Análisis moleculares en insectos de interés forense

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(1)ANÁLISIS MOLECULARES EN INSECTOS DE INTERÉS FORENSE. AURA MILENA VERA RODRIGUEZ. UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS BOGOTÁ, 2008. 1.

(2) ANÁLISIS MOLECULARES EN INSECTOS DE INTERÉS FORENSE. AURA MILENA VERA RODRIGUEZ Monografía presentada para optar al titulo de Biología. DIRECTOR: MANUEL PAREDES LÓPEZ PROFESOR CATEDRÁTICO DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS UNIVERSIDAD DE LOS ANDES. CO-DIRECTOR: SILVIA RESTREPO PROFESORA ASOCIADA DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS UNIVERSIDAD DE LOS ANDES. UNIVERSIDAD DE LOS ANDES FACULTAD DE CIENCIAS DEPARTAMENTO DE CIENCIAS BIOLÓGICAS BOGOTÁ, 2008. 2.

(3) AGRADECIMIENTOS. A Manuel Paredes por darme la oportunidad de hacer este trabajo; a Silvia Restrepo por la colaboración y la paciencia; a Ginna Camacho por su ayuda; a Jorge Noriega por brindarme información. Al grupo de Forense Lorena, Luisa, Luz, Jorge, Erica y especialmente María Andrea por la paciencia y la ayuda. A. mi. hermana. Tata,. mi. mamá. y. toda. mi. familia. por. apoyarme. incondicionalmente, por su cariño y por su respeto. A todos los que me han brindado su amistad, especialmente a Ximena Olarte que sido mi apoyo a lo largo del semestre. Y a todos los que de alguna forma colaboraron con este proyecto.. 3.

(4) ÍNDICE. 1. INTRODUCCIÓN. 7. 2. JUSTIFICACIÓN. 8. 3. OBJETIVOS 3.1. Generales. 8. 3.2. Específicos. 9. 4. ENTOMOLOGÍA FORENSE. 10. 5. EVOLUCIÓN HISTÓRICA DE LA ENTOMOLOGÍA FORENSE. 10. 6.. 5.1. Entomología forense en Suramérica. 12. 5.2. Entomología forense en Colombia. 13. CATEGORÍAS. ECOLÓGICAS. DE. DESCOMPOSICIÓN CADAVÉRICA 7. INSECTOS DE INTERÉS FORENSE. ARTRÓPODOS. EN. LA 14 15. 7.1. ORDEN DÍPTERA. 15. 7.1.1. Familias de importancia forense. 16. 7.1.1.1. Familia Calliphoridae. 16. 7.1.1.2. Familia Sarcophagidae. 17. 7.1.1.3. Familia Muscidae. 17. 7.2. ORDEN COLEÓPTERA. 18. 7.2.1. Familias de importancia forense. 19. 7.2.1.1. Familia Silphidae. 19. 7.2.1.2. Familia Dermestidae. 20. 4.

(5) 7.2.1.3. Familia Staphylinidae. 20. 7.2.1.4. Familia Histeridae. 21. 8. ESTUDIOS MOLECULARES. 22. 8.1. Orden Díptera. 22. 8.2. Orden Coleóptera. 29. 9. Bases de datos. 31. 9.1. National Center for Biotechnology Information (NCBI). 31. 9.2. European Bioinformatics Institute (EBI). 32. 9.3. The ITS2 DataBase. 32. 9.4. Barcode of life iniciative. 33. 10. DISCUSIÓN. 33. 11. CONCLUSIONES. 37. 12. REFERENCIAS. 38. 5.

(6) TABLA DE FIGURAS. Figura 1. Imágenes de moscas de “La fauna de los cadáveres”. 11. Figura 2. Individuos de la familia Calliphoridae. 16. Figura 3. Organismos de la familia Sarcophagidae. 17. Figura 4. Imágenes de la familia Muscidae. 18. Figura 5. Individuos de la familia Silphidae. 19. Figura 6. Imágenes de individuos de la familia Dermestidae. 20. Figura 7. Individuos de la familia Staphylinidae. 21. Figura 8. Imágenes de la familia Histeridae. 21. Figura 9. Árbol filogenético de la familia Calliphoridae. 23. Figura 10. Gel de productos amplificados de diferentes estadios en machos de la familia Calliphoridae. 25. Figura 11. Gel de los marcadores de ISSR. 26. Figura 12. Gel de la amplificación de los marcadores SCAR. 26. Figura 13. Árbol filogenético del género Chrysomya. 28. Figura 14. Árbol filogenético dl género Aleochara. 30. 6.

(7) 1. INTRODUCCIÓN. La entomología forense permite estudiar los insectos asociados a cadáveres, no solo para responder algunas incógnitas acerca del cuerpo, sino también para estimar el tiempo entre la muerte y el hallazgo de dicho cadáver, conocido como intervalo post-mortem; que permite dirigir la investigación en un marco de tiempo correcto; además de confirmar o refutar la coartada de un sospechoso (Magaña, 2001). Al mismo tiempo, conociendo la diversidad de insectos en regiones específicas, se puede determinar si el cuerpo ha sido movido del lugar donde se encontró (Wolff et al. 2001).. Los insectos que llegan, se encuentran en el cuerpo de acuerdo a una sucesión de especies que se da por el estado de descomposición del cadáver, ya sea que esté fresco, hinchado, en fase colicuativa o en reducción esquelética (Byrd & Castner, 2001).. Insectos del orden Díptera son por lo general los primeros colonizadores del cadáver, ya que son necrófagos, que se alimentan del cuerpo como tal, como las familias Calliphoridae, Sarcophagidae u Muscidae entre otras. Por su parte los Coleópteros, Silphidae y Dermestidae, también necrófagas, y las familias Staphylinidae y Carabidae, especies depredadoras, llegan al comienzo de la descomposición y permanecen hasta las últimas etapas; y las familias Dermestidae y Cleridae llegan ya sobre la fase seca (Magaña, 2001). Cuando se recuperan los huesos en los últimos estados de descomposición, serán estos organismos los que den la evidencia principal para determinar el intervalo post-mortem (Kulshrestha & Satpathy, 2001).. El estudio tradicional se realiza de acuerdo a claves taxonómicas de rasgos morfológicos que son representativos de los diferentes grupos de insectos. Sin embargo, cuando se tienen insectos en estadios tempranos del desarrollo, es. 7.

