Efectos de los compuestos activos y funcionales de la alcachofa (Cynara cardunculus) en el control del metabolismo energético

Texto completo

(1)Facultat de Ciències Memòria del Treball de Fi de Grau. Efectos de los compuestos activos y funcionales de la alcachofa (Cynara cardunculus) en el control del metabolismo energético Youssef Ahmiane Grau de Bioquímica Any acadèmic 2015-16. Treball tutelat perJoan Ribot Riutort Departament de Biologia Fonamental i Ciències de la Salut S'autoritza la Universitat a incloure aquest treball en el Repositori Institucional per a la seva consulta en accés obert i difusió en línia, amb finalitats exclusivament acadèmiques i d'investigació. Autor. Sí. No. x. Tutor. Sí. No. x. Paraules clau del treball: Cynara cardunculus, Cynara Scolymus, ácido clorogénico, metabolismo energético, adipocitos 3T3-L1.

(2)

(3) Trabajo de fin de grado. INDICE ABSTRACT/RESUMEN ............................................................................................. 2 PARTE BIBLIOGRAFICA ..................................................................................................... 2 1. INTRODUCCIÓN ....................................................................................................... 3 1.1. Origen, taxonomía y distribución geográfica de Cynara Cardunculus .............. 3 1.2. Descripción botánica o morfológica de la alcachofa ....................................... 4 1.3. Propagación, cultivo y producción de la alcachofa .......................................... 4 1.4. Usos tradicionales .......................................................................................... 5 1.5. Calidad e importancia nutricional ..................................................................... 6 1.6. Relación con el metabolismo energético ........................................................ 6 2. OBJETIVOS ............................................................................................................... 7 3. MATERIALES Y MÉTODOS ...................................................................................... 8 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN .................................................................................. 8 4.1. Compuestos bioactivos de la alcachofa ........................................................... 8 4.1.1. Extracto fenólico .................................................................................. 9 A. Ácidos fenólicos ........................................................................... 10 B. Flavonoides.................................................................................. 11 C. Composición del extracto fenólico ............................................... 11 4.1.2. Extracto del aceite esencial ................................................................ 13 A. Terpenos ..................................................................................... 13 B. Compuestos no terpenoides ....................................................... 15 C. Composición del aceite esencial ................................................. 15 4.1.3. Compuestos destacados ................................................................... 17 A. Ácido clorogénico ........................................................................ 17 B. Cinarina ....................................................................................... 18 C. Luteolina ....................................................................................... 18 4.2. Evidencias científicas de las propiedades de la alcachofa ............................. 19 PARTE EXPERIMENTAL .................................................................................................... 22 1. INTRODUCCIÓN ..................................................................................................... 22 2. DISEÑO DEL EXPERIMENTO ................................................................................ 22 3. MATERIALES Y MÉTODOS .................................................................................... 23 3.1. Células 3T3-L1 y cultivo celular .................................................................... 23 3.2. Diferenciación celular ................................................................................... 23 3.3. Tratamiento .................................................................................................. 23 3.4. Extracción de ARN total y síntesis de ADNc ................................................. 23 3.5. Análisis estadístico ....................................................................................... 24 4. RESULTADOS Y CONCLUSIÓN .............................................................................. 24 CONCLUSIONES GENERALES ......................................................................................... 26 AGRADECIMIENTOS ......................................................................................................... 27 BIBLIOGRAFÍA ................................................................................................................... 27. 1.

(4) Trabajo de fin de grado ABSTRACT The artichoke is a typical Mediterranean vegetable that belongs to the species Cynara cardunculus, but also grown in some Middle Eastern, Asian and American countries. It is a plant that has been used since ancient times by the Egyptians, Greeks and Romans for its therapeutic properties against liver and digestive disorders, and in the last decade it has been largely studied and a variety of properties against many diseases have been also demonstrated. The artichoke is composed of a high phytochemical content, mainly phenolic compounds and terpenoids which give various characteristic properties. Among the phenolic compounds include chlorogenic acid, and its derivatives as cynarin, and luteolin, and among terpenoids, cynaropicrin, βcubebene and caryophyllene. The aim of this work is to know the current status of the characterization of the chemical composition and properties of the artichoke demonstrated on human health. In addition to the bibliography, a little experiment in vitro was carried out in order to demonstrate the capacity of chlorogenic acid (GCA) in the induction of mouse´s white adipocytes browning, and therefore in the activation of thermogenic program. For the experiment, differentiated 3T3-L1 cells were used and then were treated with different concentrations of GCA (1, 5, 10, 25 and 50 μM) for 24 hours. The results have shown that GCA has a slightly inducing ability of some genes related with browning of white adipocytes at low dose (10 μM), whereas at high dose (50 μM), GCA has no effect on browning.. RESUMEN La alcachofa es una hortaliza típica de la cuenca mediterránea y pertenece a la especie Cynara cardunculus, pero también se cultiva en algunos países de Oriente, Asia y América. Es una planta que se ha usado desde la antigüedad por los egipcios, griegos y romanos por sus propiedades terapéuticas contra patologías hepáticas y digestivas, y durante las últimas décadas se le han atribuido y demostrado una gran variedad de propiedades contra muchas enfermedades. La alcachofa está compuesta por un alto contenido en fitoquímicos, principalmente por compuestos fenólicos y terpenoides que le otorgan diversas propiedades características. Entre los compuestos fenólicos destacan el ácido clorogénico, y sus derivados como la cinarina, y la luteolina, y entre los terpenoides, la cinaropicrina, β-cubebeno y cariofileno. El objetivo de este trabajo es conocer el estado actual de la caracterización de la composición química y las propiedades demostradas de la alcachofa sobre la salud humana. Además de la recopilación bibliográfica, también se ha realizado un pequeño experimento con el objetivo de demostrar los efectos del ácido clorogénico (ACG) en la inducción de la marronización de adipocitos blancos maduros de ratón. Se ha utilizado células 3T3-L1 diferenciadas y luego han sido tratadas con el ACG a diferentes concentraciones (1, 5, 10, 25 y 50 μM) durante 24 horas. Los resultados han reflejado que el ACG tiene una cierta capacidad inductora de algunos genes relacionados con la marronización de los adipocitos blancos a bajas dosis (10 μM), en cambio a altas dosis (50 μM), parece que el ACG no tiene efectos sobre la marronización.. 2.

(5) Parte bibliográfica. Trabajo de fin de grado. 1. INTRODUCIÓN 1.1. Origen, taxonomía y distribución geográfica de Cynara Cardunculus Cynara cardunculus L. es una antigua planta herbácea perene que se originó por polinización cruzada entre especies nativas de la cuenca mediterránea y Macaronesia (Madeira y Canarias) 1,2. Pertenece a la familia Asteraceae (Compositae), mayoritariamente son hierbas anuales, perennes, arbustos, pubescentes o glandulares y algunas tienen uso ornamental, medicinal y alimentario 3. Las plantas del género Cynara son angiospermas, dicotiledóneas y diploides con 34 cromosomas (2n=34) 4 Gracias a los estudios basados en la variación de isoenzimas y marcadores moleculares como los RAPD (random amplified polymorphic DNA) y AFLP (amplified fragment length polymorphism), el género Cynara se separó en dos grupos principales 2,5. El primer grupo es más heterogéneo y está formado por 7 especies que se caracterizan por poseer espinas en sus tallos y cabezas entre los cuales destacan las siguientes: C. bética, C. syriaca y C. aurantica. El segundo grupo comprende las especies de C. cardunculus L. 4,6. C. cardunculus L. contiene tres taxones (subespecies) diferentes: el cardo perenne salvaje (C. cardunculus subsp. Sylvestris), el cardo cultivado frondoso (C. cardunculus subsp. Altilis) y la alcachofa (C.cardunculus subsp. scolymus, a veces denominada simplemente Cynara scolymus). C. cardunculus subsp. sylvestris ha sido reconocido como el ancestro de los dos últimos taxones gracias a estudios con marcadores AFLP y RAPD 2,6,7. Estos taxones se diferencian por su morfología, color de las brácteas, forma y presencia de espines 4 (Figura 1).. Figura 1. Cabezas de la alcachofa, cardo silvestre y cardo cultivado respectivamente. 4. El cardo silvestre crece de forma natural en la Península Ibérica, norte de África, oeste de Turquía y en la Macaronesia 2, y también se ha naturalizado en América del Norte y del Sur, y en Australia 8. El cardo cultivado se cultiva principalmente en Italia, España, sur de Portugal y sur de Francia, y su propagación se lleva a cabo mediante semillas 8,9. Mientras que la alcachofa se produce en todo el mundo, especialmente en Italia, España, Francia y Turquía, debido a sus cabezas comestibles 5,6. El nombre botánico de la especie Cynara se deriva en parte de la tradición de la fertilización de la planta con las cenizas (en griego "Kynara" y en latín: cinis, cineris), y la subespecie Scolymus viene del griego "skolymos" que significa estaca puntiaguda, debido a sus espinas 6. La alcachofa es nativa del sur de Europa y el Norte de África. Su domesticación se remonta a alrededor de la edad imperial romana, posiblemente, en Sicilia, mientras el cardo cultivado probablemente fue domesticado en España en la Edad Media 2,6. A menudo, el origen de la alcachofa se asocia con la cultura árabe que dominaron el sur del Mediterráneo durante la Edad Media y. 3.

