UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO Facultad de Ciencias Biológicas
Programa de Segunda Especialidad en Ciencias Biológicas
Expresión Inmunohistoquímica de PD-L1 y PD-1 en pacientes con Linfoma Difuso de Células B Grandes diagnosticados en el Instituto Nacional de Enfermedades Neoplásicas,
Lima-Perú 2018-2020
TESIS PARA OPTAR EL TÍTULO DE SEGUNDA ESPECIALIDAD PROFESIONAL EN
LABORATORIO DE ANÁLISIS CLÍNICO Y BIOLÓGICOS
Autor: Blga. Villa Robles, María del Rosario Asesor: Dr. Barrionuevo Cornejo, Carlos Edmundo
Trujillo-Perú 2022
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DEDICATORIA
A mis padres, quienes juntos me inculcaron el respeto a la vida y a luchar por mis objetivos a pesar de las adversidades.
A mis adorados hijos, por quienes cada día agradezco el milagro de la vida y la bendición de tenerlos junto a mí.
A mis profesores quienes han sido ejemplo de dedicación y profesionalismo en cada una de sus especialidades.
A mi asesor, quien me inspiró a continuar con esta investigación y qu e compartir el conocimiento es fundamental en la vida de un profesional con vocación de servicio.
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MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR Y APROBACIÓN
Los profesores que suscriben, miembros del Jurado Examinador, declaran que el presente Informe de Tesis titulado ¨Expresión Inmunohistoquímica de PD-L1 y PD-1 en pacientes con Linfoma Difuso de Células B Grandes diagnosticados en el Instituto Nacional de Enfermedades Neoplásicas, Lima-Perú 2018-2020” ha cumplido con los requisito formales y fundamentales, siendo APROBADO por UNANIMIDAD.
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INDICE
DEDICATORIA ... ii
MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR Y APROBACIÓN... iii
INDICE ... iv
RESUMEN ... v
ABSTRACT ... vi
INTRODUCCIÓN... 1
MATERIALES Y MÉTODOS ... 6
DISCUSION ... 22
CONCLUSIONES ... 26
RECOMENDACIONES ... 27
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS... 28
ANEXOS ... 34
FORMATO DE DECLARACION JURADA ... 35
FORMATO DE AUTORIZACION DE PUBLICACION... 36
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RESUMEN
La expresión en porcentaje del ligando de la proteína de muerte programada 1 (PD-L1) en células neoplásicas y de PD-1 en los linfocitos del microambiente tumoral (MAT) de casos de linfoma difuso de células B grandes (LDCBG) mediante inmunohistoquímica (IHQ) cobran interés por su importancia en posibles terapias inmunológicas.
Se estudiaron 35 casos de una población peruana del Instituto Nacional de enfermedades Neoplásicas (INEN) determinándose la expresión de estas proteínas en biopsias embebidas en bloques de parafina mediante el método de IHQ buscándose la asociación con la SG y subtipo de LDCBG de acuerdo con la célula de origen, edad, sexo y estadio clínico (EC).
La edad promedio fue de 60.1 años, 57.1% hombres, 37.1% cursaron EC I y II, 48.6% en EC III y IV, y el 80.0% recibieron quimioterapia (QT). El 40.0% con subtipo célula B centro germinal (BCG) y 51.4% subtipo célula B activada (CBA). El 45.7% de casos presentaron positividad de PD-1 en linfocitos del MAT. El 77.1% de los casos expresó PD-L1 en las células neoplásicas, (62.5%) con alta expresión. Los casos PD-1 positivos en los linfocitos del MAT tuvieron mejor SG que los PD-1 negativos. No se encontraron otras diferencias significativas, excepto en los que recibieron QT. Se concluye que los casos que expresan PD-L1 en LDCBG es alto en comparación con otras series celulares, lo que podría tener implicancias favorables en el diseño de terapia con inhibidores de PD-1. La expresión de PD-1 por los linfocitos del MAT es un factor pronóstico favorable de SG.
Palabras claves: linfoma difuso de células B grandes, PD-L1, PD-1, supervivencia global.
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ABSTRACT
Percentage expression of programmed death protein ligand 1 (PD-L1) in neoplastic cells and of PD-1 in tumor microenvironment lymphocytes (TMA) of diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) cases by immunohistochemistry (IHC) are gaining interest due to their importance in possible immunological therapies.
Thirty-five cases of a Peruvian population from the Institute Nacional de Enfermedades Neoplásicas (INEN) were studied, determining the expression of these proteins in biopsies embedded in paraffin using the IHC method, looking for the association with OS and DLBCL subtype according to the cell of origin, age, sex and clinical stage (CS).
