Guía de Laboratorio PARA DIPLOMADO EN LABORATORIO CLÍNICO

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Texto completo

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Guía de

Laboratorio

PARA DIPLOMADO EN

LABORATORIO CLÍNICO

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Agradecimientos

Para la segunda versión de las guías de laboratorios para el Diplomado de Laboratorio Clínico del Instituto PLERUS.

La institución extiende un agradecimiento para

el Diplomado Julio Palma y el Doctor Mauricio Rodríguez, por la confección y los demás profesionales que participaron.

La edición de este documento fue realizada por la Diplomado María José Oviedo y contó con la revisión de los siguientes expertos:

Doctora María Leiva, Técnico Nicol Badilla y Diplomado Julio Palma.

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TABLA DE CONTENIDO

I NIVEL 4

Curso: Instrumentación Clínica 5

Tema 1: Uso de equipo básico de laboratorio 5

Tema 2: Uso del Microscopio 7

Tema 3: Flebotomía 9

II NIVEL 11

Curso: Microbiología I 12

Tema 1: Uso del microscopio y tinción de Gram 12

Asignación: Omnipresencia de los microorganismos 15

Tema 2: Tinciones 16

Tema 3: Técnicas de cultivo 21

Tema 4: Toma de muestras faríngeas y cutáneas 23

Tema 5: incógnitas prueba práctica 26

Curso: Métodos de Laboratorio Clínico 26

Tema 1: Flebotomía 26

Tema 2: Procesamiento de muestras de orina y de heces 28

Tema 3: Observación del sedimento urinario 31

Tema 4: Toma de muestra de hongos 32

I- Prueba práctica 33

Curso: Preparación de Reactivos Clínicos 34

Tema 1:

I- Uso de la pipeta y la micropipeta. 34

II- Lavado, preparación y esterilización de cristalería 35

Tema 2: Preparación y esterilización de medios de cultivo 37

Tema 3: Diluciones simples y seriadas 38

III NIVEL 40

Curso: Control de Calidad 41

Tema 1: Control de Calidad en Medios de Cultivo 41

Tema 2: Control de calidad en Química Clínica y Hematología 42

Tema 3: Control de calidad en equipos de laboratorio 44

Curso: Química Clínica I 45

Tema 1: Automatización y Urianálisis 45

Tema 2:

I- Uso del espectrofotómetro y conceptos de espectrofotometría 47

II- Análisis de glucosa y curva de calibración 48

Tema 3: Control de Calidad y Reglas de Westgard 51

Tema 4:

I- Repaso de Sedimento urinario 51

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Curso: Hematología y Análisis Hematológico I 52

Tema 1: Determinación de hematocrito y hemoglobina 52

Tema 2: Realización de extendidos sanguíneos y tinción de Wright 53 Tema 3:

I- Diferencial leucocitario manual 55

II- Recuentos celulares en cámara de Neubauer 55

Tema 4:

I- Repaso de Morfología celular 57

II- Prueba practica 57

IV NIVEL 58

Curso: Microbiología II 59

Tema 1: Muestras faríngeas 59

Tema 2: Coprocultivos y Urocultivos 60

Tema 3: Serología microbiana 61

Tema 4: Antibiogramas 68

Tema 5: Incógnita prueba práctica 70

Curso: Química Clínica II 71

Tema 1: Factores que afectan la cinética enzimática 71

Tema 2: Determinación de la curva de tolerancia a la glucosa e isoenzimas 73

Tema 3: Depuración endógena de creatinina 75

Tema 4: Drogas terapéuticas y de abuso 76

V NIVEL 77

Curso: Serología y Banco de Sangre 78

Tema 1: Pruebas rápidas 78

Tema 2: Grupos sanguíneos 79

Tema 3: Prueba de Coombs Directo 81

Curso: Hematología y Análisis Hematológico II 82

Tema 1: Reporte de serie roja 82

Tema 2: Recuento de reticulocitos 84

Tema 3: Diferencial leucocitario 85

Tema 4: Serie blanca patológica 86

Tema 5: Repaso de hematología y quiz 87

Curso: Parasitología Clínica 88

Temas 1 y 2: Examen coproparasitológico 88

Tema 3: Tinción de Ziehl-Neelsen 90

Tema 4: Técnica de Baermann 92

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Curso: Instrumentación Clínica

Competencias

1. Identifica y reconoce la instrumentación vinculada a la realización de procedimientos en el laboratorio clínico.

2. Describe y analiza los procedimientos de manejo de desechos sólidos entre otras normas de bioseguridad.

Tema 1: Uso de equipo básico de laboratorio

Objetivo específico

Reconocer el equipo básico que se utiliza en el laboratorio, así como el correcto uso del mismo.

Descripción

En la actualidad, el ámbito de la Microbiología y la Química Clínica se caracteriza por su alto potencial tecnológico. Una gran mayoría de los exámenes que se realizan de rutina e incluso exámenes especializados se encuentran automatizados. Sin embargo, todo laboratorio debe poseer siempre materiales y equipo para realizar las pruebas de forma manual, dado a un desperfecto del equipo o a que no se cuente con uno. En algunos casos incluso, se requerirán etapas de tratamiento de las muestras previas a ser procesadas por un equipo automatizado, sin mencionar que hay muchas prácticas que, por su naturaleza, se realizan de manera estrictamente manual.

Por lo tanto, el conocimiento del uso y manipulación correctos de la cristalería básica en un laboratorio son fundamentales para cualquier persona que se desempeñe en esta área. Técnicas como la medición de volúmenes, aforado de equipo volumétrico, tarar las balanzas granatarias, evitar errores de paralaje, entre otros, determina un buen ejercicio de la práctica en laboratorio, asegurando así resultados fidedignos y de utilidad para la intervención oportuna de los pacientes.

Dentro de la cristalería principal con que se cuenta en un laboratorio están:

• Beaker: Recipientes para contener volúmenes medianos o altos de líquidos, su exactitud es bastante baja. Se utiliza cuando se pueden utilizar cantidades aproximadas del líquido a contener.

• Erlenmeyer: También se utiliza para contener volúmenes medianos o altos de líquidos en volúmenes aproximados. Además, posee la ventaja de que disminuye la pérdida de líquido por evaporación al calentarlos, además de proveer una estructura que facilita la manipulación de sustancias calientes.

• Probeta: Es un equipo alargado, cilíndrico, que permite medir volúmenes con una exactitud mayor que un beaker o un Erlenmeyer. Existen desde capaces de medir pocos mililitros hasta algunos litros. Suelen venir graduados y los más utilizados son los pequeños.

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• Balones aforados: Son balones con un cuello delgado alargado con una marca con el nivel de llenado o “aforo”. Proveen una gran exactitud y se utilizan para preparar soluciones de concentración conocida (estándares) de modo que se agrega el soluto de interés y luego se disuelve hasta alcanzar el nivel de aforo.

• Pisetas: Suelen ser de plástico. Se utilizan para verter líquido en pequeñas cantidades de manera controlada mediante presión.

• Tubos de ensayo: Son tubos pequeños, de vidrio o plástico que se utilizan para contener volúmenes pequeños o para realizar reacciones. Sus usos varían grandemente según la disciplina en la que se utilicen. Materiales • Erlenmeyer • Beakers • Balones aforados • Probetas • Pisetas • Balanza granataria • Pipetas • Peras • Tubos de ensayo Observación

1. Observe los implementos de laboratorio que se encuentran en exposición y realice los dibujos y anotaciones que consideren importantes.

Uso de la pipeta

1. Tome una pipeta y la llene hasta un nivel intermedio

2. Observe desde varias alturas para notar el error de paralaje

3. Luego proceda a verter un volumen de la manera como se describe a continuación:

a. Vacíe el globo de la pera presionando la boquilla superior. b. Coloque la pera en la pipeta.

c. Coloque la pipeta dentro del agua y se llene por encima de su capacidad máxima, presionando la

boquilla inferior de la pera.

d. Saque la pipeta del agua y afore (llevar hasta el 0) presionando la boquilla lateral de la pera. e. Recuerde que el volumen correcto se mide en la parte inferior del menisco.

f. Seque cuidadosamente la punta de la pipeta para eliminar residuos externos, sin tocar el líquido en

la parte interna.

g. Vierta el volumen indicado en un tubo de ensayo, teniendo cuidado nuevamente en la posición del

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h. Vierta el volumen indicado en un tubo de ensayo, teniendo cuidado nuevamente en la posición del

menisco.

