Universidad de Concepción Dirección de Postgrado
Facultad de Ciencias Químicas -Programa de Graduados
Determinación de parámetros relevantes para la eficiencia de
la hidrólisis enzimática de pulpas obtenidas por procesos de
autohidrólisis y kraft de
Eucalyptus globulus
Tesis para optar al grado de doctor
FABIO DAVID ARAYA CARVAJAL
CONCEPCIÓN-CHILE
2015
Agradecimientos
Agradezco a Dios, a mis padres, Angela y Fabio y a mi amada Costa Rica, por ellos soy y existo, gracias por enseñarme y acompañarme en el camino…
A mi Edita, por creer en mi…
A mis guías y consejeros de estudios al Dr. Jaime Baeza (Q.E.P.D.) y a la Dra. Juanita Freer, por su cariño, apoyo y protección en todo momento.
A mis hermanos Alejandra, Johanna, Iveth, Sebastián, Diego y Emmanuel y a sus familias, por mostrarme su cariño y apoyo incondicional.
A los doctores Héctor Mansilla, Regis Teixeira, Germán Aroca y Nestor Escalona, miembros de la Comisión Evaluadora de Tesis, por sus correcciones y sugerencias.
A la Comisión Nacional de Investigación Científica y Tecnológica, Conicyt, por la Beca de Doctorado en Chile para extranjeros 2010 (63100148). Al Consejo Nacional para Investigaciones Cientificas y Tecnologicas de Costa Rica, Conicit (FI-59-2010). Al Fondo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico, Fondecit (1110828). A la Escuela de Graduados y Dirección de Posgrado de la Universidad de Concepción, por el apoyo económico para la asistencia a eventos de divulgación científica y pasantías.
Un especial agradecimiento al Dr. John Ralph y su equipo de trabajo del DOE Great Lakes Bioenergy Research Center (DOE Office of Science BER DE-FC02-07ER64494) de Wisconsin University, y al Dr. José Carlos del Río, Dr. Jorge Rencoret, la Dra. Ana Gutiérrez y a su equipo de trabajo del Instituto de Recursos Naturales y Agrobiología de Sevilla (IRNAS), por permitirme desarrollar parte de mi investigación en sus laboratorios y aportarme conocimiento.
Al Centro de Biotecnología, y al laboratorio de Recursos Renovables, a Eduardo, don José, Roberto, Rosemarie, Isidora, Carolina, Naty, Pame, Marcelo, Nico, a David Contreras, Pili, Marcela, Dr. Rodriguez, Dra. Valenzuela y a todos los que de alguna u otra forma aportaron algo a esta investigación.
A todo el personal de la Facultad de Ciencias Químicas de la Universidad de Concepción, en especial a la Sra. Angélica Hernández, al personal del laboratorio de fisicoquímica del Dr. Escalona, a Karla y Katy, a Karen y Silvia de NMR, y a Bernardita por su buena dispocisión.
Al Dr. Miguel Pereira y a su equipo de trabajo, del Laboratorio de Productos Forestales, Facultad de Ingeniería, por su ayuda.
Tabla de contenido
Capítulo 1: Introducción ... 14
1.1. Generalidades ... 15
1.2. La madera y sus principales componentes químicos en la pared celular ... 16
1.2.1. Celulosa ... 17
1.2.2. Hemicelulosas ... 19
1.2.3. La lignina ... 20
1.2.4. Extractivos ... 21
1.3. Biorefinería ... 22
1.3.1. Pretratamientos del material lignocelulósico ... 22
1.3.1.1. Deslignificación por pretratamientos alcalinos, Pulpaje kraft. ... 23
1.3.1.2. Pretratamientos en medio ácido ... 27
1.4. Hidrólisis enzimática de la celulosa ... 30
1.5. Recalcitrancia de la biomasa lignocelulósica ... 33
1.5.1. Efecto de la composición química de la pared celular en la digestibilidad enzimática ... 33
1.5.2. Efecto de la estructura física en la digestibilidad enzimática ... 35
1.6. Antecedentes ... 36
1.7. Hipótesis: ... 38
1.8. Objetivo principal ... 38
1.8.1. Objetivos específicos ... 38
Capítulo 2: Materiales y Métodos ... 39
2.1. Reactivos ... 40
2.2. Pretratamiento de las muestras... 40
2.2.3. Pretratamiento de autohidrólisis ... 41
2.2.4. Pretratamiento de autohidrólisis seguido de extracción alcalina ... 41
2.3. Hidrólisis enzimática de la celulosa ... 42
2.4. Métodos y técnicas analíticas... 42
2.4.1. Determinación de la humedad ... 42
2.4.2. Cuantificación de carbohidratos y lignina ... 42
2.4.3. Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) ... 43
2.4.4.. Microscopía Confocal de Láser (LSCM) ... 43
2.4.5. Espectroscopía Infrarroja con Transformada de Fourier (FTIR) ... 44
2.4.6. Espectroscopía 2D-RMN Heteronuclear Single Quantum Correlation Spectroscopy (HSQC) ... 44
2.4.7. Pirólisis analítica GC/MS ... 45
2.4.8. Determinación del Índice de Cristalinidad por RMN C-13 de sólidos ... 45
2.4.9. Viscosidad por el método del viscosímetro capilar ... 46
Capítulo 3: Resultados y Discusión ... 48
3.1. Pulpaje kraft: deslignificación a diferente álcali activo ... 49
3.1.1 Composición Química de Materia Prima y Materiales Pretratados y Conservación de los componentes en el pretratamiento. ... 49
3.1.2. Hidrólisis Enzimática de los materiales pretratados ... 51
3.1.2.1.Efecto del contenido de lignina residual en el rendimiento de la hidrólisis enzimática ... 53
3.1.3. Análisis morfológico del material pretratado ... 53
3.1.4. Análisis espectral del material pretratado ... 55
3.1.5. Caracterización de la celulosa ... 62
3.2.1. Composición química de Materia Prima y Materiales Pretratados
y Conservación de los componentes en el pretratamiento ... 64
3.2.2. Rendimiento de Glucanos Fermentables en la Hidrólisis Enzimática ... 66
3.2.3. Análisis morfológico del material pretratado ... 67
3.2.4. Análisis espectral del material pretratado ... 70
3.2.5. Caracterización de la celulosa ... 70
3.3. Estudio de la extracción alcalina de la fibra de pulpa obtenida por autohidrólisis de E. globulus. ... 80
3.3.1. Composición química del material pretratado ... 80
3.3.2. Rendimiento de Glucanos Fermentables en la Hidrólisis Enzimática ... 82
3.3.3. Análisis morfológico del material pretratado ... 83
3.3.4. Análisis espectral del material pretratado ... 86
3.3.5. Caracterización de la celulosa ... 92
Capítulo 4: Conclusiones ... 94
Bibliografía ... 98
Índice de Figuras
Figura 1.1. Estructura plasmática de las plantas y estructura de la pared celular. ... 17
Figura 1.2. Estructura y enlaces de la celulosa. ... 18
Figura 1.3. Estructura de las hemicelulosas: a) Unidad estructural de un xilano. b) Unidad
estructural de un galactoglucomanano ... 19
Figura 1.4. Modelo estructural de lignina: a) principales unidades de lignina b) modelo
propuesto para madera blanda c) modelo propuesto para madera dura ... 21
Figura 1.5. Esquema de la adición del ión sulfito de hidrógeno al enlace -O-4 éter al
carbono de la estructura de la lignina. ... 25
Figura 1.6. Reacción de peeling. ... 27
Figura 1.7. Hidrólisis ácida de los glucopiranósidos ... 28
Figura 1.8. Posibles reacciones de degradación de los enlaces β-O-4 durante la autohidrólisis,
las depolimerización de la lignina por rutas 1 o 3, repolimerización de la lignina por ruta
2.. ... 29
Figura 1.9. Diagrama de la acción enzimática sobre la celulosa ... 31
Figura 1.10. Diagrama del complejo enzimático actuando sobre la cadena de celulosa... 32
Figura 1.11. Diagrama de los mecanismos de inhibición de la lignina sobre la hidrólisis
enzimática de la celulosa: A) adsorción de la enzima a la lignina, B) restricción de la
accesibilidad de la enzima a los carbohidratos, C) inhibición de la enzima por los