(6) Parte bibliográfica. Trabajo de fin de grado. probablemente tuvieron un papel importante en la difusión del cultivo de la alcachofa, entre otras plantas como las berenjenas y las espinacas 9. Cabe señalar que la palabra “alcachofa” proviene de la palabra árabe "al Quarshuff” 6,9. La alcachofa está representada por una multitud de variedades que se diferencien por su genotipo según el país de origen o donde se cultivan mayoritariamente y por sus características morfológicas 6. Las alcachofas que se siembran en Italia, primer productor mundial, se agrupan en 4 variedades que se diferencian en base a la morfología del capitulum o cabeza (Figura 2) 4–6: a) el grupo “Spinoso”, incluye genotipos con espinas en brácteas y capitulum; b) el grupo “Violetto”, con las cabezas espinosas púrpura y de tamaño mediano; c) el grupo “Romanesco”, con las cabezas no espinosas esféricas o sub-esféricas; d) el grupo “Catanese”, con el capitulum pequeño, alargada y no espinoso.. Figura 2. Alcachofas de Italia clasificadas por características 4 morfológicas del capitulum : 1) "Spinoso”, 2) “Violetto”, 3) “Romanesco”, 4) “Catanese”.. En Francia, las variedades que se cultivan allí, se dividen en dos grupos principales: “Breton”, con capítulos grandes y verdes; “Midi”, con capítulos pigmentados de color violeta y más pequeños 5,6. En España, la variedad más común es "Blanca de Tudela” con los capítulos en forma oval, pequeños, compactos y verdes. Se propaga vegetativamente y es producida principalmente en la región de Murcia y Navarra. Otras variedades autóctonas españolas, destacan la “Morada Mallorquina” y la “Monquelina” con unas características distintivas de las otras variedades 4,5. 1.2. Descripción botánica o morfológica de la alcachofa La alcachofa es una planta herbácea, perenne, con tallos erectos, gruesos y acanalados longitudinalmente con una altura de 1,5 a 2 metros 3,5. Los tallos finalizan en inflorescencias, que es la parte de la alcachofa que se consume aunque la parte de la alcachofa que se suele utilizar como remedio/suplemento medicinal son las hojas 5,7. La inflorescencia (capitulum o cabeza) es un receptáculo donde se insertan las flores y brácteas con un diámetro de 8-15 cm 4,6. Las flores son de color violeta y están recubiertas por brácteas que pueden ser espinosas o no dependiendo de la variedad. Las hojas son largas de unos 30-50 cm de largo y 10-20 cm de ancho, pubescentes de color verde claro plateado por encima (haz) y de color blanquecino con pelos o fibrillas por debajo (envés)5. La alcachofa tiene un sistema de raíces muy potente que se puede a adaptar a una gran gama de suelos. Las raíces contienen elevadas cantidades de inulina y se ha visto que pueden alcanzar una longitud de 5m 6. 1.3. Propagación, cultivo y producción de la alcachofa La alcachofa es una planta ampliamente distribuida por el mediterráneo y durante muchos siglos se ha propagado vegetativamente (mediante hijuelos y esquejes), pero durante los últimos años han aparecido variedades de alcachofa en el mercado que se propagan por semillas que tiene como ventaja el incremento de densidad de plantación y por tanto de producción 5,7,10. 4.

(7) Parte bibliográfica. Trabajo de fin de grado. La alcachofa es una hortaliza de temporada fría y su plantación se realiza durante los meses de julio y agosto, sus cultivos duran normalmente 2 a 3 años, sin embargo, en algunas zonas son habituales los cultivos anuales 3,10. Para el cultivo de alcachofas se recomienda climas cálidos (la temperatura óptima de crecimiento se sitúa alrededor de los 15 ºC a 18 ºC) y libres de heladas, con primaveras suaves, sin cambios bruscos de temperatura y con alta humedad relativa (sobre el 60%) 10. Debido a que la alcachofa posee un sistema radicular potente y profundo, se adapta a varios tipos de suelos aunque prefiere suelos profundos (más de 80 cm), arenosos y/o arcillo-arenosos, fértiles, bien drenados y con pH ligeramente alcalino (pH entre 6 y 8) 4. Deben evitarse los suelos livianos, que tienen un excesivo drenaje y poca conservación de la humedad, ya que se obtiene una producción muy baja 5,10. Actualmente, la alcachofa se cultiva sobre todo en los países mediterráneos como Italia, España, Francia y Egipto (además de Marruecos, Argelia, Túnez) contribuyendo de manera significativa a la economía agrícola mediterránea, pero en las últimas décadas su producción se ha ampliado a países de Oriente (Turquía e Irán), América del Sur (Argentina, Chile y Perú) y Estados Unidos (California). El principal productor mundial es Italia con una cosecha media de 470 millones de toneladas durante los últimos 5 años, Egipto con una cosecha de 281 millones de toneladas y España es el tercer productor mundial con 187 millones de toneladas. En América, los principales productores son Perú y Argentina con una producción 129 y 94 millones de toneladas en los últimos 5 años, respectivamente 3,11. 1.4. Usos tradicionales Las plantas de Cynara cardunculus son conocidas desde el siglo 4 a.C como alimento y remedio, era apreciada por los antiguos egipcios, griegos y romanos que la utilizaban como remedio por sus propiedades beneficiosas frente a enfermedades hepatobiliares y digestivas 1,12. A continuación se expondrá los usos que se hacían de la alcachofa a lo largo de la historia. En el siglo IV a. C, Teofrasto, alumno de Aristóteles, fue el primero en describir en detalle toda la planta. Los antiguos egipcios consideraban la alcachofa como una fuente de fortaleza y valentía, en cambio los griegos y romanos la consideraban una valiosa remedio contra males digestivos y solo se consumía en la nobleza 12. Entre 800 y 1500 d.C, varias fuentes informan que las alcachofas fueron traídas desde el norte de África y se cultivaron en Sicilia y España. En esta época, en España y Portugal, las flores de la alcachofa y también del cardo se usaban tradicionalmente como cuajo natural para la producción de quesos de oveja 3,4,6. Además, en muchas zonas del mediterráneo, sobretodo en Italia, sumergían las alcachofas en vino y/o hacían un licor de alcachofas con efectos beneficiosos sobre la actividad gastrointestinal, coagulación de la sangre, resistencia capilar, y actividad del corazón, además de tener un efecto neutralizante sobre ciertas sustancias tóxicas 3. En la primera mitad del siglo XX, científicos franceses e italianos comenzaron la investigación moderna sobre estos usos medicinales tradicionales de la planta de alcachofa y descubrieron que los extractos de esta planta estimulaba el hígado y la bilis 12, gracias concretamente a la cinarina, un compuesto característico de estas plantas. A partir de la década 1950, se descubrió que la cinarina podía bajar el colesterol 12.. 5.

