Objetivo general
PRUEBAS CONDUCTUALES
Las ratas fueron evaluadas en el laberinto de brazos elevados durante 5 min, después fueron observadas en el campo abierto durante 5 min y posteriormente se realizó la prueba de nado forzado con una duración de 6 min.
Laberinto de Brazos Elevados
El aparato está construido de madera, consta de cuatro brazos opuestos en forma de cruz, dos brazos son abiertos (pintados de blanco) de 50 cm de largo por 10 cm de ancho, sin paredes, y los otros dos, cerrados (pintados de negro), con las mismas dimensiones y con paredes de 40 cm de alto (pintadas de negro), así mismo el aparato se elevó a 50 cm sobre el nivel del suelo (Enging & Treit, 2007) (Figura 5). Esta prueba se realizó en un cuarto aislado con iluminación de 40 lux y consistió en colocar a la rata en el centro del laberinto y llevar un conteo del número de entradas y salidas en los dos tipos de brazo (abierto y cerrado), así como también el tiempo de permanencia en ellos. Para fortalecer el análisis conductual también se evaluaron otras dos conductas: el head-dipping y el attempts, en tiempo y frecuencia.
En la parte superior del aparato, se colocó una videocámara Sony, DCR-SR85, 2000x optical zoom, para grabar todas las sesiones de prueba y posteriormente realizar los registros por dos observadores independientes. El día de la prueba, los animales fueron colocados cuidadosamente en el centro del aparato, con la cabeza en dirección hacia un brazo abierto. La prueba tuvo una duración de 5 min y se evaluaron las siguientes variables: a) tiempo de permanencia en los brazos abiertos (en segundos); b) número de entradas a los
40 brazos abiertos; c) el número total de entradas a los brazos (abiertos + cerrados); d) el porcentaje de entradas a los brazos abiertos; e) el índice de ansiedad y f) la evaluación de riesgo (head-dipping y attempts). Para la conducta de evaluación de riesgo se contabilizó el número de eventos y el tiempo empleado en dichas conductas.
El head-dipping es una conducta identificada cuando la rata asoma la cabeza hacia el suelo desde el filo de los brazos abiertos, esta respuesta puede ocurrir mientras el cuerpo del animal se encuentra en los brazos cerrados o los brazos abiertos (Walf & Frye, 2007), mientras que el attempts se identifica como un intento por explorar los brazos abiertos, seguido inmediatamente por una respuesta de evitación (la rata se estira hacia delante sin mover sus patas y enseguida se retracta, volviendo a su posición original) puede presentarse tanto en los brazos abiertos como en los cerrados, sin embargo surgen mayormente en la salida de los cerrados y se relaciona con los indicadores de mayor grado de ansiedad (Rodgers et al., 1997). Las ratas que cayeron al suelo fueron descartadas del análisis de datos. Estas variables fueron seleccionadas considerando que son un buen indicador de un estado de ansiedad; un alto porcentaje de tiempo o entradas en los brazos abiertos es indicativo de una reducción de los niveles de ansiedad (Walf & Frye, 2007). El índice de ansiedad fue calculado de acuerdo a Cohen y colaboradores (2013) de la siguiente manera:
!" = 1 −
tiempo en brazos abiertos
tiempo total de la prueba + número de entradas a brazos abiertosnúmero total de cruces a los brazos 2
Se consideró que la rata entraba a alguno de los brazos únicamente cuando tres cuartas partes de su cuerpo estuvieran dentro del brazo respectivo. Al finalizar cada prueba los brazos del laberinto fueron limpiados cuidadosamente con solución al 15% de etanol, con la finalidad de evitar que existieran alteraciones conductuales inmediatas atribuibles a los estímulos sensoriales producidos por sustancias volátiles presentes en la orina o defecaciones de la rata evaluada previamente y que pudieran contaminar los resultados (Gutiérrez-García & Contreras, 2002).
41 Figura 5. Laberinto de Brazos Elevados. Aparato empleado para evaluar las conductas relacionadas con la ansiedad. Campo Abierto
Para evaluar los efectos de los tratamientos sobre la actividad motora espontánea de las ratas y descartar la posibilidad de hipoactividad o hiperactividad atribuible a los tratamientos que pudieran influir en el rendimiento en el laberinto de brazos elevados y la prueba de nado forzado, se realizó una prueba de campo abierto con una duración de 5 min, la cual fue filmada con una videocámara Sony, DCR-SR85, 2000x optical zoom. La prueba se realizó inmediatamente después de la prueba de laberinto de brazos elevados. La caja utilizada para esta prueba mide 44 x 33 cm y está hecha de vidrio opaco, con el piso delineado en 12 cuadros de 11x 11 cm (Rodríguez-Landa et al., 2009, Figura 6).
Las variables evaluadas fueron: a) el número de cuadros cruzados, que corresponde a las veces que una rata cruza de un cuadro a otro con al menos tres cuartas partes de su cuerpo, lo cual es considerado como un indicador de motricidad, b) el tiempo de conducta vertical, que es la suma de los periodos en los cuales la rata adquiere una postura vertical sostenida sobre sus patas traseras y c) tiempo de acicalamiento, que son los periodos de tiempo (segundos) dirigidos al auto-aseo.
El acicalamiento incluye todas aquellas conductas de aseo autodirigidas como el lamido de la región ano-genital, las extremidades anteriores y la emisión de giros elípticos amplios de las extremidades anteriores sobre las orejas, la cabeza, el cuerpo y el rabo del
42 propio animal (en orden cefalo-caudal); también cualquier movimiento elíptico de amplitud pequeña limitado a las vibrisas de forma unilateral o bilateral (Kalueff & Touhimaa, 2004 y 2005). Al término de la prueba de cada sujeto, la caja fue cuidadosamente limpiada con una solución acuosa de alcohol al 15% con la finalidad de evitar que existieran alteraciones conductuales inmediatas atribuibles a los estímulos sensoriales producidos por sustancias volátiles presentes en la orina o defecaciones de la rata evaluada previamente (Gutiérrez- García & Contreras, 2002).
Figura 6. Caja de campo abierto empleada para evaluar la actividad locomotora espontánea de las ratas.
Nado Forzado
La prueba consistió en introducir a las ratas de manera individual en un estanque de vidrio (40x30x50cm). El estanque (Figura 7) tiene forma cuadrangular y fue llenado con agua a 25°C ± 1°C a una altura de 25 cm aproximadamente, altura que no les permite tocar el fondo con sus extremidades posteriores, donde no existe la posibilidad de escapar.
Se utilizó el modelo propuesto por Borsini (1995), en el cual, la prueba tiene una duración de 6 min, se analizan únicamente los últimos 4 min, y sólo se evaluó el tiempo total de inmovilidad, que es la suma de los periodos en los cuales la rata permanece
43 realizando movimientos mínimos que le permiten mantenerse a flote, pero sin desplazamientos.
Figura 7. Nado Forzado. Estanque utilizado para evaluar la respuesta de las ratas al estrés agudo.
Todas las pruebas conductuales fueron filmadas con una cámara Sony, DCR-SR85, 2000x optical zoom, para posteriormente cuantificar las variables de nuestro interés por dos observadores independientes mediante un programa elaborado para registros conductuales, hasta llegar un porcentaje de concordancia de al menos el 95%.
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