Facultad de Farmacia y Bioquímica
TESIS PARA OPTAR EL TITULO DE:
QUIMICO FARMACEUTICO
“Actividad Antibacteriana del Extracto Etanólico de hojas y tallo
de Clibadium surinamense L. (Huaca) Mediante el Método de
difusión en disco (Kirby-Bauer)”
Presentado Por las Bachilleres:
Moisés Armando Donayre García
Rosa Marleni Lao Valdivia
Asesores:
Q.F. Luis Alberto Vílchez Alcalá.
Co Asesor:
Q.F. Robert Dávila del Castillo.
Iquitos – Perú
Método de difusión en disco (Kirby-Bauer)
Moisés Armando DONAYRE GARCÍA 1 Rosa Marleni LAO VALDIVIA 1
1 Bachilleres de la Facultad de Farmacia y Bioquímica de la Universidad Nacional de la Amazonia Peruana (UNAP)
______________________________________________________________
Resumen:
El propósito del presente estudio fue evaluar la actividad antibacteriana del Extracto Etanólico de hojas y tallo de Clibadium surinamense L. (Huaca) mediante el método de difusión en disco (Kirby Bauer). La muestra fue recolectada en la comunidad “SAN ANDRES”, ubicado en las coordenadas geográficas de latitud sur 3º 41´ 2´´, longitud 73º 16´ 43´´, y una altura de 92 m.s.n.m. (coordenadas UTM, x 691,155.29, y
9´591,999.76). La muestra se identificó taxonómicamente en el Herbarium Amazonense (AMAZ) de la Facultad de Ciencias Biológicas (FCB) de la Universidad Nacional de la Amazonía Peruana (UNAP) y fue procesado en el laboratorio de Ingeniería Alimentaria ubicada en la Planta Piloto de la UNAP. La determinación de la Actividad Antimicrobiana mediante el Método de KIRBY-BAUER se realizó en los ambientes del Laboratorio de Microbiología de la FCB de la UNAP. La muestra fue secada por 2 semanas a 60°C; Luego se adiciono etanol al 70 % durante 7 días y se procedió a concentrar por rotavapor. Luego se procedió a la determinación de las características fitoquímica de la muestra en estudio. El rendimiento de las muestras se observa que el tallo presenta mayor rendimiento (8.91 %), mientras que las hojas es la menos abundante (6.83 %). El tamizaje fitoquímico del extracto etanólico de hojas y tallo de C. surinamense L. (huaca) evidencio abundante presencia de alcaloides, triterpenos-esteroides, flavonoides y saponinas, reportándose en pequeñas proporciones principios amargos - astringentes y glicósidos. La mayor inhibición obtenida con el método de Kirby-Bauer se obtuvo con el extracto etanólico de hojas de C. surinamense L. (huaca) alcanzando un mayor diámetro de halo de inhibición en 64 mg/ml con un halo promedio de 10.72 ± 1.05 mm frente a Staphylococus aureus ATCC 25923; sin embargo comparando con los halos de inhibición de los controles positivos no fue estadísticamente significativo. Todas las cepas gran negativas de Haemophilus influenzae ATCC 49247, Pseudomona aeruginosa ATCC 27853 y Escherichia coli ATCC 25922 presentaron resistencia a las diferentes concentraciones ensayadas (método de Kirby-Bauer) del extractos etanólico de tallo y hojas de Clibadium surinamense L. (huaca). No se realizó la concentración mínima inhibitoria (CMI) del extracto etanólico de hojas y tallo de C. surinamense L. (huaca) debido que no presentaron halos de inhibición significativas en el método de Kirby-Bauer. Se concluye que los extractos etanólico de hojas y tallo de de C. surinamense L. (huaca) no presenta actividad antibacteriana frente a las cepas estudiadas.
surinamense L. (Huaca) mediante el Método de difusión en disco (Kirby-Bauer)
PAGINA DE APROBACIÓN
_________________
Ing. Cleto Jara Herrera.
PRESIDENTE
Memoria presentada por los Bachilleres Moisés Armando Donayre García y Rosa Marleni Lao Valdivia para optar el grado de Químico farmacéutico por la Universidad Nacional de la Amazonia Peruana - 2013. _________________________
Q.F. Henry Vladimir Delgado Wong.
MIEMBRO
_________________
Dr. Charles Ocampo Falcón.
MIEMBRO
_______________________
Q.F. Luis Alberto Vílchez Alcalá.
ASESOR
_______________________
Q.F. Robert Dávila del Castillo.
Por la Luz, fuerza, alegría que nos da GLORIA GARCIA DE DONAYRE, por ser ejemplo de superación y de lucha constante, por ser cómplice de mis sueños y anhelos, por brindarme fortaleza en mis flaquezas para levantarme y continuar adelante en todas mis metas trazadas a mis hermanos en especial a CYNTHIA DONAYRE mi hermana, por quien me esfuerzo para ser cada día mejor; por apoyarme y estar siempre a mi lado en los momento buenos y malos, finalmente a mi flaquita MARIA FE, mi sobrinita querida.
ROSA MARLENI LAO VALDIVIA
:
Esta Tesis se la dedico en primer lugar a Dios quien supo guiarme por el buen camino, darme fuerzas y no desmayar en los problemas que se presentaban, también dedico con amor a mis padres: ENRIQUE LAO TUISIMA y MARLENI VALDIVIA ISUIZA, por darme la vida, por sus consejos, comprensión, amor, ayuda en los momentos difíciles y por ayudarme en los recursos necesarios para ser profesional, a mis hermanitos PAUL LAO y PIERO LAO, a mi esposo JUAN CARLOS por su amor, tiempo y comprensión y a mi hijo DEREK, por ser mi motivación, inspiración y felicidad y por quien me esfuerzo para ser cada día mejor.
El presente trabajo ha sido posible con la ayuda de las personas cuyos esfuerzos favorecieron en la realización de este proyecto de tesis. Una de las preeminencias especiales de que disfrutamos y al mismo tiempo un privilegio, fue trabajar con nuestro asesor y Co-Asesor, cuyos talentos y energía contribuyeron a la realización de la tesis.
Al Q.F. Luis Alberto Vilchez Alcalá, de quién tengo el mejor de los recuerdos como docente y como persona.
Al Q.F. Robert Davila, por los aportes realizados en el análisis y discusión de los resultados y por el apoyo incondicional en la parte microbiológica del presente estudio.
A la Sra. Chachita que nos brindó su apoyo incondicional en lo que es el tramite administrativos para llegar hasta donde hemos llegado.
A la Sra. Lency por la voluntad de apoyarnos en tramites finales del presente trabajo.
ÍNDICE DE CONTENIDO
. .