Uso de la Autoclave

1. Revise que el nivel de agua sea el apropiado

2. Cerciórese que la válvula de purga y la válvula de seguridad estén cerradas 3. Ponga el material en la cámara de autoclavado

4. Cierre de forma hermética girando la manija sin dejar excesivamente tallado 5. Verifique los 15 minutos del autoclavado en el Timer

6. Ponga la autoclave en modo Esterilizar

7. Encienda el equipo y presione el botón de START 8. Una vez terminado el proceso, el equipo sonará

9. Apague el equipo y espere la descompresión total en el manómetro (indicador de presión) 10. Abra la autoclave utilizando guantes y se guarda el material listo para su uso.

Tema 2: Uso del Microscopio

Objetivo específico

Reconocer las partes del microscopio y su uso, así como las fases de la tinción de Gram y el uso correcto de ambos.

Descripción

Es microscopio de luz es y ha sido la herramienta principal en el ámbito de la microbiología. Su uso abarca una gran parte de las ramas de ésta ciencia, aunque en muchas áreas su utilidad se ha ido reduciendo al implementar técnicas de mayor sensibilidad y estandarización, como las técnicas serológicas y moleculares.

Sin embargo, sigue constituyendo un equipo primordial en cualquier laboratorio de microbiología y sigue proveyendo gran utilidad en diversidad de áreas como la bacteriología, micología y parasitología. Para utilizar correctamente el microscopio es necesario conocer adecuadamente sus partes y sus funciones, dado que dependiendo del tipo de microorganismo con que se esté tratando, se deberán adaptar el aumento, la luz y el condensador para tener resultados que provean una visibilidad óptima para trabajar. En el caso de las bacterias, para poder visualizarlas es necesario realizar tinciones antes de observarlas al microscopio. La tinción más común es la tinción de Gram, la cual nos va a clasificar a las bacterias en dos grandes grupos: Gram positivas y Gram negativas.

Las bacterias Gram positivas poseen una pared celular más gruesa, lo que va a favorecer la retención del cristal violeta, por lo que, al decolorar, se mantiene la coloración morada.

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celular, por lo cual el cristal violeta es fácilmente removido al decolorar con alcohol – acetona, por lo cual es necesario realizar una contra tinción con safranina o fucsina para poderlas visualizar.

Materiales • Microscopio • Tijeras • Hilos de colores • Letras de periódico • Laminas teñidas Procedimiento

1. Observe el microscopio e identifique las siguientes partes: • Lente ocular • Lentes objetivos • Revólver • Brazo • Platina mecánica • Desplazamiento de la platina • Lente condensador • Diafragma de apertura • Macrométrico • Micrométrico • Fuente de Luz

Uso correcto del microscopio

1. Se debe de conectar y encender el microscopio.

2. El microscopio siempre debe de tener el lente objetivo de 4x (rojo) en la posición de uso. 3. Se baja la platina completamente.

4. Colocar las muestras traídas en el portaobjetos y observar al microscopio.

5. Comenzar a observar con el lente de 4x(rojo) y enfocar con el macrométrico hasta observar la muestra, una vez enfocado se pasa de lente al 10x(amarillo) y se vuelve a enfocar con el macrométrico y el micrométrico, cuando ya esté enfocado nuevamente se pasa al lente de 40x(azul) si corresponde y se enfoca con el micrométrico.

6. De ser necesario aceite de inmersión, devuélvase al lente de 4X, coloque una gota grande de aceite de inmersión y pase directo al lente de 100X (blanco), sin pasar por el de 40X. Este lente no está diseñado para soportar el aceite de inmersión y lo puede dañar. De hacerlo accidentalmente, quite el lente de 40X de la posición de trabajo y proceda a limpiarlo bien con papel para lentes.

7. Al terminar, limpie también el lente de inmersión para remover remanentes de aceite de inmersión 8. Al finalizar el proceso se debe de bajar totalmente la platina, retirar la muestra de la platina.

9. Se debe de limpiar con un papel para lentes el exceso de aceite en el lente de inmersión, el papel se emplea en un solo sentido y con suavidad.

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10. Se vuelve a colocar el lente de menor aumento 4x (rojo) en la posición de empleo.

11. El microscopio se debe de apagar y si no se va a utilizar en un tiempo prolongado se le debe de poner la funda para protegerlo.

Precauciones

1. Trabajar sobre una superficie estable, limpia y con buena iluminación

2. Nunca se debe de mover el microscopio arrastrándolo ya que se puede dañar se tiene que tomar por el brazo del microscopio levantarlo y colocarlo en el lugar deseado.

3. Nunca hay que tocar los lentes y objetivos con los dedos, si los lentes están sucios utilizar ÚNICAMENTE papel de lente y limpiarlos en un solo sentido y con suavidad, si se limpió el de inmersión cambiar de papel para no ensuciar de aceite los otros lentes.

4. El cambio de objetivos se hace girando el revólver, nunca girarlos agarrando el tubo del objetivo. 5. Se debe de mantener la platina limpia y sin ningún líquido.

6. Al finalizar el uso del microscopio SIEMPRE debe de quedar limpio y con el lente 4x (rojo) en la posición de empleo con la platina totalmente abajo y con la funda puesta.

Tema 3: Flebotomía

Objetivo específico

Aplicar todas las partes de una correcta técnica para la obtención de muestras sanguíneas

Descripción

La flebotomía o toma de muestra sanguínea es una técnica imprescindible que debe ser dominada por todo personal de laboratorio, pues de ésta manera será la obtención de la mayoría de las muestras que se procesarán.

Es un procedimiento delicado ya que es invasivo, por lo cual se debe realizar con sumo cuidado y certeza, al igual que mantener los cuidados asépticos para evitar posteriores complicaciones de los pacientes. En las muestras sanguíneas es de gran importancia considerar los tubos que se utilizarán según las pruebas solicitadas. Así tendremos, a grandes rasgos, que el tubo rojo (sin anticoagulante, con factores promotores de la coagulación) se utilizará para obtener suero y procesar química clínica y hormonas, el tubo morado (EDTA como anticoagulante) principalmente para hematología y grupos sanguíneos, los celestes (citrato como anticoagulante) se utilizarán para pruebas de coagulación, por mencionar los principales.

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Materiales • Equipo de sangrado • Tubos de muestras • Tubos morados • Simulador de brazo • Torniquete • Algodones • Alcohol • Aguja • Adaptador Procedimiento

1. Tome el brazo y coloque el torniquete fuertemente en la parte superior del mismo 2. Palpe la vena que va a punzar

3. Humedezca un algodón con alcohol al 70% y limpie el área de punción en espiral hacia afuera 4. Permita que el alcohol seque

5. Coloque la aguja en el lado afuera del adaptador y un tubo en la parte interna del mismo 6. Sin volver a palpar, realice la punción de la vena en un movimiento recto, rápido y seguro

7. Sostenga firmemente el adaptador y presione el tubo para que inicie el vacío y obtenga la muestra 8. Una vez lleno el tubo, retírelo apoyando el pulgar en el adaptador y coloque otro tubo

9. Una vez finalizado, retire el tubo, retire el torniquete y coloque un algodón seco sobre el sitio de punción

10. Presionando suavemente el algodón, retire la aguja rápidamente y en un solo movimiento 11. Indique al paciente sostener el algodón durante 5 a 10 minutos posterior a la punción.

Interpretación

• El torniquete debe ser colocado fuertemente para que las venas realmente sobresalgan.

• El movimiento a la hora de limpiar pretende que no se arrastre contaminación hacia el sitio de punción, sino fuera de él.

• Es necesario dejar que el alcohol seque, de lo contrario el paciente puede sentir un gran ardor a la hora de tomar la muestra y la sangre podría hemolizar, impidiendo que se puedan realizar muchas pruebas.

• El algodón se debe sostener durante 5 a 10 minutos posterior a la punción para evitar la formación de hematomas.

Tarea:

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Curso: Microbiología I

Competencias

Conoce y aplica los conocimientos básicos de la microbiología, bacteriología, micología, virología, parasitología, preparación de reactivos clínicos y asistencia en los métodos de laboratorio que desarrolla el Microbiólogo demostrando una alta comprensión integral del fenómeno de la Salud permitiendo desarrollar con esto, un alto sentido de la ética profesional.

Tema 1: Uso del microscopio y tinción de Gram

Objetivo específico

Reconocer las partes del microscopio y su uso, así como las fases de la tinción de Gram y el uso correcto de ambos.

