INSTITUTO POLITÉCNICO NACIONAL
CENTRO DE DESARROLLO DE PRODUCTOS BIÓTICOS
Departamento de Biotecnología
EXPRESIÓN TRANSITORIA DEL GEN uidA EN CÉLULAS DE Tagetes erecta
T E S I S
Que para obtener el grado de Maestría en Ciencias en Desarrollo de
Productos Bióticos
P R E S E N T A
Minerva García Chavarría
D I R E C T O R
Dra. Alma Angélica Del Villar Martínez
Yautepec, Morelos, México
El Presente trabajo se llevó a cabo en el Laboratorio de Biología Molecular del Departamento de Biotecnología del Centro de Desarrollo de Productos Bióticos (CeProBi) del Instituto Politécnico Nacional, Bajo la dirección del Dra. Alma A. Del Villar Martínez. Para la realización de los estudios se tuvo el apoyo económico de una beca CONACYT (No. de registro 188678 y del Programa de Institucional de Formación de Investigadores (PIFI). La investigación fue realizada con el financiamiento económico de los proyectos SPI y CONACyT (43862-Z).
DEDICATORIAS
A mis padres porque Gracias a su cariño y apoyo he llegado a realizar uno de los anhelos más importantes de mi vida, fruto del inmenso amor y confianza, con lo cual he logrado terminar una meta mas y darme la fortaleza en cada momento, siendo impulsores de inspiración con su dedicación y comprensión en la lucha por este camino
.
.
A mi hermana Arita por ser mi amiga incondicional y brindarme su plena confianza y por todo su apoyo y amor, que siempre me ha demostrado.
A mi hermana Maricarmen por estar presente en mi vida, y ser parte importante de ella y por todos los momentos de alegría, por estar siempre unidas y sobre todo por demostrarme su amor.
AGRADECIMIENTOS
Al comité tutorial y revisor: Dra. Alma A. Del Villar Martínez, Dr. Pablo E. Vanegas Espinoza, Dr. Antonio Jiménez Aparicio, Dra. Gabriela Trejo Tapia, Dra. Silvia Evangelista Lozano, Dra. Martha L. Arenas Ocampo, por sus apreciables comentarios y correcciones que permitieron enriquecer el trabajo.
A la Dra. Alma A. Del Villar Martínez, por su accesoria y dirección en la realización de este trabajo de tesis.
A la Dra. Gabriela Trejo Tapia y al Dr. Pablo Emilio Vanegas Espinoza, por su apoyo desinteresado, sus consejos tan afortunados y sugerencias, con cariño y admiración.
Al Dr. Arturo Bello Pérez y a la Dra. Kalina Bermúdez por sus observaciones durante la realización de la tesis.
A la familia Muñoz Luna por su confianza, en especial a Nora; por creer en mi a pesar de los obstáculos de la vida, por todas las veces que me vi vencida y ellos estaban ahí. Gracias por todo.
A mi amiga Denisse por que fue parte importante del apoyo brindado en todo momento, por su amistad y sobre todo por todas las chocoaventuras que pasamos juntas.
A mis compañeros de generación de la maestría: Den, Assael, Lore, Ariana, Juan, Gabriel y Rubí, por los momentos compartidos buenos y malos durante la maestría.
A mis compañeros y amigos de maestría: Pame, Paul, Alivaján, Karolita, Dante, Dennise Ubaldo, Lety, Eneida, Vero Ramos, Vero Pérez, Juan Carlos, María Luisa, Rita, Margarito, Arnold, Mario, Juan Torruco, por todos los momentos compartidos.
CONTENIDO
ÍNDICE DE TABLAS iv
ÍNDICE DE FIGURAS v
ABREVIATURAS vii
RESUMEN 1
ABSTRACT 2
I. INTRODUCCIÓN 3
II. ANTECEDENTES 4
2.1 Pigmentos naturales 4
2.1.1 Clorofilas 5
2.1.2 Pigmentos fenólicos 5
2.1.3 Betalaínas 7
2.2 Carotenoides 7
2.2.1. Ruta de biosíntesis 9
2.2.2 Distribución de los carotenoides en la naturaleza 11 2.2.3 Importancia económica de los carotenoides 13 2.2.4 Función y usos de los carotenoides 13
2.3 Cultivo de tejidos vegetales 14
2.3.1 Principios básicos del cultivo de tejidos vegetales 15 2.3.2 Tipos de cultivos de tejidos vegetales 15 2.3.3 Reguladores de crecimiento vegetal 16
2.4.Transformación genética 18
2.4.1 Mecanismos para la transferencia de genes 18
2.4.1.1 Agrobacterium tumefaciens 18
2.4.1.2 Biobalística 20
2.5 Métodos de selección de transformantes 20
2.6 Marcadores de selección 21
2.7 Expresión transitoria 21
2.8 Modelo de estudio: Tagetes erecta L. (cempaxúchil) 23 2.8.1 Generalidades y distribución del cultivo 23
2.8.2 Descripción de la planta 23
ii
2.8.3 Importancia económica 24
2.8.4 Usos y aplicaciones 26
III. JUSTIFICACIÓN 27
IV. OBJETIVOS 28
4.1 Objetivo general 28
4.2 Objetivos particulares 28
V. MATERIALES Y MÉTODOS 29
5.1 Material vegetal 29
5.2 Vector 29
5.3 Establecimiento del cultivo in vitro 29
5.3.1 Inducción de callo 31
5.4 Cinética de crecimiento 33
5.5 Determinación de la sensibilidad del tejido a kanamicina 35
5.6 Ensayos por biobalística 38
5.6.1 Preparación de las muestras para el bombardeo 39 5.6.2 Uso del equipo de biobalística 39 5.7 Análisis histoquímico de β- glucuronidasa (GUS) 42
VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN 43
6.1 Establecimiento del cultivo in vitro de Tagetes erecta L. 43
6.2 Cinética de crecimiento 46
6.3 Determinación de la sensibilidad del callo a kanamicina 53
6.4 Ensayos de biobalística 60
6.4.1 Análisis histoquímico de β- glucuronidasa (GUS) 60
VII. APORTACIONES 64
VIII. CONCLUSIONES 65
IX. PERSPECTIVAS 66
BIBLIOGRAFÍA 67
iii
ÍNDICE DE TABLAS
Tabla 1. Combinación de las diferentes concentraciones de los reguladores
2,4-D y BA 34
Tabla 2. Distancias y presiones evaluadas en las pruebas de biobalística 41
Tabla 3. Efecto de las concentraciones de 2,4-D y BA en la inducción de 47 callos de cempaxúchil
Tabla 4. Sensibilidad de células desdiferenciadas de cempaxúchil en medio MS adicionado con las diferentes concentraciones de kanamicina 56
iv
ÍNDICE DE FIGURAS
Figura 1. Estructura general de los pigmentos naturales; clorofila, betalaínas,
Flavonoides 6
Figura 2. Ejemplos de estructuras de diferentes carotenoides 8 Figura 3. Ruta de biosíntesis de carotenoides en plantas 10
Figura 4. Micrografías de las estructuras que acumulan carotenoides en callo
y lígulas de cempaxúchil 12
Figura 5. Respuestas generadas en el cultivo in vitro por la combinación
de auxinas y citocininas 17
Figura 6. Reacción del reactivo X-GLUC 22
Figura 7. Tipos de inflorescencias en Tagetes erecta 25
Figura 8. Representación del plásmido pBI426 30
Figura 9. Proceso de selección y siembra de explantes de cempaxúchil 32
Figura 10. Esquema que ilustra el área proyectada de callo 37
Figura 11. Equipo de bombardeo de alta presión 40
Figura 12. Inducción de callo de cempaxúchil con diferentes tratamientos
de reguladores de crecimiento 44
Figura 13. Inducción de callo de cempaxúchil en los diferentes tratamientos
de reguladores de crecimiento 45
v
Figura 14. Callo producido a partir de explantes de hojas de cempaxúchil 48
Figura 15. Apariencia de los callos de Tagetes erecta en los días 0, 5, 7, 9,
11, 13, 15 y 18 durante el crecimiento celular 49
Figura 16. Cinética de crecimiento en base al peso fresco (PF) de células 51 desdiferenciadas de Tagetes erecta
Figura 17. Cinética de crecimiento en base al peso seco (PS) de células
desdiferenciadas de Tagetes erecta 52
Figura 18. Callo de cempaxúchil en medio MS adicionado con kanamicina 54
Figura 19. Imágenes del área proyectada del callo de cempaxúchil 57
Figura 20. Índice de crecimiento del callo de cempaxúchil por efecto del
antibiótico 59
Figura 21. Apariencia del callo bombardeado con el plásmido pBI426 61
Figura 22. Expresión transitoria de la β-glucuronidasa en callo de cempaxúchil bombardeado con el plásmido pBI426 62
vi
ABREVIATURAS
2,4-D Ácido 2,4-diclorofenoxiacético
DNA Ácido desoxirribonucleico
d-1 Por día
BA Benciladenina
bmp Mapa de bits
CaMV Virus del mosaico de la coliflor
GGPP Geranilgeranil pirofosfato
PSY Fitoeno sintasa
ZDS ζ-caroteno desaturasa
LCYb β− licopeno ciclasa
LCYe ε−licopeno ciclasa