compuestos derivados de la lignina formados en el pretratamiento. ... 34
Figura 3.1. Perfiles de hidrólisis enzimática de pulpas de E. globulus en rendimiento de
Figura 3.2. Rendimiento de glucanos a las 72 h de hidrólisis enzimática en función del
porcentaje de lignina de pulpas de E. globulus, obtenidas por pulpaje kraft a diferentes
álcali activo... 53
Figura 3.3. Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) de pulpas obtenidas de pulpaje kraft a
165 ºC de E. globulus, durante 20 minutos y con 30% de sulfidez, a distintos álcali
activo: a) 12% AA, b) 14% AA, c) 16% AA, d) 18% AA... 54
Figura 3.4. Microscopía Confocal de Fluorescencia de pulpas obtenidas por pulpaje kraft a
165º C de árboles de E. globulus, durante 20 minutos y con 30% de sulfidez: a) 12%
AA, b) 18% AA. ... 55
Figura 3.5. Espectro infrarrojo para los árboles de E. globulus sin pretratamiento y las pulpas
obtenidas por pulpaje kraft con distintos álcali activo. ... 56
Figura 3.6.a. Expansión de la región de la cadena lateral del espectro HSQC de E. globulus y
sus respectivas pulpas obtenidas por pulpaje kraft variando el álcali activo. ... 57
Figura 3.6.b. Expansión de la región aromática del espectro HSQC de E. globulus y sus
respectivas pulpas obtenidas por pulpaje kraft variando el álcali activo. ... 57
Figura 3.7. Py-GC/MS pirogramas de madera de E. globulus, y sus respectivas pulpas
obtenidas a partir de deslignificación kraft a diferentes álcali activos. ... 60
Figura 3.8. Espectros CP-MAS 13C NMR sólidos a 400 MHz de E. globulus y pulpas
obtenidas variando el álcali activo en pretratamiento kraft. ... 63
Figura 3.9. Perfiles de hidrólisis enzimática de pulpas de E. globulus en rendimeinto de
glucosa para el árbol A y B, obtenidas por autohidrólisis a diferentes severidades. ... 67
Figura 3.10. Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) de pulpas obtenidas de autohidrólisis
Figura 3.11. Microscopía Confocal de Fluorescencia de la pulpa obtenida por autohidrólisis
de E. globulus a severidades de a) 3.89 y b) 4.78. ... 70
Figura 3.12. Espectro Infrarrojo para E. globulus sin pretratamiento y las pulpas obtenidas
por autohidrólisis a distintas severidades de reacción. ... 71
Figura 3.13.a. Expansión de la región de la cadena lateral del espectro HSQC de E. globulus
sin pretratamiento y de pulpas obtenidas por autohidrólisis a diferentes severidades. ... 74
Figura 3.13.b. Expansión de la región aromática del espectro HSQC de E. globulus sin
pretratamiento y de pulpas obtenidas por autohidrólisis a diferentes severidades. ... 74
Figura 3.14. Py-GC/MS pirogramas de madera de E. globulus, y sus respectivas pulpas
obtenidas a partir de autohidrólisis a diferentes severidades. ... 76
Figura 3.15. Espectros CP-MAS 13C NMR sólidos a 400 MHz de E. globulus y pulpas
obtenidas por autohidrólisis variando las severidades de reacción. ... 79
Figura 3.16. Perfiles de hidrólisis enzimática de pulpas de E. globulus en rendimiento de
glucosa, obtenidas por autohidrólisis a diferentes severidades antes y después de la
extracción alcalina. ... 83
Figura 3.17. Microscopía Electrónica de Barrido (SEM) de pulpas obtenidas por
autohidrólisis a distintas severidades y su posterior extracción alcalina con NaOH 8% de
árboles de E. globulus: a) So= 3.69, b) So= 3.81 y c) So= 4.02 y sus respectivas
extracciones alcalinas. ... 84
Figura 3.18. Microscopía Confocal de Fluorescencia de pulpas obtenidas por autohidrólisis a
distintas severidades y su posterior extracción alcalina con NaOH 8% de árboles de E.
globulus: a) So= 3.69, b) So= 3.81 y c) So= 4.02 y sus respectivas extracciones alcalinas. ... 85
Figura 3.19a. Expansión de la región de la cadena lateral del espectro HSQC de E. globulus
sin pretratamiento y de pulpas obtenidas por autohidrólisis a diferentes severidades antes
Figura 3.19b. Expansión de la región aromática del espectro HSQC de E. globulus sin
pretratamiento y de pulpas obtenidas por autohidrólisis a diferentes severidades antes y
después de la extracción alcalina... 87
Figura 3.20. Py-GC/MS pirogramas de madera de E. globulus, y sus respectivas pulpas
obtenidas a partir de autohidrólisis a diferentes severidades y sus respectivas
extracciones alcalinas.. ... 90
Figura 3.21. Espectros CP-MAS 13C NMR sólidos a 400 MHz de E. globulus y pulpas
obtenidas por autohidrólisis variando la severidad de reacción antes y después de la
Índice de Tablas
Tabla 3.1. Composición química de las pulpas de E. globulus obtenidas por pulpaje kraft en
base pulpa seca. ... 50
Tabla 3.2. Porcentaje de conservación de componentes en las pulpas de E. globulus obtenidas
por pulpaje kraft a diferentes álcali activos. ... 51
Tabla 3.3. Rendimiento de glucanos obtenidos en la hidrólisis enzimática de los materiales
pretratados obtenidos a diferentes álcali activo. ... 52
Tabla 3.4. Principales componentes de guayacol (G) y siringol (S) derivados de lignina de E.
globulus y pulpas obtenidas de pulpaje kraft a diferentes álcali activo (AA) (sus
estructuras químicas se muestran en el anexo 4). ... 61
Tabla 3.5. Características de la celulosa aislada de los materiales pretratados. ... 62
Tabla 3.6. Composición química de las pulpas de E. globulus obtenidas por autohidrólisis
durante 30 minutos de reacción con diferentes severidades en base madera seca. ... 65
Tabla 3.7. Porcentaje de conservación de componentes en las pulpas de E. globulus obtenidas
por autohidrólisis durante 30 minutos de reacción a diferentes severidades en base
madera seca. . ... 66
Tabla 3.8. Rendimientos de glucanos en la hidrólisis enzimática de los materiales pretratados
a 72 h. ... 67
Tabla 3.9. Principales componentes de guayacol (G) y siringol (S) derivados de lignina de E.
globulus y pulpas obtenidas de autohidrólisis a diferentes severidades. ... 77
Tabla 3.11. Composición química de las pulpas de E. globulus obtenidas por autohidrólisis a
diferentes severidades en base pulpa seca y sus respectivas extraciones alcalinas con
hidróxido de sodio. ... 81
Tabla 3.12. Porcentaje de conservación de componentes de E. globulus obtenidas por
autohidrólisis a diferentes tiempos de reacción y sus respectivas extraciones alcalinas
con hidróxido de sodio. ... 82
Tabla 3.13. Rendimiento en la hidrólisis enzimática de materiales sin y con extracción
alcalina... 83
Tabla 3.14. Principales componentes de guayacol (G) y siringol (S) derivados de lignina de
E. globulus y pulpas obtenidas de autohidrólisis a diferentes severidades antes y después
de la extracción alcalina. ... 91
Tabla 3.15. Características de la celulosa de las pulpas de E. globulus obtenidas por
autohidrólisis a diferentes tiempos de reacción y sus respectivas extraciones alcalinas
con hidróxido de sodio. ... 92
Anexo 1. Bandas características en el espectro FT-IR para la madera y sus asignaciones
según lo reportado en la literatura. ... 111
Anexo 2. Bases químicas y asignamientos de las correlaciones de las señales de 13C-1H en el espectro HSQC-2D RMN de Eucalyptus globulus y pulpas obtenidas de los distintos pretratamientos ... 112
RESUMEN
La biomasa lignocelulósica es una opción viable para la producción de combustibles alternativos.