(8) Parte bibliográfica. Trabajo de fin de grado. 1.5. Calidad e importancia nutricional La alcachofa representa un componente importante de la dieta mediterránea. Es una verdura muy saludable y nutritiva debido a su composición nutricional y fitoquímica 13.. Tabla 1. Información nutricional de las alcachofas crudas Nutriente Proximales Agua (g) Energía (kcal) Energía (kJ) Proteína (g) Lípidos total (grasa) (g) Ceniza (g) Hidratos de carbono (g) Fibra dietética total (g) Azúcares Totales (g) Minerales Calcio (mg) Hierro (mg) Magnesio (mg) Fósforo (mg) Potasio, K (mg). por 100g Nutriente Vitaminas Vit.C (mg) Tiamina (mg) Riboflavina (mg) Niacina (mg) Ácido pantoténico (mg) 1,13 Vit. B-6 (mg) 10,51 Folato Total (g) 84,94 47 197 3,27 0,15. 67. .. por 100g Nutriente. 11,7 0,072 0,066 1,046 0,338. Lípidos (en gramos) Ac. grasos, saturados totales Ac.g.totales monoinsaturados Ac.g.totales poliinsaturados ácidos grasos trans total Aminoácidos. por 100g. 0,036 0,005 0,064 0,000. 0,116 Triptófano (mg) 6 Otros: ácidos fenólicos #, en mg 68. 5,4 Folato 68 acido 3-O-Cafeoilquinico 57,22 Desde el punto alimentario (g) 0,99 Folato, DFE (g) 68 acido 4-O-Cafeoilquinico 267,02 nutricional, los capítulos de las alcachofas tienen Colina Total (mg) 34,4 acido 5-O-Cafeoilquinico 1544,91 44 Betaína (mg) 0,2 acido 1,3-O-Dicafeoilquinico 61,24 alrededor de 10% de 1,28 Vit. A, RAE (g) 1 acido 1,4-O-Dicafeoilquinico 142,91 carbohidratos, 3% de 60 β-caroteno (g) 8 acido 4,5-O-Dicafeoilquinico 224,56 90 Vit. A (IU) 13 acido 3,5-O-Dicafeoilquinico 347,05 proteínas, menos del 370 Luteína + 464 acido 1,5-O-Dicafeoilquinico 837,01 0,15% de lípidos y altos zeaxantina (g) 94 Vit. E (mg) 0,19 acido 3,4-O-Dicafeoilquinico 428,71 niveles de minerales Sodio (mg) Zinc (mg) 0,49 Vit. K (g) 14,8 Otros: flavonoides# (sobre todo potasio y Cobre (mg) 0,231 Naringenina (mg) 12,5 Apigenina (mg) 7,5 calcio) 6,67. Debido al Manganeso(mg) 0,256 Selenio, Se (g) 0,2 Luteolina (mg) 2,3 alto contenido de fibra # extraído de 1 (5,4%) y compuestos fenólicos la alcachofa se considera también un alimento funcional con propiedades antioxidantes 14– 16 (Tabla 1). Por su contenido bajo en grasas y alto contenido en fibra, la alcachofa es un ingrediente ideal en dietas para la pérdida de peso, que se pueden comer crudas en ensaladas, cocidas o guisadas con carne.. 1.6. Relación con el metabolismo energético En las últimas décadas, se ha demostrado que los alimentos que contienen fitoquímicos bioactivos modulan diferentes vías fisiológicas y moleculares implicadas en el metabolismo energético, y se ha visto que estos compuestos pueden tener efectos beneficiosos sobre la salud como la prevención de diferentes enfermedades metabólicas como la diabetes tipo 2 y la obesidad, enfermedades cardiovasculares e inflamatorias, y cáncer 17–19. La prevalencia de la obesidad y sobrepeso está aumentando a un ritmo alarmante en todo en el mundo, y según datos de la OMS, más del 10% de la población mundial adulta es obesa. La obesidad presenta un estado de balance energético positivo crónico asociado con un exceso de acumulación de grasa resultante de la ingesta de energía superior al gasto energético. La obesidad aumenta el riesgo de padecer diabetes tipo 2, enfermedades cardiovasculares (como hipertensión, dislipidemias y aterosclerosis) y esteatosis hepática no alcohólica 20,21. A causa del aumento progresivo de la obesidad 20, los países desarrollados están invirtiendo muchos recursos para desarrollar tratamientos o terapias preventivas, y se ha visto que los fitoquímicos presentan propiedades potenciales anti-obesidad ya que intervienen en diferentes mecanismos que regulan el gasto energético como: la disminución de la absorción de lípidos, disminución de la ingesta. 6.

(9) Parte bibliográfica. Trabajo de fin de grado. de energía, aumento del gasto de energía (supresión de las vías anabólicas y estimulación de las vías catabólicas en el tejido adiposo, hepático y otros tejidos), inhibición de la diferenciación de preadipocitos a adipocitos, estimulación de la apoptosis de los adipocitos maduros, inhibición de la angiogénesis en los tejidos adiposos, y reducción de la inflamación crónica asociada con la adiposidad 18,19. Uno de los mecanismos que más se está investigando es el aumento del gasto energético mediante la inducción de la remodelación del tejido adiposo blanco a marrón, este último tiene propiedades termogénicas, disipando el exceso de energía en forma de calor. En este proceso, el tejido adiposo marrón de los mamíferos (BAT, brown adipose tissue) juega un papel importante en el control del balance energético. El BAT contiene altas cantidades de la proteína UCP1, la cual disipa en forma de calor la energía generada en la fosforilación oxidativa por el gradiente protónico 19,22,23. En varios estudios se ha descrito que hay compuestos naturales que remodelan el tejido adiposo blanco (WAT, white adipose tissue) en un tejido parecido al BAT llamado “beige”, que contiene un alto nivel de mitocondrias, de esta manera aumenta su capacidad de oxidación de los ácidos grasos 19,23. Esta remodelación del WAT se considera una estrategia útil para el tratamiento de la obesidad.. 2. OBJETIVOS Este Trabajo de Fin de Grado tiene como objetivo general, la caracterización de la composición fitoquímica de la alcachofa y los efectos de los principales compuestos bioactivos y funcionales de la alcachofa (Cynara cardunculus L), concretamente de la alcachofa comercial C. cardunculus subsp. Scolymus, que modulan y regulan diferentes procesos celulares y metabólicos que influyen en el metabolismo energético de los mamíferos. Para realizar este Trabajo primero se hará una recopilación bibliográfica y después se realizara un experimento para ver los efectos de un compuesto bioactivo característico de la alcachofa. 2.1. Trabajo bibliográfico En esta parte del trabajo se hace una búsqueda y recopilación de información con el fin de conocer la composición química de la alcachofa, identificando los principales compuestos bioactivos y funcionales que tienen efectos sobre el funcionamiento de las células y, además, comprender y analizar los efectos ya demostrados sobre la salud humana. Por lo tanto, los objetivos específicos de esta parte del trabajo son: conocer la composición química de la alcachofa y los efectos de los principales compuestos bioactivos con un gran potencial sobre la salud humana. 2.2. Trabajo experimental Esta parte del trabajo consistirá principalmente en diseñar un experimento in vitro con el fin de comprobar los efectos del ácido clorogénico en la remodelación del tejido adiposo utilizando la línea celular 3T3-L1 para llevar a cabo el experimento.. 7.

(10) Parte bibliográfica. Trabajo de fin de grado. 3. MATERIALES Y MÉTODOS Para recopilar la información de la parte bibliográfica del trabajo se utilizaron diferentes bases de datos con el fin de recopilar artículos científicos de revisión o investigación que sirvan para cumplir los objetivos marcados en este trabajo. Una de las bases de datos más consultadas ha sido PubMed, una base de datos gratuita, desarrollada y mantenida por el Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI), de la Biblioteca Nacional de Medicina (NLM) de los Estados Unidos. Esta base de datos comprende más de 24 millones de citas de literatura biomédica de MEDLINE, revista de ciencias de la vida 24. Además de PudMed, también se ha utilizado la base de datos de Science Direct, una página web donde se puede buscar artículos científicos de más de 2500 revistas y 30000 libros 25. Finamente también se ha hecho uso de las herramientas de Google concretamente Google Books para la consulta de libros en versión online y Google Academic para recopilación de artículos científicos.. 4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN Para llevar a cabo la búsqueda de la bibliografía en las bases de datos se utilizaron diferentes palabras clave (Tabla 2). Los resultados de los artículos encontrados en PudMed según las palabras clave se pueden ver en la tabla siguiente. Términos clave Cynara Cardunculus Cynara Cardunculus review Cynara Cardunculus (últimos 5 años) Cynara scolymus (últimos 10 años) Cynara scolymus (humanos) phenolic composition cynara volatile oil cynara Cynara scolymus extract Chlorogenic acid Cynarin Luteolin Cynara scolymus effects Cynara scolymus properties Cynara scolymus energy metabolism Cynara scolymus obesity Cynara scolymus cholesterol Cynara scolymus cancer. Nº artículos 448 20 164 195 57 8 2 85 3380 121 2872 130 48 16 4 27 11. Tabla 2. Número de artículos obtenido en la base de datos PudMed. El número de artículos dado es el que se obtuvo de PubMed en el momento de la búsqueda y elaboración del trabajo utilizando las palabras clave mencionadas en la tabla. En la base de datos ScienceDirect se utilizaron las mismas palabras clave y en el caso de la herramienta Google Books se utilizó para buscar libros relacionados con el tema.. 4.1. Compuestos bioactivos de la alcachofa La alcachofa es una verdura muy saludable debido a su alto contenido en fitoquímicos, principalmente los ácidos fenólicos y flavonoides, juntamente con los compuestos terpenoides que le otorgan diversas propiedades 6. Los fitoquímicos son compuestos secundarios muy abundantes en el reino de las plantas y también en el reino animal, con multitudes de funciones: defensa contra el estrés, crecimiento, reproducción, entre otras 26. Se dividen en 3 grupos: terpenoides (terpenos), compuestos fenólicos y alcaloides y. 8.