INTRODUCCIÓN 1
CAPÍTULO I: EL PROBLEMA 2
1.1.- FORMULACION DEL PROBLEMA 2
1.2.- OBJETIVOS 3
1.2.1.- General 3
1.2.2.- Específicos 3
1.3.- HIPÓTESIS 4
1.4.- DEFINICIONES OPERACIONALES 5
1.4.1.- Variables 5
1.4.1.1.- Variables Independiente 5
1.4.1.2.- Variables Dependiente 5
1.4.2.- Indicadores 6
1.4.2.1.- Indicador Independiente 6
1.4.2.2.- Indicador Dependiente 6
2.1.- ANTECEDENTES 10
2.2.- BASES TEÓRICAS 11
2.2.1.- Clibadium surinamense L. “HUACA” 11
2.2.1.1.- Clasificación Taxonómica 11
2.2.1.2.- Descripción Botánica 11
2.2.1.3.- Composición Fitoquímica 13
2.2.1.4.- Uso Tradicional 16
2.2.1.5.- Estudios Toxicológicos 17
2.2.1.6.- Distribución Geográfica 19
2.2.2.- Método de Susceptibilidad por Disco de Difusión 20
2.2.2.1.- Antecedentes 20
2.2.2.2.- Fundamento del Método 20
2.2.2.3.- Indicaciones y Limitaciones 22
2.2.2.4.- Método 22
2.2.2.5.- Antimicrobianos Seleccionados 24
2.2.2.6.- Control de Calidad 24
2.2.2.7.- Preparación de MacFarland 0.5 25
2.2.2.8.- Resultados 25
2.2.3.- Método de Dilución en Caldo 27
2.2.3.1.- Antecedentes 27
2.2.3.2.- Fundamento del Método 27
2.2.3.3.- Indicaciones y Limitaciones 28
2.2.3.4.- Método 28
2.2.5.1.- Haemophilus influenzae 36
2.2.5.2.- Escherichia coli 38
2.2.5.3.- Staphylococcus aureus 42
2.2.5.4.- Pseudomona aeruginosa 44
CAPÍTULO III: MATERIALES Y MÉTODO 46
3.1.- METODOLOGÍA 46
3.1.1.- Lugar de Estudio 46
3.1.2.- Tipo de Investigación 46
3.1.3.- Diseño de la Investigación 47
3.1.4.- Flujograma de Estudio 48
3.1.4.1.- Diagrama de Flujo para Extracción etanólico 48 3.1.4.2.- Diagrama de Flujo del Procedimiento General
para la prueba de Susceptibilidad 49
3.1.5.- Procedimiento Experimental 50
3.1.5.1.- Recolección y Procesamiento de las Muestras 50 3.1.5.2.- Identificación Taxonómica de la Muestra Vegetal 50
3.1.5.3.- Preparación de Materia Prima 50
3.1.5.3.1.- Limpieza 51
3.1.5.3.2.- Lavado 51
3.1.5.3.3.- Cortado 51
3.1.5.3.4.- Secado 51
3.1.5.3.5.- Molienda 51
3.1.6.- Evaluación de la Actividad Antibacteriana 53
3.1.6.1.- Preparación del Inóculo 53
3.1.6.2.- Preparación de los Discos de Sensibilidad 54
3.1.6.3.- Aplicación de los Discos 54
3.1.6.4.- Determinación de la CMI 54
3.2.- POBLACIÓN Y MUESTRA 56
3.2.1.- Población en Estudio 56
3.2.2.- Muestra en Estudio 56
3.2.3.- Selección de las Muestras Botánicas 56
3.2.4.- Lugar de Muestreo 57
3.3.- INSTRUMENTOS 57
3.3.1.- Material Vegetal 57
3.3.2.- Material Biológico en Estudio 57
3.3.3.- Medios de Cultivos 57
3.3.4.- Materiales de Vidrio 58
3.3.5.- Materiales de Plástico 58
3.3.6.- Material de Metal 58
3.3.7.- Otros Materiales 59
3.3.8.- Equipos 59
3.3.9.- Reactivos 59
3.4.- ANÁLISIS DE DATOS 60
3.5.- PROTECCIÓN DE LOS DERECHOS HUMANOS 60
4.1.1.- Determinación del Screening Fitoquímico 61 4.1.2.- Determinación de la Solubilidad de Solventes Orgánicos 61 4.1.3.- Resultados de los Diámetros de Halos de Inhibición 63
4.2.- DISCUSIÓN 74
4.3.- CONCLUSIONES 78
4.4.- RECOMENDACIONES 79
4.5.- BIBLIOGRAFÍA 80
4.5.1.- Referencias Bibliográficas 80
4.5.2.- URL`s 95
ANEXOS 97
ANEXO 1.- Datos de pasaporte de colección de especies vegetal en estudio 97 ANEXO 2.- Exicata de Clibadium surinamense L. (huaca) 98
ANEXO 3.- Recolección de las muestras botánicas 99
ANEXO 4.- Pesada y secado de las muestras botánicas colectadas 100
ANEXO 5.- Obtención del extracto etanólico 101
ANEXO 6.- Tamizaje Fitoquímico 102
ANEXO 7.- Técnica de Kirby-Bauer 108
ANEXO 8.- Diámetro del halo de inhibición para
Escherichia coli ATCC25922 110
ANEXO 9.- Diámetro del halo de inhibición para
ANEXO 11.- Diámetro del halo de inhibición para
Haemophilus influenzae ATCC 49247 118
ANEXO 12.- Problemas que pueden surgir en la determinación de los halos
de inhibición de las cepas utilizadas como control de calidad 120
ANEXO 13.- Solventes y diluyentes para antimicrobianos 121 ANEXO 14.- Sustancias que interfieren con la Actividad Antimicrobiana 123
GRAFICO 82
GRAFICO 1.- Porcentaje de rendimiento del EE de hojas y tallo
de Clibadium surinamense L. 62
GRAFICO 2.- Distribución de promedios de halos de inhibición en base al efecto del EE de Clibadiumsurinamense L.
en disco frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923 64
GRAFICO 3.- Distribución de promedios de halos de inhibición en base al efecto del EE de Clibadiumsurinamense L.
en disco frente a Haemophilus influenzae ATCC 49247 66
GRAFICO 4.- Distribución de promedios de halos de inhibición en base al efecto del EE de Clibadiumsurinamense L.
en disco frente a Pseudomona aeruginosa ATCC 27853 68
GRAFICO 5.- Distribución de promedios de halos de inhibición en base al efecto del EE de Clibadiumsurinamense L.
en disco frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923 70
antibacteriana del EE de Clibadiumsurinamense L. a través de la variación de promedios de halo de
inhibición frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923
entre las diferentes concentraciones empleadas 71
CUADRO 2.- Prueba de significación de Tukey para actividad antibacteriana del EE de Clibadiumsurinamense L.
frente a Staphylococcus aureus ATCC 25923 por el
TABLA 2.- Escherichia coli. Patógeno Entérico 41 TABLA 3.- Toxiinfecciones Alimentarias Producidas Por E. Coli
Patógeno Entérico 41
TABLA 4.- Screening Fitoquímico de hojas y tallo
de Clibadium surinamense L. (huaca) 61
TABLA 5.- Rendimiento del EE de hojas y tallo de Clibadium surinamense L.
TABLA 6.- Actividad antimicrobiana obtenida del EE de Clibadium surinamense L. frente a
Staphylococcus aureus ATCC 25923 63
TABLA 7.- Actividad antimicrobiana obtenida del EE de Clibadium surinamense L. frente a
Haemophilus influenzae ATCC 49247 65
TABLA 8.- Actividad antimicrobiana obtenida del EE de Clibadium surinamense L. frente a
Pseudomona aeruginosa ATCC 27853 67
TABLA 9.- Actividad antimicrobiana obtenida del EE de Clibadium surinamense L. frente a
FIGURA 2.- Kaempferol 13
FIGURA 3.- Quercetina 14
FIGURA 4.- Acetato de cunaniol 14
FIGURA 5.- Éster cáprico de Ictiotereol 15
FIGURA 6.- Éster 7’-en-miristico tetrahidroictiotereol 15 FIGURA 7.- Principio de la técnica de difusión con disco en agar 21 FIGURA 8.- Determinación de la Concentración inhibitoria
mínima (CMI) y de la Concentración Bactericida
Mínima (CMB) 33
FIGURA 9.- Ejemplo de un análisis de regresión para determinar la relación entre la CIM y los puntos de quiebre en la
prueba de difusión con disco 34
FIGURA 10.- Determinación de algunos errores aplicados a la determinación de la Concentración
inhibitoria mínima (CIM) 35
FIGURA 11.- Tinciones de Gram de Haemophilus influenzae. 36 FIGURA 12.- Microfotografía de contraste de Escherichia coli 41 FIGURA 13.- Microfotografía de contraste de Staphylococcus aureus 43 FIGURA 14.- Microfotografía electrónica de barrido de
Pseudomonas aeruginosa 44
FIGURA 15.- Esquema del diseño de investigación en la
Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) 47
1 El aumento de microorganismos resistentes a los agentes antimicrobianos es el principal problema al que se enfrenta la ciencia médica en el tratamiento de las enfermedades infecciosas (1), (2); su efecto es mayor en los países en vías de desarrollo (URL1), (3). Esta problemática tiene mayor incidencia en alteraciones orgánicas como tuberculosis, malaria, cólera, neumonías, etc., que en conjunto constituyen la causa de muerte de más de 10 millones de individuos anualmente en el mundo (4), (5). Lo anterior deja ver la necesidad de ampliar el arsenal terapéutico mediante el descubrimiento de moléculas bioactivas novedosas, las cuales pueden ser halladas a partir de fuentes naturales (6), sustancias con actividad antimicrobiana provenientes de plantas superiores con la finalidad de encontrar alternativas terapéuticas efectivas contra las infecciones producidas por microorganismos resistentes a los antibióticos. En tal sentido, se hace necesaria la búsqueda de nuevas fuentes naturales con efecto antimicrobiano (9), (10)
Las plantas medicinales han sido consideradas a través de los años como el origen o punto de partida del desarrollo de los medicamentos, ya que han contribuido grandemente al descubrimiento de nuevas sustancias con actividad biológica y a la producción de fitofármacos (11). Es la fuente de medicamentos más económica y de mayor disponibilidad para la mayoría de los países (12), (13).