En Chile, la principal fuente de biomasa proviene de las plantaciones forestales, convirtiendo la
madera en un potencial recurso para el desarrollo de bioetanol celulósico. No obstante, la
compleja estructura de la biomasa lignocelulósica hace muy difícil la hidrólisis enzimática de la
celulosa. Al someter la biomasa a pretratamientos que desestructuren la matriz se logra mayor
accesibilidad a los carbohidratos por parte de las enzimas en la sacarificación enzimática. Sin
embargo, durante los pretratamientos se producen cambios estructurales que afectan la hidrólisis
enzimática, por lo que se hace necesario estudiar dichos cambios en el material pretratado, para
obtener información de los mecanismos moleculares de los pretratamientos y poder optimizarlos.
En el presente trabajo se estudiaron dos pretratamientos sobre madera de Eucalyptus globulus:
kraft (alcalino) y autohidrólisis (ácido), y se determinaron cómo se afectaron algunos parámetros
físicos y químicos, y el efecto sobre la digestibilidad de la celulosa. Los diferentes materiales
pretratados fueron analizados química, morfológica y espectroscópicamente. El pretratamiento
kraft permite la solubilización de la lignina, disminuyéndose la barrera estérica y favoreciendo la
efectividad de las enzimas por reducción de sitios de adsorpcion no productiva, incrementado el
volumen del poro y el área superficial interna. Los análisis morfológicos de la superficie de la
fibra mostraron cambios como formación de grietas, y escamaciones durante la deslignificación
que mejoraron la accesibilidad a la celulosa. La lignina sufrió una importante ruptura de
subunidades β-O-4’, estructuras tipo resinol y enlaces tipo éter de unidades S. Por autohidrólisis
se solubilizaron gran parte de las hemicelulosas y se observaron cambios estructurales y
redistribución de la lignina, mejorándose la accesibilidad de la celulasa a la celulosa, con lo que
se lograron altos rendimientos en la sacarificación a pesar de los altos contenidos de lignina. Se
observó migración y relocalización de la lignina, a una distribución más concentrada, formando
redepositaciones esféricas sobre la pared celular, y reducción de enlaces aril-éter y la presencia de
nuevas estructuras condensadas en la lignina. Bajo las condiciones estudiadas, la lignina es más
recalcitrante cuando permanece homogéneamente distribuída sobre la pared celular que cuando se
redistribuye heterogéneamente en forma de esferas. El proceso fue ligeramente más rápido al
aplicar un tratamiento alcalino posterior a la autohidrólisis para remover la lignina lixiviada, sin
embargo la conversión de glucanos en glucosa no incrementó considerablemente a las bajas
ABSTRACT
14
15 1.1. Generalidades
Debido al acelerado incremento en el consumo energético mundial, especialmente en países
desarrollados, los recursos para obtener combustibles fósiles son cada vez menores, razón por la
cual en los últimos años se ha despertado un gran interés por parte de los gobiernos en buscar
nuevas fuentes de energía renovables, que sean más amigables con el medio ambiente y capaces
de satisfacer las demandas del mercado mundial.
La biomasa lignocelulósica, que se obtiene de cultivos, árboles, alimentos de origen agrícola, así
como desechos y residuos de madera, agrícolas y de origen orgánico (Saxena et al., 2009; Zheng
et al., 2009), es un potencial recurso de energía renovable (Chang y Holtzapple, 2000; Fatih,
2009), por ser una fuente de azúcares fermentables para la producción de bioetanol (Himmel et
al., 2005; Nakagame et al., 2011).
El bioetanol es el primer combustible renovable que se produce a nivel industrial a partir de
biomasa, principalmente en países como Estados Unidos, de maíz, y Brasil, de caña de azúcar
(Lin y Tanaka, 2006; Zhu et al., 2008). Según la tecnologías para obtenerlo, los biocombustiles se
clasifican como de primera y segunda generación. Los biocombustibles de primera generación
son aquéllos que se obtienen de azúcares, almidón, grasas y aceites vegetales, pero tienen la
desventaja que se utilizan cultivos agrícolas para su producción, lo que ha generado
problemáticas de desplazamiento de áreas cultivables de alimento y encarecimiento de los
mismos (Martínez-Anaya et al., 2008). Por otra parte, están los combustibles de segunda
generación provenientes de recursos forestales como la madera y residuos agrícolas, como el
bagazo y la paja de trigo, que son en cierta medida más favorables y económicamente más viables
que los de primera generación porque utilizan desechos para su producción (Fatih, 2009)
En Chile, una de las principales fuentes de biomasa proviene de la industria forestal de plantas de
celulosa, siendo la madera una de las principales materias primas producidas a nivel nacional. De
las 75,7 millones de hectáreas del territorio chileno, 16 millones son bosques, de las cuales el
16 principalmente a la exportación. En cuanto a las empresas, cerca de mil exportan productos
forestales a más de 100 mercados en China, Japón, Europa, América del Norte y del Sur. Las dos
especies mayoritarias en los bosques cultivados son el Pinus radiata y el Eucalyptus globulus, los
cuales se utilizan para la producción de madera, tableros y pulpa para papel, entre otros
(CORMA, 2010).
La madera es un recurso renovable muy interesante para la producción de combustibles por su
bajo costo de producción, está disponible en grandes cantidades y es fácil de almacenar (Zhu et
al., 2009).
1.2. La madera y sus principales componentes químicos en la pared celular
La madera está constituida por tres componentes estructurales principales (celulosa, hemicelulosa
y lignina) y otros componentes no estructurales (extractivos), los cuales no están distribuidos
uniformemente en la pared celular, cambiando su concentración de una región morfológica a otra
(Sjöström, 1993).
Las células vegetales presentan como característica particular una pared celular formada por una
serie de multicapas estructurales (Figura 1.1). La capa más externa se conoce como lamela media
(LM) con un porcentaje mayoritario de lignina, que le da rigidez y protección a las subcapas más
internas. La pared primaria (P) que es más delgada y principalmente contiene hemicelulosa. La
pared interior es una pared secundaria que se subdivide en subcapas, S1 la más externa, S2 en el
medio y hay algunas maderas que tienen una tercera S3 más interna, la pared secundaria está
constituida por cadenas de microfibrillas de celulosa dispuestas de maneras ordenadas
entrelazadas (Sjöström, 1993; Várnai et al., 2010; Zhao et al., 2012). Al conjunto de celulosa y
hemicelulosa se le conoce como holocelulosa y contribuye a la fuerza mecánica de la pared
celular (Sjöström, 1993). El tipo de madera se clasifica dependiendo del árbol de donde se
obtiene y pueden ser maderas duras de los árboles de hojas latifoliadas, o blandas que provienen
17 Figura 1.1. Estructura plasmática de las plantas y estructura de la pared celular, modificado de Sticklen, 2008.
1.2.1. Celulosa
La celulosa es el componente estructural mayoritario de las paredes celulares vegetales; le da la
firmeza a la madera dependiendo de la linealidad y cristalinidad de sus moléculas. Está presente
entre 42% a 46% del peso en madera de coníferas y entre 43% a 50% en madera de latifoliadas
(Hon, 2000; Nelson et al., 2009).
La celulosa es un homopolisacárido compuesto de unidades de β-D-glucopiranosa, unidas por
enlaces glucosídicos (1→ 4) (Figura 1.2). Esta macromolécula es lineal y con una gran tendencia
a formar enlaces de hidrógeno tanto intra como intermoleculares (Palonen, 2004). Las moléculas
de celulosa están distribuidas en regiones de microfibrillas con alto grado de ordenamiento
(cristalino), alternados con regiones de menos ordenamiento (amorfo). Las microfibrillas
constituyen fibrillas que finalmente forman las fibras de celulosa. Debido a esta estructura fibrosa
18 disolventes. La unidad que se repite es un disacárido conocido como celobiosa, donde la
molécula de glucosa se une a la siguiente alrededor del eje C1-C4 del anillo piranósico (Sjöström,
1993; Klemn et al., 1998).
H H H H H O O H OH OHCH2 H H H H O H O O H OH OHCH2 4 1 H H H H H O O H OH OHCH2 O 4 1
Figura 1.2. Estructura y enlaces de la celulosa.