Descripción

Los diversos elementos que existen en la naturaleza, presentan tamaños, formas y composiciones distintas ellas pueden verse, algunas a simple vista y otras mediante instrumentos como el microscopio óptico o electrónico.

El microscopio de óptico es la herramienta principal en el ámbito de la microbiología. Su uso abarca una gran parte de las ramas de ésta ciencia, aunque en muchas áreas su utilidad se ha ido reduciendo al implementar técnicas de mayor sensibilidad y estandarización, como las técnicas serológicas y moleculares. En el microscopio óptico, la luz atraviesa de abajo a arriba el objeto a estudiar. Para ver con el microscopio un objeto, éste debe ser lo más fino posible. Si no lo atraviesa la luz se verá sólo un grumo deforme y opaco.

Tiene un límite resolución, distancia mínima a la que se pueden distinguir dos objetos, de 200 nm (0.2 µm). Las células observadas bajo el microscopio pueden estar vivas o fijadas y teñidas. Las muestras son depositadas en una lámina de vidrio denominada portaobjetos, de unos 5 cm de largo por 2 cm de ancho. En el lugar del portaobjetos donde se puso la muestra puede, además, ponerse una laminilla muy fina de vidrio llamada cubreobjetos.

Los oculares proporcionan un aumento de la imagen, y viene expresado 10X en el ocular. También los hay 20X. Los objetivos (generalmente cuatro), suelen tener aumentos de 4X, 10X, 40X y 100X. La ampliación de la imagen resultante al multiplicar los aumentos que proporciona el ocular.

Lo objetivos 4X, 10X y 40X, se denominan objetivos secos, porque entre la lente y la preparación, la luz atraviesa el aire proporcionando una imagen nítida. El objetivo 100, se denomina objetivo de inmersión, porque para proveer imágenes nítidas, la lente debe estar inmersa en un líquido (aceite de cedro o similar), con un índice de refracción igual al vidrio, lo que evita la dispersión de los rayos luminosos. Siempre que utilicemos el objetivo 100X debemos colocar una gota de aceite de inmersión sobre la preparación a observar.

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Partes de microscopio

Para utilizar correctamente el microscopio es necesario conocer adecuadamente sus partes y sus funciones, dado que dependiendo del tipo de microorganismo con que se esté tratando, se deberán adaptar el aumento, la luz y el condensador para tener resultados que provean una visibilidad óptima para trabajar.

Sistema óptico

• Ocular: son sistemas de lentes cuya función es aumentar la imagen procedente del objetivo tantas veces como indique el número escrito en ellos. Los dos oculares pueden moverse hacia los lados y hacia el centro, de manera que se ajusten a la distancia inter pupilar de quien esté utilizando el microscopio. En algunos microscopios ambos oculares tienen inscrito lo siguiente 10X/18L. La cifra de la izquierda (10X) indica las veces que cada ocular aumenta la imagen procedente del objetivo y la derecha (18L) es el llamado número del campo, que sirve para calcular el tamaño del diámetro del campo visual, de acuerdo con el objetivo que se esté utilizando. Este número de campo puede variar según el microscopio de que se trate y normalmente está entre 12 y 36.

• Anillo de dioptrías: se ubica en uno de los oculares y sirve para ajustar la visión binocular.

• Objetivo: Lente situada cerca de la preparación. Amplía la imagen de ésta. Sus aumentos de menor a mayor son 4x, 10x, 40x, 100x.

• Condensador: Lente que concentra los rayos luminosos sobre la preparación.

• Diafragma: Regula la cantidad de luz que entra en el condensador.

• Fuente de luz: proporciona la iluminación necesaria para la observación de la muestra. Algunos microscopios no tienen incorporada la fuente de luz y se valen de un espejo para reflejar la que proviene de un bombillo o de una lámpara.

Sistema mecánico

• Soporte: Mantiene la parte óptica. Tiene dos partes: el pie o base y el brazo.

• Platina: Lugar donde se deposita la preparación.

• Cabezal: Contiene los sistemas de lentes oculares. Puede ser monocular, binocular.

• Revólver: Contiene los sistemas de lentes objetivos. Permite, al girar, cambiar los objetivos.

• Tornillos de enfoque: El Tornillo Macrométrico que aproxima el enfoque y el Tornillo Micrométrico que consigue el enfoque correcto.

• Abertura numérica (AN): es la capacidad que tiene el objetivo para recibir el cono de luz que pasa a través de la muestra, procedente de la fuente de luz. La abertura numérica es directamente proporcional al índice de refracción del medio en que se propaga la luz (aire, agua, vidrio, aceite de inmersión), pues mientras mayor sea el índice de refracción, mayor será el cono de luz, lo cual origina un mayor poder de resolución (aspecto que se explicará en la segunda práctica de laboratorio).

• Longitud mecánica del tubo: es la distancia que hay entre la parte inferior del objetivo y los oculares. Está indicada en los objetivos y generalmente tiene un valor de 160 mm. Observe cómo al lado de este número, separados por una línea oblicua, aparece un guion o la cifra 0,17. el guion indica que estas lentes pueden usarse para observar muestras sin que sea estrictamente necesario utilizar cubreobjetos; y la cifra 0.17, que solo está en la lente A40, indica que es necesario utilizar un cubre

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• Poder de aumento (PA): es el producto del número del aumento de cada una de las lentes, el aumento del objetivo (Aob) multiplicado por el aumento del ocular (Aoc). Su fórmula se expresa así: (At) = Aob x Aoc donde At: es el aumento total; Aob: es el aumento del objetivo; Aoc: es el aumento del ocular.

• Campo visual del microscopio: es el área circular que se observa al mirar a través del microscopio. Varían según las lentes utilizadas.

• Unidades utilizadas en mediciones microscópicas: la mayoría de los organismos o estructuras que se estudian al microscopio son de tamaños muy pequeños. Por lo tanto, para medirlos es necesario utilizar unidades reducidas. Por lo tanto, para medirlos es necesario utilizar unidades reducidas tales como el milímetro (mm), el micrómetro (µm), el nanómetro (nm) y el angstrom (A°). Las relaciones que existen entre ellas son: 1 mm = 1000µm; 1µm = 1000 nm; 1nm = 10A°.

Materiales

• Microscopio • Láminas teñidas

• Cultivo mixto en medio líquido • Mechero • Portaobjetos • Cristal violeta • Safranina • Solución de alcohol-acetona. • Aceite de inmersión • Papel de lentes • Asas bacteriológicas Procedimiento Observación

1. Observe el microscopio e identifique las siguientes partes: • Lente ocular • Lentes objetivos • Revólver • Brazo • Platina mecánica • Desplazamiento de la platina • Lente condensador • Diafragma de apertura • Macrométrico • Micrométrico • Fuente de Luz

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2. Coloque una lámina teñida en el microscopio.

3. Coloque el lente de 4X (rojo) y mueva el macrométrico hasta enfocar el plano de la muestra. 4. Una vez enfocado y sin mover el carro, proceda a cambiar el lente a 10X (amarillo).

5. Una vez enfocado nuevamente y sin mover el carro, proceda a cambiar el lente a 40X (celeste). 6. De ser necesario aceite de inmersión, devuélvase al lente de 4X, coloque una gota grande de aceite

de inmersión y pase directo al lente de 100X (blanco), sin pasar por el celeste. El lente de 40X no está diseñado para soportar el aceite de inmersión y lo puede dañar. De hacerlo accidentalmente, quite el lente de 40X de la posición de trabajo y proceda a limpiarlo bien con papel para lentes.

7. Al terminar, limpie también el lente de inmersión para remover remanentes de aceite de inmersión.

Tinción de Gram

1. Esterilice las asas bacteriológicas

2. Haga dos círculos sobre un portaobjetos con el lápiz de cera

3. Una vez frías las asas, sumerja una en el cultivo líquido. Agite bien y extraiga una gota 4. Colóquela sobre el portaobjetos, dentro de uno de los círculos y extiéndala lo más posible 5. Deje secar a temperatura ambiente

6. Fije el frotis exponiéndolo varias veces y por periodos cortos a la llama del mechero 7. Proceda a realizar la tinción de la siguiente manera:

a) Cubra la lámina con cristal violeta por 1 minuto y lave con agua el excedente. b) Cubra la lámina con lugol durante 1 ó 2 minutos y lave la lámina con agua y escurra. El siguiente paso es primordial y es el que determinará si la tinción es exitosa o no

c) Decolore utilizando solución de alcohol – acetona hasta que solamente note una delgada línea

de colorante saliendo (aproximadamente 10 segundos)

d) Inmediatamente detenga la decoloración con agua y escurra el excedente e) Cubra la lámina con safranina durante 1 minuto y lave la lámina con agua. f) Séquela con la secadora.

g) Observe la lámina al microscopio con lente de inmersión.

