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Instituto de Neuroetología
Programa de maestría
Evaluación del efecto del jugo de zarzamora (
Rubus fruticosus
) sobre
la ansiedad experimental en la rata Wistar
Que para obtener el grado de Maestro en Neuroetología
Presenta:
Rafael Fernández Demeneghi.
Directora del trabajo:
Dra. María del Socorro Herrera Meza.
Instituto de Investigaciones Psicológicas
Co-Director:
Dr. Juan Francisco Rodríguez Landa
Instituto de Neuroetología,
Universidad Veracruzana.
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ÍNDICE
RESUMEN 8
INTRODUCCIÓN 9
ANTECEDENTES 11
ANSIEDAD 11
SISTEMA EMOCIONAL (SISTEMA LÍMBICO) Y LA ANSIEDAD 12
POLIFENOLES 16
FLAVONOIDES 17
ANTOCIANINAS 18
FIGURA 1.PRINCIPALES ANTOCIANINAS PRESENTES EN LOS ALIMENTOS Y SU ESTRUCTURA QUÍMICA 19
ZARZAMORA (RUBUS FRUTICOSUS) 21
FIGURA 2.ZARZAMORA (RUBUS FRUTICOSUS) 22
ULTRASONIDO 23
PARTICIPACIÓN DE LAS ANTOCINANINAS EN LA SALUD Y LA CONDUCTA 26
TABLA 1.PRINCIPALES ESTUDIOS UTILIZADOS EN ESTE TRABAJO 28
MODELOS EXPERIMENTALES DE ANSIEDAD 28
PRUEBAS CONDUCTUALES 30
LABERINTO DE BRAZOS ELEVADOS 30
PRUEBA DE CAMPO ABIERTO 31
PRUEBA DE NADO FORZADO 32
PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA 33
JUSTIFICACIÓN 34
HIPÓTESIS 35
OBJETIVO GENERAL 35
OBJETIVOS PARTICULARES 35
MATERIALES Y MÉTODOS 36
MATERIA PRIMA 36
OBTENCIÓN DEL JUGO DE ZARZAMORA 36
ANÁLISIS DE POLIFENOLES TOTALES Y ANTOCIANINAS MONOMÉRICAS 36
ANÁLISIS DE POLIFENOLES TOTALES 36
DETERMINACIÓN DE ANTOCIANINAS MONOMÉRICAS 37
ANIMALES DE EXPERIMENTACIÓN 37
ADMINISTRACIÓN DEL TRATAMIENTO 37
FIGURA 3.PROTOCOLO DE TRATAMIENTO 38
FIGURA 4.ADMINISTRACIÓN DEL JUGO POR VÍA OROGÁSTRICA 39
3
LABERINTO DE BRAZOS ELEVADOS 39
FIGURA 5.LABERINTO DE BRAZOS ELEVADOS. 41
CAMPO ABIERTO 41
FIGURA 6.CAJA DE CAMPO ABIERTO EMPLEADA PARA EVALUAR LA ACTIVIDAD LOCOMOTORA ESPONTÁNEA DE LAS
RATAS. 42
NADO FORZADO 42
FIGURA 7.NADO FORZADO. 43
DISEÑO EXPERIMENTAL 44
ANÁLISIS ESTADÍSTICO 44
RESULTADOS 45
ANÁLISIS QUÍMICO 45
CUADRO 1.ANÁLISIS QUÍMICO DEL JUGO DE ZARZAMORA. 45
PRUEBAS CONDUCTUALES 46
LABERINTO DE BRAZOS ELEVADOS 46
GRÁFICA 1.TIEMPO EN BRAZOS ABIERTOS. 46
GRÁFICA 2.NÚMERO DE ENTRADAS A LOS BRAZOS ABIERTOS. 47
GRÁFICA 3.NÚMERO DE ENTRADAS TOTALES. 48
GRÁFICA 4.PORCENTAJE DE ENTRADAS A LOS BRAZOS ABIERTOS. 49
GRÁFICA 5.FRECUENCIA DE HEAD-DIPPING. 50
GRÁFICA 6.TIEMPO EMPLEADO EN HEAD-DIPPING. 51
GRÁFICA 7.FRECUENCIA DE ATTEMPTS. 52
GRÁFICA 8.TIEMPO EMPLEADO EN ATTEMPTS. 53
GRÁFICA 9.ÍNDICE DE ANSIEDAD. 54
ACTIVIDAD LOCOMOTORA DE CAMPO ABIERTO 55
GRÁFICA 10.NÚMERO DE CUADROS CRUZADOS. 55
GRÁFICA 11.TIEMPO DE ACICALAMIENTO. 56
GRÁFICA 12.TIEMPO EMPLEADO EN CONDUCTA VERTICAL. 57
PRUEBA DE NADO FORZADO 58
GRÁFICA 13.TIEMPO TOTAL DE INMOVILIDAD. 58
DISCUSIÓN 59
COMENTARIOS FINALES 65
CONCLUSIÓN 65
PERSPECTIVAS 65
APÉNDICES 67
APÉNDICE I: BEHAVIORAL EFFECT OF STERCULIA APETALA SEED OIL CONSUMPTION IN MALE ZUCKER
RATS. JOURNAL OF MEDICINAL FOOD, 20(11), 1133-1139 67
APÉNDICE II: SÍNDROME DE BURNOUT Y SU RELACIÓN CON LOS HÁBITOS ALIMENTARIOS 76 APÉNDICE III: CONSUMO REAL VS PERCEPCIÓN DE CONSUMO DE BEBIDAS ENDULZADAS EN ADULTOS. 99
PRESENTACIÓN DE TRABAJO EN CURSO INTERNACIONAL 122
4 PONENCIA EN EL CENTRO UNIVERSITARIO DEL SUR, UNIVERSIDAD DE GUADALAJARA.
124 CONSTANCIA DE JUEZ EVALUADOR EN EL XXII CONGRESO DE AMMFEN, PUERTO
VALLARTA, ABRIL, 2017. 125
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS 126
ÍNDICE DE FIGURAS Y TABLAS
FIGURA 1.PRINCIPALES ANTOCIANINAS PRESENTES EN LOS ALIMENTOS Y SU ESTRUCTURA QUÍMICA 19
FIGURA 2.ZARZAMORA (RUBUS FRUTICOSUS) 22
TABLA 1.PRINCIPALES ESTUDIOS UTILIZADOS EN ESTE TRABAJO 28
FIGURA 3.PROTOCOLO DE TRATAMIENTO 38
FIGURA 4.ADMINISTRACIÓN DEL JUGO POR VÍA OROGÁSTRICA 39
FIGURA 5.LABERINTO DE BRAZOS ELEVADOS. 41
FIGURA 6.CAJA DE CAMPO ABIERTO 42
FIGURA 7.NADO FORZADO. 43
ÍNDICE DE GRÁFICAS Y CUADRO
CUADRO 1.ANÁLISIS QUÍMICO DEL JUGO DE ZARZAMORA. 45
GRÁFICA 1.TIEMPO EN BRAZOS ABIERTOS. 46
GRÁFICA 2.NÚMERO DE ENTRADAS A LOS BRAZOS ABIERTOS. 47
GRÁFICA 3.NÚMERO DE ENTRADAS TOTALES. 48
GRÁFICA 4.PORCENTAJE DE ENTRADAS A LOS BRAZOS ABIERTOS. 49
GRÁFICA 5.FRECUENCIA DE HEAD-DIPPING. 50
GRÁFICA 6.TIEMPO EMPLEADO EN HEAD-DIPPING. 51
GRÁFICA 7.FRECUENCIA DE ATTEMPTS. 52
GRÁFICA 8.TIEMPO EMPLEADO EN ATTEMPTS. 53
GRÁFICA 9.ÍNDICE DE ANSIEDAD. 54
GRÁFICA 10.NÚMERO DE CUADROS CRUZADOS. 55
GRÁFICA 11.TIEMPO DE ACICALAMIENTO. 56
GRÁFICA 12.TIEMPO EMPLEADO EN CONDUCTA VERTICAL. 57
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Comité de Evaluación
Dra. María del Socorro Herrera Meza
Instituto de investigaciones Psicológicas,
Universidad Veracruzana.
Xalapa, Veracruz. México.
Dr. Juan Francisco Rodríguez Landa
Instituto de Neuroetología,
Universidad Veracruzana.
Xalapa, Veracruz. México.
Dra. Rosa Isela Guzmán Gerónimo
Instituto de Ciencias Básicas,
Universidad Veracruzana.
Xalapa, Veracruz. México.