(8) difícil identificar la especie, por lo que se debe cultivar el organismo hasta que sea adulto y se puedan observar las características necesarias para lograr su clasificación. Además este análisis depende de la capacidad del investigador, detectando las características.. 2. JUSTIFICACIÓN. A lo largo de la historia, la entomología forense se ha consolidado como una herramienta útil para resolver un crimen. A nivel taxonómico se ha tenido un gran desarrollo, pero se tienen algunas limitantes: 1) Los caracteres morfológicos en larvas no son muy claros, por lo que es necesario cultivarlas hasta el adulto para realizar la clasificación, 2) Algunos individuos son muy pequeños y no es posible llegar a identificación de género o especie; y 3) Los especímenes de estudio pueden encontrarse fragmentados o deteriorados (Camacho, 2008; Comunicación personal). Los análisis moleculares permiten superar estas limitantes, pero la información disponible actualmente en esta área es muy poca (Vanegas, 2006).. Esta investigación busca presentar algunos de los diferentes análisis moleculares, realizados hasta el momento, en insectos de interés forense, centrándose en individuos de los órdenes Díptera y Coleóptera, ya que estos son los más importantes en la sucesión entomológica, necesaria para la estimación del intervalo post-mortem.. 3. OBJETIVOS. 3.1. Generales. Establecer el estado del arte para los diferentes análisis moleculares que pueden realizarse en individuos de los órdenes Díptera y Coleóptera para la. 8.

(9) identificación de especies, ya sea en muestras exclusivamente forenses o estudios realizados con fines filogenéticos que puedan utilizarse en esta identificación.. 3.2. Específicos. •. Hacer un análisis comparativo que permita ver las ventajas y desventajas de las diferentes secuencias de ADN, utilizadas en los estudios moleculares.. •. Hacer un análisis comparativo entre los diferentes protocolos de extracción y los distintos métodos moleculares utilizados.. 9.

(10) 4. ENTOMOLOGÍA FORENSE. La entomología forense es la interacción entre el sistema judicial y la rama de la zoología que estudia los insectos (Hall, 2001). Se puede dividir en: Urbana que se concentra principalmente en insectos que afecten el entorno del ser humano; De productos almacenados que involucra insectos o partes de estos presentes en comida u otros productos; y Médico legal ó médico criminal que usa los insectos como evidencia de un crimen (Hall, 2001).. Esta última subdivisión tiene como fin ayudar a resolver una investigación criminal, ya sean homicidios, asaltos, estimando el tiempo entre la muerte y el hallazgo del cadáver o intervalo post-mortem, el sitio donde ocurrió el hecho y además sirve de apoyo a otros tipos de evidencia utilizada (Magaña, 2001). Otra aplicación es la de estimar cómo y cuáles factores ambientales van a intervenir en el tiempo de descomposición del cuerpo, el proceso de colonización y el tiempo de desarrollo (Oliveira & Mello, 2004).. 5. EVOLUCIÓN HISTÓRICA DE LA ENTOMOLOGÍA FORENSE. La entomología forense nace en el siglo XIII, cuando Sung T´zu escribió el libro “Instrucciones a los Jueces”, donde explica en detalle lo que se conocía hasta el momento de la ciencia forense y resuelve el caso de un hombre que ha sido degollado con una hoz, pidiéndole a todos los habitantes que traigan sus hoces y las depositen en el suelo. Una de estas se llenó de moscas, por la sangre que aún tenía en la hoja, y de esta forma determinaron quien era el culpable. (Magaña, 2001; Goff 2001). 10.

(11) Durante los siglos XVIII y XIX, en exhumaciones masivas realizadas en Francia y Alemania, se encontraban artrópodos de muchos tipos junto a los cuerpos enterrados. Pero fue Orfila en 1831, quien entendió el papel tan importante que cumplen las larvas en la descomposición del cuerpo y comenzó a reconocer una sucesión de insectos (Benecke, 2001).. El primer caso donde se incluye una estimación del intervalo post-mortem lo reporta Bergeret en 1855. En una casa en remodelación encontraron un niño momificado, y el Doctor Bergeret realizó la autopsia, concluyendo que el niño había muerto en 1848; esto por evidencia de actividad de Sarcophaga canaria. Aunque el intervalo no era correcto, ya que malinterpretó la duración de los ciclos de vida de los insectos relacionados, en esa época fue prueba suficiente para que la policía arrestara a las personas que vivían en esa casa para la época (Goff, 2001).. Fig 1. Imágenes de moscas de “La fauna de los cadáveres”. Imagen superior: Pyophila petasionis. Imagen central: Sarcophage carnaria. Imagen inferior: Lucilia caesar. (Benecke, 2001). Mégnin, con sus publicaciones “La fauna de las tumbas” (1887) y “La fauna de los cadáveres” (1894), propuso que un cuerpo al aire sufre cambios que se van a caracterizar por ciertos artrópodos que aparecen en una sucesión regular. Así mismo, habla de 8 etapas de descomposición en humanos con oleadas de insectos, y describe 19 casos, incluyendo los propios. Inspirados por este trabajo, en 1895, los canadienses Johnston y Villeneuve realizaron estudios. 11.

(12) sistemáticos entomológicos en cadáveres humanos, concluyendo que no había datos para decir que Mégnin estuviera equivocado (Benecke, 2001; Goff, 2001).. En el siglo XX, Leclercq y Lambert, en 1976, encontraron que individuos de la especie Calliphora vomitoria depositaban sus huevos en la sangre de un cadáver, 6 horas después de la muerte. Para 1978, Leclercq publica "Entomología y Medicina Legal: Datación de la Muerte" y en 1986, Smith publica "Manual de Entomología Forense”, consolidando la entomología forense como ciencia (Benecke, 2001).. 5.1. Entomología forense en Suramérica. En Latinoamérica la información que se tiene es muy poca.. En Brasil, en Curitiba, Moura et al. (1997) realizaron un análisis preliminar de insectos de interés médico-legal. En el 2000, Carvalho et al. Identificaron artrópodos asociados a carroña de cerdo y cadáveres humanos en Campinas, Sao Paulo. Carvalho et al. (2001) determinaron el efecto del Diazepam en el crecimiento de moscas necrófagas del género Chrysomya. Para el 2004 ya hay publicaciones acerca del uso de la entomología forense para la estimación del intervalo post-mortem en casos de homicidio por parte de la policía de Rio de Janeiro (Velásquez, 2008). En Perú, en el 2003, Iannacone estudió, en un cerdo, los artrópodos asociados de interés forense en la región de Callao. Es el primer informe de este tipo en la región.. En Argentina, Oliva en el 2001, analizó los insectos de interés forense en carne de vaca. En el 2002, Centeno et al. observaron los cambios en la sucesión de. 12.