La celulosa se clasifica según su comportamiento al ser tratada con soluciones alcalinas. La
celulosa es la celulosa que es insoluble en una solución acuosa de hidróxido de sodio al 17,5%.
La porción soluble en medio alcalino que luego precipita al neutralizar se conoce como
βcelulosa. La parte que continúa soluble, aún en la solución neutralizada se conoce como
19 1.2.2. Hemicelulosas
Las hemicelulosas son polisacáridos compuestos de diferentes tipos de monómeros, unidos por
enlaces β(1→ 4) en su cadena principal, que incluyen pentosas (D-xilosa y L-arabinosa), hexosas
(D-glucosa, D-galactosa, L-galactosa, D-manosa, L-ramnosa y L-fructosa) y ácidos urónicos (ácido
D-glucurónico y ácido D-galacturónico) (Sjöström, 1993; Bobleter, 1994). Se utiliza en la
industria por sus propiedades físicas, químicas y su actividad biológica. Se puede convertir
fácilmente a compuestos más simples como xilosa, xilitol, furfural, hidroximetilfurfural o ácido
levulínico (Hon, 2000). Los compuestos sustituyentes se encuentran enlazados a la cadena
principal de la hemicelulosa o en las ramificaciones de los carbohidratos. Se encuentran a lo largo
de la pared celular, desde la lamela media hasta la capa S3 de la pared secundaria, siendo más
abundante en las capas S1 y S3, con menos cantidad en la S2. La estructura compleja de la
hemicelulosa es la que confiere una variedad de propiedades biofísicas y biomecánicas en los
tejidos de las plantas en los que se encuentra (Wyman, 1996).
Figura 1.3. Estructura de las hemicelulosas: a) Unidad estructural de un xilano. b) Unidad
estructural de un galactoglucomanano, modificado de Yeoman et al., 2010
a)
20 El contenido y el porcentaje de hemicelulosa es diferente en maderas duras y blandas. En maderas duras se encuentra en porcentajes entre 20% a 37% y en maderas blandas de 16% a 27%. En cuanto a la composición, las maderas blandas contienen grandes cantidades de galactoglucomananos parcialmente acetilados, además de arabino-4-O-metilglucuronoxilanos en menores proporciones, donde las unidades 1-4-xilanopiranosa se sustituyen parcialemente por el ácido 4-O-metil-D-glucorónico (MeGlcA) en el C-2. Mientras en maderas duras las hemicelulosas son principalmente O-acetil-4-O-metilglucoronoxilanos. En los residuos de xilosa hay grupos acetilos en las posiciones C-2 y C-3; también hay presencia de una cantidad pequeña de glucomananos (Figura 1.3) (Hon, 2000).
1.2.3. La lignina
La lignina es el segundo biopolímero más abundante en la naturaleza, es un componente de la
pared celular de traqueidas, vasos y fibras, contribuye a la fuerza y da soporte a la pared celular,
mejora el transporte del agua a través del xilema y limita el esparcimiento de patógenos en los
tejidos de las plantas (Donaldson, 2001; Grabber, 2005; Rencoret et al., 2010). Es otro
componente esencial de la madera, y se presenta en cantidades entre 20% a 30% de todo el tejido
vascular de las plantas (Laureano-Perez et al., 2005).
Es un polímero fenólico, amorfo y tridimensional, compuesto de tres tipos de monolignoles, los
cuales están heterogéneamente conectados por varias subunidades interenlazadas como: β-O-4,
ββββ, 5-5 and 4-O-5, etc (Figura 1.4) (Fengel y Wegener, 1983; Kim et al., 2011). Se
forma a partir de la de deshidrogenación de fenilpropanos, seguida de un acoplamiento
radicalario. Las maderas blandas están compuestas principalmente de unidades de guayacilo,
proveniente del alcohol trans-coniferílico como precursor (Simmons et al., 2010). En las maderas
duras la lignina presenta unidades guayacilo y siringilo, derivadas del alcohol trans-coniferílico y
el alcohol sinapílico, respectivamente (Figura 1.4) (Hon, 2000).
La lignina está covalentemente enlazada con la hemicelulosa a través de uniones tales como
bencil-éter, bencil-éster, y fenil-glicosídicos, originándose el complejo lignina carbohidrato
(CLC) de la pared celular de las plantas (Bjorkman, 1957; Fengel y Wegener, 1983; Kim et al.,
21
carbono del grupo fenilpropano en la lignina y cualquiera de los carboxilos o grupos hidroxilos
de la hemicelulosa, por medio de enlaces tipo éster o éter (Morrison, 1974; Jeffries, 1991; Xie et
al., 2000).
Figura 1.4. Modelo estructural de lignina: a) principales unidades de lignina b) modelo propuesto para madera blanda c) modelo propuesto para madera dura (Mohan et al., 2006)
1.2.4. Extractivos
La madera también cuenta con una variable cantidad de componentes no estructurales conocidos
como extractivos que están en menor proporción y son tanto de tipo lipofílicos como hidrofílicos.
En su mayoría los extractivos presentan baja masa molecular. Algunos de los extractivos son los
terpenos y esteroides que se derivan de unidades de isopreno, entre ellos se encuentran los
monoterpenos, sesquiterpenos, diterpenos, triterpenos y politerpenos. Otros extractivos son las
ceras y grasas, los constituyentes fenólicos, como lignanos, taninos y flavonoides se encuentran
principalmente en el corazón de la madera y en la corteza, estos compuestos cuentan con
propiedades fungicidas que protegen al árbol de ataques microbiológicos y además le dan a)
22 coloración natural a la madera. En menor medida la madera cuenta con una pequeña cantidad de
compuestos inorgánicos, tales como carbonatos y fosfatos de metales como calcio, potasio,
magnesio y hierro (Sjöström, 1993).
1.3. Biorefinería
La biorrefinería es un concepto muy utilizado en los procesos donde el principal objetivo es la
producción eficiente y rentable de biocombustibles, energía y productos químicos, aplicando la
tecnología a partir de la conversión de la biomasa lignocelulósica, aprovechando los diversos
componentes de la materia prima y sus intermedios (Carvalheiro et al., 2008; Fatih, 2009;
Martin-Sampedro et al., 2011). Para lograr este propósito la biorefinería necesita conocer la composición
precisa de la biomasa que será procesada, con el fin de generar conocimiento en la aplicación de
dichas tecnologías, controlando el costo y la calidad de los productos que se obtendrán.
En el caso de producción de bioetanol a partir de biomasa, los carbohidratos fermentables
resultan difíciles de liberar debido a la estructura compleja del material lignocelulósico, y los
productos que se generan en un eventual pretratamiento dificultan su hidrólisis enzimática y su
fermentación, haciendo que la producción de etanol a partir de celulosa sea un proceso
económicamente no rentable (Li et al., 2009). Es por eso que el pretratamiento de la biomasa
debe plantearse como una estrategia enfocada a la máxima recuperación de todos los
componentes por medio de pretratamientos físicos y químicos, generando productos de alto valor
agregado, con tecnologías sencillas y de fácil aplicación a los procesos ya utilizados en la
industria.
1.3.1. Pretratamientos del material lignocelulósico
Las barreras físicas y químicas causadas por la asociación de los principales componentes de la
biomasa lignocelulósica impiden la hidrólisis de los carbohidratos a azúcares fermentables. El
principal objetivo de un pretratamiento es incrementar la accesibilidad enzimática para mejorar la
digestibilidad de la celulosa. Cada pretratamiento y las condiciones en que se realice tiene efectos
específicos sobre la celulosa, hemicelulosa y lignina. Varios factores han sido reconocidos que
afectan la hidrólisis enzimática de celululosa en materiales lignocelulósicos: el contenido y
distribución de la lignina, el contenido de hemicelulosa, la cristalinidad y grado de polimerización
23 presentan diferentes características físico-químicas, lo que hace necesario aplicar pretratamientos
basados en la materia prima.