Dr. Armando Jesús Martínez Chacón
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Agradecimientos y dedicatorias
A la Dra. María del Socorro Herrera Meza por toda su enseñanza, dedicación y paciencia, la cual me condujo a concluir en buen término esta investigación. Por reclutarme y ser mi guía en esta vocación como investigador, así como inculcarme compromiso y responsabilidad en el trabajo. Por ser otra madre, por tener fe y confianza en mi persona.
Al Dr. Juan Francisco Rodríguez Landa, por toda su paciencia, bondad y enseñanza, por compartirme su porfesionalismo y demostrarme a mi mismo que siempre se puede mejorar. Por su calidad humana y su sincera aportación.
A la Dra. Rosa Isela por brindarme su tiempo y sobretodo sus conocimientos, los cuales me hicieron mejorar tanto en lo humano como en lo profesional.
Al Dr. Armando Martínez Chacón por todos sus consejos y correcciones que mejoraron siempre mi trabajo.
Al CONACyT, al Instituto de Neuroetología y a mi Universidad, sin el apoyo que me otorgaron hubiera sido imposible realizar este proyecto.
A mi equipo de trabajo, con quienes logré este trabajo y con quienes aprendí la verdadera importancia de colaboración.
Al CICAN, la Dr. Alma Gabriela Martínez, al Dr. Antonio López quienes enriquecieron mi formación y vida por todo lo que me compartieron.
A mis papás y hermanos, quienes siempre me apoyaron y sintieron orgullo por mi realización.
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Resumen
Introducción. La ansiedad es uno de los trastornos mentales más frecuentes a nivel mundial. En México, se estima una prevalencia del 14% en la población de entre 18-65 años, siendo más frecuente entre los 30-44 años. Por otro lado, las antocianinas son flavonoides hidrosolubles responsables de los colores rojo, púrpura y azul en flores y frutos, como la zarzamora. Diversos estudios han demostrado que las antocianinas poseen efectos biológicos como antioxidante, antiinflamatorio, anticancerígeno e hipoglucemiante. Recientemente, se reportó que dichos compuestos mejoran la función cognitiva, poseen un efecto neuroprotector y podrían reducir los síntomas de la ansiedad, sin embargo este último efecto ha sido poco estudiado. Objetivo. Evaluar el efecto del extracto de jugo de zarzamora rico en antocianinas sobre los indicadores de ansiedad y la respuesta conductual al estrés agudo en la rata Wistar. Métodos. Se utilizaron 45 ratas macho Wistar divididas en 5 grupos: Vehículo (8.7mL/kg), Zarzamora baja (2.5mg ant/14.35 mg polifenoles/kg), Zarzamora media (5.7mg ant/26.09 mg polifenoles/kg) y Zarzamora alta (10.4mg ant/37.45 mg polifenoles /kg), más un grupo con Diazepam (2mg/kg), como control activo de efecto ansiolítico. El jugo de zarzamora fue obtenido a través de un método innovador mediante ultrasonido para mantener la mayor cantidad de antocianinas y de polifenoles totales. Después de 21 días de tratamiento las ratas fueron sometidas a las pruebas de laberinto de brazos elevados, campo abierto y nado forzado, una hora después de la última administración. Los datos fueron analizados mediante ANOVA unifactorial, seguido de la prueba post hoc Student Newman-keuls. Un nivel de p< 0.05 se consideró significativo. Resultados y Discusión
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INTRODUCCIÓN
Los trastornos psiquiátricos han incrementado su prevalencia en la población mundial; entre 1990 y 2013, el número de personas con ansiedad y/o depresión se incrementó aproximadamente en un 40%, de 416 millones a 615 millones (OMS, 2016). Además, representan el 30% de la carga mundial de enfermedad no mortal y se tiene el registro de que el 10% de la población mundial está afectada por algún trastorno de ansiedad (OMS, 2016). Por lo que la depresión y la ansiedad, en la actualidad, representan un rubro en la economía mundial de aproximadamente 1 billón de dólares anuales (OMS, 2016).
En México se estima que cerca del 14% de la población de entre 18 y 65 años padece algún desorden de ansiedad, y suele ser más frecuente en edades entre los 30 y 44 años con el 16%, sin embargo, también en los jóvenes adultos de 18 a 29 años se presenta una prevalencia del 15% (Medina-Mora et al., 2007). En este sentido se ha considerado a la ansiedad como un trastorno incapacitante caracterizado por preocupaciones persistentes e irracionales, que desencadenan síntomas somáticos de tensión y activación simpática, las cuales deterioran la calidad de vida del individuo, aún en ausencia de un peligro inminente (American Psychiatric Association, 2013). Al respecto, en la literatura se consideran dos tipos de ansiedad, una se relaciona con la función adaptativa y protectora del individuo y de la especie y la otra es considerada de tipo patológico (Gutiérrez-García & Contreras, 2013). La ansiedad es un atributo normal en el organismo ante situaciones explícitamente peligrosas y se considera anormal, cuando no hay señales claras de la presencia de una amenaza, pero el cerebro interpreta algunas situaciones como peligrosas y ello activa el sistema natural de defensa, dirigido por el sistema nervioso simpático, caracterizado por el aumento de la frecuencia cardiaca, la tensión arterial y muscular (Smith & Chapman, 1954; Joseph-Bravo & De Gortari, 2007). La ansiedad aparece ante diversas situaciones de la vida cotidiana, por ejemplo, durante el periodo de exámenes (Geist, 2010), entrevistas de trabajo (Linden & Muschalla, 2007), tránsito vehicular (Verster et al., 2005), problemas familiares (Meadows et al., 2007) e inseguridad (Punamäki et al., 1996), entre otras situaciones potencialmente estresantes.
10 intensidad y severidad de los síntomas. Sin embargo, son fármacos que conllevan distintos efectos secundarios, como la tolerancia a los efectos farmacológicos, así como la fármaco-dependencia propios de la terapia con benzodiacepinas (Bateson, 2002; Carlini, 2003).
En este sentido, se han reportado diversos compuestos de origen natural que pudieran ser una alternativa para el tratamiento de la ansiedad como son la genisteína (un fitoestrógeno) o extractos de plantas como el de Montanoa frutescens (Rodríguez-Landa et al., 2009; Carro-Juárez et al., 2012) y los polifenoles (Viola et al., 2000; Zhang et al.,
2012), los cuales debido a sus compuestos bioactivos podrían aportar beneficios sustanciales durante la terapia en la salud mental con efectos de tipo ansiolítico y antidepresivo (Dias et al.,2012; Williams et al., 2016).
Dentro del grupo de los polifenoles se encuentran las antocianinas, que son antioxidantes presentes en todas las frutas y vegetales de coloraciones que van desde el rojo hasta el púrpura, pasando por el azul (Badui, 2006). Las antocianinas se encuentran principalmente en frutos como el arándano, las uvas moradas, las frambuesas y las zarzamoras (Harborne, 1993; Escribano-Bailon et al., 2004; Burgos et al., 2016). A dichas sustancias se les han atribuido distintas funciones biológicas, como prevención de carcinogénesis (Kamei et al., 1998; Kraft et al., 2005), decremento de la inflamación celular (Hagiwara, 2002), control de la diabetes mellitus (Shipp & Abdel-Aal, 2010) y función desinflamatoria ocular (Ohgami et al., 2005), entre otras. A nivel cerebral, se ha observado que son capaces de atravesar y actuar en diversas estructuras (Andres-Lacueva et al., 2005; Talavera et al., 2005) destacando por su papel neuroprotector (Kelsey et al.,
2011), así como su participación en la mejora de la memoria en ratas (Andres-Lacueva et al., 2005) y en humanos (Krikorian et al., 2010), por lo que se está investigando activamente su participación en el control de la ansiedad (Valcheva-Kuzmanova & Zhelyazkova-Savova, 2009; Riaz et al., 2014; Valcheva-Kuzmanova et al., 2016; Tomic et al., 2016).
11 perspectiva de que puede ser una opción terapéutica para los síntomas de la ansiedad asociados a un evento agudo estresante; que en un futuro permita el estudio específico para el diseño de alternativas terapéuticas para el ser humano.