2 EL PROBLEMA
1.1. FORMULACIÓN DEL PROBLEMA DE INVESTIGACIÓN
3 1.2.1.- General
Determinar la actividad antibacteriana in vitro del extracto etanólico de hojas y tallo de Clibadium surinamense L. (Huaca), frente a cepas de Staphylococcus aureus ATCC 25923, Haemophilus influenzae ATCC 49247, Pseudomona aeruginosa ATCC 27853 y Escherichia coli ATCC25922 mediante el método de disco difusión (Kirby - Bauer).
1. 2.2.- Específicos
Recolección de hojas y tallo de Clibadium surinamenseL. (Huaca)
Identificar taxonómicamente la muestras de Clibadium surinamense L. (Huaca)
Obtención del extractos etanólico de hojas y tallo de Clibadium
surinamenseL. (Huaca) recolectadas en la comunidad de San Andrés.
Realizar el Screening Fitoquímico del extracto etanólico de hojas y tallo de
Clibadium surinamenseL. (Huaca)
Medir los diámetros de los halos de inhibición de las cepas de
Staphylococcus aureus ATCC 25923, Haemophilus influenzae ATCC 49247, Pseudomona aeruginosa ATCC 27853 y Escherichia coli ATCC 25922.
5 1.4.1.- Variables
1.4.1.1.- Variables Independiente
Hojas de Clibadium surinamenseL. (Huaca)
Extractos Etanólico
Tallo de Clibadium surinamenseL. (Huaca)
Extractos Etanólico
1.4.1.2.- Variables Dependiente
Actividad Antimicrobiana frente a:
Cepa de Staphylococcus aureus ATCC 25923
Cepa de Haemophilus influenzaeATCC 49247
Cepa de Pseudomona aeruginosa ATCC 27853
6 1.4.2.1.- Indicador Independiente
Concentración del extracto etanólico de hojas de Clibadium surinamense L.
Tratamiento 1 : 2 mg/ml
Tratamiento 2 : 4 mg/ml
Tratamiento 3 : 8 mg/ml
Tratamiento 4 : 16 mg/ml
Tratamiento 5 : 32 mg/ml
Tratamiento 5 : 64 mg/ml
Concentración del extracto etanólico del tallo de Clibadium surinamense L.
Tratamiento 1 : 2 mg/ml
Tratamiento 2 : 4 mg/ml
Tratamiento 3 : 8 mg/ml
Tratamiento 4 : 16 mg/ml
Tratamiento 5 : 32 mg/ml
Tratamiento 5 : 64 mg/ml
1.4.2.2.- Indicador Dependiente
7 1.4.3.- Operacionalidad de variables
Variable INDEPENDIENTE
DEFINICIÓN DIMENSIÓN INDICADOR Definición
operacional
Actividad antimicrobiana de los extractos etanólico de hojas y tallo de Clibadium
surinamense L. (Huaca)
Capacidad del extracto etanólico de hojas y tallo de Clibadium surinamense L. (Huaca) de inhibir el
crecimiento microbiano que se desarrolla en un medio dado.
Cuantitativa Diámetro de halo de inhibición
8 Variable
DEPENDIENTE
DEFINICIÓN DIMENSIÓN INDICADOR Definición
operacional
Las diferentes cepas microbiológicas que serán utilizadas en los ensayos de
Cepa de Escherichia coli
ATCC25922
Crecimiento
bacteriano de la cepa.
9 CAPÍTULO II
MARCO TEÓRICO
En la actualidad existe una gran variedad de antibióticos de primera, segunda y hasta tercera generación que ofrecen una amplia variedad de opciones para el tratamiento de padecimientos causados por bacterias (26). Estos antibióticos están perdiendo eficacia por el aumento progresivo de la resistencia microbiana, lo que constituye un problema de primera línea para la salud pública global (27,28). Esto se debe, principalmente al tratamiento farmacológico incompleto de los pacientes, debido a la automedicación, y abandono de los tratamientos respectivos.
A esto se suma, el uso irracional de antibióticos que contribuyen a la aparición de cepas microbianas multi-droga-resitentes (29). Este problema, se agudiza cada vez por el elevado costo de los fármacos, lo cual resulta inaccesible para la población de bajo recursos económicos (30). El conocimiento de los perfiles de susceptibilidad antimicrobiana se debe orientar a la elaboración de esquemas de tratamiento más eficaces, políticas, estrategias, programas y metodologías que proporcionen una adecuada vigilancia en la elaboración y uso racional de antibióticos (31).
El conocimiento de los perfiles de susceptibilidad antimicrobiana se debe orientar a la elaboración de esquemas de tratamiento más eficaces, políticas, estrategias, programas y metodologías que proporcionen una adecuada vigilancia en la elaboración y uso racional de antibióticos (32-35).
10 2.1.- ANTECEDENTES
Siendo una de las pocas especies usada tradicionalmente como ictiotóxico para la pesca artesanal por parte de la población pesquera que vive a expensa de esta actividad (40, 41), la huaca (Clibadium surinamense L.) fue reportada por muchos excursionista investigadores que vieron en nuestros pobladores nativos el uso que le daban a esta especie (42).
Pammel et al, (1911), en describe al género Clibadium como plantas venenosas (14).
Heizer (1949), clasifica a 6 especies del genero Clibadium dentro de ellas al Clibadium surinamense L., con propiedades ictiotóxicas (16).
Ander et al, (2001), incluyo al Clibadium surinamense L., con posibles efecto biocida e ictiotóxico(15).
11 2.2.- BASES TEÓRICAS
2.2.1.- Clibadium surinamense L. “HUACA”
2.2.1.1.- Clasificación Taxonómica
Según el sistema de clasificación de Adolf Engler, modificado por Hans Melchior (44) en 1964, su clasificación taxonómica es la siguiente:
REINO : Plantae
SUB REINO : Tracheobionta SUPER DIVISION : Spermatophyta DIVISIÓN : Magnoliophyta
CLASE : Magnoliopsida
ORDEN : Asterales
FAMILIA : ASTERACEAE (alt. COMPOSITAE) GÉNERO : Clibadium Linnaeus
ESPECIE : Clibadium surinamense Linnaeus (44, URL2-4) NOMBRE VULGAR : Huaca (45), Barbasco (37, 46, 47) en Perú, Conabim, Cunambi en Brasil (48-50).
2.2.1.2.- Descripción Botánica
12 Receptáculos ligeramente convexos, paleáceos cerca de los márgenes, a veces desnudos en sus centros; radios fértiles, con las corolas inconspicuas, tubulares, blancas, con 2-4 lóbulos; flósculos perfectos, pero los ovarios estériles, las corolas con la garganta cilíndrica, blancas; anteras negras; estilo sin ramificaciones. Cipselas obovoides, a veces comprimidas, la superficie exterior convexa, a veces carinada la interior, negras cuando maduras; vilano ausente (40, 50-52, URL-1) (ver anexo Nº 02)
13 2.2.1.3.- Composición Fitoquímica
El género Clibadium presenta flavonoides, sesquiterpenoides, acetilenos y benzofuranos (41, 53, 55); según Schultes (1990), confiere a los benzofuranos su actividad ictiotóxica (46). En estudios fitoquímicos realizados en las hojas de Clibadium surinamense L.; se encontró la presencia de cumarinas, triterpenoides, saponinas, taninos, fenoles, azúcares reductores (18, 41, 46, 55), además de flavonoides (71)
Czerson et al, (1979) aisló un nuevo germacrólido de C. surinamense, trans -β-bergamoteno (56).