Los pretratamientos son necesarios para aumentar la digestibilidad de la celulosa en la hidrólisis
enzimática, pues permiten desestructurar la matriz lignocelulósica, debilitando los enlaces de la
pared celular, removiendo lignina y/o hemicelulosas, reduciendo la cristalinidad de la celulosa e
incrementando la porosidad del material pretratado (Mosier et al., 2005; Sun y Cheng, 2002),
lográndose con esto un aumento de la accesibilidad de las celulasas (Chang y Holtzapple, 2000;
Yang y Wyman, 2008), conduciendo a altos rendimientos de productos en la hidólisis enzimática
y en la fermentación, minimizándose la formación de productos secundarios durante la
degradación de la lignina y de los azúcares, que puedan inhibir el proceso (Palonen, 2004). Los
pretratamientos pueden ser mecánicos, químicos o biológicos. Los pretratamientos mecánicos
separan las fibras de la estructura original, que posteriormente se pueden someter a procesos
químicos. Los pretratamientos químicos se realizan con reactivos ácidos, alcalinos o solventes
orgánicos, que modifican la lignina reduciéndola a formas solubles, eliminándola en un alto
porcentaje de la lamela media y logrando la separación de las fibras o hidrolizando y removiendo
las hemicelulosas de la matriz lignocelulósica (Melo, 1995; Sun y Cheng, 2002). También se han
probado tratamientos biológicos de deslignificación utilizando microorganismos tales como
hongos que degraden y modifiquen la estructura del material lignocelúsico (Contreras et al.,
2006).
Las condiciones y variables de los distintos procesos están asociadas a las características de la
madera, su especie (contenido de lignina y distribución en la pared celular), la densidad, factores
de crecimiento, periodo de almacenamiento, o bien asociadas al pretratamiento utilizado
(cantidad de reactivos y concentración, temperatura y tiempo de cocción) (Mimms et al., 1993).
A continuación se detallan dos pretratamientos utilizados en este trabajo para la desestructuración
de la matriz lignocelulósica, pulpaje kraft (básica) y autohidrólisis (ácida).
1.3.1.1. Deslignificación por pretratamientos alcalinos, Pulpaje kraft.
Los pretratamientos alcalinos son usados para deslignificar la matriz lignocelulósica, rompen su
estructura, removiendo gran parte de la lignina y hemicelulosas, hinchando la fibra y
24 deslignificación de madera más utilizado en la industria es el proceso kraft, el cual implica la
utilización de hidróxido de sodio (NaOH) y sulfuro de sodio (Na2S) (licor blanco) para extraer la
lignina de las fibras de la madera. El líquido que se separa (licor negro) es concentrado por
evaporación y quemado en una caldera de recuperación para generar vapor de alta presión, que
puede utilizarse para las necesidades de vapor de la planta o para la producción de energía
eléctrica. La porción inorgánica del licor es usada para regenerar el hidróxido de sodio y el sulfito
de sodio necesario para el pulpeo (Jun et al., 2012). La reacción se lleva a cabo entre 140 ºC y
170 ºC durante un periodo que va de una a seis horas, dependiendo de la calidad de la pulpa
deseada. Los iones hidrógeno sulfuro (SH–) e hidroxilo (OH–) son los nucleófilos de la reacción
en el proceso de pulpaje que solubilizan la lignina, al hidrolizar los enlaces tipo éster entre la
lignina y los carbohidratos, degradándola a componentes más pequeños y más hidrofílicos
(Thompson, 1989).
Reacciones de la lignina:
El principal objetivo del pulpaje kraft es remover de una manera selectiva la lignina. En este
pretratamiento se modifica estructuralmente la madera, abriendo la fibra posibilitanto la
accesibilidad enzimática y la degradacón de los carbohidatos a sacáridos con menor grado de
polimerización. Las especies activas, OH- y SH-, fragmentan la macromolécula de lignina en
unidades pequeñas (Santos et al., 2013) más solubles, formando radicales libres por medio de
intermediarios como quinonas metiladas, rompiendo enlaces aril-alquil éter y liberando grupos
fenólicos. El ión sulfuro carga las quinonas metiladas en bencil-tioles que aumentan el
rompimiento de los enlaces de lignina y reducen la condensación de la misma (Erdtman, 1972;
25 Figura 1.5. Esquema de la adición del ión sulfito de hidrógeno al enlace -O-4 éter al carbono de la estructura de la lignina, modificado de Sixta, 2006.
El pulpaje kraft puede ser dividido en tres fases cinéticas, con diferentes tipos de reacciones de la
lignina y los carbohidratos. La fase inicial involucra la impregnación de las astillas de madera con
el licor de cocción, en esta fase se consume velozmente el álcali, debido a la neutralización de
ácidos, producto de la degradación de ramificaciones en la hemicelulosa, como hidrólisis de
grupos acetilos, y de ácidos grasos, por otra parte la deslignificación es moderada y controlada
por la difusión. En esta etapa, se rompen principalmente los enlaces αy β éter de la lignina
liberando grupos hidróxilos de fenoles, el rompimiento de enlaces β-aril éter se da por
intervención de iones SH- que generan estructuras de metil quinonas (Froass et al., 1998), que
posteriormente fragmentan las estructuras de lignina. El ropimiento de los enlaces β-O-4 de
estructuras fenólicas se muestra en la Figura 1.5. En condiciones alcalinas, las estructuras
bencil-fenólicas entran en equilibrio con las metil quinonas formadas en el proceso. En presencia de
iones hidrosulfuro se generan estructuras de benzil-tioles, que posteriormente en una reacción
nucleofílica atacan al Cβ, formando un episulfuro y un nuevo grupo fenólico terminal. La
26 cocción, el que en medio básico sufre una reacción de dismutación formándose los iones
hidrosulfuro y tiosulfato. Pueden haber reacciones de competición, donde la quinona metilada
que se formó como intermediario puede perder el grupo -hidroximetilo y formar una estructura
enol éter sin el rompimiento del enlace β-éter, o reaccionar con nucleófilos presentes en el medio
tales como estructuras de lignina o carbohidrato creando nuevos enlaces carbono-carbono más
estables (Ek et al., 2009). Estructuras no fenólicas β-O-4 en la lignina también pueden romperse
durante el pulpaje kraft, donde los grupos α o -hidroxilos se ionizan y se da un ataque
nucleofílico interno que rompe el enlace β-éter y forma un epóxido con nuevas estructuras de
lignina fenólicas (Ek et al., 2009).
En la siguiente fase, se da la mayor deslignificación, donde la lignina removida con menor
pérdida de carbohidratos, siendo la fase más selectiva del proceso. La última fase involucra baja
deslignificación con un incremento en la degradación de polisacáridos. Una concentración alta en
iones HS- es escencial para lograr una eficiente remoción de lignina con un ataque limitado a los
carbohidratos. Por el contrario una baja concentración de estos iones puede promover un
incremento en la resistencia de estructuras enol éter que son degradadas en la fase inicial, lo que
provoca un proceso más difícil de deslignificación (Santiago et al., 2008; Santos et al., 2013).
A una temperatura dada, la deslignificación kraft depende en gran medida del pH, del licor de
cocción y sobretodo de rompimiento de los enlaces en los grupos éter. La presencia de iones
sulfuro de hidrógeno facilita la desliginificación, ya que son nucleófilos más fuertes que el ión
hidroxilo. La acción de ambos iones en los enlaces de los éteres provoca la liberación de grupos
hidroxi-fenólicos que incrementan la hidrofilia de la lignina y la disuelve en el licor de cocción al
degradarla en fenolatos de sodio (Figura 1.5) (Sixta, 2006).
Reacción de los polisacáridos:
Una reacción que se da durante la cocción que afecta a la celulosa y a la hemicelulosa es la
llamada reacción de peeling, donde las unidades de azúcares terminales de la cadena de la
celulosa o la hemicelulosa, son removidas una por una. La reacción de peeling en el pulpaje kraft
conlleva una considerable pérdida de carbohidratos, los grupos acetilos (en xilano en el caso de
27 carbohidratos se convierten en ácidos carboxílicos como ácido acético y ácido fórmico (Figura
1.6). Otra reacción que llega a ser importante a temperaturas cercanas a los 170 ºC es la hidrólisis
alcalina, donde la celulosa es fraccionada, generándose más grupos terminales favoreciéndose así
la reacción de peeling (Mimms et al., 1993).
Figura 1.6. Reacción de peeling, modificado de Sixta, 2006.