ANTECEDENTES
Ansiedad
La ansiedad es una respuesta adaptativa del organismo, ante situaciones amenazantes que requieren poner en alerta al individuo, para hacer frente a las exigencias ambientales (Hommer et al., 1987; Rodríguez-Landa & Contreras, 1998; American Psychiatric Association, 2000; Gutiérrez-García & Contreras, 2013). De forma natural, la respuesta desaparece al retirar el estímulo aversivo, con lo que se normalizan las funciones del organismo (Becerra-García et al., 2007; Gutiérrez-García & Contreras, 2013). No obstante, cuando la respuesta es desproporcional al estímulo desencadenante, aparece en ausencia del mismo o se alarga, afectando la vida cotidiana del individuo, se considera como ansiedad patológica (Vermetthen & Bremner, 2002). En tal caso, es una condición altamente debilitante, que involucra afecciones cognitivas, emocionales y fisiológicas (Pauli et al.,
1991; Gutiérrez-García & Contreras, 2013). Esta manera de reaccionar de forma no adaptativa, hace que la ansiedad sea nociva, porque es excesiva y frecuente (Mawson, 2005; Vermetthen et al., 2003).
Debido a esto, a la ansiedad se le considera como un trastorno psiquiátrico prevalente en la actualidad, ya que engloba una serie de cuadros clínicos que comparten, como rasgo común, extremo carácter patológico, que se manifiesta en múltiples disfunciones y desajustes a nivel cognitivo, conductual y psicofisiológico (Alonso et al.,
2004; Kessler et al., 2005). Estos factores son expresados en diferentes ámbitos como el familiar, social o laboral (Virues, 2005, Meadows et al., 2007).
12 respuesta ante algo subjetivo, un estado emocional interno, más que una respuesta ante un peligro eminente (American Psychiatric Association, 2013). Los trastornos de ansiedad ocurren con una recurrencia mayor en mujeres que en hombres (3:1), exceptuando la fobia social donde el porcentaje es similar para ambos géneros (Medina-Mora et al., 2003; American Psychiatric Association, 2013).
En la ansiedad, donde el peligro es potencial, las estructuras generalmente involucradas son la amígdala y el sistema septo-hipocampal (Graeff, 1994; Paré et al.,
2004; Mei et al., 2005). Estas estructuras funcionan como una interfase, recibiendo información que llega de los diferentes sistemas sensoriales, asociándolas con las memorias ya almacenadas por el hipocampo e interpretándolas como emocionalmente relevantes o no, para posteriormente coordinar la emisión de respuestas (Becerra-García et al., 2007; Gutiérrez-García & Contreras, 2013).
El sistema septo-hipocampal es el principal componente del sistema de inhibición comportamental, encargado de respuestas como la de evaluación de riesgo (Espinosa-Fernández, 2016). Por ejemplo, en el caso del miedo, cuando la amenaza es real y próxima, el sistema regulador sería el sistema de activación comportamental, formado por estructuras como el hipotálamo, amígdala y sustancia gris periacueductal, que controlan respuestas como la huida y la lucha (Becerra-García et al., 2007; Espinosa-Fernández, 2016) estructuras que forman parte del sistema límbico, hoy conocido como sistema emocional (Contreras & Gutiérrez-García, 2013).
Sistema Emocional (sistema límbico) y la ansiedad
Es un conjunto de estructuras cerebrales que responden a ciertos estímulos ambientales produciendo respuestas emocionales y estrategias asociadas a la sobrevivencia. Entre estas emociones se encuentran: el miedo, la furia, las sensaciones ligadas al sexo o al placer, al dolor y a la angustia (Le Doux, 2000).
13 emocionales, principalmente las que se acompañan de comportamientos de defensa o agresión, surgieron como parte de un proceso adaptativo y evolutivo de la especie humana (Ostrosky & Vélez, 2013), fundamentados en el aprendizaje y la memoria emocional (Ehrlich et al., 2009).
El sustrato neural del aprendizaje y la memoria emocional en animales, ha sido ampliamente estudiado, siendo la amígdala el componente esencial en la red neural de reacciones emocionales (Ganella & Kim, 2014), cuyas implicaciones son similares en humanos (La Bar et al., 1995; Morris et al., 1998; Phelps et al., 2000; Aldolphs et al.,
2005; Phelps & LeDoux, 2005).
La amígdala es la región del cerebro principalmente implicada en el procesamiento del estado emocional y de miedo (Le Doux, 2000). Dicha región coordina las respuestas reflejas a las amenazas; su función es integrar la información proveniente de los sistemas sensoriales, el contexto ambiental o el aprendizaje experimental a partir de las vías cortical y subcorticales (Phelps & Le Doux, 2005). La amígdala, está conformada por diferentes núcleos con funciones específicas para la formación de la memoria emocional (Davis, 1992; LeDoux, 1996; Maren et al., 1996), como el núcleo central de la amígdala, del cual parten numerosas proyecciones reguladoras hacia otros núcleos como el rafé, hipotálamo y
locus coeruleus, los cuales, al ser activados, integran las manifestaciones emocionales alteradas como ocurre en el miedo y la ansiedad (Hurlé, 1997; LeDoux, 2000). El núcleo basolateral reúne la información sensorial y es ahí, donde ocurre la asociación del estímulo condicionado con el incondicionado, es decir, la plasticidad de este núcleo, permite detectar un estímulo neutro como un estímulo aversivo, induciendo la respuesta de miedo, además es aquí donde la información sensorial alcanza la amígdala a través del tálamo anterior, provocando, una activación del sistema nervioso autónomo y con ello, la modificación de las respuestas conductuales a través de proyecciones hacia las áreas motoras y a los núcleos del tronco encefálico (Davis, 2006).
14 lateral, a su vez, se comunica con el núcleo central amigdalino, punto que cuenta con la mayor cantidad de eferencias encargadas de generar la respuesta al miedo, tanto conductual como autonómica y endocrina (Davis, 1992; Fendt & Fanselow, 1999; Rodrigues et al.,
2009). Además de la amígdala, otras regiones del sistema emocional como el hipocampo y la corteza prefrontal han mostrado jugar un papel significativo en situaciones de miedo y ansiedad (Akirav & Maroun, 2007; Engel et al., 2009; Moustafa et al., 2013). En este sentido el hipocampo parece estar directamente involucrado en la generación de una respuesta ante la situación adversa, principalmente en el conflicto de pelea-huida. El hipocampo, también es responsable de aumentar el estado de vigilancia y atención en el sujeto, así como en procesar la información contextual (Canteras & Graeff, 2014). Estas funciones cognitivas pueden ser moduladas por la ansiedad y, en este sentido, la participación de la corteza prefrontal es esencial en el restablecimiento del equilibrio después de un evento estresante (Arnsten, 2009).
Por otro lado, ya en modelos de neurocircuitos humanos (Rauch et al., 2006; Ressler & Mayberg, 2007), se ha sugerido que la actividad amigdalina es modulada de arriba hacia abajo por las regiones medias de la corteza prefrontal, incluyendo la corteza orbitofrontal, corteza cingulada anterior, así como el hipocampo, particularmente por la información del contexto, representaciones explicitas de la memoria y la autorregulación consciente que influyen en la respuesta. Aunque la mayor parte de la investigación neurobiológica de los trastornos de ansiedad, se ha centrado principalmente en la amígdala y sus recíprocas conexiones con la corteza prefrontal, se ha incrementado también, el interés por la ínsula, conocida por sus papel central en la interocepción (Critchley et al.,
2004) que a su vez, es propuesta como la estructura integradora de la información proveniente de la amígdala, núcleo accumbens y la corteza orbitofrontal y generadora de una señal predictiva, interpretando la diferencia entre lo ocurrido en el estado presente del sujeto con lo que ocurrirá en un futuro inmediato, la cual puede verse aumentada en sujetos propensos a desarrollar la ansiedad a causa de una fobia específica (Mathew et al., 2008).
15 sanguíneo, la cual es detectada por la corteza suprarrenal, facilitando así, la liberación de glucocorticoides como el cortisol (corticoesterona en roedores) y con ello una respuesta conductual. La retroalimentación se produce a través un feedback negativo, cuando el cortisol se une a los receptores de glucocorticoides en el hipotálamo, la hipófisis suprime la liberación de CRF y ACTH (Mathew et al., 2008). La activación del sistema nervioso simpático se ve reflejado en un incremento de la “vigilancia” y de síntomas físicos como: incremento en la presión arterial, incremento del tono muscular y un aumento en la conducta de sobresalto. Además, este sistema utiliza la adrenalina y noradrenalina, que actúan en el cerebro en lugares que controlan la atención y acciones de respuesta como respuestas de “pelea-huida” y comportamiento de “congelamiento” (Mucio-Ramírez, 2007).