Asignación: Omnipresencia de los microorganismos

Objetivo específico

Identificar la presencia de microorganismos en el ambiente natural, como parte normal de la naturaleza.

Descripción

En la naturaleza se encuentran todo tipo de microorganismos. Se pueden encontrar desde el suelo, agua y aire, así como sobre los seres vivos y dentro de ellos. Muy pocos de ellos son capaces de causar algún tipo de enfermedad ya que, en su mayoría, son microorganismos de vida libre. En el ambiente se pueden encontrar bacterias, esporas de hongos e incluso protozoarios y muchos de éstos pueden ser aislados utilizando diversas técnicas.

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Materiales

• Placas de agar nutritivo

Procedimiento

Aislamiento de microorganismos en el aire

1. Coloque una placa de agar nutritivo con la tapa abierta en algún sitio de su lugar de residencia. 2. Luego de 60 minutos tápela de nuevo, y selle con cinta adhesiva.

3. Incube a 35°C por 24 h. de ser posible o a temperatura ambiente por 48 h.

Aislamiento de microorganismos en superficies corporales

1. Divida una placa de agar nutritivo rayando por fuera con un marcador en la parte inferior de la placa. 2. En una mitad, coloque los dedos de sus manos por unos segundos.

3. Proceda a lavar bien sus manos con agua, jabón y alcohol. 4. Repita en la otra mitad de la placa.

5. Tape la placa y selle con cinta adhesiva.

6. Incube a 35°C por 24 h de ser posible o a temperatura ambiente por 48 h.

Lectura de Placas

1- Analice en el laboratorio los microorganismos que crecieron en las placas. Tema 2: Tinciones

Objetivos específicos

• Saber la importancia de las tinciones para la caracterización e identificación de las bacterias. • Clasificar algunas especies bacterianas en Gram positivas o Gram negativas.

• Observar estructuras bacterianas especiales, como las endosporas y cápsulas.

Descripción

En el caso de las bacterias, para poder visualizarlas es necesario realizar tinciones antes de observarlas al microscopio. La tinción más común es la tinción de Gram, sin embargos existen otro tipo de tinciones permiten obtener mayor información por ejemplo la negativa y la selectiva.

La tinción de Gram fue propuesta por el médico danés Christian Gram en 1884, es una de las tinciones diferenciales más utilizadas en bacteriología, que clasifica los cultivos bacterianos de menos de 24 horas en Gram positivas y Gram negativas. Para establecer la diferenciación en estos dos grupos, se aplica un disolvente del colorante primario que no tiene efecto sobe el grupo de microorganismos que lo retienen firmemente, pero lo elimina de aquellos que no son capaces de retenerlo, quedando por lo tanto completamente decolorados. En estas circunstancias, sería muy difícil su observación por lo que es preciso tratarlos con otro colorante llamado secundario, como la safranina. Este colorante no modifica el color de los microorganismos que habían retenido el color primario, pero tiñe a los microorganismos decolorados. Como se observa en la figura 1.

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Figura 1. Esquema de tinción de Gram, fuente Tortora, 2012

Estas diferencias de tinción de las bacterias se explican por cambios en la composición química y estructura de las paredes celulares, que facilitan la retención o eliminación del colorante primario después del proceso de decoloración.

Las tinciones selectivas por otro lado permiten observar estructuras especializadas como las endosporas de Bacillus y Clostridium, bacterias en las que su presencia, forma y localización son importantes criterios de clasificación taxonómica. Debido a la resistencia al calor de las endosporas y a que algunas especies son microorganismos patógenos de gran toxicidad, su detección en microbiología alimentaria y médica adquiere gran interés. Las endosporas son formas de resistencia capaces de sobrevivir a altas temperaturas y medios adversos. Se producen cuando las condiciones ambientales son desfavorables (agotamiento de los nutrientes, temperaturas extremas, radiaciones, compuestos tóxicos), formándose una espora por cada forma vegetativa.

La tinción negativa, facilita las observaciones de la morfología y tamaño de las bacterias sin alteración por efecto del calor, así como de estructuras especiales, como la cápsula de algunas especies bacterianas. La cápsula también llamada glico-cáliz es una estructura externa a la célula, formada de polisacáridos o polipéptidos, que confiere protección a las bacterias contra la desecación y la fagocitosis.

La extensión sobre un portaobjetos en forma de capa fina de una mezcla de las bacterias con tinta china o nigrosina, permite observar en el microscopio estructuras especiales como son las cápsulas, que aparecen como una zona clara que rodea la célula bacteriana en un fondo oscuro.

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Materiales • Probeta de 100 mL • Parrilla de calentamiento. • Mechero • Cristal violeta. • Safranina • Lugol • Solución de alcohol-acetona. • Verde de malaquita. • Fenol 2%. • Aceite de inmersión. • Cultivo mixto • Papel filtro* • Asa bacteriológica* • Portaobjetos* • Tinta china*

• Cepas de Escherichia coli., Streptococcus sp., Bacillus subtilis, Klebsiella sp., Aspergillus niger • Microscopio compuesto de campo claro.

Procedimiento

Preparar un frotis a partir de un cultivo sólido o de cultivo líquido de cada microorganismo y aplicar la tinción necesaria.

Tinción de Gram: Escherichia coli., Streptococcus sp., o Klebsiella sp.

Tinción selectiva de endosporas: en un frotis fijado al calor de Bacillus subtilis Tinción negativa en un frotis de Klebsiella sp. o Aspergillus niger

Preparación del frotis

Cultivo de bacterias en medio líquido, tomar una o varias cargas directamente con el asa y extender sobre el portaobjetos.

Cultivo en medio sólido, depositar previamente una gota de agua sobre el portaobjetos. Tomar con el asa una pequeña parte de la colonia y dispersar en la gota de agua, realizar la extensión como en el caso anterior.

Para la fijación pueden utilizarse agentes químicos (formol, metanol) o el calor. Emplearemos el calor, y para ello el frotis, una vez seco, se pasa dos o tres veces sobre la llama, con la preparación hacia arriba, para no quemarla. Hay que procurar que el calor nunca sea excesivo, pues se alterarían las estructuras de la bacteria: en ningún momento el portaobjetos, colocado sobre el dorso de la mano, debe quemar. La fijación tiene por objeto provocar modificaciones en la composición físico-química de la bacteria (coagulación de las proteínas, etc.) de forma que ésta conserve definitivamente una estructura similar

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a la que tenía en vivo, sin deformarse como consecuencia de los tratamientos a que se verá sometida durante la tinción. Por otra parte, la fijación impide el arrastre de los microorganismos al quedar estos adheridos al portaobjetos y hace que la pared celular sea más permeable a los colorantes.

Tinción simple (se utiliza un solo colorante)

1. Hacer el frotis, secarlo y fijarlo.

2. Cubrir con colorante azul de metileno o la safranina, la preparación 3. Dejar actuar durante un minuto.

4. Lavar suavemente con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.

5. Secar al aire y observar al microscopio con el objetivo de inmersión (100x) empleando el aceite apropiado.

Tinción de Gram

1. Esterilice las asas bacteriológicas

2. Haga dos círculos sobre un portaobjetos con el lápiz de cera

3. Una vez frías las asas, sumerja una en el cultivo líquido. Agite bien y extraiga una gota 4. Colóquela sobre el portaobjetos, dentro de uno de los círculos y extiéndala lo más posible 5. Deje secar a temperatura ambiente

6. Fije el frotis exponiéndolo varias veces y por periodos cortos a la llama del mechero 7. Proceda a realizar la tinción de la siguiente manera:

a) Cubra la lámina con cristal violeta por 1 minuto y lave con agua el excedente. b) Cubra la lámina con lugol durante 1 ó 2 minutos y lave la lámina con agua y escurra. El siguiente paso es primordial y es el que determinará si la tinción es exitosa o no.

c) Decolore utilizando solución de alcohol – acetona hasta que solamente note una delgada línea

de colorante saliendo (aproximadamente 10 segundos)

d) Inmediatamente detenga la decoloración con agua y escurra el excedente e) Cubra la lámina con safranina durante 1 minuto y lave la lámina con agua. f) Séquela con la secadora.

g) Observe la lámina al microscopio con lente de inmersión.