The average age was 60.1 years, 57.1% men, 37.1% had CS I and II, 48.6% had CS III and IV, and 80.0% received chemotherapy (CT). 40.0% had germinal center B cell subtype (BCG) and 51.4% activated B cell subtype (ABC). 45.7% of cases presented with positivity for PD-1 in MAT lymphocytes. 77.1% of the cases expressed PD-L1 in the neoplastic cells, (62.5%) with high expression. PD-1 positive cases in MAT lymphocytes had better OS than PD-1 negative ones. No other significant differences were found, except in those who received CT. It is concluded that the cases that express PD-L1 in DLBCL is high compared to other cell series, which could have favorable implications in the design of therapy with PD-1 inhibitors. PD-1 expression by MAT lymphocytes is a favorable prognostic factor for GS.
Keywords: diffuse large B-cell lymphoma, PD-L1, PD-1, overall survival.
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INTRODUCCIÓN
El linfoma no Hodgkin (LNH) de células B más frecuente es el linfoma difuso de células B grandes (LDCGB); una neoplasia agresiva y de crecimiento rápido (Alaggio et al., 2022;
Campo et al., 2022). La clasificación de esta enfermedad en dos grupos de acuerdo a la célula de origen, tipo células B de centro germinal (BCG) y tipo células B activadas (CBA) ha demostrado tener impacto en el pronóstico y tratamiento (Alaggio et al., 2022; Campo et al., 2022).
En el Perú se ha reportado que el LDCGB corresponde al 40% de los LNH y 60% a 65% de los LNH de células B (Castañeda-Ruiz et al., 2017). En el mundo, el LDCGB es frecuente y corresponde al 40% de todas las neoplasias linfoides (Atallah-Yunes et al., 2022;
Sung et al., 2021; Susanibar-Adaniya & Barta, 2021).
Actualmente, el tratamiento con el esquema R-CHOP y otros regímenes terapéuticos, tienen buenos resultados, sin embargo, hay casos refractarios que requieren otros tipos de tratamiento, ante lo cual una alternativa que ha sido usada con éxito en otras neoplasias es la basada en la inhibición de puntos de chequeo, como es el caso de los bloqueadores de la proteína de muerte programada 1 (PD-1). En el caso particular de carcinoma pulmonar, la alta expresión del de PD-1 (PD-L1) se ha asociado a buenas respuestas con estos inhibidores (Lantuejoul et al., 2020).
Una de las formas en que las células tumorales escapan de la vigilancia inmunológica es la alta expresión de PD-L1, de tal forma que al unirse con PD-1, se anula la acción de los linfocitos T citotóxicos. La estrategia terapéutica consiste en el bloqueo de PD-1 con un anticuerpo anti-PD-1, logrando de esta manera reactivar la función de los linfocitos T de microambiente tumoral (MAT) (Hui, 2019).
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Existen diversos reportes que han determinado la expresión de PD-1/PD-L1 en linfomas de células B, habiéndose encontrado que la expresión de PD-L1 en las células tumorales del LDCBG puede representar un biomarcador prometedor para predecir un mal pronóstico y se asocia con características clínico-patológicas adversas (Qiu et al., 2019; Xu-Monette et al., 2018).
Un estudio proporciona evidencias de que la interacción entre estas alteraciones genéticas y el microambiente tumoral (MAT) selecciona alteraciones moleculares adicionales que promueven la progresión del linfoma, incluida la coexpresión aberrante de FOXP1 y la enzima mutagénica AID de células B, la evasión inmune a través de la regulación a la baja de MHC-II, la regulación al alza de PD-L1 y el agotamiento de las células T (Pascual et al., 2019). Interesantemente, el bloqueo de PD-1 cooperó con la citotoxicidad de células B mediada por anti-CD20, promoviendo la reactivación extendida de células T y la especificidad antitumoral que mejoró la supervivencia general a largo plazo en ratones. Los datos respaldan una prueba de concepto preclínico para incluir el bloqueo de PD-1 / PD-L1 en la inmunoterapia combinatoria para LDCBG tipo CBA.
En otra investigación, se realizó inmunohistoquímica (IHQ) para PD-1, PD-L1 y TP63 utilizando el sistema EnVision en pacientes chinos con LDCBG. PD-1 se expresó principalmente en linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) y PD-L1 en células tumorales de los pacientes. Los TIL de los casos PD-1 positivos se relacionaron con una alta tasa de sobrevida global (SG) de los pacientes, mientras que la expresión de PD-L1 se asoció con peores parámetros clínicos. Además, la expresión de PD-1, la edad de los pacientes, el estadio de Ann Arbor y la puntuación IPI fueron marcadores de pronóstico significativos para la SG, pero PD-L1 y TP63 no tuvieron importancia pronóstica. Se concluye que el bloqueo de PD-1 / PD-L1 / TP63 puede ser una estrategia terapéutica potencial para algunos pacientes (Fang et al., 2017).