Bohm y Stuessy (1981-1983) aisló 3 tipos de flavonoides derivados del kaempferol, quercetina y quercetagetina (17, 18, 54). Mismo resultados obtenidos por Según Correa & Bernal (1990) ver figura 2 y 3 (57).
Fig. 2. Kaempferol
14 Fig. 3. Quercetina
3-O-(2’’,6’’-di-O-α-L-ramnopiranosil)-β- D-glucopiranósido
Pérez-Amador et al. (1994) caracterizó aceites esenciales de las hojas, raíz e
inflorescencia del Clibadium surinamense L. como -pineno, camfeno, limoneno, eucaliptol, citronelal y en pequeñas proporciones mentol, linalol, geraniol, dodecanol (62). También se aisló y caracterizo químicamente compuestos poliacetilénicos de naturaleza isoprénica: Cunaniol (ver figura N° 4), de las hojas de Clibadium surinamenses L.(58, 59).
Fig. 4. Acetato de cunaniol
15 En el 2000 se aislaron más alcaloides esteroidales y sesquiterpenoides como el “Epoxiclibandiol”, un Nuevo Eudesmano-Sesquiterpeno del Clibadium
surinamense L. (22-24, 61).
Pérez-Amador (2006) identifico mediante espectroscopia por 1H, 13C-NMR, IR, MS y UV, el éster cáprico de ictiotereol, (ver figura N° 5) y el 7’-en-miristic éster de tetrahidroictiotereol (ver figura N° 6), componentes aislados de la inflorescencia del Clibadium surinamense L. (62).
Fig. N° 5. Éster cáprico de Ictiotereol
Fig. N° 6. Éster 7’-en-miristico tetrahidroictiotereol
16 2.2.1.4.- Uso Tradicional
Conocida vulgarmente como “huaca”, perteneciente a la familia
ASTERACEAE es una planta herbácea, a la cual la medicina tradicional le atribuye propiedades ictiotóxicas (37, 46, 47, 50, 63, 64) y pesticida (URL-5).
El Cunambi es usado como tónico y amargo, siendo recomendado para combatir la anemia. Se tiene información de que sus hojas son usadas para curar erisipela y cualquier herida (50). Correa & Bernal (1990) describen que, en Colombia esta especie es empleada como sudorífico y en las enfermedades de los pies y piernas (57).
Los indígenas Shuar y Achuar del sur-este del Ecuador lo emplean comúnmente Clibadium surinamense L., bajo el nombre de "barbasco", como ictiotóxico, introduciendo la raíz machacada o la planta entera en el rio o charco; también cogen las hojas e inflorescencias, machacan hasta que libere su pulpa húmeda y lo introducen en el agua agitándolos para una máxima distribución. Los peces al ingerir el sebo se desorienta al cabo de unos minutos pescándoles fácilmente para su consumo (19).
Los indígenas de la selva peruana han utilizado la planta por muchos siglos como ictiotóxico. En nuestra Región, las hojas de Huaca son recolectadas y trituradas; para luego ser depositadas a los ríos y ejercer su acción toxica sobre los peces, que se manifiesta mediante una desorientación observada a los pocos minutos (46).
17 Los indígenas emplean Las hojas maceradas y mescladas con fruto de Bactris gasipes (pijuayo), transformándolas en pequeñas bolas, que son lanzadas al agua para envenenar a los peces que los ingiere (65).
2.2.1.5.- Estudios Toxicológicos
El Cunaniol (ver figura N° 4), es un potente convulsivantes (68), que actúa como un antagonista GABAA receptor (69). Costa et al., (1998) realizó la extracción hexánica de las hojas y tallos de Clibadium surinamense L. y evaluó la actividad convulsivante en ratas pre tratados con diazepam y lamotrigina, los resultados presentaron un aumento en la actividad GABAnérgica con el diazepam, protegiendo la acción convulsivante del extracto hexánico pero una reducción de la liberación de aminoácidos excitatórios producida por la lamotrigina, no inhibió el efecto del mismo, sugiriendo un probable efecto post-sináptico de la huaca (49).
Moisés (2002) realizo un estudio con las hojas de Clibadium sylvestre para caracterizar sus efectos convulsivantes utilizado ratas wistar, la cual fueron administrados vía intraperitoneal con dosis de 125 y 500 mg/kg P.C., la dosis efectiva y dosis letal respectivamente. La actividad de la Na+/K+-ATPasa en el hipocampo, "Status epileticus", presento una disminución en todas las fases, recuperando su actividad 24 horas después de la crisis convulsiva. Los resultados indican que el Clibadium sylvestre contiene principios activos que inducen crisis epileptiformes dependiente de la dosis, presentando un potente modelo para estudios de epilepsia experimental (70).
18 Incháustegui et al., (2002). En estudios toxicológicos realizados mediante el método alternativo toxicológico CTA, luego de administrar vía oral el extracto liofilizado de Clibadium surinamense en ratas albinas cepa holtzman se obtuvo una DL50 de 762.98 mg/kg, y por el método a dosis límite en ratones albinos
cepa Balb-53 por vía intraperitoneal se obtuvo una DL50 de 446.08 mg/kg (72).
Dávila et al., (2009). Realizaron la evaluación mutagénica del extracto acuoso liofilizado (EAL) de Clibadium surinamense L. mediante el test de Ames, utilizaron cepas auxótrofas para histidina de Salmonella typhimurium TA98, TA100, TA1535 y TA1537. El EAL de las hojas de Clibadium surimanense L. (huaca) dio positivo (mutagénico) a la cepa TA100 +S9 a dosis de 500 y 5000
g/ml (76)
Rodríguez et al., (2013). Evaluaron la actividad antimicótica del extracto acuoso liofilizado de las hojas de Clibadium surinamense L. (Huaca) mediante el Método de Microdilución para hongos filamentosos frente a cepas de Trichophyton rubrum ATCC 28188 y Trichophyton mentagrophytes ATCC 24953. El extracto acuoso liofilizado de las hojas de Clibadium surinamense L. (huaca) presentó actividad antimicótica in vitro frente a los hongos dermatofitos cuya CMI a 72 h, para a T. rubrum fue 0.25 mg/ml. Así mismo, la CMI a 168 h fue de 2 mg/ml y 0.5 mg/ml, mientras que para T. mentagrophytes, la CMI fue 0.5 mg/ml (78).
19 2.2.1.6.- Distribución Geográfica
20 2.2.2.- Método de Susceptibilidad por Disco de Difusión Kirby – Bauer
2.2.2.1.- Antecedentes
El principio de las pruebas de difusión por disco ha sido utilizado por más de 70años en los laboratorios de microbiología. Alexander Fleming utilizó una variante de esta técnica cuando trabajaba con la penicilina en los años cincuenta. En ese tiempo, había tantos procedimientos diferentes en uso como microbiólogos. Los doctores Bauer, Kirby, Sherris y Turck probaron minuciosamente todas las variables involucradas en el proceso, tales como los medios de cultivo, la temperatura y el espesor del agar. En 1966, ellos publicaron su estudio cimero describiendo la prueba que se usa en la actualidad (76). El NCCLS adoptó los pasos básicos de los procedimientos descritos en el estudio de Bauer como el método de referencia para difusión por disco (77-84).
2.2.2.2.- Fundamento del Método
El antibiograma disco - placa basado en el trabajo de Bauer, Kirby y colaboradores es uno de los métodos que el National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS) recomienda para la determinación de la sensibilidad bacteriana a los antimicrobianos (79-84).
El antibiograma disco - placa consiste en depositar, en la superficie de agar de una placa de petri previamente inoculada con el microorganismo, discos de papel secante impregnados con los diferentes antibióticos. Tan pronto el disco impregnado de antibiótico se pone en contacto con la superficie húmeda del agar, el filtro absorbe agua y el antibiótico difunde al agar.
21 Fig. N° 7. Principio de la técnica de difusión con disco en agar. La concentración del antibiótico decrece conforma mayor sea la distancia desde el borde del disco (A). En el área en donde la concentración del antibiótico sea insuficiente para inhibir el crecimiento, se observará un margen a partir del cual ocurrirá un crecimiento confluente (B).
