MEMORIA DE PRÁCTICAS DE EMPRESA
LABORATORIO EQM
María Ángeles Curto
El laboratorio EQM realiza análisis de aguas y productos alimenticios. Las muestras normalmente son traídas por los clientes en envase estéril, a excepción de las aguas residuales y las mieles para hallar conductividad. En ocasiones nosotros mismos hemos recogido las muestras en piscinas o cocinas.
Todas las muestras son registradas para poder llevar un control y posteriormente se procede al análisis microbiológico porque la cantidad de microorganismos puede verse modificada en un espacio de tiempo corto. Posteriormente se procede a analizar los parámetros fisicoquímicos. En el caso en que la muestra no pudiera ser procesada en el momento es almacenada en frío para frenar el crecimiento de microorganismos.
Una vez realizados los análisis pertinentes los resultados se introducen en el ordenador que mediante aplicaciones matemáticas hallará el resultado final que aparece en el informe que recibe el cliente.
ANÁLISIS DE POTABILIDAD DE AGUA
A. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO:
Es lo primero que se realiza nada más abrir el envase estéril.
Se busca presencia de:
- Streptococos fecales: el medio que se emplea es Slanez-Bartley (SB) y se deja incubando 48h a 37ºC. Las colonias positivas son puntos rojos.
- Coliformes: se utiliza agar TTC y se incuban 24h a 37ºC para recuento de los totales y 44ºC para los fecales. Las colonias amarillas con un halo serón sospechosas, y para confirmarlas se sembrará en caldo lactosado; si a las 48h aparece turbidez y gas en la campana de Durham serán coliformes ya que fermentan lactosa.
- Aerobios: se pone 1ml de muestra sobre petrifilm® y se incuba a 37ºC durante 48h.
En el caso de streptococos y coliformes la siembra se lleva a cabo filtrando 100ml de muestra en una membrana.
B. ANÁLISIS FISICO-QUÍMICO:
- pH: se mide con el pHmetro, previamente calibrado (potenciometría) - Conductividad: con el conductímetro igualmente calibrado (electrometría).
- Color: mediante comparación con agua desionizada sobre fondo amarillento en una escala del “color test” Aquaquant de Merk.
- Turbidez: utilizando el trubidímetro que antes debe ser calibrado.
- Concentración de amonios: se toman 5ml de la muestra, se añade 0,5 ml de reactivo Nessler A, se espera 10 min y se añade 0,5 ml de reactivo Nessler B. Se mide en el espectrofotómetro a una longitud de onda de 425nm.
- Concentración de nitritos: a 5ml de la muestra se añaden 0.5 ml de reactivo de Zambelli, se espera 5 min y se añaden otros 0.5 de amoníaco. Se mide la absorbancia a 435 nm.
- Concentración de nitratos: a 50 ml de muestra se le añade 1 ml de HCl 1M y se mide en el espectrofotómetro utilizando luz ultravioleta, a 220 y 275 nm.
- Oxidabilidad: para medir la materia orgánica. Se toman 100ml de muestra y se le añaden 5ml de ácido sulfúrico al 25% y 10 ml de permanganato potásico. Se deja hervir, se echan 10ml de ácido oxálico y se valora en caliente con permanganato potásico.
ANÁLISIS DE AGUA DE PISCINA:
A. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO:
Se realizan las mismas siembras que para el análisis de potabilidad.
Una vez al mes también se buscan:
- Staphilococos: se emplea medio BP y se incuba 24h a 44ºC. Las colonias positivas serán moradas y con gas alrededor.
- Pseudomonas: en medio CromoCen AGN. Las colonias positivas son rosas anaranjadas con halo.
- Aerobios: También sobre petrifilm pero se incuban a 22ºC En este caso la cantidad de muestra filtrada es 250ml.
B. ANÁLISIS FISICOQUÍMICO:
- Cloro: se toman 10ml de muestra, se añade 0,5ml de tampón cloro otros 0,5ml de DPD y se determina el cloro libre midiendo absorbancia a 515 nm. Posteriormente se añade una espátula de KI y midiendo con la misma longitud de onda se determina el cloro total. Es lo primero que se debe hacer después de sembrar el agua ya que el cloro es muy volátil y los resultados se pueden alterar.
- pH: pHmetro.
- Conductividad: conductímetro - Turbidez: turbidímetro
- Oxidabilidad: perganimetría.
- Amonios: espectroscopia de absorción Nessler.
- Nitratos: espectroscopía de absorción UV.
OTROS ANÁLISIS DE AGUA:
Se realizan a petición del cliente.
CONCENTRACIÓN DE HIERRO:
Se toman 50ml de muestra y se añaden bolitas de vidrio, 1ml de hidroxilamina y 2ml de HCl al 37%.