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En otro reporte, los investigadores determinaron la expresión IHQ de PD-1, PD-L1, TIM-3 y LAG-3 en células tumorales y en TIL. TIM-3 y PD-L1 mostraron tinción positiva en las células tumorales en el 39% y 15% de los casos respectivamente. Tanto PD -1 como LAG-3 fueron positivos en células tumorales en una minoría de casos, pero se expresaron más ampliamente en TIL de una manera correlacionada. Además, observaron que el cultivo conjunto de líneas celulares de LCBGD con células T cebadas en presencia de anti-LAG-3 y anti-TIM-3 indujo aumentos en la muerte celular in vitro dependientes de la dosis a través de ensayos ELISA, AcellaTox e IL-2, lo que sugiere una potente actividad antitumoral de estos compuestos (Chen et al., 2019).
En otro estudio, se investigó la expresión de PD-1 y PD-L1 en leucemia linfocítica crónica/linfoma de linfocitos pequeños (LLC/LLP) y LDCBG transformado a partir de LLC/LLP (LDCBG-TR). En LLC/LLP, la expresión de PD-1 en células B neoplásicas fue débil y estaba restringida a prolinfocitos / parainmunoblastos dentro de centros de proliferación. La expresión de PD-1 en células B neoplásicas fue muy prevalente y demostró una mayor intensidad en LCBGD-TR. Se observó expresión de PD-L1 en las células B neoplásicas en casos raros de LDCBG-TR y los casos de LDCBG de novo, así como histiocitos de fondo y células dendríticas. La SG del LDCBG-TR fue significativamente inferior a la de los LDCBG de novo. Los hallazgos sugirieron un control biológico desde prolinfocitos/parainmunoblastos en LLC/LLP hasta las células B neoplásicas en LDCBG - TR. La expresión característica de PD-1 en LDCBG-TR lo convierte en un marcador sustituto potencial para determinar la relación clonal con LLC/LLP, que puede tener importantes implicaciones pronósticas y terapéuticas (He et al., 2018).
También se ha evaluado expresión de PD-L1 mediante IHQ en las células tumorales y en el MAT del LDCBG primario testicular y su asociación con los datos clínicos, supervivencia sin progresión (SSP) y supervivencia global (SG). Se detectó expresión de
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PD‑L1 en células tumorales y en el MAT en 20 y 13 pacientes, respectivamente. La expresión de PD-L1 en las células tumorales y en el MAT fue mayor en los que se encontraban en una etapa temprana en comparación con los pacientes en una etapa avanzada de la enfermedad. El estudio demostró que la expresión de PD-L1 en las células tumorales y en el MAT fue mayor en los pacientes en una etapa temprana de la enfermedad en comparación con aquellos en una etapa avanzada, y que la expresión de PD-L1 en las células tumorales fue mayor en los pacientes con un bajo IPI que en aquellos con un IPI alto.
Además, la expresión de PD‑L1 en las células tumorales y en el MAT no se asoció con la SSP o la SG (Zhu et al., 2019).
En LDCBG aún está en investigación el posible uso de la inmunoterapia basada en el bloqueo de PD-1, por lo que es importante conocer si las células tumorales expresan PD- L1 y en qué proporción lo hacen. Además, si la técnica de inmunohistoquímica automatizada es eficiente en esta determinación en nuestro medio. Asimismo, consideramos importante determinar el porcentaje de linfocitos T de microambiente tumoral que expresan PD -1 por su posible relación con la respuesta inmunológica.
Es por esta razón que en este proyecto de investigación se planteó la interrogante de cuál sería la proporción de la expresión de PD-L1 en las células neoplásicas y de la expresión de PD-1 en los linfocitos del MAT utilizando el método de inmunohistoquímica (IHQ) en los casos de LDCBG en el Instituto Nacional de Enfermedades Neoplásicas (INEN) entre los años 2018 y 2020
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1.1. OBJETIVOS
1.1.1. Objetivo general.
a.- Determinar la expresión inmunohistoquímica (IHQ) de la proteína de muerte celular programada (PD-1) y su ligando (PD-L1) en pacientes con Linfoma Difuso de Células B Grande (LDCBG) atendidos en el Instituto Nacional de Enfermedades Neoplásicas (INEN), Perú 2018 - 2020.
1.1.2. Objetivos específicos
- Determinar la expresión de la proteína de muerte programada 1 (PD-1) en linfocitos del microambiente tumoral (MAT) y relacionarlo con el pronóstico de vida en pacientes con Linfoma Difuso de Células B Grande (LDCBG), Perú 2018-2020.
- Determinar la expresión del ligando de la proteína de muerte programada (PD-L1) en células neoplásicas y relacionarlo con el pronóstico de vida en pacientes con Linfoma Difuso de Células B Grande (LDCBG), Perú 2018-2020.
- Comparar la expresión de estas proteínas con la supervivencia global (SG) de los casos evaluados y con la edad, sexo y estadio clínico.
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MATERIALES Y MÉTODOS
2.1. Objeto de estudio:
Muestra tisular (tejido embebido en parafina) correspondiente a biopsia de paciente con diagnóstico de LDCBG y su respectiva historia clínica, procedente del archivo del Servicio de Patología Quirúrgica del Departamento de Patología del INEN.