CHYb β- caroteno hidroxilasa
uidA Gen que codifica β-glucuronidasa
GUS β-glucuronidasa
cm Centímetro
CTV Cultivo de tejidos vegetales
ºC Grado centígrado
g Gramo H Horas kPa Kilopascales L Litros
NaOH Hidróxido de sodio
NOS Nopalina sintetasa
µg Microgramos mg Miligramos ml Mililitros mM Milimolar
MS Medio de cultivo Murashige y Skoog
µL Microlitro
vii
vii
m.s.n.m Metros sobre el nivel del mar
PF Peso fresco
PS Peso seco
RCV Reguladores de crecimiento vegetal
rpm Revoluciones por minuto
tdc Tiempo de duplicación celular
µ Velocidad específica de crecimiento
v/v Volumen/volumen
viii
RESUMEN
El cempaxúchil (Tagetes erecta L.) es una planta originaria de México. Su principal característica es la presencia de carotenoides en sus flores. Los carotenoides se han utilizado como aditivo en alimentos de aves de corral para potenciar la pigmentación de su piel y la yema de huevo. El interés por los carotenoides se ha incrementado debido a que son precursores de la vitamina A y se consideran compuestos antioxidantes. La importancia de estos compuestos ha motivado la realización de estudios, sobre la expresión de genes carotenogénicos. En este trabajo se logró el establecimiento de cultivos celulares de cempaxúchil a partir de explantes de hojas cultivadas en invernadero. Los explantes se incubaron en medio MS adicionado con diferentes combinaciones de ácido 2,4- diclorofenoxiacético (2,4-D: 1.0, 2.0 y 3.0 mg/L) y benciladenina (BA: 0.5, 1.0 y 1.5 mg/L) y se observó que la combinación de 2.0 mg/L de ambos reguladores promueve la desdiferenciación celular. Adicionalmente se realizó una cinética de crecimiento de los callos y se determinó el peso fresco y el peso seco. Se estableció que los callos alcanzan la fase exponencial al quinto día con un tiempo de duplicación de 4.8 d-1. Para establecer un sistema de transformación se requiere conocer la sensibilidad del tejido a un antibiótico que será utilizado como marcador de selección; para lo cual se analizó la sensibilidad del callo a diferentes concentraciones de kanamicina. Se determinó que la concentración adecuada a utilizar en la selección de callo es de 100 mg/L. Se observó, mediante la reacción del reactivo de GUS, que la expresión transitoria del gen que codifica para la β- glucuronidasa (uidA), fue mayor al bombardear los explantes a una distancia de 11 cm y una presión de 6201.0 kPa. Este trabajo sienta las bases para establecer las condiciones para la transformación estable del tejido analizado.
1
ABSTRACT
Marigold (Tagetes erecta L.) is native of Mexico the high carotenoid accumulation in its flowers is the main characteristic of this plant. Carotenoids have been used as additive in poultry feed in order to increase sking and egg yolk pigmentation.
Many carotenoid have antioxidant effect and some are vitamine A precursors, for these reasons it have had an increasing interest in them. Because of that, carotenogenic genes expression studies is a growing field of research. In this study marigold callus culture from leaf explants obtained from greenhouse developed plants was established. Explants were incubated in MS media supplemented with the combination of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (1.0, 2.0 and 3.0 mg/L) and benzyladenine (0.5, 1.0 and 1.5 mg/L). Undifferentiated cells were observed in explants developed in 2.0 mg/L of both regulators media. In addition, callus growth kinetics was performed in base of fresh and dry weight. Exponential phase was observed at fifth day with a duplication time of 4.8 days. For the establishment of a transformation system is necessary to know the tissue sensibility to an antibiotic that would be used as selection marker. After calli incubation in increasing kanamycin concentration added media, 100 mg/L was the best concentration to select possible transformants. Best transient uidA gene expression was observed in callus bombarded at 11 cm of distance with a pressure of 6201.0 kPa. This study sets the basic conditions for the stable genetic transformation of marigold calli for the possible carotenoid content modification.
2
I. INTRODUCCIÓN
El cempaxúchil (Tagetes erecta L.) es una planta vascular perteneciente a la familia Asteraceae; los colores de sus flores van desde el amarillo hasta el anaranjado. El cempaxúchil es originario de México y se distribuye desde el suroeste de los Estados Unidos hasta el sur de Argentina. En México el cempaxúchil es utilizado tradicionalmente en ceremonias religiosas y como ornamental; también se ha utilizado en la medicina tradicional como antiparasítico, antiespasmódico y en el tratamiento de enfermedades del estómago, el bazo y el hígado. Los pigmentos de sus flores han sido utilizados como aditivo en el alimento de aves de corral y peces para potenciar la pigmentación de su piel.
Debido al contenido de carotenoides, el cempaxúchil representa un modelo de estudio importante de la ruta de biosíntesis de estos compuestos. Los carotenoides son pigmentos liposolubles que se encuentran aportando coloración roja, anaranjada y amarilla, a flores y frutos en diferentes etapas de desarrollo de las plantas. El estudio de la expresión de genes carotenogénicos en diversos sistemas, ha aportado las herramientas y el conocimiento necesario para proponer el mejoramiento genético a través de la transformación genética; con la finalidad de mejorar la calidad y la cantidad de los pigmentos en los sistemas donde se acumulan. La biobalística es una técnica que ha demostrado ser un mecanismo eficiente para la introducción de genes a las células mediante el uso de microproyectiles acelerados a una alta velocidad, para atravesar la pared y membrana celular. Las partículas aceleradas a una velocidad determinada, tienen la función de acarrear el material genético que se va a introducir en el genoma del material a transformar. El presente trabajo plantea como objetivo establecer las condiciones de bombardeo para lograr la expresión transitoria del gen uidA en el callo de cempaxúchil. El conocimiento derivado de este trabajo será aplicado al sistema para llevar a cabo la transformación genética estable.
3
II. ANTECEDENTES
2. 1 Pigmentos naturales
Los pigmentos son compuestos químicos que absorben energía luminosa en la región visible, además de ser parte esencial en el metabolismo de las plantas y son importantes para el hombre debido a que le aportan nutrientes (Hari y col., 1994). La principal función de los pigmentos vegetales es la atracción de animales que actúan como vectores en la distribución de semillas. En el mismo sentido, en la industria alimentaria, se utilizan para hacer a los alimentos más atractivos a través del color (Mínguez –Mosquera y col., 2004).
Según la FDA (Administración de Alimentos y Fármacos de los Estados Unidos) un pigmento es cualquier material que imparte color el cual puede ser obtenido por síntesis, extraído o derivado, a partir de un vegetal, animal, mineral u otra fuente y que cuando es añadido a alimentos, medicamentos o cosméticos, es capaz de dar color por sí mismo (Vaca y Santana, 1999).
Los pigmentos se dividen en sintéticos y naturales. Los principales pigmentos sintéticos son: Azoicos: producen casi todos los colores, se caracterizan por tener un grupo cromóforo –N=N-; de éstos, los de mayor demanda son los amarillos 5 y 6, los rojos 2, 4 y 40 y el naranja B. Entre los pigmentos naturales se encuentran las antraquinonas: cuya estructura contiene uno o más grupos carboxilo en un sistema de anillos conjugados, con al menos tres anillos condensados (Thorngate, 2002).