En estas alteraciones, se han detectado también cambios en los sistemas de neurotransmisión como el serotoninérgico, el noradrenérgico y principalmente, el GABAérgico (Hurlé, 1997). El ácido γ aminobutírico (GABA) es el transmisor inhibitorio primario en el sistema nervioso central adulto y puede activar tres clases de receptores: receptores ionotrópicos tipo A (GABAA) y tipo C (GABAC) y receptores metabotrópicos tipo B (GABAB) (Bourmann, 2000).
Los neurotransmisores GABA y glutamato regulan la excitabilidad de las neuronas en el cerebro (GABA es un inhibidor, mientras que glutamato es un excitador) y por tanto, están implicados en diversos procesos fisiológicos, así como en estados patológicos. Estudios realizados sobre todo en los años 60´s con los benzodiazepínicos (sustancias que interactúan con receptores GABAérgicos, cuyo mecanismo de acción es sobre los receptores GABAA) demostraron que el principal neurotransmisor inhibitorio, el GABA, está relacionado en la regulación del estado de ansiedad (Kalueff & Nutt, 2007). La acción del GABA, según estos estudios, es inhibir estructuras inductoras de ansiedad (Kalueff & Nutt, 2007). Los fármacos que aumentan los eventos inhibitorios de GABA, disminuyen los eventos excitatorios regulados por glutamato. La inhibición está mediada por el GABA y su potencia como depresor del sistema nervioso central, ha adquirido importancia creciente por su participación en la génesis de la ansiedad y otras alteraciones psiquiátricas (Ordóñez, 2010).
16 límbicas. La acción de las neuronas GABAérgicas es importante en neuropsiquiatría porque varios ansiolíticos, sedantes y anticonvulsivantes, ejercen su acción farmacológica al actuar sobre sus receptores (Calixto, 2012); es el lugar de acción de fármacos neuroactivos con acciones agonistas o antagonistas, incluyendo las benzodiacepinas, los antiepilépticos, los barbitúricos, la picrotoxina y el muscimol (Brown et al., 1989). Actualmente, se estudian sustancias naturales de origen vegetal con potencial efecto ansiolítico que pudieran tener afinidad por estos receptores, como los polifenoles, para ser utilizados en un futuro próximo como auxiliares en el manejo de los síntomas de la ansiedad.
Polifenoles
Estudiando el potencial ansiolítico que la naturaleza provee, diversos investigadores han encontrado que algunos polifenoles poseen efectos tipo ansiolítico (Dias et al., 2012). Los compuestos fenólicos son el grupo más extenso de sustancias no energéticas presentes en los alimentos de origen vegetal. En los últimos años, se ha demostrado que una dieta rica en polifenoles vegetales, puede mejorar la salud (Quiñones et al., 2012). Sus efectos biológicos más conocidos son como antioxidantes (Estrada-Reyes et al., 2012), antiinflamatorios (Ferraro et al., 1993), antivirales (Kujumgiev et al., 1999), antimicrobianos (Vinh et al., 1993), gastroprotectores (de Lira-Mota et al., 2009), antibacterianos (Nishino et al., 1987), anticarcinogénicos (Narayana et al., 2001), inductores de enzimas antioxidantes y moduladores de vías de señalización celular (Bahadoran et al., 2013), entre otros.
Los polifenoles están presentes en frutas, verduras, hojas, frutos secos, semillas, flores y cortezas (Estrada-Reyes et al., 2012). Estos compuestos forman parte de la dieta humana y también se usan en forma de preparaciones medicinales y suplementos dietéticos (Kühnau, 1976; Kong et al., 2003). Actúan como inhibidores o activadores para una gran variedad de sistemas enzimáticos de mamíferos y como quelantes de metales y eliminadores de radicales libres de oxígeno (Ono et al., 2003; Sellappan et al., 2002).
17 (Perez-Vizcaíno et al., 2009).
En la naturaleza se conocen más de 8,000 compuestos fenólicos (Bahadoran et al.,
2013), que de acuerdo a su composición química se dividen en dos grupos: los ácidos fenólicos (benzoico y cinámico) y los flavonoides (flavonoides, antocianinas y taninos) (Badui, 2013).
Flavonoides
Su nombre que deriva del latín “flavus”, cuyo significado es “amarillo”, constituyen la subclase de polifenoles más abundante dentro del reino vegetal (Strack et al., 1992). Son compuestos de bajo peso molecular que comparten un esqueleto común difenilpirano (C6 -C3 -C6’), compuesto por dos anillos fenilo (A y B) ligados a través de un anillo C de pirano heterocíclico. Los átomos de carbono individuales de los anillos A, B y C, se numeran mediante un sistema que utiliza números ordinarios para los anillos A y C, y números primos para el anillo B. De los tres anillos, el A se biosintetiza a través de la ruta de los poliacetatos y el anillo B junto con la unidad C3 proceden de la ruta del ácido shikímico. Todos los flavonoides son estructuras hidroxiladas en sus anillos aromáticos y son, por lo tanto, estructuras polifenólicas (Quiñones et al., 2012).
Existen varios subgrupos de flavonoides. La clasificación de estos compuestos se hace en función del estado de oxidación del anillo heterocíclico (anillo C) y de la posición del anillo B. Dentro de cada familia existe una gran variedad de compuestos, que se diferencian entre sí por el número y la posición de los grupos hidroxilos, y por los distintos grupos funcionales que pueden presentar (metilos, azúcares, ácidos orgánicos). Los principales subgrupos de compuestos flavonoides son: flavonoles, flavonas, flavanonas (dihidroflavonas), isoflavonas y antocianinas (Manach et al., 2004). Dentro de los efectos farmacológicos de los flavonoides se encuentran la actividad antineoplásica (Knekt et al.,
1997), antitrombótica (Izzo et al., 1994), analgésica (Loscalzo et al., 2008), así como la disminución del colesterol (Arai et al., 2000) y la regeneración hepática (Pradhan et al.,
18 Entre los efectos más reportados de los flavonoides sobre el sistema nervioso central se encuentran la participación en mecanismos de aprendizaje y memoria (Matsuzaki et al.,
2008), su ayuda en el tratamiento del Alzheimer, inhibiendo la formación placas relacionadas con la pérdida de memoria (Zelus et al., 2012), su papel neuroprotector en la enfermedad de Parkinson (Bournival et al., 2012) y su capacidad antidepresiva (Machado et al., 2008). Cabe destacar que la primera actividad cerebral de los flavonoides está relacionada con los receptores del ácido gama amino butírico (GABA), lo cual explica su potencial efecto en el control de la ansiedad (Estrada-Reyes et al., 2012).
Cuando el GABA se une a sus receptores se producen efectos sedantes, tranquilizantes o ansiolíticos (Estrada-Reyes et al., 2012). En 1983, Medina y colaboradores, estudiando principios activos de plantas con propiedades sedantes, aislaron, evaluaron y demostraron los efectos ansiolíticos de los flavonoides crisina y apigenina, presentes en la pasiflora y en la manzanilla. Por otro lado, se reportó el efecto ansiolítico de la wogonina (Hui et al., 2002), proveniente de la medicina tradicional china y la amentoflavona (Hanrahan et al., 2011), sin causar efectos indeseables con que cursan los pacientes tratados con benzodiacepinas; por lo cual, la búsqueda de sustancias que pudieran colaborar con el control de la ansiedad u otras funciones del sistema nervioso central, no cesa y uno de los grupos de flavonoides que mayor interés ha despertado son las antocianinas.
Antocianinas
Las antocianinas son un grupo importante de compuestos flavonoides hidrosolubles, responsables de los colores rojo, púrpura y azul de flores, frutos y otras partes de las plantas y que no son tóxicas al consumo humano (Badui, 2013).
19 trisacáridos (Damodaran et al., 2010). Estos carbohidratos se enlazan siempre a la posición 3 de la antocianidina, además con frecuencia se encuentra adicionalmente glucosa en la posición 5 y, menos habitual, en las posiciones 7, 3’ y 4’ (Collado, 2011).
Las antocianinas son menos hidrosolubles que cuando se encuentran glucosiladas, además raramente existen en forma libre en los alimentos. En la actualidad se conocen cerca de 19 antocianidinas naturales, aunque las que tienen mayor presencia en alimentos son seis: pelargonidina, delfinidina, cianidina, petunidina, peonidina y malvidina (Kong et al., 2003) (Figura 1), nombres que se derivan de la fuente vegetal de donde se aislaron por primera vez. En ese mismo sentido, Kuskoski y colaboradores (2004) después de haber medido la capacidad antioxidante de pigmentos antociánicos, revelaron que la cianidina 3-glucósido y la delfinidina 3- 3-glucósido, son las que presentan mayor actividad antioxidante y que han sido identificadas en los frutos provenientes en la familia de las moras (Chen et al., 2006), específicamente en las zarzamoras (Ding et al., 2006; Cuevas-Rodríguez et al., 2010).