(13) insectos en cadáveres de cerdo, uno cubierto y otro sin cubrir, a lo largo de cambios estacionales.. En Venezuela, Mávares-Cardoso et al. en el 2005, estudiaron insectos de importancia forense asociados a pequeños cuerpos de mamíferos. En el 2006, en Carabobo, Venezuela, Salazar estudió insectos en nueve cadáveres de rata para determinar la composición de la entomofauna asociada. Finalmente en el 2007, Velásquez realizó un análisis preliminar de artrópodos asociados a carroña de ratas en una región montañosa al norte de Venezuela.. 5.2. Entomología forense en Colombia. El inicio de la entomología forense en Colombia se da con un estudio sucesional realizado en dos cánidos, en Cali, por Olaya (2001). Luego, Usaquén y Camacho en Bogotá (2000), estudiaron la presencia de Lucilia sericata. como la primera especie en colonizar el hígado humano.. Simultáneamente en Medellín, Wolff y Uribe (2000) hicieron un estudio sucesional en Sus scrofa.. En 2001 Wolff et al. , realizaron un estudio sucesional en Sus scrofa, donde concluyeron que predominaban las familias Calliphoridae, Sarcophagidae, Muscidae y Silphidae. Otro estudio es de Barreto et al. del 2002, en el que estudian estas mismas familias de insectos, asociadas a cadáveres humanos.. En la Sabana de Bogotá se ha caracterizado en Sus scrofa, los diferentes estados de descomposición en condiciones naturales de temperatura y humedad (Camacho, 2003) y de sol y sombra (Jiménez, 2003). Además, en el 2003, se observó el crecimiento de dípteros colonizadores, usando hígado contaminado con cianuro y barbitúricos (Cañón, 2003). Otro estudio es el de Martínez et al. (2007) donde realizaron un estudio sucesional en Páramo, Colombia a 3035m sobre el nivel del mar.. 13.

(14) Entre las investigaciones de entomología forense en Colombia, cabe resaltar los trabajos de Tesis que se están realizando en universidades como Universidad de los Andes, Universidad Distrital Francisco José de Cáldas, Pontificia Universidad Javeriana, Universidad de Antioquia, Universidad del Valle, Universidad Nacional de Colombia, entre otras.. Uno de estos trabajos es el realizado por Hernández en el 2008 en la Universidad de los Andes, donde trabajó con Citocromo Oxidasa I (COI) para la identificación de individuos de la familia Calliphoridae.. 6.. CATEGORÍAS. ECOLÓGICAS. DE. ARTRÓPODOS. EN. LA. DESCOMPOSICIÓN CADAVÉRICA. La sucesión entomológica sucede porque diferentes insectos son atraídos por diferentes estadios de la descomposición, que les son útiles ya sea como alimento o como extensión de su hábitat (Magaña, 2001; Benecke, 1998). Los organismos se pueden dividir en diferentes categorías ecológicas como son:. •. Necrófagos: Se alimentan del tejido en descomposición. Son los primeros en llegar, y por lo tanto los más importantes para estimar el intervalo post-mortem. En esta categoría se encuentran las familias Calliphoridae y Sarcophagidae del orden Díptera y las familias Silphidae y Dermestidae del orden Coleóptera (Magaña, 2001; Wolff et al. 2001).. •. Necrófilos: Son especies predadoras o parásitas de los necrófagos. Son el segundo grupo más importante en el cadáver. Hacen parte de este los Dípteros Calliphoridae y Stratiomydae, y los Coleópteros Silphidae, Staphylinidae e Histeridae (Magaña, 2001).. 14.

(15) •. Omnívoras: Se alimentan del cuerpo y de otros insectos. En esta categoría se encuentran hormigas, avispas y otros Coleópteros (Goff, 2001).. •. Accidentales: Son especies que no tienen relación con el cuerpo, solo lo utilizan como extensión de su hábitat, como por ejemplo arañas cazadoras o ciempiés (Magaña, 2001). También se incluyen animales que caigan de vegetación cercana o aterricen sobre el cuerpo (Goff, 2001).. 7. INSECTOS DE INTERÉS FORENSE. Es necesario identificar correctamente las especies de insectos de interés forense, pues es esta clasificación la que permite establecer el tiempo de desarrollo y obtener rangos de distribución, que puedan ayudar en la investigación.. 7.1. ORDEN DÍPTERA. Los Dípteros son de gran importancia forense, ya que hacen parte de la primera oleada de necrófagos,. y aportan gran información del entorno.. (Magaña, 2001). Los organismos de este orden pueden encontrarse en casi cualquier lugar. Poseen un solo par de alas, el segundo par está reducido a una pequeña estructura llamada halterio, que les ayuda a estabilizar el vuelo (Byrd & Castner, 2001).. Los huevos son de aproximadamente 2mm y tardan en pasar la siguiente estadio entre 24 y 72 horas dependiendo de la especie y las condiciones. 15.

(16) ambientales. Las larvas son de color cremoso, son suaves, apodas y no poseen una cabeza visible (Byrd & Castner, 2001).. 7.1.1. Familias de importancia forense. Las familias de mayor importancia forense son Calliphoridae, Sarcophagidae y Muscidae, siendo las familias en las que se han centrado los estudios en Dípteros.. 7.1.1.1. Familia Calliphoridae. Las larvas maduras son blancas o de color cremoso, y miden entre 8 y 23mm de largo. En el segmento terminal posee seis o más tubérculos con forma de cono; además en este segmento se encuentra un espiráculo posterior, que cumple la función de aparato respiratorio primario en la larva (Byrd & Castner, 2001). Cuando las larvas han terminado su crecimiento, dejan de comer y se entierran para convertirse en pupas (Magaña, 2001). El adulto tiene un tamaño entre los 6 y los 14mm de largo. La mayoría de las especies tienen una apariencia metálica con colores como el verde, azul, bronce y negro. Las antenas poseen tres segmentos con una arista plumosa en el último segmento (Byrd & Castner, 2001).. A. B. Fig 2. Individuos de la familia Calliphoridae. A. Lucilia coeruleiviridis. (Stamper & Dalhem, 2006). B. Lucilia Caesar. (Gómez, 2007). 16.

(17) 7.1.1.2. Familia Sarcophagidae. Se encuentran en todo el mundo, aunque la mayoría están en regiones tropicales o templadas. Su tamaño varía entre los 2 y los 14 mm. El adulto presenta unas franjas de color gris o negro en la región del tórax; nunca exhibe la misma coloración metálica de la Familia Calliphoridae. Otra diferencia con Calliphoridae es la antena, en la Familia Sarcophagidae es plumosa solo en la base (Byrd & Castner, 2001).. Las especies de esta familia son similares entre ellas, tanto larvas como adultos, lo que hace que sea difícil su identificación (Byrd & Castner, 2001).. A. B. C. Fig 3. Organismos de la familia Sarcophagidae. A) Sarcophaga aurifrons (Chew, 2007) B) Sarcophaga aurifrons, (CSIRO, 2004) C) Sarcophaga cf. Carnaria (Zóralski, 2006). 7.1.1.3. Familia Muscidae. Tienen una relación muy cercana con el ser humano, lo que contribuye a su importancia forense y médica (Byrd & Castner, 2001). Tienen un tamaño medio, entre los 3 y los 10mm. Presentan una coloración oscura, grisácea o amarilla, aunque algunos pueden presentar colores metálicos azul o verde. La arista de la antena es plumosa, igual que en Calliphoridae (Byrd & Castner, 2001, Carvalho, 1997).. 17.