Los pigmentos son generados por microorganismos, vegetales y animales. Es importante mencionar que el mercado mundial de pigmentos crece alrededor de 4% al año y representa cerca de 940 millones de dólares al año en ventas, debido a la preocupación del consumidor por adquirir productos que no alteren su salud
4
(Britton, 1999). Los pigmentos difieren ampliamente en su estructura química y su origen, los más utilizados en los alimentos pueden agruparse en las siguientes categorías: (Figura 1), clorofilas, pigmentos fenólicos (flavonoides, antocianinas y taninos), betalaínas, y carotenoides (Badui, 2006).
2.1.1 Clorofilas
Se encuentran en todas las plantas que realizan fotosíntesis, la clorofila es el principal agente capaz de reabsorber la energía lumínica y transformarla en energía química para la síntesis de los compuestos orgánicos que necesita la planta. Las hojas de la mayoría de las plantas tienen un color verde debido a la clorofila, aunque ésta va desapareciendo al acercarse a la senescencia, para dar paso a otros pigmentos. Este mismo proceso ocurre en frutos inmaduros que de color verde se tornan amarillos y rojos; el cambio es debido a la pérdida de la clorofila y la síntesis de otras sustancias en la etapa de maduración (Badui, 2006).
2.1.2 Pigmentos fenólicos
Los pigmentos fenólicos son sustancias con uno o más anillos aromáticos y por lo menos un sustituyente hidroxilo. Existen dos grandes grupos: los ácidos fenólicos (benzoico y cinámicos) y los flavonoides (antocianinas y taninos), (Figura 1). Hay 13 subclases de flavonoides, lo que da un total de más de 5000 compuestos que proporcionan colores amarillos y naranjados a frutos como peras, fresas, manzanas, cerezas, duraznos, limones (Stewart, 1980) así como a hortalizas y otros alimentos. Otros flavonoides proporcionan el color rojizo de las hojas de otoño (Stintzing y col., 2002).
5
Clorofila a Clorofila b
Betalaínas Betacianinas y betaxantinas
Ácidos fenólicos Flavonoides
Figura 1. Estructura general de los pigmentos naturales; clorofila, betalaínas, flavonoides (Carretero, 2000; Grotewold, 2006).
6
2.1.3 Betalaínas
Son pigmentos hidrosolubles, con glucósidos en su estructuras, se dividen en dos grandes clases: los rojos o betaciacinas, y los amarillos o betaxantinas (Francis, 1999). Estos pigmentos se encuentran en algunas familias como: Amaranthaceae, Cactaceae, Didiereaceae, Nyctaginaceae y Portulaceae. Las betalaínas son uno de los pigmentos autorizados como aditivos por la FDA que no necesitan certificación, algunas de ellas se comercializan como polvo, que incluye el pigmento y estabilizantes como azúcares, proteínas y antioxidantes. Existen restricciones de tipo legal en el uso de colorantes rojos sintéticos, por lo que se ha sugerido emplear las betalaínas en diversos alimentos como gelatinas, bebidas y postres en general (Franco, 2004).
2.2 Carotenoides
Los carotenoides están constituidos por una estructura básica poliénica de hasta 40 átomos de carbono, formada por ocho unidades de isopreno, unidas de tal forma que el arreglo de isoprenoides es reversible desde el centro de la molécula.
Debido a que un isopreno es una estructura repetitiva, se produce un gran número de isómeros geométricos de configuraciones cis y trans, la gran mayoría de los carotenoides en la naturaleza son compuestos trans (Chandler y Schwartz, 1987). Los carotenoides existen, formando complejos con proteínas, unidos a carbohidratos o como ésteres de ácidos grasos, la asociación con proteínas los hace más estables e incluso les cambia el color que tienen de manera individual (Armenta y col., 2002). Químicamente los carotenoides se dividen en dos grupos (Figura 2): los carotenos, que son hidrocarburos y las xantófilas, sus derivados oxigenados (Badui, 1999).
7
B A
Figura 2. Ejemplos de estructuras de diferentes carotenoides; A) Carotenos; B) Xantófilas (Rodríguez-Amaya, 1999).
8
2.2.1 Ruta de biosíntesis
La ruta de biosíntesis de isoprenoides en plantas se realiza mediante dos vías, la clásica del mevalonato, que ocurre en el citoplasma para la síntesis de esteroles y sesquiterpenos y la vía no mevalónica para la producción de carotenoides que se sintetizan en plastidios. Esta vía forma una unidad de cinco átomos de carbono denominada isopentil pirofosfato IPP, que es el precursor de los isoprenoides (Lichtenthaler, 1999).
En la vía no mevalónica, el gliceraldehído 3-fosfato y el piruvato actúan como precursores del IPP, condensándose por acción de una transcetolasa d-1- desoxixilulosa, para formar IPP (Mc Caskill y Croteau, 1998). Posteriormente, se lleva a cabo la condensación del dimetilalil pirofosfato con el IPP para formar geranil pirofosfato GPP el cual se condensa con otra molécula de IPP para generar farnesil pirofosfato FPP y la adición de una tercera molécula de IPP da origen al geranilgeranil pirofosfato GGPP, la condensación de todas estas moléculas son catalizadas por un grupo de enzimas llamadas preniltransferasas (Chappell, 1995).
La biosíntesis de los carotenoides (Figura 3), ocurre a partir de la condensación de dos moléculas de GGPP por acción de la enzima fitoeno sintasa (PSY). La reacción enzimática da lugar a la formación del fitoeno; el fitoeno es un producto incoloro, que consta de 40 átomos de carbono. Las etapas posteriores conducen a la síntesis de los carotenoides con color, se presentan cuatro desaturaciones del fitoeno, por acción de la enzima fitoeno desaturasa (PDS) la cual cataliza las dos primeras desaturaciones de fitoeno y fitoflueno a ζ-caroteno, mientras que la conversión de ζ-caroteno a neurosporeno y posteriormente a licopeno es realizada por la acción de la enzima ζ-caroteno desaturasa (ZDS).
9
IP P D M A P P
G P P
IP I
P T P T
Figura 3. Ruta de biosíntesis de carotenoides en plantas (Del Villar-Martínez y col., 2007).
LICOPENO R
R R R
R R
δ-CAROTENO γ-CAROTENO
β-CAROTENO ε-CAROTENO
α-CAROTENO LCY-E
LCY-B
LCY-E LCY-B
LCY-B LCY-E
F P P G G P P
P P P P
F IT O E N O
F IT O F L U E N O
ζ-C A R O T E N O
N E U R O S P O R E N O
L IC O P E N O
F itoen o sin ta sa
F itoen o d esa tur a sa
F itoen o d esa tur a sa
ζ-caroten o desaturasa
ζ-caroten o desaturasa IP P
IP P D M A P P
G P P
IP I
P T P T
F P P G G P P
P P P P
F IT O E N O
F IT O F L U E N O
ζ-C A R O T E N O
N E U R O S P O R E N O
L IC O P E N O
F itoen o sin ta sa
F itoen o d esa tur a sa
F itoen o d esa tur a sa
ζ-caroten o desaturasa
ζ-caroten o desaturasa IP P
10
La ciclación de licopeno en ambas partes terminales de la cadena da como resultado la formación de ε-caroteno, α-caroteno y β-caroteno, estas reacciones son catalizadas por las enzimas β- y ε-licopeno ciclasa. El siguiente paso en la ruta es la adición de grupos hidroxilos a los anillos de la cadena, para formar xantófilas, que dan origen a la luteína en la serie de los carotenoides α y zeaxantina en la serie de los carotenoides β (Van den Berg y col., 2000 y Sandmann, 2001).
2.2.2 Distribución de carotenoides en la naturaleza.
Los carotenoides son un grupo de pigmentos que están ampliamente distribuidos en diferentes organismos, tales como bacterias, hongos, algas, plantas y animales, éstos últimos no los sintetizan de manera que los adquieren a través de la dieta. Sus colores varían desde rojos, amarillos hasta anaranjados. Se han identificado en la naturaleza más de 600 carotenoides; algunos de ellos son esenciales para que las plantas realicen la fotosíntesis (Badui, 2006).