Se pone a hervir hasta reducirlo a unos 25ml. Después se deja enfriar a temperatura ambiente y se pasa a un tubo Nessler. Se añade 10ml de fenaltrolina y otros 10ml de tampón AcOH/NH3Ac.
Se enrasa a 50ml y se mide la absorbancia a 510nm.
CONCENTRACIÓN DE ARSÉNICOS:
En un erlenmeyer pipeteamos 50ml de muestra, 10ml de HCl, 2ml de KI, y 0,5ml de SnCl2
Se deja reposar 15 minutos y se añaden 3g de Zn.
Se introduce lana de vidrio en un tubo curvado abierto por ambos lados que es una especie de refrigerante y se empapa con acetato de plomo.
Se añade la piridina, y este tubo se coloca encima del erlenmeyer. Se lleva a la estufa de 20ºC en agitación y se deja 30 minutos.
En la reacción se produce H que asciende y reacciona con el acetato de plomo formándose SnH (arsenina). Ésta reacciona con la piridina que contiene dimetil carbamato y forma un compuesto rojo que es lo se mide al espectrofotómetro a 535nm.
CONCENTRACIÓN DE CLORUROS:
Se toman 100ml de muestra y se valoran con nitrato de palta 0,01M. Se utiliza como indicador 1ml de cromato potásico.
El cambio de color es de amarillo a marrón anaranjado.
CONCENTRACIÓN DE CALCIO:
Se toman 25ml de muestra, se le añaden 2ml de NaOH 1N y una espátula pequeña de muresina que es el indicador.
Se valora con complexona III. El cambio de color es de rosa a morado.
CONCENTRACIÓN DE MAGNESIO:
A 25ml de la muestra se le añade 2ml de un tampón que lleva amoniaco y proporciona un pH de 10. Se adiciona una espátula de indicador net y se valora con complexona.
El viraje de color es de rosa a azul.
Siembra de Legionella:
En aguas procedentes de fuentes.
Se toma muestra en un tubo estéril y se calienta a 64ºC para matar a los demás microorganismos y con un asa se siembra en el medio legionella GVPC. Las colonias positivas son blancas con un halo alrededor.
ANÁLISIS DE AGUAS RESIDUALES:
- pH: pHmetro.
- Conductividad: conductímetro - Turbidez: turbidímetro
DEMANDA BIOLÓGICA DE OXÍGENO (DBO):
Se realiza con un biómetro que mide la presión parcial.
Se introduce la muestra en el frasco del biometro junto con 20 gotas de alliltiourea, que inhibe la nitrificación, y una pastilla NaOH para la captura del CO2 producido. El frasco se incuba durante 5 días a 25 ºC con agitación suave.
La depresión registrada por el biómetro en estas condiciones es exclusiva del consumo de oxígeno para la degradación de la materia orgánica por parte de los microorganismos.
DEMANDA QUÍMICA DE OXÍGENO (DQO):
Se toman 10ml de muestra, se añaden 15ml de reactivo DQO, una espátula de Hg2SO4, y 5ml de K2Cr2O7 y se dejan en el digestor 2h a 180ºC.
Se vierten unas gotas de formalina a la muestra que actúa como indicador y se valora con SAF.
El cambio de color es a rojo.
SÓLIDOS EN SUSPENSIÓN:
Se deseca el filtro introduciéndolo en la estufa a 110ºC se apunta su peso.
Se filtra muestra hasta que se sature el filtro y se apunta ese volumen de agua.
Se deja el filtro una media hora en la estufa a 110ºC una media hora y se apunta el peso final.
Al hacer la diferencia con el peso del filtro solo sabremos qué cantidad de sólidos hay en el volumen de agua que hemos filtrado.
KJELDAR:
Para calcular el N total.
Se toman 25ml de muestra y se le añaden perlas de vidrio, media pastilla de catalizador y 10ml de ácido sulfúrico.
Se deja en el digestor 1h a 225ºC y otra hora a 400ºC.
Para la valoración se ponen 25ml de ácido bórico en un erlenmeyer, 10ml de NaOH al 40% en una probeta y el tubo con la muestra que se ha enrasado hasta 5oml con agua. Se enciende el dispositivo que da vapor y cuando el contenido del tubo hierva se enciende el dispositivo que deja caer el NaOH hasta que la muestra cambie de color. El vapor continúa encendido hasta que se hayan destilado 100ml de muestra.
Se valora con HCl 0,1N utilizando indicador mixto. El viraje de color es de verde a rosa.
ANÁLISIS DE MIELES:
A. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO:
En una bolsa estéril se pesan 25g de la muestra, se añaden 225ml de agua de peptona y se introduce en el stomacher para que se mezcle bien.