2.2. Población
Se revisaron 100 historias clínicas y se pudieron incluir 35 casos con biopsias parafinadas y con datos clínicos completos de pacientes atendidos en el INEN entre los años 2018 y 2020, identificados con el diagnóstico de LDCBG.
2.3.Muestra
La muestra fue de tipo no probabilístico, intencional.
2.4.Tamaño de la muestra
35 muestras de pacientes diagnosticados con LDCBG obtenidos de la base de datos INEN y que cumplieron con los criterios de inclusión.
2.5.Variables
2.5.1. Expresión del ligando de la proteína de muerte programada 1 (PD-L1): proteína receptora de membrana de células hematopoyéticas y no hematopoyéticas que tiene un dominio extracelular canónico tipo inmunoglobulina, responsable de la interacción y señal de traducción hacia los dominios intracelulares. (Krzysztof M.Zak, 2017). De forma anormal se puede expresar en células tumorales (Vargas- Rojas et al., 2008).
2.5.2. Expresión de proteína de muerte programada (PD-1): también denominada CD279, es una proteína receptor transmembrana tipo I expresada en la superficie de los linfocitos T, linfocitos B, monocitos, células asesinas naturales y células dendríticas, cuyos ligandos son PD-L1 y PDL-2 (Zak et al., 2017) (Xu-Monette et al., 2018). PD-1 se expresa constitutivamente en linfocitos B y T, macrófagos y células dendríticas (Vargas-Rojas et al., 2008).
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2.5.3. Pronóstico de vida: El pronóstico de vida está determinado mediante dos indicadores: sobrevida global, que está determinada por el tiempo de vida desde el diagnóstico inicial o inicio del primer tratamiento, en este caso de pacientes oncológicos, hasta la muerte por cualquier causa (Stein et al., 2017), (Pilz et al., 2012), y el estadio clínico el cual indica el progreso de la enfermedad de manera estratificada. En pacientes con linfoma maligno los estadios I y II son considerados iniciales y los III y IV, avanzados. (Ng et al., 2016b). Asimismo, se incluyeron las siguientes variables de control categóricas: sexo (mujer, hombre), subtipos de LDCGB (BCG, CBA), tratamiento (con tratamiento, sin tratamiento)
2.6. Criterios de inclusión
- Pacientes con diagnóstico de LDCBG confirmados mediante estudios histopatológicos e inmunohistoquímicos con datos clínicos completos (edad, sexo, estadio clínico, fecha de ingreso, fecha de última consulta, fecha de fallecimiento, con o sin tratamiento).
- Tener muestras parafinadas en buen estado de conservación, correspondiente a los periodos 2018-2020.
2.7. Criterio de exclusión
- Pacientes con diagnóstico de otros tipos de linfoma.
- Historias clínicas de pacientes con diagnóstico de LDCBG sin bloques de parafina disponibles para estudios de IHQ.
2.8. Procedimiento
2.8.1. Diseño Metodológico
La presente investigación se desarrolló bajo el enfoque del paradigma cuantitativo y el diseño del presente estudio fue de tipo descriptivo, observacional obteniéndose los datos epidemiológicos y patológicos de las historias clínicas de los pacientes con LDCBG,
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transversal ya que se procedió a la realización de IHQ para PD-L1 y PD-1 una sola vez durante la investigación y retrospectivo trabajándose con información de datos procedentes de las historias clínicas de los pacientes con diagnóstico de LDCBG en el periodo 2018- 2020.
2.8.2. Técnicas de Recolección de Datos 2.8.2.1. Obtención de historias clínicas:
En el Departamento de Estadística del INEN, se obtendrán las historias clínicas de pacientes con diagnóstico de LDCBG.
2.8.2.2. Revisión de historias clínicas:
De la revisión de las historias clínicas de pacientes con diagnósticos de LDCBG, se evaluaron los datos de pacientes que cumplieron con los criterios de selección, en un promedio de 20 historias diarias, para el registro en una ficha de recolección de datos confeccionada para este estudio. Se tomaron los siguientes datos: sexo, edad, fecha de ingreso, fecha de última consulta, fecha de fallecimiento, estadio clínico y tratamiento (quimioterapia y/o radioterapia).
2.8.2.3 Revisión de muestras histopatológicas:
Se procedió a reevaluar y confirmar el diagnóstico de acuerdo con los criterios de la OMS 2022. Se tomaron microfotografías. Se realizó IHQ complementaria para confirmar el diagnóstico y subtipo en caso sea necesario.