Tinción selectiva de endosporas

1. Hacer un frotis de cultivo en medio sólido (preferentemente de al menos 48 horas) de Bacillus subtilis. 2. Colocar el portaobjetos sobre un trípode y cubrir la preparación con papel de filtro del mismo tamaño

que la extensión (tienen por objeto mantener húmeda la preparación y evitar que los bordes del portaobjetos se manchen de colorante). tal como se ve en la figura 2

3. Agregar verde de malaquita (solución acuosa al 2%), sobre el papel filtro de tal manera que cubra toda la preparación.

4. Dejar durante 5 minutos evitando que se seque el colorante (agregar un poco más si es necesario) quitar el papel de filtro y eliminar el colorante con agua destilada.

5. Cubrir con safranina durante 60 segundos, lavar nuevamente y dejar secar al aire.

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Figura 3. Esquema de tinción selectiva de endosporas, fuente Manual de bacteriología clínica, 2000.

Tinción negativa para observación de cápsulas

1. Colocar una pequeña gota de tinta china en el extremo de un portaobjetos; colocar junto una gota del cultivo liquido de Klebsiella sp. Si se trata de un cultivo sólido, hacer una suspensión del microorganismo en una gota de agua destilada y mezclar cuidadosamente con la tinta china. observa la figura 3.

2. Distribuir la mezcla a lo ancho del portaobjetos, colocando otro portaobjeto perpendicular en ángulo de 45° sobre la muestra.

3. Desplazar poco a poco el segundo portaobjetos a lo largo del primero para hacer una capa fina de la mezcla.

4. Dejar secar al aire.

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Tinción de Zielhl Neelsen

1. Cubrir el extendido con fucsina

2. Con la llama de un mechero humedecido en alcohol, calentar suavemente por debajo de las láminas cubiertas con fucsina, hasta que se produzca emisión de vapores blanquecinos visibles.

3. Dejar de calentar y repetir el procedimiento por 5 minutos.

4. Importante: En ningún caso la fucsina debe hervir o secarse sobre las láminas. Si disminuye por evaporación o derrame, hay que reponerla.

5. Eliminar la fucsina lavándola con agua corriente

6. Cubrir la totalidad de la superficie del extendido con la mezcla alcohol-ácido.

7. Se puede mover suavemente en forma de vaivén para que se vaya produciendo la decoloración. Esta operación requiere alrededor de 1 a 2 minutos.

8. Lavar con agua corriente.

Ziehl-neelsen modificado

1. Cubrir el extendido con fucsina por 20 minutos. 2. Eliminar la fucsina lavándola con agua corriente. 3. Seguir los pasos del 5 al 9.

Observaciones al microscopio

Limpiar cuidadosamente los objetivos y el ocular del microscopio con papel seda.

1. Colocar los portaobjetos en la platina y empezar a localizar la preparación con el objetivo de 10X, posteriormente pasar al de 40X. para observar con el objetivo de 100X colocar previamente una pequeña gota de aceite de inmersión sobre la preparación.

2. Al finalizar las observaciones, limpiar cuidadosamente el objetivo con papel seda para eliminar el exceso de aceite y evitar incrustaciones que dañan a estos sistema.

Tema 3: Técnicas de cultivo

Objetivo específico

Practicar las técnicas básicas de cultivo de microorganismos.

Descripción

Para una correcta realización de un cultivo bacteriano son necesarias ciertas condiciones:

1. Que se lleve a cabo con instrumentos estériles sobre medios de cultivo estériles. Para estudiar una bacteria determinada, es necesario destruir todos aquellos microorganismos que pudieran encontrarse en el medio y en los instrumentos de trabajo. Esto se consigue con la esterilización. En la esterilización se utilizan dos tipos principales de esterilización: métodos físicos (calor, filtración, radiaciones) métodos químicos (empleo de soluciones químicas).

2. Que el inoculo no se contamine, modifique o destruya: normalmente se emplea el calor directo, flameando las bocas de los tubos de ensayo, matraces, pipeta, etc, antes y después de su utilización, a pesar de estar esterilizados previamente.

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3. Que las condiciones ambientales durante el proceso sean lo más próximas a la esterilidad para evitar contaminaciones durante el manejo del instrumental y de los medios de cultivo. Estas condiciones se resuelven con el uso de cabinas estériles (con flujo de aire y luz ultravioleta). Cuando no se dispone de ellas, se utiliza un mechero Bunsen que, debido a que fuerza la circulación del aire en sentido vertical y hacia arriba, es capaz de crear un ambiente semiestéril en la zona inmediata alrededor y debajo de la llama, de forma que los riesgos de contaminación disminuyen considerablemente. Un cultivo puro es aquel en el cual se encuentra únicamente una especie de microorganismo, sea bacteria u hongo, mientras que un cultivo mixto es en el cual se encuentran dos o más especies. En la naturaleza y en el cuerpo humano, es común encontrar los microorganismos conviviendo en comunidades, sin embargo, para efectos diagnósticos es de interés únicamente el agente causal de la enfermedad. Por lo tanto, es necesaria la aplicación de técnicas de aislamiento del organismo en cuestión. El método más comúnmente utilizado es el rayado. En éste método, se utiliza un asa estéril para “rayar” diferentes zonas de una placa de agar, de modo que la concentración inicial de bacterias presentes en el asa se diluya paulatinamente hasta que se logren separar las colonias, posterior a su incubación. Se asume que cada colonia proviene de una única bacteria. Existen diversos métodos de inoculación de medios de cultivo, dependiendo del objetivo, algunos de los cuales se evaluarán en la presente práctica.

Materiales • Medios de cultivo • Cultivo mixto • Asas bacteriológicas • Mechero • Cepas de: • Escherichia coli. • Streptococcus sp. • Bacillus subtilis. • Klebsiella sp. • Candida sp Procedimiento Rayado por estría

1. Tome un tubo de agar Sabouraud con Candida sp 2. Con un asa estéril proceda a tomar una colonia

3. Con cuidado, retire el algodón de un tubo de agar Sabouraud

4. Raye el agar por estría, realizando un movimiento zigzagueante desde el fondo hacia afuera 5. Tape el tubo nuevamente e incube a 24°C durante 7 días

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Rayado en placa a partir de medio líquido

1. Tome dos medios líquidos con diferentes bacterias (un bacilo y un coco) y dos placas de agar sangre 2. Sumerja un asa estéril en uno de los medios y proceda a rayar una placa de agar, ya sea en 3 o 4 zonas 3. Procure que la primer área sea pequeña y que la última tenga asadas largas y juntas para favorecer

la separación de las colonias 4. Repita con el segundo cultivo 5. Incube a 35°C durante 24h

6. Siempre esterilice cada asa luego de haberla utilizado

Rayado en placa a partir de medio sólido

1. Tome dos agares con diferentes bacterias y dos placas de agar sangre 2. Con un asa estéril tome una colonia bacteriana bien separada

3. Proceda a rayar la colonia en un agar sangre, en 3 o 4 zonas

4. Opcionalmente, puede realizar primero una pequeña estría y realizar el rayado con un asa diferente 5. Siempre esterilice cada asa luego de haberla utilizado

Lectura de Placas

1. Analice los microorganismos que crecieron en las placas

Interpretación

El agar MIO es un agar semisólido que permite la movilidad de las bacterias. Si éstas son móviles y aerobias, se desplazarán hacia donde hay mayor disponibilidad de oxígeno, es decir, hacia la parte superior del agar. Mientras que no son móviles, crecerán en la zona que tuvo contacto con el asa únicamente. Tema 4: Toma de muestras faríngeas y cutáneas

Objetivo específico

Reconocer los pasos para la toma de muestra y procesamiento correctos de muestras faríngeas y cutáneas.

Descripción

Los microorganismos son conocidos por estar presentes en todas partes, desde la naturaleza hasta el cuerpo humano. De la misma manera, en ocasiones pueden colonizar sitios anatómicos como el tracto gastrointestinal, en donde pueden actuar como comensales o simbiontes.

No obstante, en ocasiones ese crecimiento se puede volver descontrolado o invasivo, lo cual culmina en un proceso infeccioso. En estos casos, puede ser necesario la toma de muestra para aislar e identificar al patógeno, su perfil de sensibilidad a antimicrobianos y establecer una terapia efectiva para que la infección resuelva.