(11) Parte bibliográfica. Trabajo de fin de grado. otros compuestos nitrogenados, aunque los dos primeros son los más abundantes 27. Los precursores para sintetizar estos compuestos son, el ácido shikimico para formar los compuestos fenólicos y el ácido mevalónico para formar los terpenoides (Figura 3) 28.. Figura 3. Ruta general para la biosíntesis de los principales metabolitos segundarios. 28. .. La caracterización y análisis de la composición química se realiza en extractos con agua y disolventes orgánicos polares (generalmente metanol) para extraer componentes fenólicos 29, en cambio para extraer componentes volátiles y aromáticos se utilizan disolventes apolares, como el hexano 28,30. El contenido fitoquímico de la alcachofa depende de varios factores como por ejemplo: la variedad de la alcachofa, etapa de madurez, condiciones climáticas (geografía, temperatura, luz, etc.), condiciones de cultivo (tipo de suelo, fertilización, etc.) y cosecha (invierno o primavera), condiciones de almacenamiento, factores genéticos, etc 3,16,31. Pero sobretodo, de cómo se ha obtenido el extracto, ya que la composición de los extractos obtenidos por extracción con disolventes polares difiere mucho de la composición de los extractos lipofilicos 8 y de la parte de la alcachofa que se analiza 3. Antes de proseguir con la explicación de la composición de los diferentes extractos, cabe destacar que la mayoría de la bibliografía consultada caracterizan mayoritariamente la composición química de las hojas de la alcachofa, que representa la masa de desecho de las alcachofas, con un alto contenido de compuestos bioactivos por lo que presentan interesante uso para extractos con finalidad terapéutica o farmacológica.. 4.1.1. Extracto fenólico (metanólico) En este extracto se encuentran principalmente los compuestos fenólicos como los que se pueden observar en la Figura 4 8. Los compuestos fenólicos son uno de los grupos químicos más abundantes en las plantas y se han identificado más de 8000 compuestos 27, con diversas funciones fisiológicas en las plantas. Las clases principales de los compuestos fenólicos de la dieta son los ácidos fenólicos, flavonoides, y polifenoles (comúnmente conocidos como taninos y lignanos) 32. Son biosintetizados a partir de la fenilalanina y tirosina mediante dos vías: la vía del ácido shikímico (O vía de fenilpropanoides) y la vía del acetato/malato 27.. 9.

(12) Parte bibliográfica. Trabajo de fin de grado. Figura 4. Ruta principal de biosíntesis de los compuestos fenólicos en las plantas del genero Cynara cardunculus. A partir de la fenilalanina y la tirosina se produce el ácido p-cumarico, el precursor tanto de los acidos fenolicos, flavonoides como de los lignanos, gracias a diferentes enzimas. Abreviaturas: PAL, fenilalanina amonio liasa; C4H, cinamato 4hidroxilasa; CHS, chalcona sintasa; CHI, chalcona isomerasa; 4CL, 4-ligasa coumaroyl8 CoA. Modificado de. La biosíntesis de los compuestos fenólicos que se encuentran en la alcachofa se hace principalmente mediante la ruta de los fenilpropanoides 8 (Figura 4). La fenilalanina es el precursor a partir del cual se sintetizan los metabolitos segundarios de las plantas como los flavonoides (por ejemplo luteolina e apigenina), ácidos fenólicos (ácido clorogénico e ácido dicafeoilquínico) y lignanos 4,8, juntamente con la tirosina 27. Los compuestos más abundantes en la alcachofa son los ácidos fenólicos y los flavonoides. A. Ácidos fenólicos Los ácidos fenólicos, son los compuestos mayoritarios de la alcachofa, consisten en dos subgrupos: los ácidos hidroxibenzoicos y hidroxicinámicos. Estos últimos son los mayoritarios, consisten principalmente en los ácidos cumárico, cafeico y ferúlico, y raramente se encuentran en forma libre. Las especies de C. cardunculus son una buena fuente de ésteres del ácido quínico y del ácido cafeico, que se combinan formando el ácido cafeoilquínico, y normalmente son sensibles al calor 32. Los ácidos cafeoilquínicos tienen un papel relevante como componentes estructurales y funcionales de las paredes celulares vegetales, como componentes bioactivos de la dieta humana, y actúan como precursores para los procesos que conducen a una pérdida de calidad debido al fenómeno de pardeamiento causado por la polifenol oxidasa o mediante la formación de complejos de hierro y ácido clorogénico. Este fenómeno es especialmente importante en el procesamiento de la alcachofa y se debe evitar utilizando antioxidantes sintéticos para no perder la calidad de la verdura 26.. 10.

(13) Parte bibliográfica. Trabajo de fin de grado. B. Flavonoides Los flavonoides son componentes menores en la alcachofa, que representan menos del 10% de los compuestos fenólicos totales 1. Los flavonoides tienen estructura común de dos anillos aromáticos, A y B, unidos a través de tres carbonos que forma otro anillo C, este esqueleto se denomina difenilpropano (C6-C3C6) (Figura 5). El anillo A proviene de la vía del acetato/malato y tiene una hidroxilación característica en las posiciones 5 y 7, en cambio, en anillo B, proviene de la vía del ácido shikímico y suele ser hidroxilado en una o varias posiciones (3, 4 y 6) 17,32. Además del grado de hidroxilación, los flavonoides se diferencian por otras sustituciones y conjugaciones, y en el grado de polimerización 17.. Figura 5. Estructura básica de los flavonoides. Están formados por dos anillos aromáticos A y B, más 17 otro anillo C .. Se clasifican en seis subclases mayoritarios: flavonoles, flavonas, isoflavonas, flavanonas, antocianinas y flavanoles 26,27, que se diferencian según las sustituciones en el anillo C, y 6 subclases minoritarios: Aurones, chalconas, cumarinas, dihidrochalconas, dihidroflavonol y flavan-3,4 dioles 17,27 . Las antocianinas dan un color violeta en las brácteas exteriores de ciertos genotipos de la alcachofa y en las flores 26,32.. C. Composición del extracto fenólico La composición química de los extractos fenólicos de la alcachofa se ha estudiado ampliamente y se ha encontrado que contienen un alto contenido en ácidos cafeoilquínicos y sus derivados, flavonas y taninos, que se encuentran principalmente en las cabezas y hojas de las alcachofas, aunque el perfil cualitativo y cuantitativo de los compuestos identificados en estos extractos varía por muchos factores (variedades de la alcachofa, tiempo de cosecha…) como se había comentado anteriormente. Por ejemplo, las alcachofas “Romanesco” de primavera mostraban un contenido fenólico total más alto que las de la cosecha de invierno con un aumento de aproximadamente 16 veces de la cosecha de invierno a primavera, particularmente en el tallo floral de la alcachofa 31. La composición también defiere mucho según la parte de la alcachofa que se caracteriza como se puede observar en la Tabla 3 3: Las cabezas, las brácteas y los tallos de las alcachofas contienen altos niveles del ácido 5-O-cafeoilquínico y el ácido 1,5-di-O-cafeoilquínico 3,6,13. Las hojas son ricas en luteolina y apigenina (conjugados con glucósidos o rutinósidos), mientras que los tallos florales, en el ácido 1,5-di-O-cafeoilquínico, y las flores, en antocianinas 3,15,31. Como se puede ver en la Tabla 3, los compuestos fenólicos totales son más abundantes en las hojas y tallos que en la cabeza, lo que indica que las hojas juntamente con los tallos de alcachofa representan una fuente importante de compuestos con interesantes aplicaciones farmacológicas para promover la salud.. 11.

