 99,2. P. chlororaphis. P. protegens. JDS28PS065 JDS28PS115 JDS28PS067 JDS28PS078 JDS36PS058 JDS36PS071 JDS36PS087 JDS36PS052 JDS36PS050 JDS63PS020 JDS63PS082 JDS63PS083 JDS63PS043 JDS63PS058 JDS68PS034 JDS36PS037 JDS10PS016 JDS36PS017. 98. JDS59PS030 JDS36PS053 JDS36PS086 JDS28PS002 JDS38PS009 JDS38PS023 JDS49PS001 JDS49PS013 JDS67PS022 JDS68PS012 JDS49PS003 JDS49PS008 JDS49PS012 JDS38PS026 JDS36PS049 JDS38PS011 JDS28PS021 JDS28PS031 JDS36PS098 JDS49PS005 JDS38PS015 JDS38PS016 JDS49PS006 JDS59PS043 JDS38PS029 JDS38PS045 JDS59PS028 JDS38PS035 JDS28PS072 JDS38PS006 JDS59PS022 JDS38PS014 JDS38PS038 JDS28PS090 JDS28PS035 JDS67PS003 JDS36PS009 JDS28PS059 JDS22PS034 JDS57PS001 JDS02PS006 JDS02PS010 JDS22PS011 JDS10PS033 JDS22PS012 JDS10PS031 JDS22PS007 JDS02PS024 JDS08PS001 JDS10PS021 JDS22PS018 JDS28PS014 JDS28PS020 JDS02PS016 JDS28PS028 JDS22PS005 JDS22PS006 JDS22PS010 JDS28PS027 JDS10PS015 JDS10PS017 JDS10PS018 JDS28PS060 JDS02PS007. 99. P. protegens.

(50) JDS08PS003 JDS02PS009 JDS02PS020. P. fluorescens. P. protegens (and 99% with rDWA51a 95 Sanchez) P. protegens. 94,5. P. chlororaphis. nuevo taxon 01. JDS08PS004. P. fluorescens. P. saponiphila. 97,8. P. chlororaphis. P. saponiphila. P. fluorescens. P. protegens (and 99% with rDWA51a Sanchez) P. protegens 95. 94,3. P. chlororaphis. nuevo taxon 01. P. fluorescens. P. protegens (and 99% with rDWA51a Sanchez) P. protegens 95. 94,7. P. chlororaphis. nuevo taxon 01. P. fluorescens. P. saponiphila. 97. P. saponiphila. 97,3. P. chlororaphis. P. saponiphila. P. fluorescens. P. kilonensis. 99. P. kilonensis. P. corrugata. nuevo taxon 03. JDS10PS002. P. fluorescens. P. protegens (and 99% with rDWA51a Sanchez) 95 P. protegens. P. chlororaphis. nuevo taxon 01. JDS59PS024. P. chlororaphis. P. fragi. P. fragi G*. P. fragi. JDS02PS012. P. fluorescens. P. moraviensis (98 % with SE23 96 ). P. moraviensis. 96,5. P. koreensis. P. moraviensis. JDS02PS013. P. fluorescens. P. moraviensis (97 % with SE18 96 ). P. moraviensis. 96,2. P. koreensis. P. moraviensis. JDS02PS015. P. fluorescens. P. moraviensis. 96. P. moraviensis. 96,2. P. koreensis. P. moraviensis. P. fluorescens. P. koreensis. 99. P. koreensis. 98,9. P. koreensis. P. koreensis. P. fluorescens. P. moraviensis (99 % with rDWA35 ) 97. P. moraviensis. 97,5. P. koreensis. P. moraviensis. P. fluorescens. P. moraviensis (98% WITH SE23 97 Mulet et 2016) P. al., moraviensis. 97,7. P. koreensis. P. moraviensis. P. fluorescens. P. japonica JCM 21532T (99% 84with FBF35 P. Farid) japonica/S12. 81,5/99,4. P. putida G. nuevo taxon 10. P. fluorescens. P. plecoglossida (W619 with 99%) 90. P. plecoglossicida. 89,6/100,0. P. putida G. nuevo taxon 16. P. fluorescens. P. plecoglossida. P. plecoglossicida. 89,6/ 99,8. P. putida G. nuevo taxon 16. P. chlororaphis. P. koreensis. 97,3. P. koreensis. P. moraviensis. 97. P. saponiphila. JDS02PS011 JDS28PS024 JDS28PS064 JDS28PS052 JDS67PS009 JDS28PS083 JDS28PS081 JDS63PS049 JDS36PS107 JDS28PS075 JDS36PS091 JDS28PS082 JDS28PS113 JDS28PS107 JDS36PS075 JDS10PS014 JDS36PS016 JDS36PS096 JDS67PS006. 92,5/92,8. JDS67PS025 JDS03PS010 JDS68PS023 JDS10PS029 JDS68PS032 JDS68PS033. 97. P. fragi. 94,3 96. JDS59PS020 JDS59PS029 JDS59PS034 JDS67PS002 JDS59PS035 JDS59PS033 JDS59PS019. JDS02PS018 JDS36PS038 JDS28PS066 JDS10PS004 JDS08PS002 JDS28PS055 JDS28PS097 JDS28PS098 JDS63PS045 JDS10PS024 JDS28PS012 JDS63PS060 JDS38PS022 JDS67PS004 JDS67PS008 JDS63PS081 JDS63PS077 JDS36PS097 JDS68PS015 JDS63PS075 JDS67PS018 JDS38PS020 JDS63PS002 JDS68PS013 JDS49PS004 JDS08PS005 JDS28PS023 JDS28PS085 JDS28PS105 JDS28PS008 JDS67PS001 JDS28PS057 JDS28PS084. 98. JDS63PS032 JDS63PS031 JDS63PS089 JDS28PS056 JDS63PS078 JDS63PS073 JDS63PS098 JDS36PS057 JDS63PS046 JDS63PS034 JDS63PS015 JDS63PS018 JDS36PS092 JDS36PS101. 100. P. moraviensis.