(18) A. B. Fig 4. Imágenes de la familia Muscidae. A) No identificado (Wikipedia, 2002). B) Stomoxys calcitrans (Novartis, 2007). 7.2. ORDEN COLEÓPTERA. Su importancia radica en que los individuos del orden Coleóptera permanecen hasta las últimas etapas de la descomposición, siendo importantes a la hora de estimar el tiempo de muerte (Magaña, 2001; Kulshrestha & Satpathy, 2001).. Los individuos de este orden se caracterizan por los élitros, alas anteriores endurecidas que protegen las alas membranosas que les permiten volar. Otra característica de este orden es que tienen una boca masticadora (Byrd & Castner, 2001).. Las larvas poseen seis patas y una cabeza identificable; además su apariencia varía de forma considerable en las diferentes familias. Pueden ser encontrados en los mismos hábitats que cualquier otro insecto (Angulo, 2005; Byrd & Castner, 2001). 18.

(19) 7.2.1. Familias de importancia forense. Entre las familias del orden Coleóptera que son de interés forense se encuentran Silphidae, Dermestidae, Staphylinidae e Histeridae.. 7.2.1.1. Familia Silphidae. Son de tamaño mediano, entre 10 y 35mm. Los adultos varían mucho en forma y tamaño. Sin embargo, existen algunas características morfológicas que comparten y pueden ser útiles a la hora de la clasificación. El cuerpo presenta una coloración negra con parches naranjas, rojos o amarillos (Byrd & Castner, 2001).. Sus hábitos no son muy claros, algunos se alimentan de material vegetal, otros son predadores; aunque la mayoría de las especies se alimentan de cadáveres animales en descomposición (Ikeda et al. 2008).. Fig 5. Individuos de la familia Silphidae. Línea superior de izquierda a derecha: Ptomascopus zhangla Hava,. Eonecrophorus. tenuicornis. Kurosawa,. Nicrophorus chilensis Philippi, y Nicrophorus concolor Kraatz. Línea inferior de izquierda a derecha: Necrophila americana,. Oxelytrum. erythrurum. ,. Oiceoptoma. subrufum, y Necrodes surinamensis . (Sikes, 2005). 19.

(20) 7.2.1.2. Familia Dermestidae. Son Coleópteros pequeños, de entre 2 y 12mm de longitud de adulto, mientras la larva mide entre 5 y 15mm. Redondos u ovalados, con antenas de 11 segmentos que finalizan en masas de 3 segmentos, aunque puede variar entre especies.. Algunos de estos individuos han sido usados en museos para. ayudar a limpiar los huesos que aún tienen restos adheridos al hueso (Magaña, 2001).. A. B. C. A. A. Fig 6. Imágenes de individuos de la familia Dermestidae. A) Dermestes lardarius (Makarov, 2004). B) Dermestes maculatus (Gross, 2006). C) Anthrenus sp. (Gompel & Gruber, 2006). 7.2.1.3. Familia Staphylinidae. Se encuentran en todo el mundo. Tienen un tamaño de 1 a 25mm, con una forma característica, en la mayoría de los casos, que permite diferenciarlo hasta el nivel de Familia. Las larvas son alargadas, con 2 a 4 segmentos. Son de abdomen flexible y cada pata termina en una uña (Frank, 1997; Byrd & Castner, 2001).. 20.

(21) A. B. C. Fig 7. Individuos de la familia Staphylinidae. A) Oxyporus sp. (Newton & Thayer, 1995). B) Tachyporinae (Newton & Thayer, 1995). C) Algon bramlettorum (Schillhammer, 2005). 7.2.1.4. Familia Histeridae. Su tamaño varía entre 0.5 y 20mm. Son de cuerpo corto y compacto, y presentan una coloración negra, a veces con manchas rojas o amarillas. Tanto las larvas como los adultos son predadores y se alimentan de carroña (Lawrence, 2001).. A. B. Fig 8. Imágenes de la familia Histeridae. A) Hister quadrimaculatus. B). C. Abraeus areolatus C). Margarinotus bipustulatus (Makarov, 2006). 21.

(22) 8. ESTUDIOS MOLECULARES. Con el fin de minimizar el tiempo de identificación y evitar los problemas de tamaño del organismo, se han desarrollado métodos moleculares que complementen la identificación taxonómica.. 8.1. Orden Díptera. A nivel molecular, es este el orden del que más se encuentra información, ya que es importante a la hora de estimar el intervalo post-mortem y por la dificultad que se puede tener al clasificar las larvas de estos individuos.. En 1998, Benecke, extrajo ADN de adultos y juveniles de Díptera y Coleóptera , por medio de una digestión con proteinasa K, seguida de una extracción con Fenol-Cloroformo. Trabajó con ADN polimórfico amplificado al azar (RAPD). Tomó larvas de Lucilia sp. y las comparó con adultos de Calliphora erythrocephala de otro caso y un adulto de Silphidae. Como conclusión obtuvo que este método es una herramienta útil cuando no se puede utilizar otro medio, o cuando el caso es urgente y no se dispone del tiempo suficiente para cultivar las larvas hasta el estadio de adulto. En el área médico legal, RAPD pueden ser reportados solo para exclusiones, ya que cuando dos individuos son similares, se necesita una base de datos para comparar el patrón. El problema con este método, es que las bandas que se obtienen. son de. diferentes tamaños y no es reproducible.. Malgorn & Coquoz (1999), trabajaron con entre 3 y 7 individuos por especie de 4 especies de Lucilia. y una Calliphora vicina. El proceso de extracción. consistió en cortar las muestras en piezas pequeñas y colocarlas en un microtubo con pistón, donde se agregó buffer de lisis y se colocó en incubación. 22.

(23) a 56ºC durante la noche. El producto lisado se purificó por extracción con Fenol-Cloroformo. A continuación amplificaron dos fragmentos de la secuencia de Citocromo oxidasa I (COI), el primero de 297pb (2373-2075pb) y el segundo de 305pb (2800-2495pb). Primero trabajaron solo con 3 de las 5 especies, y los polimorfismos fueron suficientes para diferenciarlas. Una vez lograron resultados positivos con 3 de las especies, procedieron a utilizarla en las 2 restantes; al usar todas las especies, notaron que Callihpora vicina era la que presentaba más diferencias, como era lo esperado. Presentan este método como fácil y rápido para identificar especies, especialmente en estadios larvarios.. Fig. 9.. Árbol. filogenético. de. la. familia. Calliphoridae. Obtenido por Máxima parsimonia con el soporte de bootstrap utilizando el gen COI y COII. Wells & Sperling (2001). En el 2001, Wells & Sperling, analizaron ADN mitocondrial en individuos de Chrysomyinae, estudiando una secuencia de 2.3Kb (1467-3771 de Drosophila yakuba) correspondiente a COI y COII, y la región de RNA de transferencia de la leucina (tRNA-leu) en un individuo de cada una de las especies escogidas. Utilizaron el kit QIAamp tissue columns para la extracción, realizaron una. 23.