2.8.3. Técnicas para el procesamiento de las muestras Inmunohistoquímica:
Se trabajó con los bloques de parafina de los casos con diagnóstico de LCGBD. Se utilizó el método de polímeros (Vitro Master Diagnóstica Detection Plus) con recuperación antigénica
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inducida con calor. Se sumergieron las secciones de los bloques de parafina en Tampón Tris- EDTA pH 9.0 a 92º C en equipo automatizado de recuperación PT LINK 48. Se utilizaron 2 anticuerpos PD-L1 (CAL 10) y PD-1 (NAT 105) procesándose en equipo automatizado AUTOSTSINER LINK 48 según protocolos de inmunotinción, con 30 min de incubación con el anticuerpo primario. Se incluyó tejido amigdalino normal como control. Se consideró positividad cuando se observó expresión de color marrón oscuro en las membranas celulares (PD-L1) o citoplasma (PD-1) durante el análisis mediante el microscopio óptico. Se consideró PD-L1 positivo cuando se identificó tinción marrón de membrana en 1% o más de las células neoplásicas. Se determinó un punto de 50% o más de positividad de PD -L1 para determinar grupos con alta expresión (50% o más) o baja expresión (menos de 50%).
Se consideró PD-1 positivo en el MAT por campo de alto poder (CAP) cuando se identificó tinción citoplasmática marrón en 5% o más de linfocitos. Se consideró alta expresión de PD- 1 cuando se identificó esta positividad en 50% o más linfocitos del MAT por CAP del total de linfocitos y baja expresión cuando hubo menos de 50% de expresión por CAP (Ozturk et al., 2020).
2.8.4. Técnicas para el Procesamiento de la Información
Se realizó un análisis descriptivo a través de frecuencias, porcentajes y medidas resumen (promedio, mediana, mínimo y máximo).
El tiempo de seguimiento para la SG se calculó desde la fecha de ingreso hasta la fecha de muerte (evento de interés) o fecha de última consulta. Las curvas de SG se estimaron con el método de Kaplan-Meier y las diferencias entre las mismas se evaluaron con la prueba logrank.
Se consideró un valor de p<0.05 para una diferencia significativa. En el análisis se usó el programa estadístico R (R Core Team (2022). R: A language and environment for statistical
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computing. R Foundation for Statistical Computing, Vienna, Austria. URL https://www.R- project.org/.
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RESULTADOS
3.1. Características histológicas:
Los casos evaluados mostraron características clásicas escritas en la literatura (Stein, H;
Pileri, S; Weiss, 2017): patrón difuso, células linfoides grandes, de morfología tipo centroblasto o inmunoblasto y alto índice de mitosis (figuras1 y 2).
Figura 1. Caso de LDCBG que muestra proliferación de células neoplásicas linfoides grandes (flecha azul), intercaladas con regular cantidad de linfocitos pequeños reactivos (flecha roja) (40X).
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Figura 2. Otro caso de LDCBG que muestra mayor cantidad de linfocitos pequeños reactivos (flecha roja) (40X).
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Todos los casos tenían IHQ confirmatoria del diagnóstico patológico, como CD20 positivo y CD3 negativo (figuras 3 y 4).
Figura 3. Caso de LDCBG que muestra positividad de membrana de CD20 en células neoplásicas, lo que confirma el diagnóstico (40X).
Figura 4. Caso de LDCBG que muestra positividad citoplasmática de CD3 en los linfocitos T reactivos del MAT, intercalados con las células neoplásicas negativas para este anticuerpo (40X).
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3.2. Características de los pacientes en estudio:
La edad promedio de los 35 pacientes en estudio es de 60.1 años (rango, 24 a 84 años), el 50% de pacientes tuvieron edades por debajo de 61 años (mediana de las edades de los pacientes en estudio). Hubo 14 (40.0%) pacientes con edades menores de 60 años y 21 (60.0%) con edades iguales o mayores de 60 años. Según el sexo, hubo 15 (42.9%) pacientes mujeres y 20 (57.1%) hombres. Según el estadio clínico (EC), hubo 6 (17.1%) pacientes con EC I, 7 (20.0%) con EC II, 10 (28.6%) con EC III y 6 (17.1%) con EC IV. En 6 (17.1%) pacientes no se especificó el EC. Considerando el tratamiento recibido por los pacientes en estudio, a 28 (80.0%) pacientes se les administró quimioterapia, a 8 (22.9%) se les aplicó radioterapia, y a 1 (2.9%) se le realizó trasplante de médula ósea. Según el subtipo de acuerdo con la célula de origen, 14 (40.0%) pacientes fueron subtipo BCG, 18 (51.4%) subtipo CBA, 2 (5.7%) tuvieron otro subtipo y 1 (2.9%) subtipo indeterminado. Hubo expresión de PD-1 en linfocitos del MAT en 16 pacientes (45.7%), no expresión en el mismo número de casos (45.7%) y en 3 pacientes (8.6%) no se evaluó esta proteína (Tabla 1). Del total de pacientes con expresión de PD-1, 6 pacientes (37.5%) tuvieron menos del 50% y 10 (62.5%) más del 50% (figuras 5 y 6). Hubo expresión de PD-L1 en células neoplásicas en 27 pacientes (77.1%) y negatividad en 7 (20.0%). En 1 (2.9%) no se evaluó la expresión. Del total de pacientes, 9 (25.7%) fueron negativos, con menos del 1% o ninguna expresión, 16 (47.0%) tuvieron entre 1% y 49% y 9 (26.5%), 50% o más de expresión de PD-L1 (figuras 7 y 8).