1.3.1.2. Pretratamientos en medio ácido
El objetivo del pretratamiento es desestructurar la biomasa abriendo la matriz
lignina-hemicelulosa y rompiendo la estructura interna de la celulosa, para ello las lignina-hemicelulosas son
preferiblemente atacadas, seguidas de la celulosa amorfa por una hidrólisis ácida (Foston y
Ragauskas, 2010; Sannigrahi et al., 2011). A diferencia de los pretratamientos alcalinos, durante
la hidrólisis ácida, la hemicelulosa es removida por hidrólisis de los enlaces glicosídicos, mientras
la lignina es depolimerizada al romperse los enlaces -aril éter no condensados del complejo
lignina-carbohidrato y repolimeriza sobre la fibra (Guerra et al., 2006; Thompson, 1989).
Existen varios métodos para remover principalmente hemicelulosas de la biomasa como la
explosión a vapor, tratamiento con solventes orgánicos, ácidos diluidos, o con enzimas (Tunc y
van Heiningen, 2008; Vila et al., 2011). Un método muy común para remover hemicelulosas en
28 pretratamiento de autohidrólisis las maderas duras son sometidas a altas temperaturas en un
reactor con agua, donde se liberan los grupos acetilos unidos a las cadenas de hemicelulosa, que
generan un medio ácido que hidroliza y solubiliza los xilanos (Romaní et al., 2010).
Reacción de los polisacáridos:
Remover las hemicelulosas de la madera involucra la hidrólisis de enlaces glicosídicos en los
polisacáridos y las uniones α y β- aril éter con la lignina. Frecuentemente, la hidrólisis va
acompañada de reacciones de deshidratación, degradación y condensación. La reactividad de las
uniones glicosídicas depende del tamaño del anillo de los azúcares, su conformación y el pH del
medio. El mecanismo para los polisacáridos implica la protonación del oxígeno glicosídico, la
formación de un ión carbonio-oxonio y la descomposición del ácido conjugado correspondiente,
posteriormente una molécula de agua sirve de nucléofilo y se forma el azúcar libre (Figura 1.7)
(Hon, 2000).
Figura 1.7. Hidrólisis ácida de los glucopiranósidos (Hon, 2000)
El descenso del pH en el medio, debido principalemnte a hidrólisis de los grupos acetilo en las
hemicelulosas, favorecen las reacciones de hidrólisis de los enlaces glicosídicos, las cuales son
catalizadas por los iones hidronio (Carvalheiro et al., 2008), degradando las hemicelulosas a
sacáridos solubles en el licor de reacción (Bardet et al., 1985; Garrote et al., 1999; Romaní et al.,
29 Reacciones de la lignina:
En condiciones ácidas, donde los xilanos son relativamente más fáciles de remover, la lignina
sufre fragmentación por acidólisis en los enlaces β-O-4 (Chen et al., 2010; Moxley et al., 2012),
generándose reacciones colaterales de repolimerización entre anillos aromáticos y el ión carbonio
que se forma como intermediario, frecuentemente en la cadena alifática en el Cα formando
nuevos enlaces C-C que son más estables que los enlaces éter (Li et al., 2007), la lignina se
redeposita, acumulándose sobre la fibra de la pulpa (Donohoe et al., 2008; Li et al., 2007). En
condiciones de acidez débil, como cuando el catalizador es el ácido acético generado por la
hidrólisis de acetilos en la hemicelulosa, se producen rompimientos homolíticos en la lignina por
medio de intermediarios como metilquinonas, por medio de reacciones de acoplamientos e
intercambio de radicales, las que generan formación de nuevos tipos enlaces βββyβ entre
las ligninas, estos enlaces son más difíciles de romper en el pretratamiento, pero puede haber
formación de formaldehido a partir de la hidrólisis en los enlaces -C de la cadena alifática
(Figura 1.8) (Leschinsky et al., 2008).
Figura 1.8. Posibles reacciones de degradación de los enlaces β-O-4 durante la autohidrólisis, las depolimerización de la lignina por rutas 1 o 3, repolimerización de la lignina por ruta 2.
Modificado de Li et al., 2008.
El remover hemicelulosas de la madera se ha utilizado para producir pulpas, ya que se modifica la
30 celulosa en las pulpas con un menor grado de polimerización (DP) que en el material original
(Jun et al., 2012). Además, las hemicelulosas tienen potenciales usos a nivel industrial como
biopolímeros, hidrogeles y derivados de xilano, o bien por su naturaleza amorfa sus cadenas de
polisacáridos son más fácilmente hidrolizables que la celulosa (Hon, 2000).
La celulosa obtenida de los distintos pretratamientos a partir de la desestructuración de la madera,
posteriormente se separan en azúcares más sencillos como la glucosa, por medio de una hidrólisis
enzimática con un complejo de celulasas y luego poder fermentarlos para obtener etanol.
1.4. Hidrólisis enzimática de la celulosa
El material celulósico como fuente de carbono es bastante interesante por su abundancia y bajo
costo, sin embargo su naturaleza recalcitrante hace que sólo organismos particulares generen
enzimas necesarias que actúen simultáneamente, para convertir la celulosa en glucosa mediante
una hidrólisis enzimática (Kumar y Wyman, 2008). La primera parte de la hidrólisis enzimática
consiste en la adsorción de las enzimas de la fase líquida a la superficie de las celulosa (sólido),
posteriormente la biodegradación de la celulosa a azúcares más simples, principalmente celobiosa
y oligómeros, finalmente, la desorción de las celulasas a la fase líquida (Saddler et al., 1982).
La hidrólisis se lleva a cabo por medio de la acción sinérgica de por lo menos tres enzimas
conocidas como celulasas, las cuales son altamente específicas y se producen extracelularmente
por microrganismos, ya sean hongos o bacterias, que utilzan la fuente de carbono que hay en la
celulosa (Mussatto et al., 2008). El complejo enzimático se clasifica por lo general en tres grupos:
exoglucanasas, endoglucanasas y β-glucosidasas. Las endoglucanasas disminuyen el grado de
polimerización de la celulosa, atacando la región amorfa, rompiendo los enlaces β-1,4 dejando
terminales reductores y no reductores. Las exoglucanasas formadas por celodextrinasas y
celobiohidrolasas actúan en los extremos reductores liberando oligo-sacáridos, celobiosa y
glucosa, las endoglucanasas atúan prefrerentemente sobre las áreas amorfas de la fibra de
celulosa (Rahikainen et al., 2013). Por último, la β-glucosidasa hidroliza la celobiosa en glucosa
(Arantes y Saddler, 2010), esta enzima se encarga de la regulación de todo el proceso celulolítico,
limitando la velocidad de la hidrólisis. Tanto las exoglucanasas como las endoglucanasas son
31 que degraden simultáneamente la celobiosa en glucosa, sin embargo las β-glucosidasas son
inhibidas por la glucosa, por lo que una solución a esto puede ser trabajar con una sacarificación
y fermentación simultánea (SFS) que es un proceso en que se reduce la inhibición de los
productos finales de la hidrólisis, pues disminuye el contenido de azúcares que se van
produciendo en la hidrólisis al fermentarlos simultáneamente a etanol (Ward, 2011; Lynd et al.,
2002; Sun y Cheng, 2002). Un diagrama de la acción del complejo enzimático se muestra en la
Figura 1.9.
Las celulasas presentan una estructura modular que actúan en sinergismo unas con las otras, su
estructura de péptido no catalítico tiene un sitio de unión a los carbohidratos (se conoce como
CBM), que se acopla por medio de aminoácidos hidroxilados y glicosilados al sitio catalítico de
la enzima, donde se lleva a cabo la hidrólisis de la celulosa (Figura 1.10). El sitio de unión
aproxima el sustrato al anclarse a él por un tiempo prolongado, potenciando la hidrólisis en el
sitio catalítico (Martínez-Anaya et al., 2008; Linder y Teeri, 1996).
32 La hidrólisis enzimática es una reacción heterogénea que requiere contacto físico entre la enzima
y el substrato, las enzimas deben difundirse desde el medio lignocelulósico en la biomasa hasta la
superficie específica de la celulosa como substrato, sin embargo la presencia de otros
componentes (lignina y hemicelulosa) (Thompson, 1989), y de propiedades físcoquímicas como
la cristalinidad y el grado de polimerización de la celulosa, dificultan la acción enzimática en un
fenómeno conocido como recalcitrancia (Mussatto et al., 2008).