(14) Parte bibliográfica. Trabajo de fin de grado. Tabla 3.Variación de la concentración de compuestos fenólicos en distintos partes de la alcachofa. Floral Outer Inner Phenolic compound Leaves stem bracts bracts 1-O-Caffeoylquinic acid 0–83 0–1,111 0–54 0–648 3-O-Caffeoylquinic acid – 0–284 0–25 0–226 4-O-Caffeoylquinic acid 0–567 0–574 0–154 0–525 5-O-Caffeoylquinic acid 0–2,135 157–4,732 0–1,049 18–14.841 1,3-O-Dicaffeoylquinic acid 0–72 21–90 0–58 11–73 3,4-O-Dicaffeoylquinic acid – 0–598 – 0–342 3,5-O-Dicaffeoylquinic acid 0–254 28–4,441 0–55 0–3,872 1,5-O-Dicaffeoylquinic acid 0–665 136–7,999 0–608 0–7,498 4,5-O-Dicaffeoylquinic acid 0–151 0–195 0–56 – Luteolin-7-O-rutinoside 891–2,956 0–224 0–57 0–149 Luteolin-7-O-glucoside 460–1,758 0–298 0–57 0–25 Luteolin-7-O-malonylglucoside 284–1,047 0–48 – – Apigenin-7-O-rutinoside 0–1059 0–547 0–343 15–206 Apigenin malonylglucoside 0–208 – 107–189 – ‡ All concentration ranges are in mg kg–1 DW.. 3. Receptacle 0–131 0–138 17–157 20–4,717 0–45 0–115 12–1,172 12–1,102 0–57 0–38 0–248 0–738 –. Además, la cocción también varía la composición de los compuestos bioactivos en la alcachofa, aumentando el contenido fenólico total de los extractos acuosos y hidroalcohólicos 16. Uno de los más recientes estudios sobre la dilucidación de los compuestos de la alcachofa fue realizado en 2013 por M. Abu-Reidah et al 14, donde se ha hecho una profunda y amplia caracterización de los compuestos fenólicos presentes en las hojas alcachofa de la variedad “Blanca de Tudela” (Cynara scolymus) mediante el uso de HPLC acoplado a DAD-ESI-QTOF-MS. Se encontraron unos 61 compuestos fenólicos, entre los cuales se han caracterizado por primera vez 34 nuevos compuestos fenólicos: 3 ácidos hidroxibenzoicos, 17 ácidos hidroxicinámicos, 4 lignanos, 7 flavonas, 2 flavonoles, y 1 derivado de fenol. Así que los compuestos más destacables en la alcachofa son los que pertenecen al subgrupo de los ácidos fenólicos y flavonoides 14. Los principales ácidos fenólicos encontrados en las alcachofas son el ácido 5-O-cafeoilquínico (o ácido clorogénico) y el ácido 1,5-O–dicafeoilquínico que están presentes sobretodo en el receptáculo y el tallo floral 26 con una concentración de 3143 y 3890 mg/kg de materia seca respectivamente 3, seguido de compuestos como los ácidos 1 y 3-O-cafeoilquínico y los ácidos 1,3- 3,5- y 4,5-Odicafeoilquínico que están en menor concentración 26. Generalmente, el ácido 1,3-O-dicafeoilquínico (cinarina) es considerado el principal responsable de las propiedades biológicas de alcachofa, debido a su mayor capacidad para inhibir la biosíntesis del colesterol y la oxidación de LDL 33. En cambio, los compuestos flavonoides más representativos de la alcachofa son la luteolina, y la apigenina (ambos son flavonas), con sus conjugados, seguido de la narigenina y narirutina 1,3. También encontramos antocianinas como la cianidina, sobre todo en las flores y brácteas externas. Otros compuestos encontrados en la alcachofa son los lignanos, exactamente los derivados del pinoresinol como: 1-Hidroxipinoresinol 1-O-β-d glucósido, pinoresinol 4-O-β-d glucósido, pinoresinolacetilhexosido y (+)–pinoresinol 14. Estos compuestos se formen por condensación de monómeros de flavan-3-ol 14.. 12.

(15) Parte bibliográfica. Trabajo de fin de grado. 4.1.2. Extracto del aceite esencial Los aceites esenciales son una mezcla compleja de compuestos naturales, volátiles caracterizados por un fuerte olor y son sintetizados por las plantas aromáticas como metabolitos secundarios 30,34 . Por lo general, la extracción de este aceite se realiza mediante el uso de dióxido de carbono líquido o microondas, y la destilación, principalmente de baja o alta presión empleando agua hirviendo o vapor caliente. El extracto que se obtiene es un líquido volátil, límpido y rara vez coloreado, soluble en lípidos y en disolventes orgánicos con una densidad generalmente más baja que la del agua 30. El perfil químico del extracto del aceite esencial se diferencia no sólo en el número de moléculas, sino también en los tipos estereoquímicas de moléculas extraídas, de acuerdo con el tipo de extracción, y el tipo de extracción que se elige en función de la finalidad de la utilización 30. Además, la composición también varía en calidad y en cantidad de acuerdo con el clima, la composición del suelo, el órgano de planta, la edad y la etapa del ciclo vegetativo 3,30,31. Los aceites esenciales están formados por compuestos complejos que pueden contener aproximadamente 20-60 componentes en concentraciones muy diferentes. Se caracterizan por dos o tres componentes principales en concentraciones bastantes altas (20-70%) en comparación con otros componentes presentes en cantidades traza 30. La composición química de los aceites esenciales se divide principalmente en dos grupos: terpenos (o terpenoides) e hidrocarburos no terpenoides 27,30. A. Terpenos También llamados terpenoides o isoprenoides, son uno de los grupos de fitoquimicos naturales más numerosos, con más de 30.000 compuestos aislados de plantas, microorganismos y animales. Se forman a partir reordenamientos de dos o más unidades de isopreno (5 carbonos) 30,34. Para la biosíntesis de los terpenos hay dos precursores universales, el pirofosfato de isopentenilo (IPP) y el pirofosfato de dimetilalilo (DMAPP). Hay dos vías para sintetizar estos precursores: la vía del ácido mevalónico (MVA) y la vía del metilo D-eritritol 4-fosfato (MEP) 34 (Figura 6). En la vía MVA, una molécula del ácido mevalónico es pirofosfatada por dos unidades de ATP para originar el mevalónilpirofosfato que luego se descarboxila gracias a otra molécula de ATP para formar una molécula de IPP. Y para originar el DMAPP, se produce una simple isomerización del enlace doble del IPP 27. El IPP y DMAPP generan el pirofosfato de geranil (GPP), un precursor inmediato de los monoterpenos y la unión de distintas unidades del GPP que pueden generar distintos compuestos con esqueletos lineales o cíclicos formando de esta manera los diferentes compuestos en las plantas como la alcachofa. La condensación de GPP y IPP conduce a la formación del farnesil pirofosfato (FPP), precursor inmediato de sesquiterpenos 27,34.. 13.

(16) Parte bibliográfica. Trabajo de fin de grado. Figura 6. Biosíntesis del precursor de isoprenoides. El IPP se puede originar a partir de dos vías: la vía del ácido malvonico (MVA) que se forma a partir del acetil-CoA, y la vía del metilo D-eritritol 4-fosfato (MEP) que se forma a partir del gliceraldehído 3-fosfato (GAP). Las dos vías dan lugar al pirofosfato de isopentenilo (IPP), a partir 27 del cual se sintetizan todos los terpenoides .. Los principales terpenos son los monoterpenos (C10) y sesquiterpenos (C15), pero también existen los hemiterpenes (C5), diterpenos (C20), triterpenos (C30) y tetraterpenos (C40). Además, si un terpeno contiene un oxígeno se denomina terpenoide 27,30. Los monoterpenos se forman por la unión de dos unidades de un isopreno y constituyen el 90% de los aceites esenciales. Los sesquiterpenos se forman a partir de la unión de tres unidades de isopreno 30 Figura 7. Esquema de la formación de las principales subclases de los terpenoides. A partir del pirofosfato de isopentenilo (IPP) y el pirofosfato de dimetilalilo (DMAPP) se forman los monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15), y diterpenos (C20) por unión de unidades de 5 carbonos gracias a las enzimas preniltransferasas. Los triterpenos(C30) se forman por union de dos unidades de farnesil (C15) y los tetraterpenos(C40), por union de dos 27 geranilgeranilo (C20) .. 14.

(17) Parte bibliográfica. Trabajo de fin de grado. B. Compuestos no terpenoides Esta parte del extracto está formado principalmente por policétidos (metabolitos segundarios derivados de lípidos), y los derivados del ácido shikimico 28. Entre estos compuestos se encuentran alcoholes, aldehídos, cetonas, éteres, lactónas, ésteres…34. Estos compuestos se encuentran en menor proporción en el extracto del aceite esencial ya que se producen en menor frecuencia en las plantas 30. C. Composición del aceite esencial La composición química del aceite volátil de la alcachofa esta poca caracterizada en la bibliografía porque hay poca bibliografía sobre ella. Generalmente el aceite esencial que corresponde a la fracción lipídica, se obtiene a partir de las hojas y cabeza (capitulum) de las alcachofas. Para separar los compuestos químicos en este extracto se utiliza la cromatografía de gas integral bidimensional (GC) acoplado a un espectrómetro de masas (MS) o detector de ionización de llama (FID) para identificar los compuestos 29,35. El aceite esencial de las hojas y cabezas de la alcachofa contiene más de 30 compuestos entre los cuales se encuentran: monoterpenos, sesquiterpenos, alcoholes, aldehídos y cetonas que son los principales componentes volátiles 29. Los sesquiterpenos están principalmente concentrados en las hojas y presentes en pequeñas cantidades en los tallos y capítulos, en contraste con los triterpenos que están presentes en menor cantidad en las hojas. El sesquiterpeno más predomínate en las hojas es la cinaropicrina que proporciona un sabor amargo a las alcachofas conjuntamente con los ácidos clorogénicos 6. Uno de los primeros estudios realizados sobre la caracterización de los compuestos volátiles del aceite fue realizado por Ron G. Buttery et al. en 1978 36 en alcachofas cocidas y se detectaron 32 compuestos. Los componentes mayoritarios en este extracto fueron los sesquiterpenos: β-selineno y cariofileno, y los componentes que proporcionaban aroma y olor a este extracto eran: oct-l-en-3-ona, hex-l-en-3-ona, decanal, no-trans-2-enal, fenilacetaldehído y eugenol 36. En otro estudio realizado en 2013 por Nassar et al. 35, se pretendía identificar los compuestos presentes en las brácteas de las alcachofas de Egipto. Se identificaron 37 compuestos (Tabla 4). Los principales componentes activos identificados fueron: ciclozativeno (45,4%), mirtenal (11,6%), 2metil undecanal (3,1%), n-dodecano (2,6%), xantorrizol (2,6%), bencilo tiglato (2,5%), isocomeno (2,4%), isosilvestreno (2,4%), ciclamen aldehído (1,6%) y fencona (1,1%). Estos compuestos principalmente son terpenos (75,99% de la cantidad total de los compuestos identificados) incluyendo los mono y sesquiterpenos. Otros compuestos corresponden a hidrocarburos oxigenados (18%) 35. Finalmente un estudio realizado por Caroline Saucier et al. en 2014 29, se encontraron un total de 130 compuestos en el aceite esencial de las hojas de la alcachofa, 109 de los cuales son reportados por primera vez en C. scolymus utilizando cromatografía de gases bidimensional integral acoplada a un espectrómetro de masas cuadrupolar de barrido rápido (GC×GC/ qMS) para dilucidar exhaustivamente la composición las hojas, en cambio con el GC/qMS solo se dilucidaron 32 compuestos, entre los cuales se incluyen 7 aldehídos, 7 norisoprenoides, 6 fenilpropanoides, 6 cetonas, 4 monoterpenos oxigenados, 1 lactona y 1 alcohol (Tabla 4). Los principales compuestos dilucidados mediante el GC×GC/ qMS fueron: 1-octen-3-ona (11,30%), acetaldehído benceno. 15.