A partir de esta mezclan se realizan las siembras de:
- Enterobacterias: en medio agar bilis cristal violeta y glucosa (VRBG) que se prepara en el momento y se vierte sobre 1ml de muestra para que solidifique. Como las enterobacterias son anaerobias se debe verter otra capa de medio para crear las condiciones de anoxia. Se incuba 24h a 37ºC, las colonias positivas son rojas con un halo alrededor.
- Clostridium perfringens: se siembra en SPS que está ya preparado y solo hay que calentarlo. Se siembra en el mismo tubo 1ml de abajo a arriba para conseguir anoxia y se enfría rápidamente en agua. Se incuba a 44ºC 24h. Si es positivo aparecerán colonias negras y el agar partido ya que producen gas.
- Staphylococcus aureus: el medio utilizado es BP y a está preparado en la nevera y solo hay que verter sobre la placa 0,1ml de muestra y extenderla con el asa de siembra. Se incuba a 37ºC durante 48h. Las colonias son presuntamente positivas si son negras con un halo transparente y han de confirmarse en DNAsa.
- Mohos y levaduras: ambos se siembran en YGC que ya está preparado, se debe calentar y cuando este líquido se vierte sobre una placa de petri que contiene 1ml de muestra. Se incuban entre 5 a 7 días a 22ºC. Las colonias positivas son negras.
- Escherichia coli: se siembra 1ml de muestra en petrifilm ® y se incuba a 44ºC durante 24h. Las colinas positivas negras muy pequeñas con gas.
- Aerobios: se siembran al igual que en análisis de agua en petrifilm® pero en este caso se incuban 72h a 31ºC.
- Salmonella: la bolsa con la muestra restante se incuba 24h a 37ºC para enriquecimiento en agua de peptona. Al día siguiente se realiza la resiembra de 1ml en caldo Rappaport que se incuba 24h a44ºC. Será posible positivo si el color torna de azul a verdoso, y para confirmarlo habrá que pasar por siembra por asa 1ml sobre XLD, éste se incuba 24h a 37ºC. Es un medio selectivo y las colonias sospechosas serán rosadas con el centro negro.
B. ANÁLISIS FISICOQUÍMICO:
SÓLIDOS INSOLUBLES:
Se pesan 20g de la muestra de miel y se disuelven en 50ml de agua.
Se debe ajustar el pH a 8-9 con sosa 1N.
El crisol previamente ha sido desecado en la estufa a 110º durante 2h y posteriormente enfriado en el desecador. Su apunta su peso y se filtra a través de él la muestra con 500ml de agua caliente.
El crisol se introduce en la estufa 2 horas a 110º
Pasado ese tiempo se saca de la estufa, se pesa y la diferencia con el peso antes del filtrado serán los sólidos.
CONDUCTIVIDAD:
Se mide la humedad de las distintas muestras con el refractómetro y con esos datos el ordenador nos da la cantidad de muestra que se debe pesar.
Se disuelve esa cantidad en un poquito de agua caliente y se enrasa en el tubo Nessler que hace 50 ml.
Se mide la conductividad en el conductímetro en modo continuo a una temperatura de 20ºC.
ACTIVIDAD DIASTÁSICA:
Para ver la frescura de la miel.
Se disuelve 10g de la muestra en 25ml de agua y se añaden 5ml de tampón HAcO/NaAcO (pH 4.5).
Antes de enrasar en Nessler se añaden 3ml de NaCl 0.5M.
Se cogen 6 tubos de ensayo, dos de ellos se colocan delante en la gradilla, uno lleva 5ml de agua destilada y el otro 5ml de la muestra.
En los otros cuatro de echan 5ml de agua con 10ml de iodo 0.0007N.
Todo ello se mantiene en una baño a 40ºC 10 minutos junto con el bote que contiene una disolución de almidón comercial.
Se pasa 1ml del tubo de adelante con agua al blanco, y 1ml de la muestra a los tres restantes.
Se ponen 5ml del almidón en otro tubo y se pasa 1ml al blanco y se mide en el espectrofotómetro. A las muestras también se le añade 1ml de almidón 1 minutos después, 7 y quince.
Las amilasas que contenga la miel hidrolizan el almidón y el iodo reacciona con la glucosa libre dando color a la disolución por lo que la reacción puede ser seguida con el espectrofotómetro realizando una lectura a 660nm.
AZÚCARES:
Se disuelven 2g de la muestra en 25 ml de agua y se lleva a un matraz de 200 para enrasar con agua.
De aquí se toman 50 ml para verterlos en un vaso de precipitados y otros 50 ml se llevan a un matraz de 100ml y se enrasa.