Figura 1. Principales antocianinas presentes en los alimentos y su estructura química (Tomada de Dreiseitel et al., 2009).
20 como el hígado, ojos y cerebro, logrando así acumularse en los mismos (Kalt et al., 2008; Fernandes et al., 2014).
Las funciones biológicas de las antocianinas se pueden clasificar en 2 tipos: aquellas relacionadas con su capacidad antioxidante y las implicadas en la modulación de las vías de señalización celular (Santos-Buelga et al., 2014). En general, se les atribuyen efectos como la prevención y/o disminución de ateroesclerosis (Wang et al., 2010), reducción en la incidencia de enfermedades cardiovasculares (Wallace, 2011); actividad anticancerígena (Kamei et al., 1995); antiinflamatoria (Hidalgo et al., 2012); hipoglucemiante (Rojo et al., 2012); mejora de la agudeza visual (Zafra-Stone et al., 2007) así como implicaciones en la cognición (Pribis & Shukitt-Hale, 2014).
En el mismo contexto de las actividades neurales de las antocianinas se destaca, de manera primordial, su acción antioxidante ante las especies reactivas de oxígeno (Zafra-Stone et al., 2007), la capacidad de atravesar la barrera hematoencefálica y acumularse en regiones cerebrales relacionadas con el aprendizaje y la memoria, como el hipocampo y la corteza cerebral, modificando la conducta (Andres-Lacueva et al., 2005). Se ha observado además, una inhibición de la enzima monoamino oxidasa, cuyo aumento de actividad se relaciona con Alzheimer y otros trastornos neurológicos (Dreiseitel et al., 2009), la capacidad antioxidante disminuyendo los radicales libres y las señalizaciones del estrés, controlando la homeostasis del calcio en el cerebro y que recientemente se investiga su relación como desencadenante de la ansiedad (Joshep et al., 2010; Bouayed, 2011). También ejercen efectos protectores contra el estrés oxidativo en modelos celulares de la enfermedad de Parkinson (Kim et al., 2010) y promueven una óptima neurotrasmisión, principalmente en edad avanzada (Miller & Shukkitt-Hale, 2012).
Por otro lado Barros y colaboradores (2006) encontraron un efecto tipo ansiolítico en ratones tratados con arándanos, efecto similar a lo observado con Aronia melanocarpa en ratas (Kuzmanova & Zhelyazkova-Savova, 2009; Eftimov, 2013; Valcheva-Kuzmanova et al., 2016).
21 miligramos por persona (Horbowicz et al., 2008). La dosis diaria recomendada de antocianinas es de 2.5 mg/kg de peso (Clifford, 2000); y principalmente se pueden encontrar en frutos rojos como los arándanos, fresa, uva y zarzamora.
Zarzamora (Rubus fruticosus)
En la naturaleza se encuentran alimentos que además de contener los nutrientes tradicionales, se acompañan de sustancias capaces de proporcionar un beneficio para la salud, lo que caracteriza a los llamados “alimentos funcionales” dentro de las sustancias que pueden dar esta denominación a ciertos alimentos encontramos a los polifenoles (Silveira-Rodríguez et al., 2003).
Uno de los alimentos funcionales con mayor contenido de polifenoles, principalmente antocianinas, es la zarzamora (Rubus fruticosus) fruta de la familia Rosaceae. Cuenta con un gran número de especies (aproximadamente 750) y se encuentra distribuida principalmente en regiones de clima templado y frío del hemisferio norte, pero también están presentes en zonas montañosas intertropicales (Rzedowski & Rzedowski 2005); se han aclimatado a diferentes condiciones ambientales, razón que ha favorecido su distribución por casi todo el mundo (Cruz, 2013). En México habita en zonas boscosas del centro y sur del país (López, 2009) y con las bondades de su clima, tienen producción fuera de temporada logrando abastecer las demandas del mercado (Zavala, 2006).
22 Figura 2. Zarzamora (Rubus fruticosus)
En la industria, las zarzamoras se utilizan en la producción de suplementos alimenticios, helados, mermeladas, pasteles y yogurt (Kafkas et al., 2006), ya que además de ser ricos en vitaminas y minerales, contienen baja cantidad calórica (Figura 3). La zarzamora es una fruta que ha despertado mucho interés debido a su alto contenido de polifenoles, principalmente las antocianinas, que contribuyen ampliamente a su alta capacidad antioxidante, basada principalmente en su absorción de radicales de oxígeno (Cho et al., 2004). Estudios epidemiológicos y clínicos sugieren que el consumo de antocianinas y otros flavonoides presentes en vegetales y frutas puede disminuir el riesgo de diferentes enfermedades degenerativas (Knekt et al., 1997; Karlsen et al., 2007; Jensen
et al., 2008; Krikorian et al., 2010).
La composición química de las zarzamoras es diferente de acuerdo a la variedad, las condiciones ambientales de cultivo, estado de madurez, cosecha y almacenamiento (Talcott, 2007). Los estudios fitoquímicos realizados en este fruto muestran su alto contenido en polifenoles, incluyendo antocianinas (Wu et al., 2006), elagitanos (Bushman
23 glucosa, xilosa, arabinosa (Wu et al., 2006; Howard & Hager, 2007) enlazados en la posición 3, quedando como cianidina glucósido, cianidina arabinósido, cianidina 3-rutinósido, cianidina 3-dioxaloylglucósido, entre otras indetectables (Howar & Hager, 2007) siendo la cianidina 3-glucósido la que mayor presencia tiene, con un rango de 44-95% (Fan-Chiang & Wrolstad, 2005; Howard & Hager, 2007) así como la que posee el efecto antioxidante más reportado (Chen et al., 2006). Las antocianinas en la zarzamora se sintetizan en su etapa de maduración, resultando en la coloración púrpura-azul oscuro, siendo esta coloración la que indica el mayor contenido de los compuestos antociánicos (Wang & Lin, 2000; Acosta-Montoya et al., 2010).
En lo referente a la alimentación humana, la zarzamora constituye una de las principales fuentes de compuestos fenólicos, cuya capacidad antioxidante sugiere que su consumo puede desempeñar un papel importante en la atenuación del daño ocasionado por los radicales libres en ciertas situaciones patológicas y el envejecimiento (Márquez-Mendoza, 2011).
En años recientes se han utilizado tecnologías no convencionales que buscan mejorar las técnicas de extracción, salvaguardando la mayor cantidad de nutrientes del fruto y explotar al máximo los antioxidantes que la naturaleza provee, entre ellas podemos ubicar al ultrasonido.
Ultrasonido
Las ondas sonoras son ondas mecánicas que requieren de un medio material para propagarse. Cuando tienen una frecuencia mayor a los 20 KHz se les conoce como ondas de ultrasonido, ya que rebasan el umbral de la audición humana (20 Hz a 20 KHz) (Cárcel
et al., 2012) y pueden llegar hasta los 5MHz en gases o los 500MHz en líquidos y sólidos (Kuldiloke et al., 2002). Estas ondas son generadas a partir de la conversión de energía eléctrica a mecánica por medio de diferentes tipos de transductores. Esta energía transmitida por el ultrasonido puede ser expresada como poder de ultrasonido (W), intensidad de ultrasonido (W/cm2), densidad de energía acústica (W/mL), o intensidad cavitacional (W/ cm2) (O’Donnell et al., 2010).
24 con el que se trabaja. Por otro lado, la velocidad ultrasónica (c), el coeficiente de atenuación (α) y la impedancia acústica (Z) son parámetros que dependen de las propiedades físicas del material que es sometido al tratamiento y, por lo tanto, su medición reviste de importancia para la determinación de cambios en la estructura, composición o estado físico de los materiales (González et al., 2008). De acuerdo con Mason (1990) los intervalos de frecuencia de sonido utilizados en el ultrasonido se dividen en:
• Ultrasonido de diagnóstico o de alta frecuencia (2-10 MHz) • Ultrasonido de poder o de baja frecuencia (20-100Khz)
El ultrasonido de poder o de baja frecuencia es capaz de producir el fenómeno de cavitación, que consiste en la formación de burbujas al momento en el que la energía ultrasónica se propaga en un líquido, produciendo una alternancia de ondas de compresión y descompresión en el medio; cuando la energía alcanza cierto umbral, estas burbujas crecen y colapsan liberando energía, resultando en regiones de alta temperatura y presión (Cárcel et al., 2012). La intensidad de la cavitación y sus efectos dependen de las características del medio, como la viscosidad, la intensidad del ultrasonido, frecuencia o presión (Cárcel et al., 2012).