Figura 1.10. Diagrama del complejo enzimático actuando sobre la cadena de celulosa,
33 1.5. Recalcitrancia de la biomasa lignocelulósica
Aunque la hidrólisis enzimática de la biomasa lignocelulósica y la fermentación de los azúcares
obtenidos, son una buena alternativa para la producción de combustibles renovables, la
accesibilidad de las enzimas y microorganismos digestivos, al substrato celulósico se limita por la
estructura compleja de la biomasa (Zhu et al., 2008). El material lignocelulósico frecuentemente
es descrito como “recalcitrante” (Himmel et al., 2005). La recalcitrancia es la resistencia natural
que presentan las paredes celulares de las plantas a la destrucción por microorganismos o enzimas
(Himmel et al., 2007; Pu et al., 2013), esto debido a sus mecanismos físicos y químicos de
defensa (Himmel et al., 2005), covirtiéndose en el mayor obstáculo económico costo-eficiencia
en la producción de biocombustibles a partir de celulosa (Rollin et al., 2011).
Entre los factores naturales que contribuyen a la lenta reacción del material biomásico se pueden
incluir el alto contenido de lignina y la presencia de hemicelulosas en la pared celular, que
recubren las microfibrillas de celulosa. Estos compuestos limitan el acceso enzimático para la
hidrólisis de la celulosa (Nakagame et al., 2011). Además, la estructura en sí misma de la
celulosa, la cristalinidad, tamaño de poro, superficie específica y grado de polimerización
dificulta el trabajo enzimático, también se ha propuesto que elementos estructurales de muchos
materiales lignocelulósicos reaccionan a los procesos de pretratamiento de manera que también
reducen la digestibilidad enzimática (Boussaid y Saddler, 1999; Himmel et al. 2005; Mooney et
al., 1999). Es por todo esto que se hace necesario el conocimiento profundo de las características
del substrato y su relación con la hidrólisis enzimática para optimizar el proceso de la
sacarificación de la biomasa, explorando así mismo nuevas alternativas a los diseños ya
conocidos (Rollin et al., 2011).
1.5.1. Efecto de la composición química de la pared celular en la digestibilidad enzimática
La lignina:
La lignina es el componente estructural que le da protección a la pared celular del ataque de
microorganísmos del medio, y constituye la barrera física más importante que limita el acceso a
34 distribución y la estructura físico-química de la lignina afecta la hidrólisis enzimática, aún más
que su cantidad total presente (bajo cierto límite) en la biomasa, dificultándose su remoción por la
presencia de enlaces covalentes con la hemicelulosa, pues la accesibilidad de las enzimas a la
celulosa puede jugar un papel más importante durante la hidrólisis que las interacciones
hidrofóbicas de la lignina con las celulasas (Grabber, 2005; Hu et al., 2013; Wiman et al., 2012).
Algunos autores consideran que la lignina residual después del pretratamiento retrasa la velocidad
de la hidrólisis enzimática y disminuye la digestibilidad de la celulosa (Mendes et al., 2011; Pan
et al., 2005; Ralph et al., 2001), al presentar interacciones hidrofóbicas, electrostáticas y por
enlaces de hidrógeno con los grupos hidrofóbicos en las celulasas como grupos aromáticos, como
triptofano, fenilalanina y tirosina (Martín-Sampedro et al., 2013; Palonen, 2004), provocando
uniones improductivas, reduciendo la cantidad de enzima disponible para hidrolizar la celulosa
(Chandra et al., 2007; Nakagame et al., 2011; Pu et al., 2013; Yang y Wyman, 2004). También
ha sido postulado que el efecto que provoca la lignina a la accesibilidad de la celulosa se debe
principalmente a su distribución sobre la matriz, más que su contenido mismo (Thompson, 1989).
Se han sugerido tres mecanismos por los cuales la lignina puede generar inhibición de las
celulasas (Figura 1.11): primero la lignina cubre la superficie de los carbohidratos impidiendo el
ataque enzimático (Mooney et al., 1998), segundo la lignina puede adsorberse a la enzima
(Palonen, 2004) y por último, los compuestos derivados de la lignina formados durante el
pretratamiento pueden interaccionar con la enzima inhibiendo su acción sobre la celulosa
(Ximenes et al., 2010; 2011).
Figura 1.11. Diagrama de los mecanismos de inhibición de la lignina sobre la hidrólisis enzimática de la celulosa: A) adsorción de la enzima a la lignina, B) restricción de la accesibilidad de la enzima a los carbohidratos, C) inhibición de la enzima por los compuestos
35 Las Hemicelulosas:
Aunque las hemicelulosas representan también una barrera física que dificulta la acción
enzimática de las celulasas (Moxley et al., 2012; Pu et al., 2013), lo hacen en menor grado que la
lignina. Por otra parte, son más fáciles de hidrolizar por pretratamientos ácidos o con vapor,
incluso se remueve en gran cantidad en el proceso de deslignificación. Algunas investigaciones
han demostrado que el remover hemicelulosas de la biomasa aumenta considerablemente la
hidrólisis enzimática de la celulosa al incrementar la porosidad y aumentar el área superficial de
la celulosa (Shuai et al., 2010). Las hemicelulosas pueden removerse por métodos de
autohidrólisis, donde por la presencia de grupos ácidos en la cadena de polisacáridos se forman
ácidos que bajan el pH entre 3,5 y 4,5, removiéndose la hemicelulosa en forma de oligómeros
(Jun et al., 2012).
Se ha encontrado que la presencia de grupos acetilos en las cadenas de la hemicelulosa pueden
inhibir a las celulasas, sin embargo su porcentaje en la biomasa proveniente de la madera es tan
bajo y es relativamente fácil de remover, que su aporte a la recalcitrancia es muy pequeño (Zhu et
al., 2008 ).
1.5.2. Efecto de la estructura física en la digestibilidad enzimática
Debido a que la superficie del substrato es el factor más relevante en la accesibilidad de la
enzima, es necesario tomar en cuenta la influencia de la reducción del tamaño de partícula en el
proceso hidrolítico de la celulosa y en el pretratamiento realizado para mejorar su digestión (Zhu
et al., 2009). La superficie accesible que limita la digestibilidad de la celulosa está altamente
relacionado con el tamaño de partícula de la biomasa lignocelulósica y el volumen del poro.
Disminuir el tamaño de partícula o aumentar el volumen del poro incrementa la superficie
accesible para que actúe la enzima aumentando la digestibilidad de la celulosa (Zhu et al., 2008 ).
Cristalinidad de la celulosa:
La estructura cristalina de la celulosa es una característica particular muy inusual en los
polisacáridos, a raíz de los enlaces de hidrógeno, que provocan que los componentes moleculares
36 sólo de enzimas hidrolíticas, si no que incluso de moléculas pequeñas, como el agua (Arantes y
Saddler, 2010; Mosier et al., 2005). La región cristalina de la celulosa es la parte más
recalcitrante para las enzimas. Sin embargo, las microfibrillas de la celulosa no sólo son
cristalinas, presentan además regiones amorfas, estos componentes amorfos son más fácilmente
digeridos por las enzimas (Laureano-Perez et al., 2005; Lynd et al., 2002; Zhao et al., 2006). Los
pretratamientos de la biomasa que reducen la cristalinidad usualmente aumentan la hidrólisis de
la celulosa.
Grado de polimerización:
El grado de polimerización (DP) se conoce como la cantidad de unidades de glucosa en la cadena
de celulosa. En la hidrólisis enzimática se despolimeriza su estructura por medio de la acción
sinérgica del sistema enzimático de celulasas. En las maderas, el largo en las cadenas influye
directamente en la facilidad con que las enzimas pueden hidrolizar la celulosa. Un bajo DP de la
celulosa le provee a las enzimas más sitios de unión, aumentando la velocidad de hidrólisis (Zhao
et al., 2012). El DP está ligado a la cristalinidad y porosidad de la celulosa, que con los
pretratamientos de la biomasa se ven afectados, en la mayoría de los casos DP de celulosa se
reduce, dejando más regiones amorfas y mejorando el substrato al incrementar la superficie sobre
de la fibra (Chandra et al., 2007; Gupta y Lee, 2009).