(18) Parte bibliográfica. Trabajo de fin de grado. (8,86%), β-ionona (6,05%), diciclohexil-metanona (5,18%), (E) -β-damescenona (5,02%), dihidroactinidiolide (3,43%) y acetona de geranilo (2,23%). Además, también se estudia la composición de las flores y tallos de las alcachofas, aprovechando de esta manera todas las partes de la alcachofa para obtener compuestos bioactivos interesantes farmacológicamente. En un análisis multivariado (PCA) de los biocompuestos de las plantas de la familia Compositae, se ha dilucidado la composición de las diferentes partes de la alcachofa mediante el GC-MS y se encontró que los principales compuestos en las flores, las hojas, las raíces y tallos, son el β-cubeneno, cariofeleno y elixeno 37. Composición en las brácteas 35. Composición en las hojas 29. Nº 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11. Compound cis-Piperitol Geranyl formate Limonene aldehyde (Z)-Damascone Cyclosativene 4-(E)-Octene Myrtenol Isocitronellene n-Hexanol Myrtenal Dihydro-linalool. C (%) 0,3 0,4 0,8 0,1 45,4 0,3 0,6. Compound Furfural (E)-2-Hexenal Benzaldehyde 1-Octen-3-one 6-Methyl-5-hepten-2-one Octanal Benzene acetaldehyde. C (%) 1,84 1,42 1,44 11,30 0,37 0,40 8,86. 12. Fenchone. 0,6 0,2 11,6 0,4 1,1. 0,62 0,11 0,25 1,68 0,62. 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37. 3-p-Menthane Xanthorrhizol Helifolenol B Thuj-3-en-10-al Mayurone α-Isocomene Cyclamen aldehyde β-Atlantol Isosylvestrene 1-Phenyl heptan-3-one Prenopsan-8-ol Methyl tiglate Benzyl tiglate Nerol oxide 2-Methyl undecanal n-Pentadecane Methyl dodcanoate trans-Dehydro-β-terpineol Cryptomeridiol Geranyl acetate trans-Pinane 3-Dodecanone n-Dodecane 3-Decanone Cedranediol (85, 13-). (E)-2-Octenal Acetophenone (E,E)-3,5-Octadien-2-one Nonanal (E)-6-Methyl-3,5heptadien-2-one Phenethyl alcohol Isophorone 3-Nonen-2-one (E,Z)-2,6-Nonadienal 4-Methyl-acetophenone Safranal Decanal β-Cyclocitral Neral β-Homocyclocitral Geranial p-Vinylguaiacol Eugenol γ-Nonalactone (E)-β-Damascenone Geranyl acetone β-Ionone Dicyclohexyl-methanone Dihydroactinidiolide Phytone. 0,8 2,6 0,9 0,8 0,6 2.4 1,7 0,3 2,4 0,3 0,8 0,3 2.5 0,4 3,1 1,2 1 0,3 0,3 0,3 0,3 0,4 2,6 0,2 0,8. Tabla 4. Composición del aceite volátil de Cynara scolymus L de las brácteas utilizando un GC-MS, de las hojas utilizando un GC-qMS y de las flores utilizando GC-MS. (*) Las concentraciones relativas expresadas como porcentaje de área de la superficie total picos detectados por el MS o qMS de los principales biocompuestos. 0,46 1,18 0,26 0,30 0,36 1,15 0,28 1,35 0,22 0,24 0,80 0,68 0,69 0,85 5,02 2,23 6,05 5,18 3,43 0,19. Los resultados de estos estudios implican que se puedes utilizar las hojas, tallos, brácteas y raíces de las alcachofas, que normalmente presentan la biomasa de desecho, por lo que se pueden aprovechar para obtener estos compuestos bioactivos volátiles con potenciales propiedades farmacológicas.. 16.

(19) Parte bibliográfica. Trabajo de fin de grado. 4.1.3. Compuestos destacados Los compuestos más destacados en cuanto a composición e importancia funcional presentes en la alcachofa son: el ácido clorogénico y sus derivados, que son los ácidos hidroxicinámicos más predominante en la alcachofa; la cinarina, compuesto especifico de las plantas del género Cynara; y por último la luteolina, una flavona se encuentra principalmente en las hojas y tallo. Estos compuestos tienen diferentes propiedades sobre todo antioxidantes. A. Ácido clorogénico El ácido chlorogénico (ACG) es un compuesto fenólico que se forma por la esterificación del ácido cafeico y ácido quínico. El ACG se encuentra en altas cantidades en el café y frutas como arándanos y ciruelas, además de la alcachofa 38,39 . Según la nomenclatura de la IUPAC es conocido como el ácido 5-O-cafeoilquínico 26. Para sintetizar el ACG se han propuesto tres rutas distintas en las plantas con diferentes precursores: (ruta 1) transesterificación del cafeoil-DGlucosa con el ácido quinico mediante hidroxicinamoil D- Figura 8. Figura Rutas simplificadas para la biosíntesis del ácido glucosa quinato hidroxicinamoil clorogénico en plantas. Las enzimas implicados en esta ruta son: PAL, transferasa (HCGQT); (ruta 2) fenilalanina amonio liasa; C4H, cinamato 4-hidroxilasa; 4CL, 4-cumarato trans-esterificación del cafeoil- ligasa CoA; HCT, hidroxicinamoil CoA Shikimato/quinato hidroxicinamoil transferasa; C3H, p-cumarato 3'-hidroxilasa; HQT, hidroxicinamoil CoA CoA y ácido quínico a través de transferasa quinato hidroxicinamoil; UGCT, glucosa UDP cinamato glucosil la hidroxicinamoil-CoA quinato transferasa; HCGQT, hidroxicinamoil D-glucosa quinato hidroxicinamoil 38 hidroxicinamoil transferasa transferasa (HQT); y (ruta 3) hidroxilacion del p- coumaroyl quinato a ACG mediante la p-cumarato 3'-hidroxilasa (C3H) 38. Las biosíntesis del ACG en la alcachofa se hace principalmente a través de las rutas 2 y 3, utilizando el p- coumaroyl-CoA como precursor principal para dar lugar al ACG 39. En los últimos años, el ácido clorogénico ha tenido un creciente interés por sus diversas funciones biológicas y farmacológicas. El ACG regula el metabolismo glucídico y lipídico mediante la activación de la AMPK y la activación de la glucosa-6-fosfatasa hepática, inhibiendo así la gluconeogénesis y lipogénesis hepática y por otro lado aumenta la captación de la glucosa en el musculo hepático 40,41. También inhibe la carcinogénesis en el colon e hígado, reduce el riesgo de sufrir enfermedades cardiovasculares al disminuir la oxidación de las lipoproteínas de baja densidad (LPL) y la biosíntesis del colesterol. Además, también inhibe el crecimiento de preadipocitos con efectos anti-obesidad 40.. 17.