En la toma de muestras microbiológicas lo más importante es recolectar el microorganismo que causa la

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se cuente únicamente con el microorganismo de interés y no se identifiquen erróneamente la flora normal o contaminante, dado que se incurriría en un error de tratamiento que podría ser inefectivo y se podría comprometer grandemente la salud del paciente.

En el laboratorio de microbiología es muy importante mantener los microorganismos del ambiente fuera de los materiales de trabajo, para que no interfieran con el aislamiento de los agentes buscados. Esto se logra mediante una serie de medidas y cuidados en la manipulación de los medios de cultivo y de los implementos de laboratorio, es importante controlar la contaminación ambiental, así como la que pudiera aportar las manos, respiración entre otros, además la aplicación correcta de las normas de bioseguridad que garanticen un trabajo correcto de laboratorio evitará la contaminación y las posibles infecciones por accidentes de laboratorio. Todo esto en conjunto se llama “técnica aséptica”.

La muestra se debe recolectar la manera más apropiada y en condiciones asépticas, ya que el diagnóstico va a depender de esto.

En al caso de lesiones por hongos, las más frecuentes son en piel y uñas, el procesamiento de muestras abarca: la recolección de la muestra, el examen directo, los cultivos y la identificación del agente

etiológico.

La cantidad es muy importante de ser suficiente para realizar exámenes directos y cultivos, que sea de la zona donde está la lesión concentrada y no se contamine ni por contacto con el paciente o con el ambiente. Materiales • Microscopio • Portaobjetos • KOH 20% y 40% • Azul de Lactofenol • Tinción de Gram • Torundas estériles • Hojas de bisturí

• Placas de agar nutritivo • Bajalenguas

• Solución salina estéril

Procedimiento

Las normas básicas para la recolección correcta de muestras biológicas son:

1. La muestra para cultivo debe proceder, del verdadero sitio de la infección y deberá recogerse con un mínimo de contaminación de tejidos, órganos o secreciones adyacentes.

2. Se establecerán los períodos óptimos para la recolección de las muestras de acuerdo al proceso natural de la enfermedad y del microorganismo posiblemente involucrado. Esto se realiza con la

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finalidad de aumentar las posibilidades de recuperar y aislar el agente etiológico. 3. Obtener la suficiente cantidad de muestra para llevar a cabo todas las pruebas.

4. Utilizar dispositivos de recolección, recipientes para las muestras y medios de transporte adecuados para asegurar el óptimo aislamiento de los microorganismos.

5. Siempre que sea posible, se deberán obtener las muestras clínicas antes de la administración de antibióticos.

6. El envase o los dispositivos de recolección de muestras clínicas deberán estar correctamente rotulados y fechados.

Toma de muestra faríngea

1. Tome dos hisopos estériles, un tubo de solución salina estéril, una placa de agar y dos portaobjetos. 2. Pida a su compañero (a) que abra la boca

3. Baje la lengua de su compañero utilizando bajalenguas

4. Con un hisopo remojado en la solución salina, proceda a raspar las paredes de la faringe rotándolo para cubrir toda su superficie. Debe ser profundo, de lo contrario se llenará de saliva o se contaminará con la flora normal del tracto digestivo

5. Raye el agar con el hisopo utilizado y descarte el hisopo

6. Repita la toma de muestra con el otro hisopo y realice un extendido en ambos portaobjetos 7. Realice una tinción de Gram a los extendidos

Toma de muestra cutánea

1. Retire la hoja de bisturí del empaque.

2. Flamee la hoja para asegurarse de su esterilidad (lo óptimo es contar con un bisturí sin filo, sin embargo, la llama poco a poco va removiendo el filo).

3. Raspe el área infectada o de interés en ángulo menor a 90 grados, para evitar cortaduras.

4. El movimiento debe ser ascendente, con el fin de que las escamas de piel que se desprendan queden retenidas en el bisturí y no se pierdan o propaguen el patógeno.

5. Después de unos raspados, introduzca el bisturí en un agar nutritivo, realizando cortes hasta el fondo para inocularlo.

6. Continúe raspando y coloque el raspado en un portaobjetos con KOH al 20%. 7. Observe al microscopio e identifique estructuras fúngicas.

Lectura de Placas

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Tema 5: incógnitas prueba práctica Materiales • Portaobjetos • Cubreobjetos • Tubos de ensayo • Microscopio • Medios de cultivo • Cultivo mixto • Asas bacteriológicas • Mechero Procedimiento

Siga las instrucciones de su docente, y analice las muestras si es necesario realice tinciones o el cultivo de los microorganismos que le correspondieron, utilizando las técnicas estudiadas en los laboratorios vistos. Curso: Métodos de Laboratorio Clínico

Competencias

Conoce y aplica los conocimientos básicos de la microbiología, bacteriología, micología, virología, parasitología, preparación de reactivos clínicos y asistencia en los métodos de laboratorio que desarrolla el Microbiólogo demostrando una alta comprensión integral del fenómeno de la Salud permitiendo desarrollar con esto, un alto sentido de la ética profesional.

Tema 1: Flebotomía

Objetivo específico:

Aplicar todas las partes de una correcta técnica para la obtención de muestras sanguíneas.

Descripción

La flebotomía o toma de muestra sanguínea es una técnica imprescindible que debe ser dominada por todo personal de laboratorio, pues de ésta manera será la obtención de la mayoría de las muestras que se procesarán.

Es un procedimiento delicado ya que es invasivo, por lo cual se debe realizar con sumo cuidado y certeza, al igual que mantener los cuidados asépticos para evitar posteriores complicaciones de los pacientes. En las muestras sanguíneas es de gran importancia considerar los tubos que se utilizarán según las pruebas solicitadas. Así tendremos, a grandes rasgos, que el tubo rojo (sin anticoagulante, con factores promotores de la coagulación) se utilizará para obtener suero y procesar química clínica y hormonas, el tubo morado (EDTA como anticoagulante) principalmente para hematología y grupos sanguíneos, los celestes (citrato como anticoagulante) se utilizarán para pruebas de coagulación, por mencionar los principales.

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El dominio de la técnica no se obtiene rápidamente, se requiere seguridad y mucha práctica, por lo que se recomiendan diversas dinámicas para familiarizarse con el equipo, por lo que en el laboratorio se cuenta con simuladores de brazos para mayor facilidad.

Drenaje venoso del Brazo

Es importante conocer la anatomía venosa del brazo, aunque no hay un patrón establecido podemos ver como a nivel de la fosa del codo tenemos las dos venas, cefálica y basílica. En medio, estas se van a comunicar a través de la vena mediana del codo, la cual se usa usualmente para tomar la muestra de sangre. A nivel de la fosa cubital, las venas superficiales pueden variar.

• Forma de H: la mediana del codo (a veces llamada mediana cubital) solo une las venas cefálica y basílica.

• Forma de M: se da una v. mediana cefálica, una v. mediana basílica y una v. mediana del antebrazo. Esta última se origina de las venas del carpo y asciende por la línea media para comunicar a la cefálica con la basílica. Materiales • Tubos rojos • Tubos morados • Torniquete • Algodones • Alcohol • Aguja • Adaptador

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Procedimiento

Flebotomía

1. Tome el brazo y coloque el torniquete fuertemente en la parte superior del mismo aproximadamente 10 centímetros por arriba del sitio seleccionado, para visualizar mejor las venas.

2. Palpe la vena que va a punzar.

3. Humedezca un algodón con alcohol al 70% y limpie el área de punción en forma de “C” hacia afuera. 4. Permita que el alcohol seque.

5. Coloque la aguja en el lado afuera del adaptador y un tubo en la parte interna del mismo.

6. Sin volver a palpar, realice la punción de la vena en un movimiento recto con el bisel de la aguja siempre hacia arriba, rápido y seguro

7. Sostenga firmemente el adaptador y presione el tubo para que inicie el vacío y obtenga la muestra. 8. Una vez lleno el tubo, retírelo apoyando el pulgar en el adaptador y coloque otro tubo.

9. Una vez finalizado, retire el tubo, retire el torniquete y coloque un algodón seco sobre el sitio de punción.

10. Presionando suavemente el algodón, retire la aguja rápidamente y en un solo movimiento. 11. Indique al paciente sostener el algodón durante 5 a 10 minutos posterior a la punción.