22 2.2.2.3.- Indicaciones y Limitaciones
El antibiograma está indicado cuando se aísla una bacteria responsable de un proceso infeccioso y no puede predecirse su sensibilidad, especialmente si se sabe que este tipo de bacteria puede presentar resistencia a los antimicrobianos más habituales. Estas pruebas de sensibilidad también son útiles en estudios epidemiológicos ya que el resultado del antibiograma puede ser considerado como el primer marcador epidemiológico de que se dispone.
El método de disco-placa es fácil de realizar, rápido y barato. Es una metodología aplicable a una amplia variedad de bacterias, fundamentalmente bacterias aerobias no exigentes de crecimiento rápido como Enterobacteriaceae, Pseudomonas spp., Stenotrophomonas maltophilia, Burkholderia cepacia, Acinetobacter spp., Staphylococcus spp. y Enterococcus spp. Además, con ligeras modificaciones, puede ser aplicado a Haemophilus spp., Neisseria gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae y Streptococcus spp.
2.2.2.4.- Método
A.- Preparación del inóculo.
23 B.- Inoculación de las placas.
Antes de que transcurran 15 minutos de haber ajustado el inóculo, introducir un escobillón dentro de la suspensión y al retirarlo rotar varias veces contra la pared del tubo por encima del nivel del líquido con la finalidad de eliminar el exceso de inóculo. Inocular las placas de Mueller-Hinton completamente, sin dejar ninguna zona libre. Esto se consigue deslizando el escobillón por la superficie del agar tres veces, rotando la placa unos 60º cada vez y pasándola por último por la periferia del agar para conseguir una siembra uniforme. Dejar secar de 3 a 5 minutos antes de depositar los discos.
C.- Dispensación de los discos.
Colocar los discos manualmente con pinzas estériles. Debe asegurase que contacten perfectamente con la superficie del agar, por lo que deben presionarse ligeramente sobre la superficie del agar. No deben situarse a menos de 15 mm del borde de la placa, y han de estar distribuidos de forma que no se produzca superposición de los halos de inhibición. Para placas de 150 mm no se emplearán más de 12 discos y para las de 100 mm no más de 6.
Incubar las placas invertidas (agar en la parte superior), en grupos no superiores a 5 placas, a 35°C en atmósfera aeróbica antes de que transcurran 15 minutos. Las placas se incubarán 16-18 horas.
D.- Lectura de los Resultados.
24 Como regla general, no debe considerarse aquellas colonias diminutas que aparecen en el halo de inhibición y que han sido visualizadas mediante luz transmitida o con ayuda de una lupa, a excepción de estafilococos resistentes a oxacilina o enterococos resistentes a vancomicina. La interpretación de los resultados puede realizarse en función de las normas del NCCLS (79-84) (ver anexo N° 8-11).
2.2.2.5.- Antimicrobianos Seleccionados
Es evidente la imposibilidad de ensayar un gran número de antimicrobianos frente a un microorganismo determinado. La selección final de qué antibióticos deben ser estudiados dependerá del criterio del investigador (86). En las Tablas 1 a 5 (ver en anexo 13 y 14) se muestran los antimicrobianos recomendados por la NCCLS (79-84), agrupados en cuatro grupos según el trabajo de Washington (85). En el grupo A se encuentran aquellos antimicrobianos que se han de ensayar y que deben ser informados de forma rutinaria. El grupo B está constituido por antimicrobianos que pueden ser valorados de forma rutinaria, pero cuya información se efectuará de forma selectiva; es decir, solamente se informarán si los del grupo A no son activos, no son apropiados para un lugar determinado de la infección, o si se constata un fallo terapéutico con el grupo A. En el grupo C están incluidos los antibióticos que serán estudiados cuando aparezcan problemas específicos de resistencia, por ejemplo, brotes epidémicos, en pacientes con alergia a otros antibióticos o en infecciones inusuales. Finalmente, el grupo D, se destina a antimicrobianos utilizados en infecciones del tracto urinario.
2.2.2.6.- Control de Calidad
25 El NCCLS ha establecido unos límites en los diámetros de las zonas de inhibición que son aceptables para las cepas utilizadas en el control de calidad (79-84). Los problemas que podamos encontrar en la determinación del halo de inhibición de las cepas de control de calidad y su resolución se detallan anexo 12. Para el control del inoculo se utiliza un MacFarland 0.5.
2.2.2.7.- Preparación de MacFarland 0.5
Para prepararlo se emplea 0.5 ml de 0.048 M de BaCl2 (1,175 % BaCl2 +
2H2O) en 99,5 ml de 0.18 M H2SO4 (1% v/v) con agitación constante.
La absorción a 625 nm ha de estar entre 0.08 y 0.10 (comprobar cada mes). Alícuotas de 4 a 6 ml se distribuyen en tubos con tapón de rosca y se guardan en la oscuridad a temperatura ambiente.
2.2.2.8.- Resultados
Interpretación: Comparando los diámetros del halo de inhibición con las CMIs, y estableciendo las correspondientes rectas de regresión, se han fijado unos criterios para clasificar las cepas estudiadas. De esta forma se han fijado tres categorías: sensible (S), intermedia (I) y resistentes (R). Anteriormente se añadía la categoría moderadamente sensible (MS) que tiende a eliminarse y los resultados correspondientes a la misma se han situado en la categoría de intermedia.
26 El término intermedio indica que el halo de inhibición traducido en valores de CMI se aproxima a las concentraciones de antimicrobiano alcanzables en sangre o tejidos y que puede esperarse eficacia clínica en aquellas localizaciones en las que se alcanzan altas concentraciones de antimicrobiano (p. ej. orina) o cuando se emplean dosis más elevadas de lo habitual.
El NCCLS también incluye en esta categoría aquellos casos de antimicrobianos con márgenes de toxicidad estrechos en los que pequeños errores técnicos podrían suponer cambios de interpretación en la categoría clínica (79-84, 86).
27 2.2.3.- Método de Dilución en Caldo
2.2.3.1.- Antecedentes
Las pruebas de dilución han sido utilizadas durante años. Los procedimientos iniciales eran realizados en tubos de ensayo grandes (13 por 100 mm) con volúmenes de caldo de por lo menos 1 ml. Este método fue estandarizado en la década de los años 70 por el Estudio Cooperativo Internacional y luego la NCCLS publicó un estándar del método (31,79-84, 86). Este método es llamado macrodilución en caldo. A partir de los años 60 se comenzaron a utilizar dispositivos serológicos para dispensar y diluir. Esta miniaturización simple de la técnica se conoció como microdilución en caldo.
2.2.3.2.- Fundamento del Método
La cuantificación de la actividad in vitro de los antimicrobianos se evalúa habitualmente mediante alguna de las variantes de los métodos de dilución. Estos métodos se basan en la determinación del crecimiento del microorganismo en presencia de concentraciones crecientes del antimicrobiano, que se encuentra diluido en el medio de cultivo (caldo o agar).
28 2.2.3.3.- Indicaciones y Limitaciones
Los métodos de dilución se consideran de referencia para la determinación cuantitativa de la actividad de los antimicrobianos. Son los métodos indicados cuando, además de la actividad inhibitoria, se quiere determinar también la actividad bactericida. La gran cantidad de variables (dependientes del microorganismo, del medio de cultivo, del inóculo) que influyen en estos métodos son responsables de oscilaciones en el resultado finalmente obtenido, por lo que para su correcta evaluación es necesario que se realicen de forma estandarizada.
La determinación de la actividad antimicrobiana mediante técnicas de dilución se realiza utilizando una escala discontinua (habitualmente concentraciones crecientes en base 2) en vez de una escala continua (como sucede en el método de difusión), por lo que los valores de CMI reales de un determinado antimicrobiano se encontrarán en algún valor situado entre la CMI experimentalmente obtenida y la concentración inmediatamente inferior (79
-84). Desde el punto de vista clínico la diferencia entre los valores real y experimental de CMI no suelen ser trascendentes cuando se trata de concentraciones bajas, pero pueden tener importancia para las CMIs altas que se acerquen a las concentraciones alcanzables in vivo (84, 89).