En los plástidios se localizan y sintetizan los carotenoides en plantas, los cuales tienen diferentes formas, tamaños y funciones. El número de plástidios en los diferentes órganos pueden variar con las diferentes etapas de desarrollo de las células (Bonora y col., 2000). Estas estructuras se han identificado en células desdiferenciadas de cempaxúchil y en las lígulas de sus flores (figura 4), mediante microscopia electrónica de barrido, se han descrito las estructuras denominadas liposomas; dichas estructuras se han definido como el sitio de acumulación de los carotenoides en el interior de los plátidios (Del Villar-Martínez y col., 2005; Ramos – Viveros, 2007).
11
A
B C
Vesículas
lípidicas Cloroplasto
Cromoplasto
Vesícula lípidica
Cromoplasto
Vacuola
Figura 4. Micrografías de las estructuras que acumulan carotenoides en callo y lígulas de cempaxúchil A); B) y C) Presencia de vesículas lípidicas de diferentes dimensiones (Ramos- Viveros, 2007).
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Los carotenoides se encuentran en frutos, tejidos verdes, en algunos animales como crustáceos, camarón, langosta y cangrejo, estos organismos obtienen los carotenoides por la dieta que ingieren, así como microalgas (Haematococcus pluvials), levaduras (Phaffia rhodozyma) y bacterias (Corynebacetrium poinsettiae) (Arad y Yaron 1992; Wrolstand, 2000). En la naturaleza se producen alrededor de 108 tons/año de carotenoides y la mayoría se encuentra en algas marinas (fucoxantina) y en hojas verdes (luteína, violaxantina y neoxantina) (Delgado- Vargas y Paredes-López, 2003). La mayor parte de los carotenoides utilizados provienen del océano producidos por algas (Mejía y col., 1988; López-Hernández y col., 2001)
2.2.3 Importancia económica de los carotenoides
Los carotenoides son importantes en la industria de los alimentos, farmacéutica y cosmetológica. En el área de la biotecnología existe interés en las propiedades nutricionales y anticancerígenas de los carotenoides. En el año de 1996 la demanda fue de 240 millones de dólares la cual fue incrementando, para el año 2002 ésta fue de 1000 millones de dólares, esto ha dado la pauta para el desarrollo de la investigación relacionada con la producción de estos pigmentos (Delgado-Vargas y Paredes-López, 2003)
2.2.4 Función y usos de los carotenoides
En muchos organismos y específicamente en plantas, la coloración que imparten los carotenoides al igual que otros compuestos tiene una implicación ecológica, les permiten atraer insectos polinizadores y animales dispersores de semillas (Krinsky, 1994; Armstrong y Hearst, 1996; Eskling y col.,1997). Los carotenoides se han utilizado contra agentes generadores de radicales libres en el humano, estos compuestos son introducidos al organismo a través de los alimentos y transportados a la sangre (Argawl y Rao, 1998). Los carotenoides con un anillo β-
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ionona presentan actividad biológica de provitamina A; su potencial anticancerígeno aun es objeto de investigaciones, y se han utilizado en la prevención de enfermedades cardiacas (Simpson, 1983). Estudios epidemiológicos demuestran una relación directa entre la ingesta de xantófilas (luteína y zeaxantina) y la reducción en el riesgo de padecer ciertos tipos de cáncer, especialmente el pulmonar (Van den Berg y col., 2000).
Dentro de la industria alimentaria los carotenoides o productos ricos en estos compuestos han sido utilizados como colorantes desde tiempos ancestrales, en la actualidad, entre los carotenoides de uso comercial están principalmente β caroteno, licopeno, luteína y zeaxantina; existen en las formas de extractos, concentrados o harinas de plantas con altos contenidos de carotenoides; algunas de sus fuentes son: achiote (Bixa orellana), chile (Capsicum annuum), tomate (Lycopersicon esculentum) y cempaxúchil (Tagetes erecta L.) (Francis, 1999;
Delgado-Vargas y Paredes-López, 2003). Los carotenoides se utilizan en productos alimenticios como jugos, refrescos, sopas, gelatinas, postres, pastas, productos de repostería y panadería, margarinas, mantecas vegetales, mantequilla, quesos y productos lácteos, también es utilizado como aditivo en alimento de aves de corral para pigmentar su piel y la yema de huevos. Además del uso que se le da para pigmentar peces y potenciar el color de su piel (Hinostroza y col., 1997).
2.3 Cultivo de tejidos vegetales
El cultivo de tejidos vegetales CTV, se define como el conjunto de técnicas que permite el establecimiento, mantenimiento y desarrollo de cualquier parte de la planta, desde una célula hasta un organismo completo, bajo condiciones artificiales, axénicas y controladas. El cultivo de tejidos vegetales se utiliza para resolver problemas aplicados a la biología vegetal, ofrece diferentes modelos ideales para la investigación fisiológica, bioquímica, genética y estructural, así
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como la aplicación práctica en la clonación, conservación y manipulación in vitro de cualquier material vegetal (Pérez-Molphe y col., 1999).
2.3.1 Principios básicos del cultivo de tejidos vegetales
El CTV se basa principalmente: en la elección del explante, la elección del medio, las condiciones del cultivo y las condiciones asépticas. Se llama explante al órgano, tejido o segmento de tejido vegetal que se va a utilizar para iniciar el cultivo. Éste puede ser una semilla, embrión, un segmento de hoja, tallo, raíz u órganos reproductores. Pero se debe tomar en cuenta que el tipo de explante que se elija será determinante para la obtención de la respuesta deseada, ya que cada uno de ellos, responderá de manera particular. Para la respuesta exitosa del cultivo es necesaria la elección del medio y las condiciones adecuadas. Además de la formulación del medio, es importante considerar las condiciones físicas como: luz, fotoperíodo, temperatura y humedad, ya que éstas participan en la respuesta favorable del explante; así como las condiciones asépticas. Para que el cultivo de cualquier tejido vegetal prospere de manera deseada debe excluirse cualquier tipo de organismo contaminante; por lo que, el material vegetal debe desinfestarse y el medio de cultivo esterilizarse previamente para evitar cualquier tipo de contaminación (Pérez-Molphe y col., 1999).
2.3.2 Tipos de cultivos de tejidos vegetales
Existen diferentes tipos de cultivo in vitro, estos son:
1.- Cultivo de plantas completas: en el cual se trabaja con individuos completos, aunque cultivados en condiciones artificiales.
2.- Cultivo de órganos: se cultivan in vitro órganos aislados, se pueden distinguir diferentes tipos de cultivo de órganos como el cultivo de raíces, meristemos, ápices y cultivo de anteras.
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3.- Cultivo de segmentos de órganos: este tipo de tejido tiene importantes aplicaciones en estudios de tipo fisiológico, bioquímico, genético, producción de compuestos secundarios y para la generación de variación genética en los cultivos.
4.- Cultivo de células: consiste en el crecimiento de células individuales, obtenidas de un tejido, callo o cultivo en suspensión.
5.- Cocultivo: es el cultivo en el cual crece juntos el tejido vegetal y un microorganismo (Mateo-Sagasta, 1990; Pérez-Molphe y col., 1999).
2.3.3 Reguladores de crecimiento vegetal
El papel principal en la integración de los fenómenos del desarrollo de las plantas lo desempeñan las hormonas de crecimiento o mejor conocidos como los reguladores de crecimiento vegetal; por lo tanto, es importante conocer sus mecanismos de acción. Los reguladores de crecimiento vegetal están agrupadas en siete clases: auxinas, giberelinas, citocininas, brasinoesteroides, etileno, ácido abscísico y jasmonatos. Generalmente cada uno de los reguladores influye en fenómenos del desarrollo, mientras que los efectos biológicos que observamos por lo general resultan de la acción conjunta de diferentes reguladores de crecimiento (Davies, 1995 y Barba-Álvarez, 2001).
Los reguladores de crecimiento vegetal más utilizados en los cultivos in vitro son los que pertenecen a los grupos de las auxinas y de las citocininas, ya que son los que regulan los procesos de crecimiento y desarrollo en los cultivos de tejidos vegetales. El balance entre las auxinas y citocininas en el cultivo in vitro es de importancia para la respuesta en el desarrollo del tejido (Figura 5). En conjunto las auxinas y citocinas permiten la inducción y el establecimiento de los cultivos de células vegetales y determinan sus características de los cultivos in vitro. Las auxinas son compuestos derivados del triptófano, sintetizado en células de ápices
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Concentración de Concentración de AUXINAS CITOCININAS
RESPUESTA
ALTA NULA Producción de raíces
Embriogénesis Tejido calloso Brotes adventicios Proliferación de yemas
NULA ALTA
Figura 5. Respuestas generadas en el cultivo in vitro por la combinación de auxinas y citocininas (Pérez- Molphe y col., 1999).