Al vaso se le añaden 10ml de HCl 6N, 5ml de Fehling A, otros 5ml de Fehling B y se lleva a 64ºC. Después se deja enfriar y se ajusta el pH a 6-7 con NaOH. Se pasa a un matraz de 100ml y lo llevamos a valorar.
La bureta se llena con el contenido del matraz y la valoración se realiza sobre la placa caliente.
Al matraz se le añaden dos gotas de una solución acuosa se azul de metileno al 1% y se dejan caer gotas de la bureta hasta que la solución vire de azul a amarillo.
Anotamos el volumen gastado y posteriormente se realizaran los cálculos necesarios.
HMF:
Es la determinación del hidroximetilfurfaral.
Se pesan 5g de muestra y se disuelven en 25ml de agua. Se pasa al matraz y se añade 0,5ml de reactivo Carrez I y otros 0,5ml de reactivo Carrez II. Se enrasa a 50ml y se agita.
Se filtra con embudos y papel de filtro.
Los primeros 5ml se desechan, y se toman otros 5ml para la muestra y para el blanco.
A la muestra se le añaden 5ml de agua destilada.
Al blanco 5ml de hidrgonosulfito.
Se lee a 284 y 336nm.
CENIZAS:
Se pesa el crisol y se anota el peso inicial.
En él se ponen 5g de miel y se introduce en la estufa hasta caramelización, antes se han puesto unas gotas de aceite de oliva para que caramelice y por si explota lo que se pierda no sea muestra.
Se introduce en la mufla hasta obtener cenizas blancas y se pesa. La diferencia con el peso inicial serán las cenizas.
F-G:
Es el contenido en fructosa y glucosa.
El análisis se lleva a cabo utilizando un kit comercial consistente en un método cinético enzimático.
Se disuelven 0,250g en un matraz de 200 ó 0,300 en un matraz de 300 y se introduce en un baño a 37ºC.
Se añade el reactivo 1 y a los tres minutos se lee en el espectrofotómetro a 340nm.
Se añade el reactivo 2 y se lee a los 15 minutos.
Se agrega el reactivo 3 y los 15 minutos se realiza la última lectura.
ACIDEZ:
Se pesan 10g, se apunta el peso exacto y se disuelven en 50ml de agua.
Se llena la bureta con NaOH 0,05M y se programa el pHmetro en modo continuo. Cuando el pH esté estabilizado se abre la bureta para que gotee continuamente y cuando se alcance un pH de 8,5 se para y se apunta el volumen que se gasta.
ANÁLISIS DE PLATOS PRECOCINADOS:
Al igual que para las mieles se toman 25g de la muestra y se depositan en una bolsa estéril. Se le añaden 225ml de agua de peptona y se introduce en el stomacher las veces que sea necesario hasta que quede una papilla lo más homogénea posible.
Se siembra:
- Enterobacterias: en VRBG
- Clostridium: en SPS y solo si se trata de carne cruda.
- Staphylococcus aureus: en BP y se confirma en DNAsa. Se realiza una dilución de 1/100.
- Escherichia coli: en petrifilm ®
- Aerobios: en petrifilm®, en este caso se realiza una dilución 1/1000.
- Salmonella: cultivo de enriquecimiento en agua de peptona y resiembra en caldo Rappaport. Se confirma en XLD.
- Lysteria: Se resiembra al día siguiente 1ml en caldo Fraser y se incuba 24h a 37ºC. Si aparece turbidez se confirme en Palcam que se incuba 48h a 37ºC y las colonias positivas serán negras deprimidas en el centro.
En el caso de gaseosas se siembra la muestra sin diluir después de haberle quitado el gas.
Posteriormente se le añade el agua de peptona para enriquecimiento y poder realizar la resiembra de Salmonella y Lysteria.
PREPARACIÓN DE PLACAS DE SUPERFICIE:
Se utilizan para control de limpieza en establecimientos donde se trabaja con productos alimenticios.
Se prepara el medio correspondiente y se vierte un volumen conocido de 15ml en unas placas especiales. Con este volumen conseguimos que el medio no salga de la placa pero que sobresalga lo justo para poder tomar muestras de superficies.
Se preparan placas para:
- Aerobios: agar nutritivo - Enterobacterias: VRBG
- Staphylococcus aureus: Agar sal de manitol
El cliente se lleva las placas, toma la muestra y nos las trae para que las incubemos a 37ºC 24h.
El límite para enterobacterias es 1, para aerobios hasta 20.
A parte de las técnicas descritas, he realizado las tareas habituales de un laboratorio como limpieza del material, preparación de reactivos, de medios de cultivo y emplacaje, etc.
adquiriendo soltura en el uso del instrumental del laboratorio y observando cuestiones que hasta el momento solo había visto en teoría.