(24) Reacción en Cadena de la Polimerasa (PCR) y análisis bioinformáticos, y concluyeron que esta metodología es útil para identificar especímenes asociados a cuerpos muertos en cualquier parte de Estados Unidos o Canadá, con la posible excepción de algunas especies raras. En este mismo estudio se realizó el análisis molecular en una larva no identificada tomada de un cuerpo. Al obtener el árbol por máxima parsimonia con un soporte de bootstrap (Figura 9), se identificó la larva como un individuo del género Compsomyiops callipes, con un soporte bootstrap de 98, demostrando así la utilidad de este método para la identificación de especies.. Simultáneamente, Stevens y Wall. estudiaron la relación genética entre. individuos de la familia Calliphoridae de interés forense, usando la subunidad 28S del RNA ribosomal. Tomaron músculo torácico de adultos y realizaron la extracción por el método de bromuro de cetil-trimetil amonio (CTAB). Obtuvieron que dentro de las sub-familias Luciliinae y Chrysomyinae, la identificación a nivel de especie se logra en la mayoría de los casos usando un fragmento corto de la secuencia, y en todos los casos usando la secuencia completa. Calliphora sp. y Cynomya sp. requieren la secuencia completa para su identificación. Regiones bien conservadas, como la 28S, pueden ser útiles en la identificación de especies por su confiabilidad, bajo costo y rapidez.. Chen et al. en el 2004, en individuos adultos de la familia Calliphoridae, realizaron una extracción con Fenol-Cloroformo, y finalmente PCR para la amplificación de una secuencia de 1.6-Kilobases para lograr la identificación molecular con COI. Lo que hacen es evaluar diferentes partes del cuerpo y diferentes estadios de los organismos y obtuvieron resultados positivos. Concluyen que el COI es informativo para un rango amplio de insectos. Por ser una de las secuencias más largas del ADN mitocondrial, da mucha información para análisis filogenéticos e identificación de especies. Además es importante resaltar que, como se ve en la figura 10, esta metodología se puede trabajar en organismos en estadios inmaduros diferentes. A nivel forense esto es muy. 24.

(25) importante, ya que son estos estadios los que presentan una mayor dificultad a la hora de la identificación.. Fig 10. Gel de productos amplificados de diferentes estadios en machos de la familia Calliphoridae. Gel obtenido por Chen et al. Pozos: 1) un huevo. 2) una larva en instar 1. 3) una larva en instar 2. 4) una larva en instar 3. 5) una pupa. 6) un pupario. 7) un adulto. Chen et al. 2004.. En este mismo año, Junqueira et al. hicieron una secuenciación del ADN mitocondrial (mtDNA) completo en Chrysomya chloropyga (15837pb). Para la purificación del mtADN utilizan un gradiente de cloruro de cesio. Lo que encontraron es que Chrysomya chloropyga posee una región duplicada con un tRNA completo, siendo el primer díptero con 23 tRNA y no los 22 descritos para artrópodos. Los mismos autores realizaron este mismo análisis en otros géneros de la familia Calliphoridae y no encontraron el mismo patrón, pero caracterizando otro Chrysomya si encontraron la región duplicada. De esta forma determinan que esta región se puede utilizar como marcador molecular para esta especie especialmente a la larva, que es difícil de identificar por medio de claves morfológicas.. En el 2007, He et al. trabajaron con 5 especies de Dípteros de importancia forense utilizando Inter Secuencias Simples Repetidas (ISSR) y Región Amplificada Caracterizada por una Secuencia (SCAR). Realizaron la extracción por el método de Fenol-Cloroformo. Encontraron que los ISSR prometen mucho en la identificación molecular de especies, ya que es rápido, confiable,. 25.

(26) conveniente y con una alta exactitud. Sin embargo, ISSR es útil solo si se compara con una muestra de referencia. Este método trabaja bien en larvas, como lo muestra la figura 11.. Los pozos 1 a 6 corresponden a la misma. especie, Lucilia sericata, en tres de sus estadios (adulto, larva 2 instar, larva 3 instar), y se ve el mismo patrón de bandeo. Esta técnica puede ser de gran utilidad en el área forense, pues permite una correcta identificación de especies tanto en adultos como en estadios inmaduros.. Fig 11. Gel de los marcadores de ISSR. Amplificación del primer (CA)6GT obtenida por He et al. (2007). 1y2: Lucilia sericata adulto. 3y4: L.sericata larva 2do instar. 5y6: L.sericata larva 3er instar. 7y8: Aldrichina grahamani adulto. 9y10: Chrysomya megacephala adulto. 11y12: C.megacephala larva 3er instar. 13y14: Musca domestica adulto. 15y16: Parasarcophaga crassipalpis adulto. He et al. 2007.. Fig 12. Gel de la amplificación de los marcadores SCAR obtenidos por He et al. (2007). 1y2: L.sericata adulto. 3y4: A.grahamani adulto. 5y6: C.megacephala adulto. 7y8: P.crassipalpis adulto. 9y10: M.domestica adulto. A) Marcador SCAR correspondiente a C.megacephala. B) Marcador SCAR. correspondiente. a. P.crassipalpis.. C). Marcador SCAR correspondiente a M.domestica. He et al. 2007.. 26.

(27) Por otro lado He et al. también encontraron que el método de SCAR es más reproducible. El problema es que se obtiene un solo marcador por especie con todos los amplicones de tamaños similares, luego el número de amplificaciones necesarias dependerá del número de marcadores disponibles. En el caso de los autores, trabajaron con 3 marcadores y por lo tanto, realizaron tres amplificaciones como lo muestra la gráfica 12.. En otro estudio realizado en el 2007 es el de Smith y Baker. La extracción la hicieron con tarjetas FTA® y con QIAamp tissue protocol, realizando la amplificación con el kit ReddyMix™ PCR Master Mix 1X y finalmente trabajando con polimorfismos de la longitud de los fragmentos de restricción en productos de PCR (PCR-RFLP) con COI, en secuencias de 524pb, para la identificación de larvas de moscas en el Reino Unido. Encontraron 3 marcadores RFLP que podrían arrojar un patrón diferente de bandeo en las 8 especies escogidas para la investigación, y por lo tanto útiles en la identificación de especies. Aunque los autores recomiendan tener en cuenta la posibilidad de variación intraespecifica con esta metodología.. También en el 2007, Alessandrini et al., utilizaron el kit QIAamp DNA mini kit para la extracción de ADN en larvas, pupas y adultos. Amplificaron las secuencias de COI y COII (900pb aproximadamente), y al realizar el análisis obtuvieron la identificación de 7 especies de Dípteros, además concluyen que en Dípteros es más exacto identificar especies con fragmentos de COI y COII que solo con fragmentos de COI.. Song et al. en el 2008, analizaron 63 secuencias completas del espaciador interno transcrito 2 (ITS2) del ADN ribosomal en 29 especies de moscas necrófagas comunes en la provincia Guangdong, al sur de China. La extracción la realizaron por Fenol-Cloroformo en músculos torácicos de adultos. Como resultado obtuvieron que el poder de resolución de esta región puede alcanzar niveles profundos de la taxonomía, como Subgéneros. Aunque este estudio muestra la región ITS2 como útil en la identificación de especies, la base de. 27.