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Tabla 1. Características de los pacientes.
Variables N (%)
Edad, años
Promedio / Mediana [Min-Max] 60.1 / 61 [24-84]
Grupos de edad
<60 años 14 (40.0)
≥60 años 21 (60.0)
Sexo
Mujeres 15 (42.9)
Hombres 20 (57.1)
Estadio clínico
I 6 (17.1)
II 7 (20.0)
III 10 (28.6)
IV 6 (17.1)
No especificado 6 (17.1)
Tratamiento con quimioterapia
Si 28 (80.0)
No 7 (20.0)
Tratamiento con radioterapia
Si 8 (22.9)
No 27 (77.1)
Trasplante
Si 1 (2.9)
No 34 (97.1)
Subtipo de acuerdo con la célula de origen
BCG 14 (40.0)
CBA 18 (51.4)
Otro 2 (5.7)
No determinado 1 (2.9)
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Variables N (%) Expresión de PD-1
Positivo 16 (45.7)
Negativo 16 (45.7)
No especificado 3 (8.6)
Porcentaje de expresión de PD-1 (N=16)
<50% 6 (37.5)
≥50% 10 (62.5)
Expresión de PD-L1
Positivo 25 (71.4)
Negativo 9 (25.7)
No especificado 1 (2.9)
Porcentaje de expresión de PD-L1 (N=32) 0%
< 1%
2 (5.9) 7 (20.6)
≥ 1% a 49% 16 (47.0)
≥ 50% 9 (26.5)
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Figura 5. Caso de LDCBG que muestra positividad de PD-1 en más del 50% de la población de linfocitos T reactivos del MAT (40X).
Figura 6. Caso de LDCBG que muestra positividad de PD-1 en menos del 50% de la población de linfocitos T reactivos del MAT (40X).
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Figura 7. Caso de LDCBG que muestra positividad de PD-L1 en más del 50% de las células linfoides B grandes neoplásicas (40X).
Figura 8. Caso de LDCBG que muestra positividad de PD-L1 en menos del 50% de las células linfoides B grandes neoplásicas (40X).
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3.3. Supervivencia global:
En el grupo de pacientes en estudio se documentaron 17 (48.6%) decesos. El 50% de pacientes con tiempos de seguimiento por debajo de los 13 meses (mediana de los tiempos de seguimiento de los pacientes en estudio). La SG a los 12, 24, 36, 60 y 120 meses se estimó en 66.3%, 50.1%, 41.8%, 41.8% y 31.3%, respectivamente; la mediana del tiempo de SG se estimó en 34 meses (figura 9).
Figura 9. Curva estimada de la supervivencia global.
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Se encontró una diferencia significativa en la SG según el tratamiento con quimioterapia. En el grupo de pacientes que no recibió quimioterapia la SG a los 3 meses se estimó en 14.3%
y en el grupo de pacientes que, si recibió quimioterapia, la SG a los 12, 24, 36, 60 y 120 meses se estimó en 80.0%, 60.5%, 50.4%, 50.4% y 37.8%, respectivamente. La mediana del tiempo de SG en los pacientes que no recibieron quimioterapia se estimó en 2 meses y en los pacientes que si recibieron quimioterapia se estimó en 65 meses (figura 10). El tiempo de vida de los pacientes que recibieron quimioterapia se muestra superior al de los pacientes que no recibieron quimioterapia (p<0.05).
Figura 10. Curvas estimadas de la supervivencia global según tratamiento con quimioterapia.
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Se encontró una diferencia significativa en la SG según la expresión de PD-1 por los linfocitos del MAT. En el grupo de pacientes con PD-1 negativo, la SG a los 12, 24, 36 y 60 meses se estimó en 53.8%, 33.7%, 16.8% y 16.8%, respectivamente; y en el grupo de pacientes con expresión de PD-1 a los 12, 24, 36, 60 y 120 meses se estimó en 78.7%, 70.8%, 70.8%, 70.8% y 70.8%, respectivamente. La mediana del tiempo de SG en los pacientes con PD-1 negativo se estimó en 16 meses (figura 11). El tiempo de vida de los pacientes con expresión de PD-1 en los linfocitos del MAT se muestra superior al de los pacientes PD-1 negativos (p=0.011).
No se encontró una diferencia significativa en la SG según los grupos de edad, el sexo, el estadio clínico, el tratamiento con radioterapia, el subtipo de acuerdo con la célula de origen y la expresión de PD-L1 por las células neoplásicas.
Figura 11. Curvas estimadas de la supervivencia global según expresión de PD-1.