2.2.3.4.- Método
A.- Preparación del Antimicrobiano.
29 La sustancia valorada debe pesarse en una balanza de precisión. Para conseguir una determinada concentración, lo más sencillo es pesar con un ligero exceso una cantidad de sustancia valorada y, posteriormente, añadir el volumen de diluyente necesario. Como resulta obvio, para calcular una determinada concentración de antimicrobiano hemos de considerar la pureza de la sustancia que se esté empleando (que en la mayoría de casos no es del 100%). Las concentraciones de antimicrobianos deben prepararse al menos 10 veces más concentradas que la concentración más alta que se vaya a evaluar, y en todo caso superior a 1000 mg/l. En el anexo 13 se indican los diluyentes y solventes necesarios para la preparación de los antimicrobianos más habituales. No es necesario esterilizar las soluciones de antimicrobianos porque la contaminación de estas soluciones es muy infrecuente.
Las soluciones de antimicrobianos se deben emplear el mismo día de su preparación. Alternativamente, se pueden congelar en alícuotas (usando tubos estériles de vidrio o plástico). La temperatura ideal para la conservación de estas soluciones es de al menos 60ºC, y en todo caso nunca superior a los -20ºC. Se acepta que a temperaturas de -60ºC las soluciones madres de antimicrobianos son estables, con muy contadas excepciones, durante al menos 6 meses.
30 En anexo 12 están los rangos de dilución aconsejables desde un punto de vista clínico (90). Algunos investigadores y/o laboratorios han de estudiar la actividad de nuevos antimicrobianos o realizar estudios comparativos sobre miembros de grupos/familias estrechamente relacionados, pero en general, y teniendo en cuenta que el número de antimicrobianos (de uso clínico) es enorme, no todos ellos se pueden estudiar de forma rutinaria (89).
En general, se escoge un representante de un grupo y se asume que la actividad de otros antimicrobianos del mismo grupo, con igual mecanismo de acción y frente a los que los mecanismos de resistencia bacteriana son similares, tendrá una actividad igual o muy similar. Por otro lado, aun cuando el laboratorio estudie un amplio grupo de antimicrobianos de forma rutinaria, muchos autores consideran innecesario informar de todos ellos al clínico.
B.- Dilución en Caldo.
El NCCLS recomienda para la mayoría de los microorganismos utilizar caldo Mueller-Hinton, al que se añadirán los suplementos necesarios para asegurar el crecimiento de organismos exigentes (79-84). El medio debe tener un pH de 7.2 a 7.4 y estar ajustado con Ca2+ (20-25 mg/l) y Mg2+ (10-12.5 mg/l). Esta cantidad de iones divalentes asegura la reproducibilidad de los valores de CMI de aminoglucósidos frente a P. aeruginosa y de tetraciclinas frente a la gran mayoría de microorganismos, al compararlos con los que se obtienen con agar Mueller-Hinton.
El ajuste de cationes del caldo Mueller-Hinton se hará en función de la cantidad basal que contenga el mismo, habitualmente proporcionada por los fabricantes del medio. Por cada 1 mg/l de incremento que sea necesario ajustar se añaden, al medio ya estéril y a 4ºC, 0.1ml de una solución esterilizada por filtración que contiene 10mg de Mg2+/ml (8.26 gramos de Cl2Mg.6H20 en 100
31 Si el fabricante ofrece ya un medio con las cantidades suficientes de cationes divalentes no es necesario ajuste alguno. Existen dos modalidades de los métodos de dilución, en las que se utilizan tubos (macrométodo) o placas de microtitulación (micrométodo).
Método de Macrodilución:
En el método de macrodilución se emplea por cada combinación microorganismo/antimicrobiano una batería de tubos. Habitualmente se prepara la batería de tubos con 1ml de medio estéril sin antimicrobiano. Al primero de ellos se añade 1 ml de la solución inicial del tubo de antimicrobiano hasta conseguir la concentración más alta a estudiar (teniendo en cuenta que este primer paso supone la dilución a la mitad de la solución madre, y que una vez inoculados los tubos, con 1 ml de inóculo, se diluirá nuevamente la concentración de antimicrobiano a la mitad). Tras mezclar adecuadamente, se pasa 1 ml al siguiente tubo; el proceso se repite tantas veces como diluciones se quieran estudiar, eliminando del último tubo de la serie 1 ml de medio con antimicrobiano, con objeto de mantener el volumen final de 1 ml. Para cada paso de dilución se debe emplear una pipeta diferente. La serie de tubos se completa con uno de control sin antimicrobiano que solamente tiene 1 ml de caldo.
Método de Microdilución:
32 Teniendo en cuenta que la mayoría de placas disponibles tienen 96 pocillos (12x8), podemos estudiar con cada una de ellas, y para el mismo microorganismo 8 antimicrobianos y 11 diluciones (la última columna se suele utilizar como control de crecimiento) o viceversa. En ocasiones se preparan placas con 12 diluciones de antimicrobiano y se utiliza una placa adicional para realizar los controles. El volumen final de cada pocillo es habitualmente de 100 µl, por lo que antes de la inoculación de la placa, cada pocillo debe contener 100 µl de caldo con antimicrobiano (volumen de inóculo menor de 10 µl) o 50 µl (si se van a usar también 50 µl para inocular la placa). En este último caso debe tenerse en cuenta, a la hora de calcular la concentración inicial más alta, que tras añadir el inóculo la concentración de antimicrobiano se diluirá a la mitad. Dependiendo, pues, del volumen de inóculo final, las placas se rellenan utilizando una pipeta multicanal con 100 ó 200µl de la solución más alta de antimicrobiano en la columna 1. Posteriormente se añade un volumen de 50 o 100µl de caldo sin antimicrobiano en los pocillos de las columnas 2 a 11 y se realiza la dilución en la forma habitual empleando la pipeta multicanal, dejando los pocillos de la última columna como controles (positivos - no antimicrobiano- y negativos - no inóculo-).
33 Fig. N° 8. Determinación de la Concentración inhibitoria mínima (CIM) y de la Concentración Bactericida Mínima (CBM). Fundamentos: consiste en exponer a las cepas a estudiar a diferentes concentraciones de antimicrobianos, en diluciones a la mitad y observar el crecimiento de los microorganismos para luego definir la CIM
C.- Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria (CMI)
34 D.- Lectura e Interpretación de la CMI.
La CIM corresponde a la mínima concentración de antibiótico en donde no se observa desarrollo (turbidez). La CIM se expresa en μg/ml. Luego se debe
recurrir, teniendo en cuenta el valor de CIM obtenido para esa cepa, a las tablas para definir según los valores de CIM que en ellas aparecen si las cepas en estudio son sensibles o resistentes a un determinado antibiótico (84).
Diámetro de la zona de inhibición (mm)
35 E.- Informe de Resultados.
Cuando la determinación de la CMI tiene una finalidad clínica, no es aconsejable presentar simplemente los valores absolutos obtenidos con cualquiera de los métodos expuestos. Resulta más útil traducir, mediante una categorización cualitativa, estos valores de CMI. La interpretación de estos resultados debe considerar también aspectos farmacocinéticos, posibles mecanismos de resistencia y datos de eficacia clínica. De esta forma se pueden distinguir tres categorías clínicas: sensible, intermedio y resistente (76-91).
2.2.4.- Comparación de Técnicas
Normalmente, las pruebas cuantitativas clásicas (dilución en caldo o en agar) se suelen tomar como patrones de referencia para evaluar otros sistemas de determinación de sensibilidad antimicrobiana. Cualquier laboratorio que realice antibiogramas con regularidad debería comparar periódicamente sus resultados con la determinación de CMI como método de control de calidad. A partir de esta comparación podemos elaborar un cuadro similar al siguiente, en el que se puede ver la clasificación de resultados en las dos técnicas:
36 2.2.5.- Característica de las cepas en estudio
2.2.5.1.- Haemophilus influenzae
Los microorganismos de Haemophilus son bacilos gramnegativos pequeños y, en ocasiones, pleomorfos (ver figura N° 11; cuadro 35-1). Haemophilus influenzae es la especie que se asocia con mayor frecuencia a enfermedad y las infecciones en pacientes pediátricos eran las más frecuentes con anterioridad a la introducción de la vacuna frente a H. influenzae tipo b (HIB). Haemophilus aegyptius es una causa importante de conjuntivitis aguda purulenta (92, 93,
95). Desde el punto de vista taxonómico, H. aegyptius pertenece a la especie H influenzae, aunque tradicionalmente se ha separado de esta. Para complicar aún más esta clasificación, H. influenzae biogrupo aegyptius presenta una relación fenotípica con H. aegyptius, si bien difiere de esta especie a nivel taxonómico. El biogrupo aegyptius es el agente etiológico de la enfermedad pediátrica fulminante conocida como fiebre purpúrica brasileña (96).