(28) datos que se desarrollaron en la investigación presenta cierto grado de riesgo en el reconocimiento, debido a las secuencias de alta similaridad entre algunas especies.. Utilizando un protocolo de extracción con Nal y PCR-RFLP para amplificar la región ITS2 del rADN, Nelson et al. (2008), encontraron que una limitante de este método es una mutación en un solo punto, pues puede introducir o remover. sitios. de. restricción,. arrojando. una. identificación. incorrecta.. Observando el árbol obtenido por el análisis de inferencia bayesiana (figura 13), se ven soportes de probabilidad a posteriori altos entre especies hermanas, pero no tan altos entre grupos hermanos. También, comparando el análisis que los autores realizaron con la región de ITS2 y los resultados obtenidos por Wallman et al. con un fragmento de COI y COII, se puede observar que el primero es menos exitoso a la hora de resolver problemas filogenéticos a nivel de especie. Esto implica que la secuencia de ITS2 no va a tener una buena resolución si se trabaja en identificación de especies.. Fig 13. Árbol filogenético del género Chrysomya. Basado en análisis bayesiano de la secuencia ITS2 con los soportes de probabilidad a posteriori. Nelson et al. 2008.. Otro trabajo realizado es el de Harvey et al. en el 2008. La extracción se realizó utilizando el “DNEasy Tissue Kit” de Qiagen, y se procedió a la amplificación de una secuencia de 1270pb del gen COI. Realizaron un análisis filogenético para evaluar 27 especies de Calliphora en 119 especímenes de 22 países. A nivel. 28.

(29) de especie, al realizar inferencia bayesiana, obtuvieron probabilidades posteriores superiores a 94% en tres de las especies y comprobaron el gran potencial que tiene esta secuencia en la identificación de especies.. Asimismo, en el 2008, Hernández. amplificó el gen COI (440pb), en 12. individuos, 11 adultos y una larva, de la familia Calliphoridae que hacían parte de la colección entomológica del Instituto Nacional de Medicina Legal y Ciencias Forenses, Regional Bogotá. Primero trabajó diferentes protocolos de extracción, como son las tarjetas FTA®, Chelex 100® al 15%, DNAzol® y Fenol-Cloroformo. Sin embargo el método que arrojó los mejores resultados fue el de Fenol-Cloroformo. Al comparar las secuencias con las reportadas en NCBI se obtuvieron 3 géneros y 4 especies; además fueron comparadas con la identificación que se tenía por morfología, encontrando una correspondencia absoluta entre estos. Concluye que el COI es de gran utilidad en la identificación de especies, y específicamente el análisis del fragmento C es favorable, pues disminuye el tiempo de identificación de 45 a 2-3 días aproximadamente.. 8.2. Orden Coleóptera. En este orden los análisis moleculares que se han hecho son muy pocos; a excepción del trabajo realizado por Benecke en 1998, en Díptera y Coleóptera, la información disponible está más enfocada en aclarar problemas filogenéticos que a la identificación de especies.. En el 2000, Dobler y Müller, investigaron la relación filogenética al nivel de familia en Silphidae, con las secuencias de COI, COII y tRNA-leu (2094pb) , en 23 especies de 13 géneros. Utilizaron patas y antenas de los individuos de la familia Silphidae, y organismos completos de los outgroups para realizar la extracción, que se hizo con el QIAgen tissue kit, los cuales amplificaron y secuenciaron. Como resultado obtuvieron la primera filogenia de Silphidae, con árboles bien soportados en la mayoría de especies. Sin embargo, el estudio se. 29.

(30) hizo a nivel de familia, por lo tanto se debe evaluar a qué nivel taxonómico el resultado sigue siendo satisfactorio.. Maus et al., en el 2001, con la secuencia de 2022pb que corresponden a COI, COII y tRNA de Leucina, realizaron una filogenia para 50 especies del género Aleochara de la familia Silphidae. Tomaron adultos y les removieron el abdomen y los genitales para evitar la contaminación con parásitos o restos de comida, y para una posterior confirmación de la identificación con los genitales. En la parte anterior del cuerpo se realizó la extracción con QIAgen tissue kit, y realizaron amplificación por PCR. Una de las conclusiones es que las secuencias de COI y COII son útiles para reconstrucciones filogenéticas en este género; los árboles obtenidos, como el que se muestra en la figura 14, presentan soportes de Bootstrap muy altos principalmente entre grupos hermanos, y los análisis resultan consistentes con los árboles obtenidos por características morfológicas. Sin embargo, a niveles taxonómicos mayores (tribu), los valores de bootstrap no son muy altos.. Fig 14. Árbol filogenético dl género Aleochara. Obtenido por máxima verosimilitud con soportes de bootstrap en sus ramas.. 30.

(31) Basados en análisis de la región 18S, Caterino et al. (2005), realizan una filogenia del infraorden Staphiliniformia. Tomaron muestras de 88 adultos, 1 huevo y 29 larvas; extrajeron ADN con Fenol-Cloroformo y con QIAgen tissue kit. Además realizaron análisis morfológico de los mismos individuos. Los árboles estaban bien soportados hasta superfamilia, pero a nivel de familia se presentaban resultados ambiguos; esto debido a que el mínimo nivel taxonómico al que 18S presenta una buena resolución es al de superfamilia. Para los autores, en niveles inferiores se deben buscar genes que evolucionen más rápido que el 18S.. En el 2008 Ikeda et al., explican la historia evolutiva de la pérdida del vuelo y su relación con los hábitos alimenticios, número y tamaño de los huevos en la familia Silphinae. El ADN fue extraído por dos métodos: Fenol-Cloroformo y Chelex 100®, y amplificado por PCR para las secuencias de la subunidad 16S de rADN, la subunidad 28S de rADN, Wingless (Wg) y phosphoenolpyruvate carboxykinase (Pepck). Utilizaron 21 especies de 12 géneros. Los árboles obtenidos mostraron a Silphinidae como grupo monofilético con soportes altos, coherente con lo obtenido por Dobler y Müller (2000). Utilizan datos morfológicos y moleculares para tener más características a evaluar y que los resultados obtenidos sean más confiables.. 9. Bases de datos. 9.1. National Center for Biotechnology Information (NCBI). Creado en 1988 como una división del Instituto Nacional de la Salud (NIH) de Estados Unidos. Funciona como base de datos pública, pero también trabaja desarrollando software que permita analizar datos de genomas, y ayuda a. 31.