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que están implicadas en eventos relacionados con el crecimiento y diferenciación celular, participan en procesos como el crecimiento celular, la acidificación de la pared celular, el inicio de la división celular, la formación de tejidos no diferenciados, la diferenciación del tejido vascular y la formación de órganos. Las citocininas: Son compuestos derivados de la adenina y son sintetizados en tejidos jóvenes y raíces. Posen dos características importantes para el cultivo de tejidos, estimulan la división celular y rompen la latencia de las yemas axilares haciéndolas brotar (Pérez-Molphe y col., 1999).
2.4. Transformación genética
El avance de la biotecnología ha encontrado alternativas para el mejoramiento de cultivos a través de la manipulación directa de genes de interés comercial sin afectar otras características. La transferencia de DNA específico a células vegetales ha sido importante en la investigación, mediante esfuerzos encaminados a la producción de materiales transgénicos con características particulares; por ejemplo, la obtención de plantas con resistencia a virus, hongos y bacterias, así como tolerancia a herbicidas (Christou, 1996; Vergunst y Hooykaas, 1999).
2.4.1 Mecanismos para la transferencia de genes
Mediante el uso de técnicas de biología molecular es posible la transferencia de información genética entre células. Los métodos más comunes para llevar a cabo la manipulación genética en plantas son:
2.4.1.1 Agrobacterium tumefaciens
Es una bacteria fitopatógena que causa la enfermedad conocida como agalla de la corona, ésta ataca naturalmente a un gran número de especies dicotiledóneas. La
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enfermedad se caracteriza por producir una tumoración o crecimiento celular descontrolado de la zona basal de los tallos.
El mecanismo de acción de Agrobacterium para la transferencia de la información genética de la bacteria hacia la planta es mediante dos elementos importantes, el plásmido llamado Ti, inductor de tumor y el T-DNA que es la parte de DNA en la cual se transfiere el material genético a la planta. Este DNA codifica para varias enzimas involucradas en la síntesis de reguladores de crecimiento como auxinas y citocininas. Los reguladores de crecimiento generados por la introducción de dichos genes son los causantes del crecimiento desmedido de los tumores. El T- DNA está limitado por secuencias bien caracterizadas llamadas secuencias borde, las cuales son esenciales para que se realice la transferencia de la información genética. Los genes codificados en el T-DNA no son indispensables ya que la transferencia del DNA ocurre aún cuando estos genes hayan sido cambiados, esta característica permite usar cepas de Agrobacterium modificadas con algún gen de interés. Para que la transferencia ocurra se requiere la participación de los productos de la región vir o de virulencia, también codificada dentro del plásmido, dentro de esta región se encuentran los genes vir A, vir B, vir C, virD, vir E, vir G y vir H (Hooykaas y Schilperoort, 1992; Vergunst y Hooykaas, 1999). Los sistemas para la transformación genética mediada por Agrobacterium tienen algunas desventajas, como la baja eficiencia en plantas monocotiledóneas y alto porcentaje de combinación de dos individuos de la misma especie o de distintas especies (quimeras) (Peña y col., 1995; Cevera y col.,1998) a pesar de estas desventajas el proceso que emplea Agrobacterium se utiliza principalmente en especies dicotiledóneas por su facilidad y alto porcentaje de transformación (Blanco y col., 2003).
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2.4.1.2 Biobalística
La biobalística es una técnica que se utiliza para el mejoramiento genético a través de manipulación directa de genes de interés comercial (Vanegas-Espinoza, 2003).
Esta metodología fue ideada y refinada por John Sanford, Theodore Klein, Edward Wolf y Nelson Allen en la Universidad de Cornell en la década de los 80.
Mediante este método, el DNA de interés es introducido en las células por medio de partículas microscópicas aceleradas a velocidades altas, que atraviesan la pared y la membrana celular, por medio de microproyectiles de tungsteno u oro, a las que se adhiere el DNA que se desea transferir a las células vegetales (Christou, 1996). Las desventajas de este método son principalmente el daño que pueden causar las partículas al tejido bombardeado, las distribución de las partículas que pueden provocar la muerte del tejido (Vanegas-Espinoza, 2003), aunque básicamente cualquier tipo de tejido es susceptible de ser utilizado como blanco para la transformación genética por este método; con esta técnica se ha logrado solucionar algunos problemas que presentan otros métodos de transformación (Birch, 1997).
2.5 Métodos de selección de transformantes
Todos los sistemas de transformación desarrollados hasta el momento requieren seleccionar aquellas plantas que contengan el transgén. El sistema más sencillo es incorporar al transgén otro gen que confiera resistencia a un antibiótico o a un herbicida, de forma que, al realizar el cultivo in vitro en presencia del agente de selección (antibiótico o herbicida), se garantiza que únicamente sobrevivirán aquellas células que hayan sido transformadas. El gen marcador otorga a las células transgénicas una ventaja, con respecto a las células no transgénicas, al permitirles crecer en un medio selectivo que contiene el agente selectivo específico (Díaz-Maiana y col., 2004).
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2.6 Marcadores de selección
La combinación de los antibióticos y genes que confieren resistencia son una herramienta importante en la ingeniería genética. Los genes marcadores tienen la cualidad de inactivar selectivamente ciertos antibióticos y en consecuencia proteger las células contra su actividad (EFB, 2001).
2.7 Expresión transitoria
Se han utilizado genes para evaluar la etapa previa a la transformación genética estable. Los genes marcadores o reporteros ayudan a la observación directa de las células que los expresan. Estos genes codifican para proteínas que no están presentes en las células vegetales y producen un fenotipo característico de fácil identificación.
El gen reportero uidA que codifica para la enzima β-glucuronidasa, puede ser detectado cualitativamente por tinción histoquímica, en presencia de un sustrato específico, por la producción de un precipitado azul índigo como resultado de la actividad de la enzima, y se muestra en el tejido al expresar el gen. La expresión transitoria, permite evaluar el tejido a las 24-48 horas después de la transferencia del DNA. El reactivo X-gluc, está asociado al ácido glucurónico y la enzima β- glucuronidasa rompe los enlaces para producir ácido glucurónico más cloro bromoíndigo, y al llevarse a cabo una dimerización se produce 5,5 dibromo 4,4- dicloro- índigo que se visualiza como un precipitado azul (Figura 6) (Karcher y Gelvin, 2007).
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Figura 6. Reacción del reactivo X-GLUC o 5-bromo-4-cloro-3-indolil- β -D- glucurónido, es hidrolizado por la β-glucuronidasa para formar el ácido glucurónico y cloro-bromoíndigo. El cloro-bromoíndigo se dimeriza para producir un precipitado azul insoluble llamado 5,5-dibromo-4, 4dicloro-indigo (Karcher y Gelvin, 2007).
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2.8 Modelo de estudio Tagetes erecta L. (cempaxúchil)
Cempaxúchil (Tagetes erecta L.) es una planta originaria de México, algunas especies se emplean con fines ceremoniales por ello, se le conoce comúnmente como flor de muerto (Códice Florentino, 1980). En diversas regiones de México a esta planta se le ha denominado con diferentes nombres: apátsicua, cempaxúchil, cempasúchil, cimpual, zempoalxóchil, flor de muerto y en la península de Yucatán se le llama x´pujuc (Chi- Manzanero y col., 2002).
2.8.1 Generalidades y distribución del cultivo
Es una planta herbácea pertenece a la familia Asteraceae, nativa del continente americano, cuya principal característica son sus flores agrupadas en cabezuelas o inflorescencias, estructuras de donde se extraen los pigmentos. México es el área de mayor diversidad de especies del género Tagetes (Tun Suárez, 1990). Es una especie que crece en los bosques de encino, pino, pino-encino a una altitud de 2450 m.s.n.m. México es un centro de radiación de muchas de las tribus que conforman la familia Asteraceae. Ubicado en la tribu Tageteae, el género Tagetes se compone de 30 especies (Turner, 1996). De las cuales cerca de la mitad habita en México. Las especies relacionadas con la diversidad de cempaxúchil son: T.
erecta, T. lunulata, T. patula y T. tenuifolia. La especie más popular es T. erecta (Serrato-Cruz,1999). La cual se distribuye a lo largo del continente americano, desde el suroeste de los Estados Unidos hasta regiones de Argentina. En México se cultiva en los estados de Veracruz, México, Tabasco, Chiapas, Hidalgo, Guanajuato y Sinaloa (Mendieta y Del Amo, 1981).