Interpretación

1. El torniquete debe ser colocado fuertemente para que las venas realmente sobresalgan.

2. El movimiento a la hora de limpiar pretende que no se arrastre contaminación hacia el sitio de punción, sino fuera de él.

3. Es necesario dejar que el alcohol seque, de lo contrario el paciente puede sentir un gran ardor a la hora de tomar la muestra y la sangre podría hemolizar, impidiendo que se puedan realizar muchas pruebas.

4. El algodón se debe sostener durante 5 a 10 minutos posterior a la punción para evitar la formación de hematomas.

Tema 2: Procesamiento de muestras de orina y de heces

I- Procesamiento de muestras de orinas Objetivo específico

Reconocer los pasos para llevar a cabo un examen general de orina

Descripción

Las muestras de orina proveen gran cantidad de información acerca del funcionamiento del sistema renal de los pacientes. Tiene la ventaja de no ser invasiva, de fácil obtención y de poder ser tomada directamente por el paciente.

Como toda muestra se le debe indicar al paciente los cuidados a la hora de tomarla, como que sea la primera orina de la mañana y descartar el primer chorro antes de comenzar a recolectar.

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Usualmente un examen general de orina (EGO) consta de dos fases: La utilización de tiras reactivas para determinaciones químicas básicas y la observación del sedimento urinario, con el fin de determinar la presencia de estructuras de importancia como leucocitos, eritrocitos, cristales, entre otros.

Materiales • Tubos de ensayo • Tiras reactivas • Portaobjetos • Cubreobjetos Procedimiento Tiras reactivas

1. Homogenice la orina en el frasco

2. Trasvase una pequeña cantidad a un tubo de ensayo, cerca de unas ¾ partes de su capacidad

3. Sumerja una tira reactiva en la orina de modo que se cubran todos los cuadros reactivos, no descarte la orina

4. Seque el excedente de orina de la tira tocando de costado sobre un papel toalla 5. Espere 1 minuto y lea los colores comparando con el frasco.

Observación del sedimento urinario

1. Tome el mismo tubo con orina utilizado anteriormente y centrifugue durante 5 minutos a 1500 rpm (con el adecuado uso de la centrifuga)

2. Decante el sobrenadante en un movimiento ágil y seguro 3. Resuspenda el sedimento con la última gota

4. Coloque una pequeña gota del sedimento resuspendido sobre un portaobjetos y coloque un cubreobjetos encima

5. Observe con lente de 40X y observe por estructuras de interés

Interpretación

• Se debe secar el excedente de las tiras reactivas con el fin de que los colorantes no se pasen entre cuadros y no causen coloraciones indebidas.

II- Procesamiento de muestras de heces Objetivo específico

Reconocer los pasos básicos para el montaje y procesamiento de muestras de heces.

Descripción

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vías de desarrollo. Éstos pueden causar una amplia gama de patologías, desde gastroenteritis, diarreas, desnutrición por malabsorción; hasta patologías más severas como hepatopatías fulminantes e incluso encefalopatías.

La mayoría de los parásitos intestinales pueden ser encontrados e identificado en muestras de heces, de lo cual radica la importancia de la técnica apropiada para su montaje y la pericia a la hora de observar al microscopio.

El montaje al fresco consta de un análisis en solución salina, en donde se pueden ver formas móviles (trofozoítos) y estructuras como cromatoidales, presentes en quistes de algunas amebas; a su vez, se realiza un montaje en lugol, el cual funciona como una tinción negativa, en donde las estructuras internas de los protozoarios se verán mejor sus estructuras internas por contraste.

El montaje al fresco tiene una mayor importancia en la observación y detección de protozoarios, sin embargo, para helmintos la técnica más adecuada es la concentración de Kato. En ésta, se coloca una pequeña porción de heces sobre un portaobjetos y se coloca sobre él una tira de papel celofán sumergido en solución de Kato (verde malaquita con glicerol). Luego se presiona contra un papel para distribuir la muestra en una capa delgada.

Se deja secar de 5 a 10 minutos, con el fin de que se decoloren los detritos de la muestra, mas no así los huevecillos de helmintos. Se observa al microscopio con lente de 10X o 40X.

Materiales • Muestras de heces • Solución salina • Lugol • Portaobjetos • Cubreobjetos • Reactivo de kato Procedimiento Montaje al fresco

1. Coloque una gota de solución salina y una de lugol en lados opuestos de un portaobjetos 2. Con un palillo de madera, proceda a picar varias veces la muestra de heces en diferentes zonas 3. Coloque una muy pequeña porción en la solución salina y homogenice

4. Quiebre el palillo o cámbielo y repita en el lugol 5. Coloque cubreobjetos en ambos

6. Observe al microscopio con lente de 40X en busca de amebas

Concentración de Kato

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2. Coloque sobre la muestra, una tira de papel celofán con reactivo de Kato

3. Presione el portaobjetos contra un papel toalla para distribuir la muestra en una capa delgada 4. Deje secar durante 10 minutos

5. Observe con lente de 10X en búsqueda de huevecillos Tema 3: Observación del sedimento urinario

Descripción

Las muestras de orina proveen gran cantidad de información acerca del funcionamiento del sistema renal de los pacientes. Tiene la ventaja de no ser invasiva, de fácil obtención y de poder ser tomada directamente por el paciente. El análisis en el laboratorio clínico tiene gran parte de acción del laboratorista ya que la observación del sedimento urinario es esencial para el reporte del Examen General de Orina (EGO). El reporte se realiza por campos de visión se deben observar al menos 15 campos para poder dar un reporte asertivo, y en aumento de 40X.

Una amplia gama de elementos puede observarse en el sedimento urinario, pueden formarse a lo largo de todo el tracto urinario o desde el glomérulo hasta la uretra, pero también podemos tener contaminantes como, por ejemplo: sangre de menstruación, espermatozoides, fibras, gránulos de almidón, fluidos vaginales (mucus en exceso)

Podemos observar elementos celulares, como leucocitos y eritrocitos que se reportan en número exacto, realizando un promedio de los que se hayan observado por campo (2, 5, 10…), también tenemos las células epiteliales, estas se reportan por cantidad (escasas, pocas, muchas o abundantes).

Los microorganismos oportunistas como bacterias, levaduras y trichomonas pueden estar presentes y su hallazgo no siempre es anormal, pero en cantidades abundantes si corresponden a procesos patológicos. Otros hallazgos pueden ser precipitados químicos, estos corresponden a los cristales y el sedimento amorfo, que se relacionan con el pH de la orina.

Los cilindros, que se observan para poder visualizarlos de mejor forma en 10X, son formados en el lumen de los túbulos renales y se evacuan con la orina.

Identificar y reportar de forma adecuada un sedimento urinario, nos ayuda a monitorear al paciente y alguna posible afectación que este presentando.

En el reporte final del EGO deben estar siempre

Leucocitos Eritrocitos

Células epiteliales Bacterias

Y cualquier otro hallazgo

Materiales

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• Tubos de ensayo • Tiras reactivas • Portaobjetos • Cubreobjetos • Centrifuga • Microscopio

Observación del sedimento urinario

1. Tome el mismo tubo con orina utilizado anteriormente y centrifugue durante 5 minutos a 1500 rpm 2. Decante el sobrenadante en un movimiento ágil y seguro

3. Resuspenda el sedimento con la última gota

4. Coloque una pequeña gota del sedimento resuspendido sobre un portaobjetos y coloque un cubreobjetos encima

5. Observe con lente de 40X y observe por estructuras de interés

Interpretación

• No se debe centrifugar a más de 1500 rpm, pues se pueden destruir cilindros presentes en la muestra. Tema 4: Toma de muestra de hongos

Descripción

Los hongos son organismos eucariotas que comprende gran cantidad de especies (se cree que hay más de millón y medio), las infecciones causadas por hongos de denominan micosis. Los causantes de las micosis son aproximadamente 100 especies.

En nuestras mucosas tenemos hongos endógenos, que en condiciones normales no causan afectaciones, como las candidas. Los exógenos llevan su vida fuera del ser humano y algunos son parásitos obligatorios como los dermatofitos, otros según las condiciones pueden afectar al ser humano. Los hongos exógenos y algunas levaduras se conocen como el grupo de los hongos oportunistas.

El procesamiento de muestras para micología médica contempla la recolección de la muestra, el examen directo, los cultivos y la identificación del agente etiológico.