(32) difundir información biomédica. Maneja la base de datos GenBank junto con otras bases de datos de interés científico y médico (NCBI, 2004).. Dispone de un gran número de secuencias reportadas de las utilizadas en los artículos aquí expuestos. El gen de la citocromo oxidasa presenta un mayor número de secuencias reportadas respecto a las otras secuencias utilizadas, tanto para Díptera como para Coleóptera.. 9.2. European Bioinformatics Institute (EBI). El Instituto Europeo de Bioinformática hace parte del Laboratorio Europeo de Biología Molecular. Trabaja en asociación con entidades internacionales, principalmente NCBI, tanto a nivel de fondos como a nivel de información. (EBI, 2008). Tiene a disposición las secuencias tanto de NCBI como algunas propias del laboratorio, por lo que se encuentra un número mayor de secuencias reportadas.. 9.3. The ITS2 DataBase. Esta base de datos es específica de la secuencia de ITS2 y tiene como función principal modelar y ayudar a predecir la estructura secundaria de ITS2. También trabaja asociada a NCBI, por lo que para obtener la estructura secundaria se puede utilizar la secuencia específica o el número de acceso de dicha base de datos (ITS2 DataBase, 2008).. 32.

(33) 9.4. Barcode of life iniciative. Esta base de datos trabaja con la secuencia del gen de la COI, y lo que busca es lograr una identificación de especies con esta secuencia. Utiliza como fuente secuencias disponibles en NCBI, la página de árbol de la vida (Tree of Life Web Project), el Centro Canadiense para Código de Barras de ADN (Canadian center for DNA barcoding) y el sistema integrado de información taxonómica (ITIS) entre otros (BOLD, 2008).. 10. DISCUSIÓN. La investigación en el área molecular de la entomología forense está en auge, cada vez son más los investigadores que se preocupan por este tema. Y es lógico, si se piensa en todo el tiempo que se puede economizar utilizando estos métodos.. Hay una gran diversidad de metodologías, protocolos de extracción, y de regiones o secuencias amplificadas. La herramienta que se use, dependerá de las características del individuo a estudiar y de la disponibilidad de tiempo y de recursos. De acuerdo a esto, habrá ventajas y desventajas de los procesos elegidos.. Existen muchos protocolos de extracción, pero no todos funcionan con la misma eficiencia. Como es el caso de las tarjetas FTA® y Chelex 100® que, a pesar de que algunos de los artículos mencionados anteriormente logran obtener buenas extracciones, el trabajo realizado por Hernández (2008) no obtuvo una extracción eficiente, por lo que trabajó con Fenol-Cloroformo. En los. 33.

(34) artículos aquí expuestos en los que se utilizaron estos métodos, se realizó un paso extra de purificación con “Kit”. Es posible que tanto la tarjeta impregnada de químicos como la resina quelante, no tengan la capacidad de liberar todo el ADN unido a tejidos complejos como el músculo (Hernández, 2008), y requieran este paso de purificación para obtener una eficiencia mayor.. Fenol-Cloroformo permite obtener un ADN más puro que otros protocolos, pero requiere mucho tiempo para obtener el resultado, mientras que trabajar con CTAB implica menos pasos y menos tiempo, lo que disminuye la cantidad de posibles contaminaciones de la muestra, pero la pureza de la muestra es menor que la de Fenol-Cloroformo (Fraga et al., 2004). Los “Kits” de QIAgen son útiles y permiten obtener ADN puro, sin embargo en trabajos, por ejemplo en las universidades, no están disponibles, por lo que Fenol-Cloroformo se convierte en la mejor opción para la extracción.. Los “kits”, Fenol-Cloroformo y CTAB son los mejores protocolos para obtener ADN, ya que tarjetas FTA y Chelex necesitan un paso de purificación adicional para obtener una eficiencia suficiente para los análisis posteriores.. El método molecular más usado es PCR. Es rápido, fácil de usar, y no requiere concentraciones muy altas de ADN. Entre las desventajas están la gran cantidad de inhibidores. Si no se realiza una buena purificación, no se van a obtener resultados; y como es tan sensible, existirá un alto riesgo de contaminación, que arrojará datos incorrectos. Además, para realizar una buena PCR se deben conocer las características de los primers, pues de estos dependerá la temperatura a utilizar.. Otro método es el de RAPD, que poseen la ventaja del tiempo, pero tiene una desventaja muy grande, y es la falta de reproducibilidad. Puede ser útil en casos de exclusión, más no en casos de inclusión. Cuando dos individuos son similares requiere una base de datos con la cual se pueda comparar, pero el número de especies de insectos de interés forense es muy grande y se. 34.

(35) necesitaría mucho tiempo. Sin embargo tiene la ventaja de generar resultados con larvas.. En cuanto a los ISSR, pueden generar polimorfismos adicionales, arrojando un perfil más complejo. Algunos de los fragmentos solo se dan en especies particulares. Al convertir los marcadores ISSR a SCAR, como lo hicieron He et al. (2007), se obtuvieron marcadores especie – específicos que tendrán un gran potencial en la identificación forense. Los marcadores pueden requerir un gasto de tiempo en su diseño (IPGRI, 2003). Además tanto ISSR como SCAR permiten obtener buenos resultados con estadios inmaduros, por lo tanto son herramientas útiles para la identificación de especies, especialmente en el área forense, porque facilitan la correcta identificación de estos estadios, difíciles de clasificar con claves taxonómicas morfológicas.. También pueden usarse métodos como PCR-RFLP, que puede ser útil, pero una mutación en un solo punto puede cambiar los fragmentos de restricción, puede aumentarlos o disminuirlos, mostrando un patrón diferente al que es.. Con lo anteriormente mencionado se puede decir que la mejor opción es trabajar con PCR, con ISSR o con SCAR, son los métodos que dan resultados favorables y no presentan desventajas tan significativas como PCR-RFLP y RAPD, que no son reproducibles. Además PCR-RFLP con una sola mutación puede cambiar el resultado.. En cuanto a las secuencias comúnmente utilizadas, la de Citocromo Oxidasa es la que permite obtener mejores resultados. Es de gran utilidad en la identificación forense en el mismo género, y para realizar análisis filogenéticos, como se muestra en los estudios moleculares. Además de la gran cantidad de información que se puede obtener con este gen, influye también el hecho de ser el que más secuencias reportadas posee en las bases de. Así, cuando se tenga un resultado, se tendrá un punto de comparación que permita ver que tan real y coherente es lo que se está obteniendo.. 35.