(20) Parte bibliográfica. Trabajo de fin de grado. B. Cinarina La cinarina es un derivado del ácido hidroxicinámico, químicamente conocido como el ácido 1,3-di-Ocafeoilquinico que se forma por esterificación de dos unidades del ácido cafeico y una unidad del ácido quinico 42,43(Figura 9). Este compuesto es considerado el principio activo de las alcachofas, ha sido aislado por primera vez en las plantas de Cynara cardunculus y se encuentra en concentraciones más altas en las hojas.. Figura 9. Estructura química de la cinarina. 42. .. La primera referencia de la extracción y aislamiento de este compuesto en las alcachofas data del 1954. Se ha aislado este compuesto en las hojas que han sido cocidas y tratadas con acetato de plomo 43. La obtención de cinarina puro se hace a partir de una mezcla de ácidos mono- y dicafeoilquínicos de un extracto vegetal crudo 42, aunque su biosíntesis se hace a partir del ácido clorogénico. La cinarina es la responsable de las propiedades colagogas y coloréticas de la alcachofa. Otras propiedades que tiene la cinarina son: hepaprotectoras hipocolesterolémicas, antivirales, antibacterianas y antihistamínicas 33,42. C. Luteolina La luteolina (3 ', 4', 5,7-tetrahidroxi-flavona) es uno de los flavonoides más comunes en el reino vegetal, pertenece a la subclase conocida como flavonas. Está presente en verduras y frutas, como el apio, brócoli, alcachofa y manzana 44,45. Normalmente, se encuentra en forma de glucósidos que son metabolizados por las bacterias intestinales. Cabe destacar que la luteolina es estable al calor, y las pérdidas por cocción son relativamente bajas 44. Molecularmente, la luteolina está formada por 3 anillos, el anillo A es un grupo resorcinol, el anillo B es un grupo catecol y el anillo C que contiene un doble enlace en el Figura 10. Estructura química de la luteolina carbono 2-3 y un grupo 4-oxo. La luteolina se forma por hidroxilación en el C5’ de la apigenina. Los grupos hidroxilo y el doble enlace están asociados a las actividades bioquímicas y biológicas de la luteolina como por ejemplo su buena capacidad antioxidante 17,44. La luteolina posee varios efectos biológicos que se han demostrado científicamente. Entre estos efectos, se incluyen efectos antioxidantes, antimicrobianos, anticancerígenos, neuro y cardioprotectores, entre otros 44.. 18.

(21) Parte bibliográfica. Trabajo de fin de grado. 4.2. Evidencias científicas de las propiedades de la alcachofa Como se ha comentado en el apartado 1.4, a lo largo de la historia se le han atribuido varias propiedades a los extractos de la alcachofa. A continuación veremos algunos estudios que aportan evidencias científicas sobre las propiedades de la alcachofa en los seres humanos, en modelos animales o in vitro (Tabla 5). Las propiedades que exhiben los extractos de alcachofa se le atribuyen al alto contenido en el ácido clorogénico y cinarina y flavonoides como la luteolina. Como el objetivo de este trabajo es averiguar los afectos de la alcachofa sobre el metabolismo energético, en un estudio realizado Cho et al. en ratas, se vio que dietas altas en grasas suplementadas con el ácido clorogénico reducían significativamente el peso corporal, mejoraban el metabolismo lipídico y los niveles hormonales relacionados con la obesidad (leptina, adiponectina e insulina)40. Este estudio nos sugiere que la alcachofa puede utilizarse para combatir la obesidad en humanos, que posteriormente ha sido demostrado en estudios realizados por Rondanelli et al. 46,47. Cabe señalar que por sus efectos hipoglucemiantes, que se le relacionen por el contenido del ácido clorogénico en los extractos de la alcachofa, también se puede utilizar como terapia para la diabetes tipo 2 12,52. Otras investigaciones indican que los extractos de la alcachofa poseen propiedades hipocolesterolémiantes, ya que inhiben la HMG-CoA reductasa, enzima clave en la biosíntesis de colesterol. Este efecto inhibidor se relaciona con la luteolina, ácido clorogénico y cinarina 5,12,40. Además, también se ha visto que estos extractos reducen la oxidación de LDL, gracias a alto contenido en compuestos fenólicos con actividad antioxidante, y también aumentan la secreción biliar para eliminar el colesterol (efecto colerético) 48. La disminución del colesterol por parte del extracto de alcachofa puede también tener una repercusión en la disminución de enfermedades cardiacas y aterosclerosis, por ejemplo en el caso de la aterosclerosis, el extracto de la alcachofa tiene efecto sobre la regulación de la óxido nítrico sintasa endotelial, aumentando la producción del óxido nítrico con funciones vasodilatadoras y también inhibe la expresión de moléculas de adhesión endoteliales, ICAM-1 y VCAM-1, reduciendo la adhesión de los monocitos al endotelio 12. Por otra parte, les propiedades antioxidantes de la alcachofa se ha visto que tienen efectos hepatoprotectoras 49,protección contra el estrés oxidativo que mejora las ulceras gástricas inducidas por químicos como el etanol 35. Por último, investigaciones recientes sugieren que el extracto de la alcachofa, especialmente algunos de sus compuestos, tienen efectos quimiopreventivos en el cáncer, propiedades neuroprotectoras y anti-VIH…5,45,50 (Tabla 5). Ensayo Clínico o Enfermedad Línea Celular 55 sujetos obesos con el IMC 25-35 y DM2 Obesidad. 40 sujetos con sobrepeso con IMC 25 y 35. Tratamiento/ Compuesto bioactivo Extracto alcohólico de cabezas de alcachofa Extracto de judías(EJ) y alcachofas. Dosis y Duración. Efectos del tratatamiento. Ref. 600 mg /día, 8 semanas. Reduce parámetros glucémicos, lipídicos y peso corporal. 47. 100 mg de EJ y 200 mg de alcachofa, 8 meses. Aumento de la sensación de saciedad, reducción de peso corporal y del IMC. 46. 19.

(22) Parte bibliográfica Extracto de hoja de alcachofa (ALE) Extracto de hoja de alcachofa (ALE) Extracto hidroalcohólico de alcachofa. 2x250 mg ALE/ día, 8 semanas. Jugo de hojas de alcachofa. 20 ml de jugo/día, 6 semanas. Concentrado de jugo de las hojas de alcachofa Extracto de hoja de alcachofa. 2x 50 o 100 mg de jugo/día, 12 semanas 1,5g/kg/día, 2 semanas. Extracto de alcachofa. 200 y 400 mg de extracto/kg. 244 sujetos con diagnóstico de dispepsia funcional 454 sujetos con síntomas de dispepsia. Extracto de hoja de alcachofa. 2x 320 mg de extracto/día, 6 semanas 320 o 640 mg/ día, 2 meses. infecciones fúngicas. In vitro, con diferentes microorganismos. Cáncer de mama. In vitro, línea celular de cáncer de mama humano MDAMB231. Extracto de cloroformo, etanol, acetato de etilo, de hojas, cabezas y tallos de alcachofa Extracto hidroalcohólico de cabezas y brácteas de la alcachofa(AEs) e ácido clorogénico. Hipercolesterolemia. Diabetes mellitus. 47 sujetos con el IMC 19 – 30 con hipercolesterolemia leve 75 sujetos con IMC 20-25 con hipercolesterolemia leve 40 ratas machos adultos Wistar. Trabajo de fin de grado. Aterosclerosis 38 sujetos. hiperlipidémicos (LDL 130-200 mg/dl y/o triglicéridos 150250 mg/dl) Hipertensión 98 varones con PAS:140-159 mmHg y/o PAD:90-99 mmHg Daño Ratas hembras hepático Wistar inducido por CCl4. Ulcera Ratas Spraguegástrica Dawley inducida por etanol. Dispepsia. Extracto acuoso de hojas de alcachofa. 280 mg ALE/ día, 12 semanas 100 o 300 mg/peso/día, 6 días. 12,5, 25, 50 mg/ml (hojas); 25, 50, 75 mg/ml (cabezas); 50, 100, 150 mg / ml (tallos) -Proliferación: 100-400μM AEs, 6 días -Citotoxicidad: 200-800 μM AEs, 24 horas; 200-1,200 Μm ACG, 24 y 48 horas. Aumento de la [HDL] y disminución de [LDL] y colesterol total Disminución de colesterol total (4,2%). 51. 48. Reducción de la glucemia y aumento de secreción de insulina. Además hay una reducción de las ALP, ALT y AST Reducción de las VCAM-1 e ICAM-1 y la mejora de la vasodilatación mediada por el flujo de la arteria braquial. 52. 53. Se reduce la presión arterial dependiente de dosis. 54. Disminución significativa de las actividades de las transaminasas plasmáticas (AST y ALT) y mejoras histopatológicos en el hígado después de la inyección de CCl4 mediante la inducción de glutatión peroxidasa (GSH-Px), en ratas pretratadas con el extracto. Aumento en la producción de moco gástrico, y una reducción del área de la úlcera dependiente de la dosis con 55,33% y 72,14%, y de los niveles de glutatión y la actividad de la catalasa. Mejora significativa de los síntomas dispépticos parecida a los fármacos químicos Mejora de los síntomas gastrointestinales y de la calidad de vida. Dosis altas reducen mejor los síntomas. Todos los extractos (hojas, cabezas y tallos) mostraron actividad anti fúngica. Los extractos de etanol mostraron el mayor grado de inhibición. -El extracto induce apoptosis en la células mda-mb231, por activación de las caspasas-8 y 9. En cambio, en células normales no se ha visto estos efectos. -El ACG no tuvo efectos importantes sobre la tasa de muerte celular de las células MDA-MB231. 49. 35. 55. 56. 57. 50. 20.