1.6. Antecedentes
Los efectos de los factores que originan la recalcitrancia de la biomasa lignocelulósica han sido
objeto de estudio en diversas investigaciones. Laureano-Perez et al. (2005) evaluaron los cambios
en la cristalinidad de la celulosa y la remoción de lignina y hemicelulosas en el rastrojo del maíz,
al pretratarlas por explosión a vapor y amonio (método AFEX), encontrando mejores
rendimientos de azúcares en la hidrólisis enzimática. Yang y Wyman(2004) también evaluaron la
recalcitrancia de residuos de maíz al someter a un proceso de hidrólisis ácida obteniendo
resultados similares. Zhu et al. (2008) encontraron que al deslignificar e hidrolizar la
hemicelulosa para disminuir el contenido de grupos acetilos en el álamo por un pretratamiento
alcalino con KOH, se modifica y reduce la cristalinidad de la celulosa mejorando la digestibilidad
37 residuos de trigo obteniendo un aumento en el rendimiento de la glucosa al remover lignina y
hemicelulosas de la biomasa.
El mejoramiento y desarrollo de pretratamientos que faciliten la conversión efectiva y viable de la
biomasa lignocelulósica en azúcares fermentables, requiere de un detallado conocimiento de las
propiedades físicas y químicas que influyen en la recalcitrancia de la celulosa, así mismo como
estas propiedades pueden alterar los mecanismos de hidrólisis enzimática por el complejo de
celulasas, afectando las interacciones biocatalíticas de las enzimas sobre la biomasa, es por todo
lo anterior que en el presente estudio se pretendió encontrar respuestas a dichos factores desde un
punto de vista de las alteraciones de la matriz en el proceso.
El pretratamiento de la biomasa lignocelulósica es indispensable para obtener un alto rendimiento
de azúcares fermentables para la producción de bioetanol. Sin embargo, las características más
importantes de estructura y composición, que limitan la conversión enzimática, no están aún
claramente comprendidas. En el desarrollo de una biorefinería es de gran interés entender la
estructura de la biomasa, y los efectos que tienen los pretratamientos sobre sus componentes, con
el fin de minimizar costos en preprocesamientos y enzimas, logrando un modelo que sea
económico.
En el presente trabajo se estudiaron dos pretratamientos sobre madera de E. globulus: kraft
(alcalino) y autohidrólisis (ácido) y se determinaron cómo se afectaron algunos parámetros físicos
38 1.7. Hipótesis:
La interacción de las propiedades físicas y químicas más relevantes que afectan los rendimientos
de sacarificación en la hidrólisis enzimática, pueden ser establecidas mediante el análisis de
pulpas de madera de E. globulus con diferente contenido de lignina, obtenidas por procesos de
autohidrólisis y kraft.
1.8. Objetivo principal:
Estudiar las propiedades físicas y químicas que influyen en la recalcitrancia de la hidrólisis
enzimática de pulpas obtenidas de los procesos de autohidrólisis y kraft, de madera de E. globulus
con diferente composición química.
1.8.1. Objetivos específicos:
1. Determinar características químicas y/o físicas entre dos muestras de madera de E.
globulus con diferente contenido de lignina.
2. Establecer relaciones entre las propiedades físicas y químicas de las pulpas, y el
rendimiento de la hidrólisis enzimática de la celulosa del proceso kraft.
3. Establecer relaciones entre el rendimiento de la hidrólisis enzimática de la celulosa, la
severidad y las características físicas y químicas del material pretratado por autohidrólisis.
4. Estudiar el efecto del contenido de lignina, hemicelulosa y celulosa residual, además su
estructura química sobre la recalcitrancia de la madera pretratada mediante los procesos
39
40
2.1. Reactivos
Ácido acético glacial (CH3COOH) (RA ACS JT Baker)
Ácido sulfúrico (H2SO4) (JT Baker)
Bromuro de potasio (KBr) (Aldrich)
Celulasa (NS-22128 CCN03128; 71 FPU mL-1Novozyme)
-glucosidasa (NS-22128 DCN00216; 265 CB mL-1Novozyme)
Clorito de sodio (NaClO2) (IBI Scientific)
Cobre (II)-etilendiamina (Merck Millipore)
DMSO-d6 ((CH3)2SO) (Merck Millipore)
Etanol (CH3CH2OH) (Sigma)
Hidróxido de sodio (NaOH) (Merck Millipore)
Piridina-d5 (C5H5N) (Merck Millipore)
Sulfuro de sodio (Na2S) (Merck Millipore)
Tolueno (C7H8) (JT Baker)
2.2. Pretratamiento de las muestras 2.2.1 Materia prima
Muestras de madera de E. globulus con distinto contenido de lignina (25 % árbol A y 28% árbol
B) fueron provistas por una empresa forestal de la Región del Bío-Bío. Astillas (2.5 x 1.5 x 0.2
cm) fueron secadas a aproximadamente 40 °C en estufa de aire forzado hasta lograr un contenido
de humedad cercano a 10%. El material secado se almacenó en bolsas selladas en lugar fresco y
seco hasta su uso. Estas muestras se sometieron a diferentes pretratamientos (kraft, autohidrólisis
y autohidrólisis-extracción alcalina) variando las condiciones de los procesos. Las muestras de
madera y de materiales pretratados fueron caracterizadas química, espectroscópica y
morfólogicamente
2.2.2. Pretratamiento kraft
Se trataron 100 g de astillas de madera de E. globulus de cada uno de los árboles utilizados para
41 en un digestor rotatorio (Regmed®, Brasil) de 4 reactores individuales. Las digestiones se
llevaron a cabo a distintos álcali activo (12, 14, 16 y 18%) y una sulfidez de 30% (calculadas
sobre base madera seca y expresadas como Na2O equivalentes). Después del pretratamiento el
reactor se enfrió con agua. El sobrenadante fue removido por decantación y el sólido separado
por filtración en una bolsa de nylon de 130 mesh. El sólido fue lavado con agua hasta pH neutro
a papel de pH. El material pretratado se almacenó en bolsas plásticas a 4 ºC.
2.2.3. Pretratamiento de autohidrólisis
El pretratamiento se llevó a cabo en un reactor Parr de 1 L (Moline, IL, USA) cargado con 100 g
de astillas de madera de E. globulus de los árboles A y B (en base madera seca) y agua
desionizada en proporción 1:4 m/v. Se realizaron reacciones a diferentes severidades (So = 3.89,
4.20, 4.48, 4.78). Las severidades se calcularon de acuerdo con la metodología de Sixta et
al.(2006), a partir de un factor obtenido de la relación tiempo temperatura registradas durante la
reacción de autohidrólisis, calculado mediante la fórmula So = [log(R)] con R= t * exp ((T-100)/
14.75) dónde t fue el tiempo de residencia (min) y T fue la temperatura de reacción (ºC).
Después del pretratamiento el reactor se enfrió en un baño agua-hielo. El sobrenadante fue
removido por decantación y el sólido se separó por filtración en una bolsa de nylon de 130 mesh.
El sólido fue lavado con agua hasta pH neutro a papel de pH y fueron desintegradas en una
licuadora de laboratorio TAPPI con agua desionizada. La pulpa resultante se centrifugó y se
almacenó en bolsas plásticas a 4 ºC .
2.2.4. Pretratamiento de autohidrólisis seguido de extracción alcalina
Se utilizaron 100 g de madera del árbol A, previamente impregnados con agua desionizada por 24
horas, que se colocaron en vasos del reactor Regmed® y se adicionó agua desionizada con una
razón 1:4 m/v. Se llevó a cabo la autohidrólisis a diferentes severidades (So =3.69, 3.81, 4.02),
calculados con la misma metodología de Sixta et al.(2006). Después del pretratamiento el reactor
se enfrió con agua. El sobrenadante fue removido por decantación y el sólido se separó por
filtración en una bolsa de nylon de 130 mesh. El sólido fue lavado con agua hasta pH neutro a