37 La estructura de la pared celular de Haemophilus es la típica de otros bacilos gramnegativos. La pared celular posee un lipopolisacárido con actividad de endotoxina, y la membrana externa presenta proteínas específicas de cepa y específicas de especie. El análisis de estas proteínas específicas de cepa resulta de utilidad en los estudios epidemiológicos. La superficie de muchas de las cepas de H. influenzae está recubierta de una cápsula de polisacárido, y se han identificado seis serotipos antigénicos (de la a a la f). Con anterioridad a la introducción de la vacuna HIB, el serotipo b de H. influenzae era el responsable de más del 95% de las infecciones invasivas por Haemophilus. Casi todas las enfermedades causadas por este serotipo han desaparecido tras la introducción de esta vacuna. En la actualidad, los serotipos c y f y los serotipos no encapsulados de H. influenzae producen la mayor parte de las infecciones por H. influenzae. Las especies de Haemophilus se encuentran presentes en casi todas las personas, en las que colonizan principalmente las membranas mucosas del tracto respiratorio (92, 97).
39 Escherichia coli es la especie tipo del género Escherichia. Incluye gérmenes generalmente móviles, que producen ácido y gas a partir de la glucosa, la arabinosa, y habitualmente de la lactosa y otros azúcares. Producen reacción positiva de rojo de metilo, y negativa de Vogues-Proskauer. Son inhibidos por KCN e incapaces de crecer en medio con citrato como única fuente de carbono y energía, pero sí en caldo acetato. Son H2S, ureasa y fenilalanina negativos,
pero en general son indol positivos y decarboxilan la lisina (ver Tabla 1). Se clasifican en más de 170 serogrupos O según las características antigénicas de su LPS, y en serotipos por la combinación de antígenos O y H flagelares. Otros antígenos presentes en distintas cepas (capsulares, fimbriales y otros) han sido empleados para su clasificación o identificación.
TABLA N° 1
Características Generales de E. Coli
40 E. coli coloniza el tracto gastrointestinal a las pocas horas de vida del niño, y establece con el huésped una relación estable de mutuo beneficio (102). Como integrante de la flora normal del hombre y de muchos animales, se lo considera un germen indicador de contaminación fecal cuando está presente en el ambiente, agua y alimentos, junto con otros similares agrupados bajo la denominación de "bacterias coliformes". Estas son enterobacterias que pertenecen al género Escherichia y a otros relacionados como Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter o Serratia, y que tienen en común la capacidad de fermentar la lactosa en un lapso no mayor de 48 horas, con producción de ácido y gas.
Son gérmenes de gran ubicuidad y capacidad de proliferación, y a la vez de fácil cultivo e identificación, y por lo tanto muy útiles como indicadores de contaminación, pero no son enteropatógenos como grupo (como tampoco lo es E. coli), y por lo tanto su presencia en alimentos, ambiente o pacientes no certifica la etiología de una infección intestinal o un brote de ETA.
41 Figura N° 12.Microfotografía de contraste de Escherichia coli (103)
TABLA 2
Escherichia coli. Patógeno Entérico
Enterotoxigénicos ETEC
Enteropatógenos clásicos EPEC
Entero invasores EIEC
Productores de toxina de shiga STX STEC
Entero agregativos EAEC
TABLA 3
TOXIINFECCIONES ALIMENTARIAS PRODUCIDAS Por E. Coli
42 2.2.5.3.- Staphylococcus aureus
Staphylococcus aureus es una bacteria Gram positiva esférica que se agrupa en pares, cadenas cortas o agrupado en racimos. Algunas cepas son capaces de producir toxinas termostables capaces de causar enfermedades en humanos como la estafiloenterotoxicosis.
La estafiloenterotoxicosis, estafiloenterotoxemia o intoxicación estafilococica es una intoxicación alimentaria asociada a Staphylococcus aureus (104).
La gravedad de los síntomas depende de la susceptibilidad del individuo hacia la toxina, la cantidad ingerida de alimento contaminado, la cantidad ingerida de toxina y la salud general en general del hospedero. Los síntomas más comunes son náusea, vómito, dolor y calambres abdominales y postración. Algunos individuos podrían no siempre mostrar todos los síntomas asociados con la enfermedad (105).
En los casos más graves podrían presentarse dolores de cabeza, calambres musculares y cambios temporales en la presión arterial y en la frecuencia del pulso. La recuperación generalmente lleva dos días. Sin embargo, no es inusual que la recuperación completa lleve tres días y algunas veces más en los casos más graves (URL-9). Esta intoxicación está asociada a alimentos que se han sometido a un proceso de cocción inadecuado o bien a un almacenamiento a bajas temperaturas (7.2 °C o menos) (URL-9).
43 Figura Nº 13. Microfotografía de contraste de Staphylococcus aureus (106)
44 2.2.5.4.- Pseudomona aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa es un microorganismo ambiental común resistente a algunos desinfectantes químicos, y que además puede crecer en algunos de ellos. P. aeruginosa es el principal agente biológico de la mayoría de las intoxicaciones, septicemias y enfermedades gastrointestinales intrahospitalarias (96). Asimismo, los miembros de la familia Pseudomoniaceae son relevantes en los procesos de conservación de alimentos y constituyen puntos de riesgo en programas de calidad de acuerdo con HACCP (Hazard Analysis of Critical Control Points) (108).
Figura Nº 14. Microfotografía electrónica de barrido de Pseudomonas aeruginosa (94).
Pseudomonas aeruginosa es una bacteria patógena Gram negativa de 2-5 m
45 Esta versatilidad le da oportunidad de responder a condiciones ambientales variables y frecuentemente adversas. Considerado por muchos como un organismo aeróbico, es capaz de crecer anaeróbicamente en presencia de ciertos sustratos como los nitratos o la arginina (99). Es capaz de crecer en fuentes nutritivas muy simples e inclusive utilizar lentamente compuestos empleados en la formulación de desinfectantes y antisépticos.
46 CAPÍTULO III
MATERIALES Y MÉTODO
3.1.- METODOLOGÍA
3.1.1.- Lugar de Estudio
El trabajo Farmacognóstico se realizó en el Laboratorio de Ingeniería de Alimentos ubicado en la Planta Piloto de la Universidad Nacional de la Amazonia Peruana (UNAP) ubicado en la Av. Freyre N° 610 - Iquitos. La determinación de la Actividad Antimicrobiana mediante el Método de KIRBY-BAUER se realizó en los ambientes del Laboratorio de Microbiología de la Facultad de Ciencias Biológica de la UNAP entre los meses de febrero y Junio del 2013.
3.1.2.- Tipo de Investigación
Se empleó el siguiente tipo de investigación:
Experimental, porque se evaluó un fenómeno dado introduciendo elementos que
modifica el comportamiento de las variables en estudio, las mismas que fueron medidos en determinados momentos.
Descriptivo: porque el estudio describió e interpretó en forma clara y detallada los
hechos obtenidos en la investigación.
Prospectivo, porque se desarrolló hacia delante del tiempo.
Longitudinal, porque permitió realizar la recolección sistemática de las variables
47 3.1.3.- Diseño de la Investigación
48 3.1.4.1.- Diagrama de Flujo para Extracción Etanólico
Esquema N° 1: Flujograma de investigación. Preparación del extracto etanólico de hojas y
tallo de Clibadium surinamense L. Identificación Taxonómica
Recolección de Muestras
Evaluación actividad antibacteriana in vitro Método de KIRBY-BAUER
Determinación del Rendimiento
Staphylococus aureus ATCC 25923
Haemophilus influenzaeATCC 49247
Screening Fitoquímico Obtención del Extracto
Etanólico de hojas y tallo de Clibadium surinamense L.