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DISCUSION
La expresión de PD-L1 en las células neoplásicas de los casos evaluados fue alta (71.4%), aunque sólo 26.5% mostró expresión igual o mayor del 50%, no habiéndose encontrado asociación con la SG ni el estadio clínico. Diversos estudios han mostrado expresión variable de PD-L1 en LDCBG, la mayoría con menor proporción de casos positivos en relación con los negativos. En un estudio de metaanálisis, de 13 reportes, solo uno evidenció mayor porcentaje de casos positivos (Qiu et al., 2019). Estas diferencias pueden deberse al punto de corte utilizado para considerar positividad y a si la expresión es en membrana, en citoplasma o en ambas. En este estudio se decidió usar un punto de corte igual o mayor al 1% y expresión en membrana de acuerdo a criterios usados en cáncer de pulmón y en otras neoplasias (Elias et al., 2016; Lantuejoul et al., 2020).
Por otra parte, se ha descrito que la mayor expresión de PD-L1 se correlaciona con el subtipo no-GCB y la positividad del virus Epstein-Barr (VEB) en el LDCBG (Xie et al., 2019). Una explicación del alto porcentaje de los casos evaluados con expresión de PD-L1 podría deberse a que más de la mitad de estos corresponden al subtipo no-GCB y quizá por la alta asociación de VEB con LDCBG en la población peruana, lo que ha sido previamente descrito (Dueñas et al., 2020)
En cuanto al pronóstico de SG, este estudio de metaanálisis evaluó la expresión de PD-L1 y SG en 1478 pacientes con LDCBG. Con un modelo de efectos aleatorios, observaron que la expresión positiva de PD-L1 se asoció con una SG más corta en comparación con la expresión negativa. El análisis de subgrupos del valor de corte y la región geográfica de procedencia, reveló que los estudios que utilizaron ≥30 % para predecir el pronóstico mostraron una mayor significancia en comparación con los que utilizaron <30%.
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Por otro lado, los efectos predictivos de PD-L1 fueron mayores cuando los estudios se limitaron a poblaciones asiáticas (Qiu et al., 2019). Sin embargo, en dos ensayos clínicos, PD-L1 no constituyó un factor de riesgo en LDCBG, aunque hubo más expresión de esta proteína en células mieloides (85% a 95%) que en las células neoplásicas (10%) (McCord et al., 2019).
En los casos evaluados, dos factores pueden haber influido en la falta de asociación entre la expresión PD-L1 en las células neoplásicas y la SG: el poco número de casos (35) y el punto de corte para considerar positividad y alta expresión (1% y 50% respectivamente). La importancia de la determinación de PD-L1 en células neoplásicas no solo se debe a que puede constituir un factor pronóstico de SG, sino sobre todo a que puede ser un factor predictivo de respuesta al tratamiento con inhibidores de punto de control como el anti-PD- 1. Aunque el uso de estos inhibidores aún no ha mostrado mucho éxito, un reporte en que usó un inhibidor de PD-1 (pembrolizumab) más el régimen R-CHOP se asoció con alta tasa de respuesta completa y supervivencia libre de progresión a los dos años en casos con neoplasia que expresaba PD-L1 (Smith et al., 2020).
Otros reportes han sugerido que el uso de estos inhibidores pueden sensibilizar al LDCBG para quimioterapia posterior (Susanibar-Adaniya & Barta, 2021). El subtipo de LDCBG primario mediastinal ha mostrado tasas de remisiones altas y duraderas con pembrolizumab en casos de recaídas. Esto podría deberse a que, en forma similar a lo que ocurre con el linfoma de Hodgkin (LH), este tipo de linfoma presenta con frecuencia alteraciones del número de copias de 9p24.1, lo que implica mayor expresión de genes de PD-L1, PD-L2 y JAK-2 (Fakhri & Ai, 2021).
Otra variante de LDCBG que ha demostrado respuesta a los inhibidores de PD-1 es el linfoma de células B grandes rico en histiocitos/células T. Esta neoplasia alberga ganancia o amplificación de copias de PD-L1/PD-L2 en la mayor parte de casos estudiados lo que se
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asoció con una mayor expresión de PD-L1 (Griffin et al., 2021). Otro dato interesante es la observación que las células del MAT expresan tanto PD-1 como PD-L1. Se ha encontrado que las células NK tienen altos niveles de PD-1 y los macrófagos de PD-L1, en LDCBG y en LH, aunque ambas proteínas en mayor proporción en esta última neoplasia. En ese contexto, la supresión de las células NK puede deberse a la expresión de PD-L1 en los macrófagos, lo que podría evitarse bloqueando PD-1 (Vari et al., 2018).
Se han descrito otros mecanismos relacionados a la función de evasión de respuesta inmune mediante PD-L1 en LDCBG. Un ejemplo es el papel que juega el inflamosoma NLRP3, que regula al alza a PD-L1 y reduce la cantidad de células T citotóxicas, de tal manera que el bloqueo de NLRP3 reduce el crecimiento de la neoplasia mediante la regulación negativa de PD-L1 y disminución de linfocitos T PD-1 positivos. Se ha indicado a la interleucina 18 (IL- 18) como la principal citoquina efectora involucrada en la regulación negativa de la inmunidad contra el linfoma y que se correlaciona positivamente con PD-L1 (Lu et al., 2021).