2.8.2 Descripción de la planta
El cempaxúchil, es una planta con hojas principalmente opuestas enteras o pinatisectadas, tallos estriados, cabezuelas grandes o pequeñas radiadas,
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amarillas (Kearney y Puebles, 1960). Es una planta anual de crecimiento recto que alcanza una altura aproximada de 1 a 1.5 metros. Las inflorescencias están agrupadas en capítulos que a su vez pueden estar agrupados o solitarios en los extremos de las ramas con pedúnculos alargados, provisto de brácteas. Los capítulos son radiados con flores dimorfas, el género Tagetes presenta dimorfismo sexual con representantes hembras (inflorescencias dobles con flores pistiladas) y hermafroditas (capítulos con flores liguladas hembras y flores tubuladas hermafroditas) (Serrato- Cruz, 1994).
El invólucro es campanulado. Las flores liguladas tienen coloraciones vistosas de color amarillo claro hasta naranja intenso (Rzedowski y Rzedowski, 1985). Es una planta alógama que se propaga por semilla, sin embargo también se puede propagar vegetativamente por medio de esquejes (Tun Suárez, 1990). De acuerdo con Serrato- Cruz y col. (2000), las poblaciones silvestres de Tagetes erecta L.
son alógamas, pero las cultivadas, además de ser alógamas también se comportan como autógamas, este origen reproductivo no modifica la morfología floral de estas poblaciones. Las inflorescencias se clasifican en tres categorías (Galicia, 1994), dependiendo de la morfología de sus flores individuales (Figura 7):
a). El tipo pompón o doble con flores 100% liguladas b). El tipo intermedio con flores liguladas y tubulares
c). El tipo sencillo o margarita con mas del 90% de flores tubulares.
2.8.3 Importancia económica de Tagetes erecta L.
En agricultura las plantas de cempaxúchil se utilizan en variadas formas, T. erecta y T. patula se utilizan para extraer abono orgánico para la tierra de cultivo, mejorar la calidad del suelo y controlar nemátodos en cultivos de piña, fresa, papa, gladiola y, en general, en áreas hortícolas y florícolas afectados por ese tipo de plagas donde se utilizan extractos acuosos y polvos de diferentes partes de la
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(a)
(b)
(c )
Figura 7. Tipos de inflorescencias en T.
erecta, a) tipo pompón, b) tipo intermedio con flores liguladas y tubulares, c) El tipo sencillo o margarita.
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planta (raíces, tallos y hojas, inflorescencias o toda la planta). Los agricultores utilizan esta planta en la rotación de cultivos para controlar, diversos patógenos, repeler o matar insectos y como nematicida (Serrato-Cruz, 2004). Además, se obtienen pigmentos de la flor, que se utilizan como aditivo en la alimentación de los pollos, para pigmentar la carne de las aves de engorda (Delgado-Vargas, 1997).
2.8.4 Usos y aplicaciones
El cempaxúchil se utiliza como planta de ornato, a la venta en macetas o como semillas, se ha utilizado tradicionalmente en ceremonias religiosas del día de muertos. Desde la época prehispánica, se han utilizado las plantas en la medicina tradicional, en las comunidades indígenas para atacar diversos padecimientos, existen pocas evidencias científicas sobre la efectividad de los tratamientos tradicionales, se tiene información de que T. tenuifolia controla enfermedades relacionadas con el sistema respiratorio causado por bacterias, T. patula es efectiva contra infecciones dermatomucosas causadas por hongos y T. erecta se ha empleado para atender algunos tipos de úlceras (Turner, 1996). También se utiliza como antiparasítico, antiespasmódico y en enfermedades relacionadas con el estómago, bazo e hígado (Delgado-Vargas, 1997; Guzmán-Maldonado y Paredes López, 1998).
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III. JUSTIFICACIÓN
La importancia económica de los carotenoides y los estudios relacionados con el análisis de la expresión de genes involucrados en la síntesis de carotenoides, aportan información importante acerca de los puntos susceptibles de modificación genética de la ruta de biosíntesis de carotenoides en cempaxúchil, por lo que la evaluación de la expresión transitoria es necesaria, para establecer las condiciones óptimas, que aplicadas al sistema ayudarán a obtener la transformación genética estable.
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IV. OBJETIVOS
4.1 Objetivo general
Establecer las condiciones de bombardeo para lograr la expresión transitoria del gen uid A en células desdiferenciadas de Tagetes erecta L.
4.2 Objetivos particulares
• Establecer cultivos in vitro de Tagetes erecta L. e inducir la formación de células desdiferenciadas (callo).
• Evaluar el crecimiento del cultivo de células desdiferenciadas de Tagetes erecta L.
• Determinar la sensibilidad del callo de cempaxúchil al antibiótico kanamicina y evaluar los cultivos, por medio de un análisis digital de imágenes.
• Establecer las condiciones adecuadas para la integración de genes exógenos al genoma del callo de cempaxúchil por biobalística.
• Determinar la expresión del gen uidA en callo de cempaxúchil, mediante la reacción de gus.
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V. MATERIALES Y MÉTODOS
5.1 Material vegetal
Se utilizaron plantas y semillas de cempaxúchil (Tagetes erecta L.), obtenidas del genotipo experimental de porte bajo cosecha 1999, donadas por el Dr. Miguel Ángel Serrato Cruz de la Universidad Autónoma Chapingo. Este material se mantuvo en invernadero.
5.2 Vector
Se utilizó el plásmido denominado PBI426, que se deriva del pUC9 (Figura 8).
Este plásmido contiene el gen uidA que codifica para la enzima β-glucuronidasa y el gen nptII que codifica para la enzima neomicina fosfotransferasa, ambos bajo el control de un promotor doble 35S del virus del mosaico de la coliflor (CaMV) y terminador de la nopalino sintasa (NOS) (Dalta y col., 1991). El gen nptII aporta resistencia al antibiótico kanamicina lo que permite la selección de posibles transformantes; aquellas células que sobreviven en un medio con el antibiótico han integrado el gen que les confiere resistencia. La actividad de la enzima β- glucuronidasa permite identificar visualmente células posiblemente transformadas.
5.3. Establecimiento del cultivo in vitro
Se desinfestaron semillas de cempaxúchil del material porte bajo previamente seleccionadas en lotes de 20 a 30 semillas, a las cuales se les realizaron diferentes lavados con etanol absoluto durante 1 minuto, etanol al 70% (v/v) por 5 minutos, y dos lavados con hipoclorito de sodio a una concentración del 2% (v/v) y 1% (v/v) durante 15 minutos, entre cada uno de los lavados se hicieron enjuagues con agua destilada estéril, al menos tres veces entre cada lavado para eliminar los
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Nos Ter
35s . 35s uidA . npt II
Sac I BgII
EcoRI NcoI BamHI
XbaI HindIII
Figura 8. Representación del plásmido pBI426 (Dalta y col.,1991).
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residuos del hipoclorito de sodio. Todo esto se llevó a cabo en condiciones asépticas, en una cámara de flujo laminar (Vanegas-Espinoza, 2003). Las semillas previamente desinfestadas se colocaron en una charola con papel absorbente completamente húmedo con agua estéril y se incubaron por 2 semanas aproximadamente hasta que las plantulas alcanzaran una altura de 3 a 4 cm aproximadamente.
Las plántulas de la charola se pasaron con unas pinzas a macetas con sustrato estéril, compuesto de una mezcla de Turba (sustrato orgánico), vermiculita (mediana) y agrolita (perlita mineral inerte) en una relación 3:1:1. Las plántulas se llevaron al invernadero para finalizar su desarrollo (Evangelista- Lozano y col., 2005).