El ultrasonido tiene diversas aplicaciones; dentro de la industria alimentaria, es uno de los métodos no térmicos de procesamiento de alimentos que se encuentran en investigación y desarrollo en la actualidad, dados los beneficios que puede suponer (Ivanovic et al., 2014).
El uso de ultrasonido es un método eficiente de procesamiento, de bajo consumo energético y que utiliza temperaturas menores a otros tratamientos; contribuyendo así a una mejor extracción y conservación de algunos componentes de los alimentos. Es una técnica de control microbiológico, además puede inhibir ciertas enzimas (Chemat et al., 2011; Tiwari et al., 2009).
25 bacterias, el tiempo de contacto con las mismas, la cantidad, composición del alimento y la temperatura durante el tratamiento (Mason, 1998).
La aplicación de ultrasonido en los alimentos supone una alternativa promisoria para la futura elaboración los productos alimentarios, incluyendo los jugos de fruta, cuya carga microbiana debe reducirse en al menos 5 ciclos logarítmicos de acuerdo a lo estipulado por la FDA, un requisito que esta tecnología satisface (Salleh-Mack et al., 2007) y que incluso dicha organización promueve.
El ultrasonido es capaz de inactivar enzimas presentes en los frutos responsables de algunos procesos de degradación entre sus componentes. Esta inactivación se debe a la desnaturalización proteica y la formación de radicales libres por la sonólisis (ruptura de moléculas) del agua (H2O→OH−+H+), por el efecto de cavitación o la combinación de ambos (Mason et al., 1994). Sin embargo, el ultrasonido también puede favorecer la actividad de algunas enzimas como las lipasas (Sakakibara et al., 1996; Liu et al., 2008).
Como se mencionó, otra ventaja tecnológica del uso del ultrasonido en el procesamiento de alimentos es que no es necesario el uso de altas temperaturas como en otros tratamientos convencionales. Esto permite conservar en mayor medida algunos compuestos con actividad biológica que son termolábiles, por ejemplo, las antocianinas, cuya degradación llega hasta un 50% al emplear métodos que requieren temperaturas elevadas, como la pasteurización (Hager et al., 2008).
Específicamente en el caso de los jugos, se ha observado que el tratamiento ultrasónico tiene un mínimo de efecto sobre la calidad del producto final (O’Donnell et al.,
2010). Se ha reportado que las antocianinas, en jugos, se degradan en pequeñas cantidades (Cheng et al., 2007), o incluso en algunos jugos, como el de fresa, la concentración de antocianinas incrementa entre un 1 y 2% luego del procesamiento con bajos niveles de amplitud (Tiwari et al., 2009), ya que el ultrasonido contribuye a una mayor liberación de los compuestos presentes en la pulpa de las frutas. Por ejemplo: durante el procesamiento del Jugo de zarzamora por 10 min, utilizando una amplitud al 40% y una frecuencia de 20 KHz se alcanza una retención cercana al 95% de antocianinas (Wong et al., 2010; Pérez-Grijalva et al., 2017).
26 (2013) en jugo de piña, donde encontraron que el ultrasonido degradó la concentración de los compuestos fenólicos, además de que lograron la inactivación de la enzima polifenol-oxidasa, algo no observado al utilizar el calentamiento a alta temperatura. En el presente trabajo, el ultrasonido fue empleado como una etapa previa al proceso de extracción del jugo, con la finalidad de mantener en mayor cantidad los compuestos fenólicos de acuerdo a trabajo previo realizado por (Estevés, 2016). Cabe señalar que, de acuerdo con lo propuesto por Ivanovic y colaboradores (2014) el ultrasonido también favorece la extracción de las antocianinas, lo cual sería de gran utilidad para investigaciones futuras. Actualmente, la industria alimentaria busca la aplicación de tecnologías que permitan obtener productos con un mayor contenido de antioxidantes naturales y que, además, estén mínimamente procesados, en respuesta a la solicitud de un amplio sector de los consumidores, cada día más preocupado por su salud.
Participación de las antocinaninas en la salud y la conducta
Los efectos antioxidantes de las antocianinas son más que evidentes y el interés por las antocianinas ha incrementado su investigación en los últimos años, debido no solamente al color que confieren a los productos que las contienen, sino a sus propiedades farmacológicas y terapéuticas (Garzón, 2008).
Wang y Jiao (2000), así como Wang y Lin (2000) han demostrado que frutos ricos en antocianinas tienen una alta actividad antioxidante contra la presencia de peróxido de hidrógeno (H2O2) y contra los radicales peróxido (ROO) y superóxido (O2). Kamei et al. (1998) reportaron la supresión de células cancerígenas HCT-15 provenientes del colon humano y de células cancerígenas gástricas, al suministrar fracciones de antocianinas de vino tinto. También, Kraft et al. (2005) realizaron bioensayos que muestran que los arándanos inhiben las etapas de iniciación, promoción y progresión de la carcinogénesis. Perossini et al. (1987) en sus estudios clínicos, realizados en Italia, revelaron que 79% de los pacientes diabéticos consumidores de extracto de frutos rojos (160 mg dos veces al día durante un mes) mostraron disminución de los síntomas de retinopatía diabética.
27 la agudeza visual y disminución de la inflamación ocular en ratas. De igual manera, Varadinova (2009) indicó que con 7 días de dosificación (200mg/Kg) el arándano ya presenta indicios de neuroprotección; mientras que Pribis y Shukitt-Hale (2014) confirmaron los reportes de Andres-Lacueva et al. (2005), respecto a que las antocianinas son capaces de atravesar la barrera hematoencefálica y favorecer la memoria espacial, emocional y el aprendizaje.
28 Tabla 1. Principales estudios utilizados en este trabajo.
Modelos experimentales de ansiedad
Para el estudio de los trastornos psiquiátricos, el ser humano sería el sujeto de estudio adecuado, sin embargo, esto es prácticamente imposible debido a limitaciones éticas, por ello se emplean animales de laboratorio, para que una vez identificados los efectos benéficos y potencialmente indeseables se pase al estudio en el ser humano. El uso de animales de laboratorio para el estudio de los trastornos emocionales representa una herramienta fundamental entre la investigación básica y clínica, ya que permite hacer aproximaciones hacia el entendimiento de la fisiopatología de estos desórdenes (Rodríguez-Landa & Contreras, 2000). Los modelos animales de ansiedad, son comúnmente utilizados para el desarrollo de nuevos agentes terapéuticos, para investigar los mecanismos de acción de los fármacos, así como la fisiopatología de los trastornos psiquiátricos. Con todo esto, las investigaciones con humanos constituyen una conexión útil y necesaria entre los modelos animales y los trastornos tratados en situaciones clínicas (Becerra-García et al.,
2007).
29 y de algunas estructuras entre las especies (Treit, 1985). Existen diversos modelos animales utilizados en el estudio de la ansiedad. Uno de ellos es la supresión condicionada, procedimiento descrito por Estes y Skinner (1941) al final de la primera mitad del siglo XX. Ellos entrenaron ratas para apretar una palanca y recibir una recompensa. Cuando los animales estaban entrenados, los investigadores ocasionalmente presentaban un sonido neutro por algún tiempo, al fin del cual aplicaban un choque eléctrico en las patas de los animales. Después de algunas sesiones, las ratas cesaban la presión sobre la palanca una vez que el sonido se iniciaba, indicando que el sonido se volvía aversivo por estar condicionado al choque eléctrico y reducía la frecuencia de respuestas. La reducción en la frecuencia de presiones de la palanca después de la asociación con el choque se considera un indicador de ansiedad: cuanto mayor sea la supresión (esto es, menor frecuencia de respuestas), mayor será el grado de ansiedad.
Por otro lado, Geller y Seifter (1962) crearon una condición de conflicto que se dio a conocer como “prueba de conflicto de Geller y Seifter”. En esta prueba, en determinados momentos de la sesión un sonido indica que todas las respuestas de presionar la palanca serán seguidas de recompensa, así como de choque eléctrico en las patas (castigo) mientras que en otros momentos no hay sonido y algunas de las respuestas son seguidas de recompensa. Por tanto, en una de las condiciones se establece un conflicto entre obtener la recompensa y simultáneamente recibir un choque eléctrico. Este tipo de pareamiento hace que el animal trabaje menos.