(23) Parte bibliográfica. Trabajo de fin de grado. Alzheimer 60 ratas machos inducido por Wistar STZ. Luteolina. 10 o 20 mg /kg/día, 5 días. Isquemia Ratas Spraguecerebral focal Dawley. Ácido clorogénico. 3, 10 y 30 mg ACG/kg, 1 semana. anti-VIH. Cinarina. 25- 250 μM. In vitro, línea celular MT-2. Luteolina mejoró significativamente la perdida de la memoria espacial y aprendizaje en ratas con Alzheimer ACG reduce el daño en la barrera hematoencefálica y el riesgo de edemas cerebrales (efecto neuroprotector contra la isquemia). 45. 58. inhibición de la replicación del VIH-1 25μM (EC50). 59. Tabla 5. Propiedades demostradas del extracto o compuestos de la alcachofa. En la tabla se detallan algunos estudios, relacionados con la salud, llevados a cabo sobre la alcachofa o sus compuestos durante los últimos años. Se puede observar que el extracto de la alcachofa tiene diversas propiedades para combatir o prevenir diferentes enfermedades. IMC: índice de masa corporal, DM2: Diabetes mellitus2, ALP: fosfatasa alcalina, ALT: alanina aminotransferasa, AST: aspartato aminotransferasa, VCAM-1 e ICAM-1: moléculas de adhesión endoteliales EC50: concentración efectiva media. En conclusión, gracias a las investigaciones que se han llevado a cabo se ha podido comprobar las propiedades beneficiosas para la salud debido a su alta composición en fitoquímicos como se ha visto anteriormente (apartado 4.1). Por estas evidencias científicas, la alcachofa tiene características de un alimento funcional, y su consumo es muy interesante a nivel de salud.. 21.

(24) Parte experimental. Trabajo de fin de grado. El ácido clorogénico induce la marronización en adipocitos blancos 3T3-L1 a bajas dosis. INTRODUCCIÓN En los últimos años, se ha observado que el tejido adiposo blanco tiene una cierta plasticidad o capacidad de remodelación para cambiar de fenotipo. Esta remodelación consiste en un proceso llamado “marronización” o browning, que es el oscurecimiento del adipocitos blancos adquiriendo características de adipocitos marrones y se denominan adipocitos “beige” o “brite”. Los adipocitos beige expresan UCP1, proteína clave de la termogénesis, tienen un contenido mayor de mitocondrias y mayor gasto energético 22,23. El proceso de marronización se puede inducir por varios factores como la exposición prolongada al frío, agonistas beta adrenérgicos, ácido retinoico, dietas hiperlipídicas, entre otros. Representa un mecanismo con potenciales propiedades terapéuticas en diversas enfermedades, especialmente en el caso de la obesidad, como se ha comentado anteriormente 23. Últimamente hay muchas investigaciones relacionadas con la remodelación de los adipocitos blancos mediante compuestos bioactivos 18. De ahí que nuestro objetivo de esta parte del trabajo sea estudiar los efectos del ácido clorogénico (ACG) en la marronización de adipocitos maduros blancos ya que se ha visto que el ACG modula el metabolismo glucídico y lipídico 60, y tiene efectos antiobesidad 40. DISEÑO DEL EXPERIMENTO Para llevar a cabo nuestro objetivo se va a analizar la expresión de algunos genes que están relacionados con la remodelación de tejido adiposo en adipocitos blancos maduros de la línea celular 3T3-L1 tratados durante 24 horas con concentraciones crecientes de ácido clorogénico (ACG) mediante RT-PCR a tiempo real. Estos genes son los siguientes: . . . Pparγ2 (peroxisome proliferator activated receptor gamma 2): Pparγ2, un regulador maestro de la diferenciación de adipocitos, que se expresa tanto en el WAT como BAT, se requiere para la formación de grasa marrón 61. Ucp2 (Uncoupling protein 2): es un gen que codifica para una proteína mitocondrial clave en la regulación central del metabolismo de la energía mediante la modulación de la producción de ROS. La expresión de UCP2 se aumenta mediante los receptores nucleares pparγ, pgc1α y productos ROS. En el tejido adiposo tiene un papel importante contra el estrés oxidativo 62. Pgc1α (peroxisome proliferator activated receptor gamma coactivator 1α), prdm16 (PRD1-BF1-RIZ1 homologous domain containing protein-16) y cidea (Cell death-inducing DNA fragmentation factor alpha-like effector A) son genes implicados en la regulación de la marronización del tejido blanco. El pgc1α induce y coordina genes que están relacionados en la biogénesis mitocondrial y termogénesis (UCP1), y coactiva el pparγ y otros receptores nucleares 61. Prdm16 estimula la marronización mediante la unión a PGC-1α, PGC-1β, C / EBP-β y la activación de PPARγ. CIDEA es coactivador transcripcional que se expresa abundantemente en el tejido adiposo marrón y se induce mediante la expresión de PPARγ61,63.. 22.

(25) Parte experimental. Trabajo de fin de grado. MATERIALES Y MÉTODOS Cultivo y diferenciación celular de 3T3-L1 Las células de preadipocitos 3T3-L1 de ratón se adquirieron de la casa comercial ZenBio, se cultivaron en dos placas de 12 pocillos en un medio de preadipocitos (PM-1-L1) y se incubaron a 37 °C en una atmósfera humidificada de 5% de CO2 hasta la confluencia (7 días). EL medio PM-1-L1 se cambió cada dos días 64. Cuando las células 3T3-L1 alcanzaron la confluencia después de 48 h de incubación (día 0), se cambió el medio PM-1-L1 por el medio de diferenciación (Medio Dulbecco modificado por Eagle (DMEM) suplementado con 10% de suero bovino fetal (FBS), 2% de solución de penicilinaestreptomicina, 0.5mM 3-isobutil-1-metilxantina(IBMX), 50nM de dexametasona, 1% piruvato de sodio y 5 μg/ml de insulina) y las células se incubaron a 37 °C con un 8% de CO2 durante 2 días. Después de 48h (día 2), el medio de diferenciación se cambió a un medio de mantenimiento sin dexametasona ni IBMX y se incubó durante 5 días más, cambiando el medio cada dos días 64. Tratamiento Los adipocitos 3T3-L1 se recogieron 8 días después de la iniciación de la diferenciación y fueron tratadas con 1 a 50 μM del ácido clorogénico (≥98.0%, Sigma-Aldrich) diluido en DMSO y se incubaron durante 24 h a 37 °C en una atmósfera humidificada 5% de CO2 incubadora. Se realizaron 6 grupos: Grupo control o vehículo (DMSO), grupo tratamiento de 1, 5, 10, 25 y 50 μM del ácido clorogénico. Después de 24h se observaron las células con microscopio para ver los efectos de tratamiento y finalmente se congelaron las muestras a -80 °C para la posterior extracción de ARN. Extracción de ARN total y síntesis de ADNc La extracción de ARN de las células tratadas se realizó en columnas mediante el kit E.Z.N.A. Total RNA y se siguió los pasos indicados en el protocolo del kit. El ARN extraído se resuspendió en agua libre de ARNasas y se medió la concentración del ARN con el espectrofotómetro NanoDrop ND-1000. Después se realizaron diluciones del ARN de las muestras a 50 ng/μL. Con las diluciones de ARN a 50 ng/μL, se llevó a cabo una electroforesis en gel de agarosa al 1% con Syber Safe para determinar la integridad del ARN total de las muestras. La síntesis de ADNc se realizó mediante la transcripción reversa-PCR, utilizando el Termociclador 2720 de Applied biosystems, a partir de 0,25μg de ARN diluido de cada muestra que ha sido desnaturalizado a 65 ˚C durante 10 minutos y después se le añade una mix (master mix) que contiene: 1.25μL de M-MuLV Reverse Transcriptase Reaction Buffer 10X, 1.25μL de MgCl2 25mM, 2μL de desoxinucleótidos trifosfato (dNTPs) 2.5mN, 0.5μL de random hexamers 50μM, 0.5μL de inhibidor de RNasas 20 U/μL, 0.5μL de transcriptasa reversa 50 U/μL y 1.5μL de agua libre de ARNasas para cada muestra. Una vez obtenido el ADNc de las muestra, se realiza una reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (qPCR) utilizando el StepOnePlusTM Real-Time PCR System de Applied Biosystems para analizar la expresión génica de los genes: β-actina (gen constitutivo), pparγ2 , ucp2, pgc1α, prdm16 y cidea, estos tres últimos genes se consideran genes clave en el browning del WAT; utilizando 2μL del producto de la transcripción reversa diluido a 1/5 y una mix (master mix), para cada muestra, que. 23.