(Huaca)
49 Susceptibilidad
Para la interpretación de los resultados se consideraron 3 categorías:
Inhibición del crecimiento, a todo halo translúcido detectado alrededor del disco, es decir que la bacteria es sensible al compuesto.
No inhibición del crecimiento, es decir que no se forma halo y la bacteria no es sensible. Se presenta en la tabla como (NI)
50 3.1.5.1.- Recolección y Procesamiento de las Muestras
La muestra botánica fue envuelta en papel periódico y puesta en costales desinfectados para su transporte al Laboratorio de Ingeniería de Alimentos ubicado en la Planta Piloto de la Universidad Nacional de la Amazonia Peruana (UNAP) ubicado en la Av. Freyre N° 610 - Iquitos.
Con la muestra botánica recolectada se anotaron los datos referente a la especie y fecha de colecta, luego parte de la muestras botánica se prenso y fue sometido al proceso de secado a temperatura de 40º C, luego las muestras pasaron al montaje sobre cartulina y se etiquetaron consignándose los siguientes datos, según anexo Nº01.
3.1.5.2.- Identificación Taxonómica de la Muestra Vegetal
La identificación taxonómica de la especie colectada fue identificada en el Herbarium Amazonense de la Universidad Nacional de la Amazonía Peruana, con la asesoría de un botánico, el cual determinó la categoría taxonómica según el sistema de clasificación de Engler & Prantil modificado por Melchor (44).
3.1.5.3.- Preparación de Materia Prima
51 Se eliminó cuidadosamente el polvo y la tierra adherida, de preferencia se utilizaron cuchillos de acero inoxidables de hoja roma
3.1.5.3.2.- Lavado
Tuvo por finalidad eliminar los últimos vestigios de tierra, se realizó mediante un flujo continuo de agua potable a temperatura ambiente y luego se dejó escurrir y se dio un oreado por seis (06) horas para eliminar el exceso de humedad.
3.1.5.3.3.- Cortado
Debido a que la muestra debe ser secada, se recomienda cortarlas en hojuelas de 1 cm para facilitar la operación de secado. Esto se realizó en forma manual con ayuda de cuchillos de acero inoxidable. Para los tallos se cortaron en fragmento menor de 1 cm, también para facilitar la operación de secado.
3.1.5.3.4.- Secado
Se realizó para facilitar el proceso de extracción; se hicieron pruebas con un secador de bandejas a 60ºC, secado natural bajo el sol y secado natural bajo cobertizo. El tiempo total de secado estuvo comprendido entre una a dos semanas y la humedad final de la materia prima varió entre 12 y 13%.
3.1.5.3.5.- Molienda
52 El extracto se obtuvo por maceración en frio (a temperatura ambiente) añadiendo el disolvente (etanol 70%) durante 7 días.
Luego se filtró en contenido y se vacío en un Erlenmeyer, la concentración del extracto se realizó por eliminación de disolventes a presión reducida en un rotavapor, a una temperatura de 46ºC y a una presión de 690 mnHg por espacio de 3 horas aproximadamente, posteriormente se dejó secar a temperatura ambiente por 7 días.(Ver foto 7 en anexo Nº 05)
3.1.5.5.- Determinación del Rendimiento
Para el cálculo de los porcentajes de rendimientos se utilizará la siguiente ecuación tanto para la hoja como para el tallo:
Peso del extracto
% Rendimiento = x 100 Peso de la muestra total
3.1.5.6.- Tamizaje Fitoquímico
53 3.1.6.1.- Preparación del Inóculo
Con un asa bacteriológica se tocan cuatro o cinco colonias bien aisladas del mismo tipo morfológico y se inoculó en 4 ml de caldo Mueller Hinton. Los cultivos de caldo se dejaron incubar por 2 horas a 35°C hasta la aparición de una turbidez ligeramente visible. La turbidez se ajustó con caldo cerebro-corazón (BHI) para obtener una turbidez visualmente comparable a la del estándar (0.5 de Mc Farland). Luego de preparado el inóculo bacteriano con la cepa en estudio se realizaron los siguientes pasos:
Se introdujo un hisopo estéril en el inóculo bacteriano preparado, de manera de embeberlo completamente. Antes de retirarlo se escurrió sobre las paredes del tubo para retirar el exceso de líquido del mismo.
Se sembró la placa de Mueller Hinton de manera de obtener un crecimiento confluente, para lo cual se realiza estría con el hisopo en forma paralela y bien compacta abarcando toda la superficie de la misma. Luego se repitió el procedimiento rotando la placa 60° en dos oportunidades más.
Se dejó secar 3 a 5 minutos antes de colocar los discos.
54 Con un perforador estéril se perforó papel filtro Whatman No. 1 (Whatman International Ltd. England), obteniéndose discos de 5.5mm de diámetro. De cada una de las diluciones de 2, 4, 8, 16, 32 y 64 mg/ml de los extractos etanólico tanto de hojas como de tallo, se procedió a preparar los discos de sensibilidad añadiendo 15 L., de las soluciones en discos de papel.
3.1.6.3.- Aplicación de los Discos
Se aplicó los discos usando unas pinzas ligeramente flameadas
Se presionó los discos ligeramente contra el Agar.
Se usó 5 discos por placa.
1.6.4.- Determinación de la Concentración Mínima Inhibitoria
La Concentración Mínima Inhibitoria (CMI) se basó en las normas de la NCCLS. Se preparó Caldo Nutritivo en tubos con tapa rosca en los que se añadieron los extractos etanólico de las hojas y del tallo preparados a concentraciones finales de 2, 4, 8, 16, 32 y 64 mg/ml, se autoclavarón los tubos a 125º C a 15lb de presión, luego de atemperar los tubos a 37º C se sembrará 107 UFC de las bacterias control en los tubos con Caldo Nutritivo BHI, se incubarán a 37º C por 48 horas.
Luego se tomó 15µl del cultivo y se añadió al caldo nutritivo BHI, los que se incubaron a 37º C por 48 horas, al cabo de ese tiempo se registró la turbidez de los tubos. Al cabo de 24 horas se observa la turbidez de los tubos que indicara desarrollo bacteriano.
56 3.2.1.- Población en Estudio
Lo constituyen las unidades de las especies vegetales de:
Clibadium surinamense L. (Huaca)
3.2.2.- Muestra en Estudio
La muestra vegetal lo constituyen las hojas frescas y tallo de:
Clibadium surinamense L. (Huaca)
3.2.3.- Selección de las Muestras Botánicas
La selección de las muestras botánicas a estudiar, se realizará tomando en cuenta los siguientes criterios:
Arbustos jóvenes de tamaño mediano de Clibadium surinamense L. (Huaca)
Hojas sanas de Clibadium surinamense L. (Huaca)
57 Las muestras botánicas de Clibadium surinamense L. “huaca” fue colectado en la comunidad de “SAN ANDRES”, ubicado en las coordenadas geográficas de latitud sur 3º 41´ 2´´, longitud 73º 16´ 43´´, y una altura de 92 m.s.n.m. (coordenadas Universal de Transversal de Mercator -UTM-, x 691,155.29, y 9´591,999.76); La cual abarca una superficie de 10 ha, con una temperatura media mensual que oscila entre 20º C y 33º C; del Distrito de Villa Punchana, Provincia de Maynas del Departamento de Loreto.
El lugar de muestreo se eligió debido a que la comunidad realiza su pesca artesanal con huaca y cuenta con Clibadium surimanense L. de diferentes especies.
3.3.- INSTRUMENTOS 3.3.1.- Material Vegetal
El material vegetal serán los extractos etanólico de las hojas y tallo de Clibadium
surinamense L. (huaca).
3.3.2.- Material Biológico en Estudio
Staphylococcus aureus ATCC 25923
Haemophilus influenzaeATCC 49247
Pseudomona aeruginosa ATCC 27853
Escherichia coli ATCC 25922
3.3.3.- Medios de Cultivos