5.3.1 Inducción de callo
Se cortaron hojas jóvenes completas de plantas cultivadas en invernadero. Se realizaron diferentes lavados, primero en una solución de detergente agitándolas ligeramente, seguido de un enjuague en agua corriente. Las hojas se remojaron en agua destilada estéril y se transportaron a una campana de flujo laminar. Éstas se lavaron con etanol al 50% durante 1 min, posteriormente con cloro comercial al 2% por 3 min y al 1% por 5 min, en agitación constante, entre cada uno de los lavados se hicieron enjuagues con agua destilada estéril (Vanegas, 2003).
Una vez desinfestadas las hojas, se seleccionaron los foliolos y se cortaron porciones de aproximadamente 0.25 cm2 en una caja petri con papel filtro humedecido con agua estéril. Para la inducción de callo, se evaluó la respuesta del explante frente a las combinaciones de tres concentraciones (2,4-D) y (BA) lo cual se puede observar en la Figura 9. Estos explantes se cultivaron en un medio que contenía 20 mL de medio MS (Murashige y Skoog, 1962) adicionado con la combinación de 2,4-D (1.0, 2.0, 3.0 mg/L) y BA (0.5, 1.0, 2.0 mg/L) 30 g/L de
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Figura 9. Proceso de selección y siembra de explantes de cempaxúchil en medio de cultivo MS con diferentes concentraciones de reguladores de crecimiento vegetal (2,4-D y B A).
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sacarosa, 3 g/L de agente gelificante Phytagel (SIGMA) pH de 5.8; cada uno de los medios se marcó con una letra diferente para identificar las diferentes concentraciones de reguladores de crecimiento adicionadas al medio de cultivo (Tabla 1). De acuerdo con lo presentado en la tabla se obtuvo un total de 9. Las condiciones de incubación fueron 25 ± 2° C y fotoperiodo de 16 h luz y 8 h oscuridad (lámparas de luz fluorescente).
Los explantes de hoja de cempaxúchil se incubaron en el medio MS suplementado con la combinación de 2,4-D (1.0, 2.0 y 3.0 mg/L) y BA (0.5, 1.0 y 2 mg/L). Para la evaluación durante la inducción de callo, se tomaron en cuenta los siguientes parámetros: tamaño, color, consistencia y necrosis del tejido. Esta evaluación se realizó durante 30 días con muestreos semanales y se continuó con el mantenimiento de estos cultivos mediante resiembras subsecuentes cada 15 días en medio MS con las diversas concentraciones de reguladores de crecimiento establecidas, con los datos obtenidos se realizo un diseño completamente al azar.
5.4 Cinética de crecimiento
Para analizar el crecimiento del callo de cempaxúchil se llevó a cabo una cinética de crecimiento. La cual consistió en evaluar el peso fresco (PF) y peso seco (PS) del callo. El inóculo inicial fue de 0.5 g de peso fresco en frascos tipo “gerber”, con 20 mL de medio previamente seleccionado para el mantenimiento del cultivo. Las condiciones de incubación fueron a 25 + 2º C en completa oscuridad. El callo fue colocado sobre papel filtro, previamente pesado y el PF fue registrado mediante la diferencia de peso entre el papel filtro y el papel con la muestra. Para el PS, el papel filtro con la muestra se llevó a peso constante en un horno a 50º C durante 72 h.
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Tabla 1. Combinación de las diferentes concentraciones de los reguladores de crecimiento (2,4-D y BA) para la inducción de células desdiferenciadas de cempaxúchil.
Tratamiento BA mg/L 2,4-D mg/L
A 2.0 1.0
B 2.0 2.0
C 2.0 3.0
D 1.0 1.0
E 1.0 2.0
F 1.0 3.0
G 0.5 1.0
H 0.5 2.0
I 0.5 3.0
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Lo anterior se evaluó cada tercer día durante 18 días, analizando las muestras por triplicado y se realizaron las gráficas correspondientes al PF y PS con respecto al tiempo, obteniéndose así las cinéticas de crecimiento. A partir de ellas se calculó el tiempo de duplicación celular y la velocidad de crecimiento, mediante las siguientes ecuaciones:
a) Tiempo de duplicación celular vegetal (Brown, 1990)
m 2 tdc=λn
b) Velocidad específica de crecimiento (µ), a partir del tdc con:
tdc
µ= 1
Donde:
tdc: tiempo de duplicación celular m = pendiente de la recta
5.5 Determinación de la sensibilidad del callo a kanamicina
Para establecer un método de transformación genética se requiere tener el cultivo en condiciones controladas y posteriormente conocer la sensibilidad natural del tejido al antibiótico que será utilizado como marcador de selección de posibles transformantes. Se utilizó callo producido y mantenido en un medio de regeneración al que se le adicionaron diferentes concentraciones de kanamicina (50, 100, 250, 500 mg/L). Posteriormente se realizó un diseño completamente al azar con tres repeticiones por cada tratamiento. Se evaluó la sensibilidad de los callos al antibiótico, se probó la tolerancia del tejido al antibiótico, en relación a su crecimiento durante 30 días. Con los resultados que se obtuvieron del experimento se estableció la dosis letal mínima, para el callo de cempaxúchil.
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Para ello se siguió una metodología por análisis digital de imágenes (Sanchez- Segura y col. 2007), para ello se obtuvieron fotografías (cuatro para cada tratamiento) para el análisis digital de imágenes del callo con el antibiótico kanamicina al inicio del cultivo y a los 30 días, para observar el efecto del antibiótico en el crecimiento del tejido. Es importante señalar que las muestras a las que se les tomaron las imágenes al inicio y final del experimento fueron las mismas. Las imágenes fueron capturadas con una cámara fotográfica digital Nikon, Coolpix E900 de 2.1 Mpixeles acoplada a un tripié fotográfico;
posteriormente las imágenes obtenidas se procesaron en el programa Corel Photo–Paint-ll (V11.0, Corel Corporation, USA), donde se transformaron, principalmente pasándolas a escala de grises de 8 bits segmentándolas para extraer el objeto de interés (callo) y finalmente binarizándolas para ser almacenadas digitalmente en mapa de bits (*.bmp); y una resolución de 1280 por 980 pixeles por pulgada.
Las muestras posteriormente se analizaron morfométricamente en el programa Sigma Pro 5 (Sigma SPSS-USA) utilizando un referente conocido de medición para la calibración del sistema, con este programa se obtuvo el valor del área proyectada en mm2 (Figura10). Finalmente el índice de crecimiento se calculó con los datos de área proyectada al inicio y al final del tratamiento (hasta los 30 días), utilizando la siguiente ecuación:
x 100 Donde:
I.C. = Índice de crecimiento adimensional Af = Área proyectada final
Ao= Área proyectada inicial
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Figura 10. Esquema que ilustra el área proyectada del callo (Isaza, 2006)
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5.6 Ensayos por biobalística
Para la introducción del gen uidA se utilizó una pistola de aceleración de partículas de alta presión. Los bombardeos se realizaron con partículas de oro, las cuales se prepararon previamente. Se pesaron 60 mg de partículas de oro, a las cuales se les agregó 1 mL de etanol absoluto, seguido de agitación en vórtex por espacio de tres minutos, posteriormente se centrifugaron las partículas a 13000 rpm por tres minutos, eliminando el sobrenadante. Adicionalmente a la muestra se le agregó 1 mL de etanol al 70%, y se agitó en el vórtex por dos minutos. Pasado el tiempo las partículas se incubaron 15 minutos, la muestra se volvió a centrifugar durante tres min, se eliminó el sobrenadante y se le agregó 1 ml de agua destilada estéril y se le aplicó vórtex por un minuto, se dejaron reposar las partículas por un min a temperatura ambiente, adicionalmente se centrifugaron las partículas a una velocidad máxima durante dos minutos y se le añadió 50% (v/v) de glicerol, y se almacenaron a -20º C.
Una vez que se tuvieron partículas estériles se continúo con la precipitación del DNA a una concentración menor a 1µg/µL. Las partículas de oro fueron resuspendidas mediante agitación en vórtex por un minuto, en un tubo limpio se agregaron 50 µL de las partículas, adicionando 12 µL del plásmido pBI426 y 50 µl de cloruro de calcio (2 M), y se mezcló en vórtex, posteriormente se le agregaron 20 µL de espermidina (5 M) mezclando una vez más en vórtex en hielo.
Posteriormente la muestra se centrifugó a 12000 rpm durante 20 seg. Se eliminó el sobrenadante y se lavó la pastilla con 50 µl de etanol al 70%.