Otro hallazgo interesante de la presente investigación es que la alta expresión de PD -1 en los linfocitos del MAT se correlacionó significativamente con mejor SG. Este dato ya se había descrito en un estudio comparativo de diversos linfomas en relación a la expresión de PD-L1 / PD-1. En dicha investigación, se determinó que la infiltración por linfocitos intratumorales (TIL) PD-1 positivos fue un factor pronóstico favorable en LDCBG, a diferencia de lo que se observó en LH y linfoma folicular (LF). Por otro lado, en ese mismo estudio se evidenció que las células T PD-1 positivas circulantes, contrariamente, se correlacionaban con progresión de enfermedad y mal pronóstico en LDCBG y leucemia linfocítica crónica (LLC) (Xie et al., 2019).
En cuanto a la función de PD-L1 / PD-1 en el bloqueo de la respuesta inmune, se ha determinado que es un proceso complejo, con acumulación de mutaciones y alteraciones
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epigenéticas y alta expresión de PD-L1, mayor capacidad para secretar IL-10, estableciéndose un microambiente inmunosupresor complejo donde las células neoplásicas del LDCBG mantienen la proliferación y la supervivencia al afectar el control regulatorio de los linfocitos T colaboradores foliculares (TFR), limitar las funciones antitumorales mediadas por IL-21 de los linfocitos T reguladores (TFH) y maximizar el uso de señalización PD-1/PD-L1 para escapar de la actividad citotóxica de CD8+ (Garcia-Lacarte et al., 2021).
Una alteración genética adicional recientemente descrita asociada a la sobreexpresión de PD-L1 en LDCBG se debe a cambios genéticos de CD73/A2aR (Zhang et al., 2022). Otra mutación asociada a la sobreexpresión de PD-L1 en las células neoplásicas y linfocitos del MAT del LDCBG descrita hace poco, es la del MYD88 (Fu et al., 2021). El papel del MAT es también crucial en el escape de la inmunovigilancia. Se ha descrito que el perfil de expresión génica de las células microambientales, el fenotipo de macrófagos asociados a tumores, la expresión de proteínas como SPARC y fibronectina, la sobreexpresión de varios tipos de metaloproteinasas de matriz como MMP -2 y MMP-9 o los inhibidores tisulares de las metaloproteinasas de matriz (TIMP) pueden conducir a un resultado favorable o adverso para la sobrevivencia del LDCBG (Cioroianu et al., 2019).
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CONCLUSIONES
1. En general, la SG de la serie evaluada, es baja, con 85.7% de casos fallecidos a los 36 meses.
2. En la serie evaluada, 71.4% de células neoplásicas de LDCBG expresó PD-L1, con positividad de 50% o más de esta proteína en 26.5% de los casos.
3. En la serie evaluada, 45.7% de linfocitos T del MAT expresaron PD-1. De estos, 62% tuvieron positividad en 50% o más (alta expresión).
4. Se observó un comportamiento más favorable en SG en los pacientes que recibieron quimioterapia.
5. Se observó un comportamiento más favorable en SG en los pacientes con alta expresión PD-1 en los linfocitos del MAT.
6. No se encontraron diferencias significativas en la SG según la edad, sexo, estadio clínico, tratamiento con radioterapia, subtipo de acuerdo con la célula de origen y expresión de PD-L1 en las células neoplásicas.
7. Los mecanismos de expresión e intervención de PD-L1/PD-1 en el escape de la inmunovigilancia en LDCBG son complejos y participan una serie de alteraciones genéticas como son las mutaciones de CD73/A2aR y de MYD88, cambios epigenéticos, diversas interleucinas, y alteraciones genéticas de las células del MAT.
Conocer estos mecanismos es relevante para el diseño de terapias inmunológicas en LDCBG.
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RECOMENDACIONES
1. Teniendo en cuenta el alto porcentaje de expresión de PD-L1 en células neoplásicas del LDCBG en la serie evaluada, es recomendable realizar más estudios con mayor número de casos y diversos puntos de corte de porcentaje de positividad para evaluar el impacto en el pronóstico de SG.
2. Teniendo en cuenta el alto porcentaje de expresión de PD-L1 en células neoplásicas del LDCBG en esta serie, es recomendable realizar un ensayo clínico de pacientes peruanos con esta neoplasia para determinar la utilidad de los inhibidores de PD-1 o PD-L1 en el tratamiento, sobre todo en casos de recaídas o poca respuesta a otros tratamientos.
3. Teniendo en cuenta que la expresión de PD-1 en los linfocitos del MAT se correlaciona con mejor SG, este anticuerpo podría usarse como marcador de pronóstico de SG.
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ANEXO 1.- Datos de HC de pacientes en estudio.
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