Estos procedimientos, sin embargo, fueron muy criticados ya que inmiscuían muchas variables (entrenamiento prolongado, esquemas de refuerzo y castigo, privación de los animales, además de la manipulación prolongada de los mismos). Intentando evitar esas críticas, otros modelos utilizaron respuestas más acercadas a la naturaleza de la especie.
30 considerado un indicador de ansiedad (Holland, 1985).
Otra razón para contemplar la utilidad de los modelos experimentales animales es la posibilidad de reproducir fenómenos que parecen jugar un papel significativo en el origen mismo de estos padecimientos; para medir la exploración y su relación con la ansiedad se utilizan diversos modelos animales, entre ellos, la prueba de campo abierto (Crawley, 1985; Gómez et al., 2002), la prueba de interacción social (File & Hyde, 1978), el enterramiento defensivo (Pinel & Treit, 1978) y el laberinto de brazos elevados (Pellow et al., 1985) entre otros modelos recientemente desarrollados. En estas pruebas entran en conflicto dos conductas innatas de los roedores, por una parte, son curiosos, por ello buscarán explorar un ambiente novedoso y, por otra parte, los roedores no se exponen fácilmente a espacios abiertos (agorafobia), prefieren las paredes (tigmotaxis) o la periferia del campo (Treit & Fundytus, 1988).
Pruebas conductuales
Laberinto de Brazos Elevados
Uno de los modelos más utilizados, en la actualidad en las investigaciones sobre ansiedad en animales, es el laberinto de brazos elevados (Carobrez & Bertoglio, 2005). El estudio del comportamiento de la rata de laboratorio, en el laberinto brazos elevados, es empleado en la comprensión de algunos estados emocionales y en la identificación de los efectos de fármacos ansiolíticos (Miranda et al., 2009).
31 conductas innatas de los roedores (Walf & Frye, 2007), ya que típicamente se observa que emplean mayor cantidad de tiempo explorando los brazos cerrados en comparación con los abiertos.
En esta prueba, son considerados indicadores de ansiedad la frecuencia de entradas y tiempo gastado en los brazos: cuanto menor sea la exploración de los brazos abiertos mayor será el grado de ansiedad (Barros et al., 2000; Barros et al., 2006; Pellow et al.,
1985). La prueba dura 5 min, tiempo suficiente para observar modificaciones conductuales (Walf & Frye, 2007). Cuando los animales son tratados con sustancias con actividad ansiolítica, exploran con mayor frecuencia y por más tiempo, los brazos abiertos (Becerra-García et al., 2007) lo que se interpreta como una disminución de la ansiedad. Por lo tanto, este modelo se utiliza para evaluar conductas similares a las que se observan en la condición humana, permitiendo identificar sustancias con posibles efectos terapéuticos relacionados con el tratamiento de la ansiedad.
Prueba de Campo abierto
Se trata de una prueba sencilla y económica que permite evaluar la conducta de exploración del ratas, en un ambiente novedoso, así como su actividad locomotriz (Hall, 1934; Christmas & Maxwell, 1970). Las alteraciones en esta conducta pueden afectar los resultados observados en otros estudios, como el miedo a los espacios novedosos, el aprendizaje, la memoria o la recompensa (Mällo et al., 2007). Esta Prueba también permite identificar si un tratamiento o lesión afectan la motricidad (Walf & Frye, 2007).
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Prueba de Nado Forzado
La prueba de nado forzado consiste en introducir a un animal (rata o ratón) en un recipiente con agua donde no existe la posibilidad de escapar. En una primera sesión (pre-prueba), se introduce al animal en el recipiente durante 15 min, donde después de un periodo de vigorosa actividad, sólo realiza los movimientos necesarios para mantener la cabeza por arriba del nivel del agua, pero sin desplazarse (inmovilidad). Se acepta que en esta sesión el animal “aprende” que la prueba no tiene solución. Veinticuatro horas más tarde el animal es sometido a la prueba durante 5 min para evaluar la inmovilidad(Porsolt et al.,1977).
En la segunda sesión, la inmovilidad corresponde a un indicador de desesperanza. Esta hipótesis es respaldada por el hecho de que la aplicación de diversas terapias clínicamente efectivas, tales como las farmacológicas (antidepresivos tricíclicos y atípicos, inhibidores de la enzima monoamino oxidasa y agonistas selectivos serotonérgicos) disminuyen la inmovilidad en esta prueba, sin afectar la actividad locomotora(Porsolt et al.,1977), lo cual descarta acciones estimulantes o depresoras de la actividad del sistema nervioso que puedan contaminar los resultados. Una vez descartadas las acciones sobre la locomoción, un tiempo aumentado de nado es interpretado como un aumento de la motivación del animal para buscar alternativas de solución al problema e intentar el escape (Porsolt et al.,1977).
Las ratas se colocan individualmente en un estanque rectangular de vidrio (40 x 30 x 50 cm) lleno con agua a temperatura controlada (25 ± 1°C) a una altura que no le permite tocar el fondo del estanque, 25 centímetros, tomando en cuenta que las ratas adultas alcanzan a medir, en promedio, 30 centímetros, más otros 30 del largo de su cola. Existe una modificación de la prueba de nado forzado, propuesta por Borsini (1995), donde se emplea una sola sesión (prueba) con una duración de 6 min, en los que los 2 primeros minutos sirven al sujeto experimental de adaptación, los siguientes cuatro se filman, y en ellos, se evalúa el tiempo de inmovilidad, que revela la calidad de la respuesta de las ratas al estrés agudo que representa la prueba.
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PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
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Justificación
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Hipótesis
La administración del jugo de zarzamora (con alto contenido polifenoles y antocinaninas) en ratas adultas ejerce un efecto tipo ansiolítico y antiestrés similar al diazepam, sin modificar la actividad locomotora.
Objetivo general
Evaluar el efecto de la administración del jugo de zarzamora sobre los indicadores de la ansiedad experimental y el afrontamiento al estrés agudo en la rata Wistar.
Objetivos particulares
1. Determinar los efectos de diferentes concentraciones de antocianinas y polifenoles totales en el jugo de zarzamora sobre la actividad motora espontánea de las ratas.
2. Comparar el efecto del jugo de zarzamora sobre la ansiedad experimental y la respuesta conductual estrés agudo con el efecto producido por el diazepam.
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MATERIALES Y MÉTODOS
Materia prima
El jugo de zarzamora fue realizado en el Instituto de Ciencias Básicas de la Universidad Veracruzana. Para su elaboración se empleó zarzamora de la empresa Driscoll’s de México, la cual fue adquirida en un mercado local de la ciudad de Xalapa, Veracruz, México, entre los meses de marzo y abril de 2015. Dichos frutos se procesaron en estado fresco.
Obtención del jugo de zarzamora
Los frutos fueron lavados en una solución de hipoclorito de sodio al 0.1 %. Una vez lavados, se pesaron en grupos en promedio de 80 gr, siendo molidos por separado con un homogeneizador marca Braun durante 30 s. Posteriormente, la fruta molida fue colocada en un vaso de vidrio sobre un baño de hielo para ser procesada a 40% de amplitud durante 10 min, con 5 s en modo encendido y 5 s en modo apagado, empleando un homogeneizador ultrasónico con frecuencia de 20 kHz y una potencia 750 W (Cole-Palmer Instrumental Company, VCX-750, E.E.U.U.) (Estevés, 2016). Finamente, la pulpa de zarzamora fue colocada en tubos para ser centrifugadas a 4000 rpm durante 10 min a 10 °C en una centrifuga Hettich Universal 32R.
Con la finalidad de incrementar el contenido de antocianinas en el jugo de zarzamora a 2x (Media) y 4x (Alta), el jugo previamente procesado con ultrasonido fue liofilizado utilizando un equipo liofilizador (FreeZone 4.5 Liter Cascade Benchtop Freeze Dry System) a una temperatura y presión bajas (-45ºC y 0.0045 mbar). El jugo liofilizado se resuspendió en el jugo de zarzamora para llevar su concentración al doble (Zarzamora-Media) y al cuádruple (Zarzamora-Alta).
Análisis de polifenoles totales y antocianinas monoméricas
Análisis de polifenoles totales
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Determinación de antocianinas monoméricas
La cuantificación de antocianinas se llevó a cabo por el método de pH diferencial descrito por Giusti & Wrolstad (2001). La cantidad de antocianinas se expresó como mg de cianidina 3-glucosido/L de muestra y las determinaciones, en cada muestra, se realizó por triplicado.