Subsecuentemente se sonificarón las partículas durante un min y se centrifugó a 12000 rpm por 20 seg eliminando el sobrenadante. Por último se resuspendieron en 50 µL de etanol absoluto. Todo lo anterior se llevó a cabo en una campana de flujo laminar.
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5.6.1 Preparación de las muestras para el bombardeo
Para iniciar los ensayos de bombardeo, se expuso el tejido a un tratamiento osmótico, éste se realizó exponiendo el callo a un medio con maltosa (15%), como agente osmótico durante cuatro horas previas al bombardeo.
5.6.2 Uso del equipo de biobalística
Para el bombardeo se utilizó un equipo de biobalística de alta presión (Figura 11), inicialmente se lavaron las membranas con alcohol absoluto y se dejaron secar.
Se prosiguió a limpiar el equipo con alcohol al 70%. De una solución de 1 µg/µL de DNA se pusieron 7.5 µl de DNA en cada membrana y se colocaron en el interior del equipo, en un carrier de acrílico. Se colocaron la muestra a bombardear a la distancia requerida, las presiones están dadas por el número de membranas que se utilicen, cada membrana resiste una presión de 3100.5 kPa, el equipo se cerró, se aplicó vacío y se abrió el gas de helio. Se dispararon las partículas con DNA hacia el callo. Por último se liberó el vacío al permitir la entrada de aire. Se retiró la muestra y se colocó la siguiente muestra. Se evaluaron las muestras sometidas a diferentes combinaciones de presión y distancia que se muestran en la Tabla 2, para evaluar la expresión transitoria del gen uidA.
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Figura 11. Equipo de biobalística de alta presión, para realizar las pruebas de bombardeo (CINVESTAV-IPN. Unidad Irapuato, México).
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Distancia (cm) Presión (kPa)
9 3100.5
9 6201
11 3100.5
11 6201
Tabla 2. Distancias y presiones evaluadas en las pruebas de biobalística en un sistema de bombardeo de alta presión en células ce cempaxúchil.
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5.7 Análisis histoquímico de β- glucuronidasa (GUS)
La expresión del gen uidA se evaluó mediante un ensayo histoquímico de la enzima β- glucuronidasa, en el cual se evaluó el callo tratado en diferentes combinaciones de presión (3100.5 y 6201 kPa) y distancia (9 y 11 cm). El análisis se basó en transferir el callo previamente bombardeado a cajas petri, al cual se le adicionaron 2 mL de buffer de reacción el cual contenía una concentración de 500 mg/L del sustrato X- Gluc (ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil glucurónico);
además contenía fosfato de potasio 100 mM pH 7.0, EDTA 10 mM pH 8, ferriocianuro de potasio 0.5 mM, ferrocianuro de potasio 0.1 mM y el X-Gluc previamente disuelto en tritón 0.1%.
El callo con el buffer se incubó a 37º C en total oscuridad durante toda la noche, posteriormente, se retiró la solución y se llevaron a cabo tres lavados con metanol para remover los pigmentos del explante. Una vez realizados los lavados al callo, se le agregó glicerol al 50% para conservar la muestra. Las células que expresaron el gen uidA mostraron un precipitado de color azul, lo que se considera una respuesta positiva por la presencia de puntos azules en el callo.
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VI. RESULTADOS Y DISCUSIÓN
6.1 Establecimiento del cultivo in vitro de Tagetes erecta L.
Para la evaluación de la inducción del callo, se indujo a partir de explantes de hojas de cempaxúchil; el callo se seleccionó por apreciación visual, tomando en consideración la formación del callo, tamaño, color, consistencia, y necrosis del tejido. Posteriormente se hicieron resiembras del material cada 15 días para el mantenimiento del cultivo, con las diversas concentraciones de reguladores de crecimiento evaluadas. Con los datos obtenidos se prosiguió a ser el análisis estadístico.
Las observaciones mostraron que las dos primeras semanas de incubación los explantes cambiaron su coloración de verde a verde oscuro y el tejido se fue desdiferenciando paulatinamente en la mayoría de los tratamientos. Las evaluaciones mostraron que en los tratamientos con 2,4-D (1.0, 2.0 y 3.0 mg/L) combinado con BA (0.5 mg/L) se observó necrosis en algunos de los explantes, aproximadamente un 10% del total de los explantes en el tratamiento para la formación del callo, este mismo comportamiento lo presentó el tratamiento con 2,4-D (1.0 mg/L) combinado con BA (1.0 mg/L) (Figura 12).
Para los tratamientos con 2,4-D (1.0, 2.0 y 3.0 mg/L) combinado con BA (2.0 mg/L) y los tratamientos con 2,4-D (2.0 y 3.0 mg/L) combinados con BA (1.0 mg/L), se presentó la desdiferenciación (Figura 13). Sin embargo, se observó una tendencia a la oxidación en todos los tratamientos excepto en el tratamiento 2,4-D (2.0 mg/L) combinado con BA (2.0 mg/L), el cual presentó completamente la desdiferenciación del explante, con una coloración verde y consistencia friable, tras la resiembra durante el periodo de evaluación.
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A) B)
C) D)
Figura 12. Inducción de callo de cempaxúchil con diferentes
tratamientos de reguladores de crecimiento; A) 2,4-D/ BA (1.0 /0.5 mg/L); B) 2,4-D/ BA (2.0 /0.5 mg/L); C) 2,4-D/ BA (3.0 /0.5 mg/L); D) 2,4-D/BA (1.0/1.0 mg/L).
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A) B)
C) D)
Figura 13. Inducción de callo de cempaxúchil con diferentes tratamientos de reguladores de crecimiento; A) 2,4-D/ BA (1.0 /2.0 mg/L); B) 2,4-D/ BA (3.0 /2.0 mg/L); C) 2,4-D/ BA (2.0 /1.0 mg/L); D) 2,4-D/BA (3.0/1.0 mg/L).
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Se han realizado diferentes trabajos encaminados al desarrollo de un sistema de obtención de callo con explantes de hojas de Tagetes erecta L.; Belarmino y col.
(1992) reportaron que el uso de ANA/BA (5/2 mg/L) produjo callos con color amarillo, Bespalhok y Hattori (1998) obtuvieron la misma respuesta utilizando únicamente 2,4-D (2 mg/L) a partir de explantes de cotiledones. La concentración de 2,4-D corresponde con la obtenida en este reporte. El uso de 2,4-D/BA ha sido reportado por Vanegas y col. (2002) para la producción de callo, logrando callos friables y de color amarillo pálido a verde.
La desdiferenciación celular se evaluó por comparación entre las diferentes combinaciones de reguladores mediante un análisis estadístico completamente al azar para conocer si hay diferencias significativas entre los nueve tratamientos (tabla 3). De la observación anterior se definió la combinación de 2,4-D (2.0 mg/L) y BA (2.0 mg/L) como el tratamiento más adecuado para la producción de callo ya que el material obtenido, además de tener mejor tamaño y color que la combinación de 2.0 g/L de BA y 1.0 g/L de 2,4-D, presentaron una consistencia friable, característica muy importante para experimentos subsecuentes (Figura 14).
6.2 Cinética de crecimiento
Los callos de cempaxúchil subcultivados cada 15 días, como se mencionó anteriormente presentaron una coloración amarillo-verde. Se realizó una cinética de crecimiento celular, usando un inóculo inicial de PF del callo, en 20 mL de medio de cultivo MS con los nutrientes necesarios para el desarrollo del cultivo. El cual, se mantuvo en total oscuridad a lo largo de las diferentes etapas de crecimiento, durante los 18 días de evaluación de crecimiento (Figura 15).
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Tabla 3. Efecto de las concentraciones de 2,4-D y B A en la inducción de callos de cempaxúchil.
Concentración BA mg/L
Concentración 2,4-D mg/L
Porcentaje de inducción de callo (%)
2.0 1.0 19.5 ab
2.0 2.0 32.0 a
2.0 3.0 6.0 bc
1.0 1.0 8.0 bc
1.0 2.0 8.2 bc
1.0 3.0 8.0 bc
0.5 1.0 10.0 bc
0.5 2.0 10.0 bc
0.5 3.0 4.0 c
Los valores seguidos por la misma letra no difieren estadísticamente a p=0.05 de acuerdo a la prueba de diferencias mínimas significativas (dms).
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