Para asegurarse de que el trabajo de laboratorio sea de calidad, debemos recolectar la muestra de la manera más apropiada, así como su transporte y almacenaje, si fuera necesario. El primer paso es fundamental para el diagnóstico de las enfermedades micóticas, ya que muestras insuficientes, no respectivas o contaminadas, pueden causar fallos en el diagnóstico.

Las muestras deben obtenerse en condiciones asépticas, luego de una limpieza apropiada del área de trabajo. La cantidad de muestra es fundamental, ya que debe ser suficiente para realizarse exámenes directos y cultivos.

Toda muestra debe acompañarse con los datos del paciente, nombre, edad, sexo y uso de antimicóticos previos; además de los datos del material biológico como tipo de muestra y hora de la recolección.

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Materiales • Bisturí • Placas Petri • Portaobjetos • Cubreobjetos • KOH 10% y 40% • Microscopio Procedimiento

Toma de muestra piel

• Raspar cuidadosamente las lesiones con un bisturí sin filo.

• Depositar en una placa de Petri estéril o se montan directamente en una lámina con 1 o 2 gotas de KOH al 10 o 20% y se coloca el cubreobjetos.

Toma de muestra uña

• Antes de recolectar la muestra, se puede limpiar el área afectada con alcohol y dejar evaporar. • Raspar la zona de la uña donde se observa la lesión, obtener lo que se deposita debajo y en las orillas de las uñas afectadas, utilizando un estilete acanalado o un bisturí.

• Depositar en una placa de Petri estéril o se montan directamente en una lámina con 1 o 2 gotas de KOH al 40% y se coloca el cubreobjetos.

Observación con KOH

• Depositar una gota de KO al 10,20 o 40% sobre un portaobjeto limpio.

• Recolectar suficiente material de la lesión, depositaria en el KOH y colocar un cubreobjetos. Nota: el KOH es caústico por lo que si se hace el montaje mientras se recolecta la muestra al paciente, se debe limpiar el bisturí luego de que entra en contacto con el KOH, antes de obtener más muestra.

• Calentar ligeramente la preparación sin llegar a ebullición y presionar el cubreobjetos para distribuir la muestra en una capa fina. Para aclarar detritos y material queratinoso que pueden interferir en la observación de elementos fúngicos.

• Observar en el microscopio en bajo y alto poder, cerrando el diagrama ligeramente para obtener una buena profundidad de campo.

I- Prueba práctica

Procedimiento

Siga las instrucciones de su docente, y analice las muestras entregadas. Coloque en su reporte todo lo necesario.

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Curso: Preparación de Reactivos Clínicos

Competencias

1. Conoce y aplica los conocimientos básicos de la microbiología, bacteriología, micología, virología, parasitología, preparación de reactivos clínicos y asistencia en los métodos de laboratorio que desarrolla el Microbiólogo demostrando una alta comprensión integral del fenómeno de la Salud permitiendo desarrollar con esto, un alto sentido de la ética profesional.

Tema 1: I- Uso de la pipeta y la micropipeta.

Objetivo específico

Practicar el correcto uso y manipulación de la pipeta y micropipeta.

Descripción

Como se ha mencionado anteriormente, la cristalería es un equipo fundamental del laboratorio. Sin embargo, es imprescindible su correcto uso, en especial en Química Clínica, en donde se requiere una exactitud analítica y no puede haber pequeños errores, ya que repercutirían grandemente en el resultado final de las determinaciones.

Los principales implementos que se utilizan son los volumétricos, ya que la mayoría de la química manual es líquida y principalmente, se utilizan las pipetas y micropipetas. Éstas requieren ciertos cuidados a la hora de utilizarlas, como aforar correctamente, evitar el error de paralaje y limpieza de la punta antes de verter. Además, si se realizan diluciones seriadas, se debe cambiar la punta o la pipeta entre cada dilución, pues éstas pueden generar arrastre a las diluciones siguientes e interferir con la concentración real final de éstas.

En Química Clínica muchas determinaciones se realizan mediante curvas de calibración, es decir, se procesan patrones con concentración conocida y se mide su absorbancia para genera una gráfica, luego se mide la muestra y se interpola el resultado de la concentración.

Es de gran importancia en estos casos, la correcta manipulación del equipo, dado que cualquier error en la medición de algún patrón, causará un error en las determinaciones finales de las muestras.

Materiales • Pipetas • Micropipetas • Puntas de micropipeta • Tubos de ensayo • Kit de glucosa • Espectrofotómetro • Equipo de sangrado • Muestras en tubo rojo

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Procedimiento Uso de la pipeta

1. Tome un beaker con agua, un tubo de ensayo, una hoja de papel toalla, pipeta graduada y una pera 2. Monte la pipeta y la pera, vaciar el balón de la pera

3. Sumerja la pipeta en el beaker con agua y proceda a llenarla por encima del 0mL (cero mililitros) 4. Si se forman burbujas, descarte y comience de nuevo

5. Saque la pipeta del agua y seque la punta de la pipeta con papel toalla, con cuidado de no tocar el centro, ya que absorbería el líquido del interior de la pipeta

6. Proceda a verter agua lentamente hasta que se alcance la marca del 0mL (Aforar) 7. Vierta en el tubo de ensayo 1.5mL de agua

8. Descarte el resto del agua de vuelta al beaker

Uso de la micropipeta

1. Tome un beaker con agua, un tubo de ensayo, una hoja de papel toalla, micropipeta y puntas del tamaño adecuado para la micropipeta

2. Coloque la punta en la micropipeta 3. Gradúe la pipeta a 500uL

4. Presione la micropipeta hasta el primer paso, sumerja la punta de la micropipeta en el beaker con agua y suelte lentamente para llenar la punta

5. Si se forman burbujas, descarte y comience de nuevo

6. Seque la punta de la micropipeta con papel toalla, con cuidado de no tocar el centro, ya que absorbería el líquido del interior

7. Vierta el volumen lentamente en el tubo de ensayo, presionando hasta el segundo paso para “soplar” la última gota

8. Descarte el resto del agua en el beaker y la punta en el descartador correspondiente II- Lavado, preparación y esterilización de cristalería

Objetivo específico

Practicar los métodos de preparación, desinfección y esterilización de la cristalería.

Descripción

La cristalería forma parte del equipo básico de trabajo en cualquier laboratorio clínico. Su uso se puede extender a prácticamente todas las ramas de la Microbiología y la Química Clínica y, dependiendo de ello, deberá cumplir con ciertas características que la hagan óptima para su uso.

En todos los casos, la cristalería deberá estar lavada y desinfectada, para reducir los riesgos infecciosos hacia el personal que lo manipula, en caso de accidente. Sin embargo, si se destinará a uso Bacteriológico o Micológico, no basta con que esté desinfectado, sino que requerirá estar también estéril.

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reducir la carga microbiana viable que se encuentra sobre él. Por otra parte, un material estará estéril cuando se ha aplicado por el uno o varios métodos que permiten garantizar que hay ausencia total de microorganismos viables.

Antes de realizar el lavado de la cristalería, ésta debe estar autoclavada (en caso de que haya se haya utilizado para contener material biológico) y dejarse previamente al menos 24 horas sumergida en una solución de cloro y jabón, con el fin de que se dé una desinfección adecuada.

De ahí que el correcto lavado y preparación de la cristalería, así como de la disolución desinfectante, influyen directamente, tanto en la seguridad del personal, como en el resultado final que se obtendrá en los ensayos. Materiales • Tubos sucios • Pipetas sucias • Puntas sucias • Jabón • Cloro • Probetas • Beakers Procedimiento

Preparación de la solución desinfectante (de reposo)

1. Mida 10mL de jabón y 10mL de cloro al 3% y agréguelos a 1L de agua de tubo

Preparación de la solución de lavado

1. Mida 10mL de detergente tensoactivo no tóxico y agréguelo en 1L de agua de tubo, ésta será la solución de trabajo para realizar el lavado de la cristalería

Lavado de la cristalería y puntas

1. Sumerja el hisopo en la solución de trabajo

2. Proceda a hisopar la cristalería para lavarla, debe repetirse al menos 5 veces

3. Enjuague en forma minuciosa para eliminar todos los restos de jabón, de lo contrario podría quedar precipitado de jabón a la hora de secar

4. Enjuague una última vez con agua destilada

5. Coloque la cristalería en una bandeja y seque en horno a 250°C durante 20 minutos (excepto las puntas que se dejan secando a temperatura ambiente)

6. Saque la bandeja caliente con un guante térmico y deje que los tubos alcancen la temperatura ambiente

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