(36) Comparando los trabajos realizados con Citocromo Oxidasa, tanto en Díptera como en Coleóptera, vemos que en este último las secuencias utilizadas son de gran tamaño (Dobler & Müller 2094pb; Maus et al. 2022pb), mientras en Díptera las secuencias son de diferentes tamaños, algunas de COI, COII y tRNA-leu, otras solo de COI. Aunque ya se conoce la utilidad de CO para la identificación de especies, es necesario realizar este tipo de investigaciones en el orden Coleóptera para conocer que región de la citocromo oxidasa es más útil en este orden.. Otra región utilizada es la ITS2 del rADN, cuya resolución llega hasta Subgénero; sin embargo, al compararla con citocromo oxidasa, no es tan útil a nivel de especie. También se puede usar la secuencia de la subunidad 28S del rADN, una región conservada, y donde el proceso es rápido y confiable. En cuanto a la 18S del rADN, al nivel de superfamilia se obtienen buenos resultados, pero a nivel de familia arroja información ambigua, por lo tanto, no es útil a niveles taxonómicos inferiores.. Los estudios entre órdenes no son comparables. En Díptera hay muchas investigaciones enfocadas a la identificación de especies de interés forense, y cada vez más, los investigadores se dedican a este tipo de trabajos; mientras que en Coleóptera, uno de los problemas más importantes actualmente, es aclarar las relaciones filogenéticas de los linajes mayores, que son muy poco conocidos (Madisson, 2000), por lo que la mayoría de estudios se centran en este tema.. A futuro se debe investigar qué regiones pueden ser útiles para la identificación de especies en Coleóptera, para lograr unos buenos resultados, que disminuyan el tiempo invertido en la clasificación de este orden. Existen familias, como la Staphylinidae, donde solo se ha llegado hasta Tribu, pues el tamaño no permite diferenciar más claves morfológicas, y no se tienen los. 36.

(37) análisis moleculares para avanzar a niveles taxonómicos inferiores (Camacho, comunicación personal).. Otro factor que se puede mejorar es el de las bases de datos, algunos genes no tienen la información suficiente disponible para realizar los estudios, o algunas metodologías que requieren una base de datos que les permita comparar los resultados.. 10. CONCLUSIONES. -. Para la extracción los mejores resultados se obtiene con “Kits”, con el protocolo de Fenol-Cloroformo o con CTAB.. -. El uso de los métodos de PCR, ISSR y SCAR arrojará los mejores resultados de identificación de especies, debido a su rapidez, su confiabilidad y bajo costo.. -. RADP no es útil para identificación forense porque no es reproducible. Tampoco PCR-RFLP pues con pequeñas mutaciones cambia el patrón de bandeo y da como resultado una identificación incorrecta.. -. La secuencia más estudiada y más eficiente es la de citocromo oxidasa, permite la identificación al nivel de género y se tiene una amplia base de datos que permite su comparación.. -. La región ITS2 tiene una buena resolución al nivel de subgénero, pero no es tan buena al nivel de especie. La subunidad 18S es útil en niveles taxonómicos superiores a familia.. -. La información que se encuentra de Coleóptera, es principalmente para análisis filogenéticos a niveles de familia o superiores. No son una base para identificación de especies.. 37.

(38) 11. Referencias. Alessandrini, F; Mazzanti, M; Onofri, V; Turchi, C; Tagliabracci, A. 2007. MtDNA analysis for genetic identification of forensically important insects. Forensic Science International: Genetics Supplement Series 1. P 584–585. Barreto, M; Burbano, M & Barreto, P. 2002. Flies (Calliphoridae, Muscidae) and Beetles (Silphidae) from Human Cadavers in Cali, Colombia. Memorias del Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro. 97 (1) , P 137 - 138. Benecke M. 1998. Six forensic entomology cases: description and commentary. J Forensic Sci; 43. P 797- 805. Benecke, M , 2001. A brief history of forensic entomology. Forensic Science International. 120. P 2- 14.. Benecke, M , 1998. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) typing of necrophageous insects (diptera, coleoptera) in criminal forensic studies: validation and use in practice. Forensic Science International. 98. P 157-168.. Byrd, J & Castner, J. 2001. Chapter 2: Insects of forensic importance. Forensic entomology. The utility of arthropods in Legal investigation. CRC Press LLC.. Camacho, G. 2003. Sucesión de la entomofauna cadavérica y ciclos de vida de las primeras especies colonizadores, utilizando como biomodelo cerdo blanco (Sus scrofa) en la sabana de Bogotá. Universidad Distrital Francisco José de Caldas. Bogotá, Colombia . Trabajo de grado.. Cañón, L & Segura, A. 2003. Efecto de cianuro y barbitúricos en el ciclo de vida de dípteros colonizadores en hígados humanos bajo condiciones de campo en. 38.

(39) la Universidad Nacional de Colombia y de laboratorio en el Instituto Nacional de Medicina Legal y Ciencias Forenses Regional Bogotá. Universidad Distrital Francisco José de Caldas. Bogotá, Colombia. Trabajo de Grado. Carvalho, L; Thyssen, P; Linhares, A; & Palhares, F. 2000. A checklist of arthropods associated with pig carrion and human corpses in Southeastern Brazil. Memorias Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro. 95(1) P 135-138. Carvalho, L; Linhares, A; & Trigo, J. 2001. Determination of drug levels and the effect of diazepam on the growth of necrophagous flies of forensic importance in southeastern Brazil. Forensic Science International 120. P 140-144.. Carvalho, C. J. B. de. 1997. Muscidae. En: Solís, A. (ed.) Las Familias de insectos. de. Costa. Rica.. INBio.. http://www.inbio.ac.cr/papers/insectoscr/Texto538.html. Caterino, M; Hunt, T; & Vogler, A. 2005. On the constitution and phylogeny of Staphyliniformia (Insecta: Coleoptera) . Molecular Phylogenetics and Evolution 34. P 655-672. Centeno, N; Maldonado, M; & Oliva, A. 2002. Seasonal patterns of arthropods ocurring on shletered and unshletered pig carcasses in Buenos Aires Province (Argentina). Forensic Science International 126. P 63-70.. Chen, W; Hung, T & Shiao, S. 2004. Molecular identification of Forensically Important Blow Fly Species (Diptera: Calliphoridae) in Taiwan. J. Med. Entomol. 41 (1) P 47-57. Chew, P. 2007. Flesh Fly - Family Sarcophagidae. Brisbane Insects and Spiders Home Page. Imagen A de Sarcophaga aurifrons. Recuperado el 4 de diciembre. de. 2008. en. http://www.geocities.com/brisbane_flies/SARCOPHAGIDAE.htm.. 39.

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