Animales de experimentación
Se utilizaron 45 ratas macho de la cepa Wistar. Todos los sujetos estuvieron alojados en cajas de estancia a temperatura ambiente y un ciclo de luz/oscuridad de 12 horas (la luz se encendía a las 7:00 AM) en el bioterio del Instituto de Investigaciones Psicológicas de la Universidad Veracruzana. El acceso a alimento y agua purificada fue ad libitum. Todos los animales empleados en este estudio fueron manejados bajo las condiciones estándar de acuerdo a la Norma Oficial Mexicana (NOM-062-ZOO-1999) en lo relativo a las especificaciones técnicas para la producción, cuidado y uso de los animales de laboratorio, y conforme a los lineamientos éticos internacionales basados en la Guía de Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicado por el NRC (National Research Council, 1996) acordes al cumplimiento de los principios éticos relacionados con el empleo de animales de experimentación, los requerimientos de salud y bienestar animal para cada una de las especies de roedores.
Administración del tratamiento
38 tres dosis de zarzamora se basaron en un volumen de 8.7 mL/ kg, mientras que la administración de diazepam fue por vía intraperitoneal. Las ratas fueron pesados una vez por semana ajustando así la dosis del tratamiento durante los 21 días (Figura 3).
Figura 3. Protocolo de tratamiento
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Figura 4. Administración del jugo por vía orogástrica.
PRUEBAS CONDUCTUALES
Las ratas fueron evaluadas en el laberinto de brazos elevados durante 5 min, después fueron observadas en el campo abierto durante 5 min y posteriormente se realizó la prueba de nado forzado con una duración de 6 min.
Laberinto de Brazos Elevados
El aparato está construido de madera, consta de cuatro brazos opuestos en forma de cruz, dos brazos son abiertos (pintados de blanco) de 50 cm de largo por 10 cm de ancho, sin paredes, y los otros dos, cerrados (pintados de negro), con las mismas dimensiones y con paredes de 40 cm de alto (pintadas de negro), así mismo el aparato se elevó a 50 cm sobre el nivel del suelo (Enging & Treit, 2007) (Figura 5). Esta prueba se realizó en un cuarto aislado con iluminación de 40 lux y consistió en colocar a la rata en el centro del laberinto y llevar un conteo del número de entradas y salidas en los dos tipos de brazo (abierto y cerrado), así como también el tiempo de permanencia en ellos. Para fortalecer el análisis conductual también se evaluaron otras dos conductas: el head-dipping y el attempts, en tiempo y frecuencia.
40 brazos abiertos; c) el número total de entradas a los brazos (abiertos + cerrados); d) el porcentaje de entradas a los brazos abiertos; e) el índice de ansiedad y f) la evaluación de riesgo (head-dipping y attempts). Para la conducta de evaluación de riesgo se contabilizó el número de eventos y el tiempo empleado en dichas conductas.
El head-dipping es una conducta identificada cuando la rata asoma la cabeza hacia el suelo desde el filo de los brazos abiertos, esta respuesta puede ocurrir mientras el cuerpo del animal se encuentra en los brazos cerrados o los brazos abiertos (Walf & Frye, 2007), mientras que el attempts se identifica como un intento por explorar los brazos abiertos, seguido inmediatamente por una respuesta de evitación (la rata se estira hacia delante sin mover sus patas y enseguida se retracta, volviendo a su posición original) puede presentarse tanto en los brazos abiertos como en los cerrados, sin embargo surgen mayormente en la salida de los cerrados y se relaciona con los indicadores de mayor grado de ansiedad (Rodgers et al., 1997). Las ratas que cayeron al suelo fueron descartadas del análisis de datos. Estas variables fueron seleccionadas considerando que son un buen indicador de un estado de ansiedad; un alto porcentaje de tiempo o entradas en los brazos abiertos es indicativo de una reducción de los niveles de ansiedad (Walf & Frye, 2007). El índice de ansiedad fue calculado de acuerdo a Cohen y colaboradores (2013) de la siguiente manera:
!" = 1 −
tiempo en brazos abiertos
tiempo total de la prueba + número de entradas a brazos abiertosnúmero total de cruces a los brazos 2
41 Figura 5. Laberinto de Brazos Elevados. Aparato empleado para evaluar las conductas relacionadas con la ansiedad.
Campo Abierto
Para evaluar los efectos de los tratamientos sobre la actividad motora espontánea de las ratas y descartar la posibilidad de hipoactividad o hiperactividad atribuible a los tratamientos que pudieran influir en el rendimiento en el laberinto de brazos elevados y la prueba de nado forzado, se realizó una prueba de campo abierto con una duración de 5 min, la cual fue filmada con una videocámara Sony, DCR-SR85, 2000x optical zoom. La prueba se realizó inmediatamente después de la prueba de laberinto de brazos elevados. La caja utilizada para esta prueba mide 44 x 33 cm y está hecha de vidrio opaco, con el piso delineado en 12 cuadros de 11x 11 cm (Rodríguez-Landa et al., 2009, Figura 6).
Las variables evaluadas fueron: a) el número de cuadros cruzados, que corresponde a las veces que una rata cruza de un cuadro a otro con al menos tres cuartas partes de su cuerpo, lo cual es considerado como un indicador de motricidad, b) el tiempo de conducta vertical, que es la suma de los periodos en los cuales la rata adquiere una postura vertical sostenida sobre sus patas traseras y c) tiempo de acicalamiento, que son los periodos de tiempo (segundos) dirigidos al auto-aseo.
42 propio animal (en orden cefalo-caudal); también cualquier movimiento elíptico de amplitud pequeña limitado a las vibrisas de forma unilateral o bilateral (Kalueff & Touhimaa, 2004 y 2005). Al término de la prueba de cada sujeto, la caja fue cuidadosamente limpiada con una solución acuosa de alcohol al 15% con la finalidad de evitar que existieran alteraciones conductuales inmediatas atribuibles a los estímulos sensoriales producidos por sustancias volátiles presentes en la orina o defecaciones de la rata evaluada previamente (Gutiérrez-García & Contreras, 2002).
Figura 6. Caja de campo abierto empleada para evaluar la actividad locomotora espontánea de las ratas.
Nado Forzado
La prueba consistió en introducir a las ratas de manera individual en un estanque de vidrio (40x30x50cm). El estanque (Figura 7) tiene forma cuadrangular y fue llenado con agua a 25°C ± 1°C a una altura de 25 cm aproximadamente, altura que no les permite tocar el fondo con sus extremidades posteriores, donde no existe la posibilidad de escapar.
43 realizando movimientos mínimos que le permiten mantenerse a flote, pero sin desplazamientos.
Figura 7. Nado Forzado. Estanque utilizado para evaluar la respuesta de las ratas al estrés agudo.
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Diseño experimental
Análisis estadístico
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RESULTADOS
Análisis químico
En el Cuadro 1 se muestran los valores de polifenoles totales y antocianinas monoméricas en el jugo de zarzamora procesado con ultrasonido (Zarzamora-Baja), procesado con ultrasonido + jugo liofilizado 2x (Zarzamora-Media) y 4x (Zarzamora-Alta). El aporte diario de la ingesta de 600 mL de zarzamora en el jugo Zarzamora-Baja para una persona de 70 kg es de 1005 mg de polifenoles totales (14.35 mgEAG/kg) y 179 mg de antocianinas (2.5 mgC3G/kg) un la ingesta diaria recomendada por Clifford (2000).
Polifenoles totales
mg EAG/L Antocianinas monoméricas mg C3G/L
Zarzamora-Baja 1675 299
Zarzamora-Media 3044 671
Zarzamora-Alta 4370 1216
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Pruebas conductuales
Laberinto de Brazos Elevados
Tiempo de permanencia en los brazos abiertos
La variable de respuesta tiempo de permanencia (segundos) en los brazos abiertos varió al comparar entre los grupos experimentales (F(4,40)=5.63, p<0.001), además se encontró que los grupos Diazepam y Zarzamora-Media permanecieron mayor tiempo en los brazos abiertos del laberinto en contraste con el grupo Vehículo, mientras que el grupo de Zarzamora-Alta se comportó de manera similar al Vehículo (Gráfica 1).
Gráfica 1. Tiempo en brazos abiertos. ANOVA de una vía para grupos independientes, prueba post hoc Student-Newman-Keuls. Abreviaturas: Veh, grupo Vehículo; Dzp, grupo de Diazepam; Z. Baja, grupo de Zarzamora-Baja; Z. Media, grupo de Zarzamora-Media; Z. Alta, grupo de Zarzamora-alta.