Trabajo de Grado
Caracterización molecular de procesamientos no canónicos del
factor de transcripción Ikaros en pacientes con Leucemia Linfoide
Aguda tipo B.
Presentado por: Victor Andres Villamizar
Directores: Valeriano López Segura, Helena Groot De Restrepo
Resumen
Íkaros es un factor de transcripción involucrado en varios niveles dentro del control de la hematopoyesis. Este control se encuentra determinado por una expresión específica de las distintas isoformas del gen, y un desbalance de estos niveles de expresión se ha visto relacionado con distintas neoplasias hematopoyéticas. En un trabajo previo del grupo de investigación se estandarizó un nuevo método cuantitativo para la evaluación de los niveles de expresión del gen Ikaros, este estudio encontró adicionalmente la presencia de procesamientos aberrantes en un gran número de pacientes. Tomando en cuenta los resultados obtenidos en el trabajo previo, en el presente trabajo se procedió a caracterizar los posibles procesamientos no canónicos del factor de transcripción Ikaros (IKZF1) encontrados en pacientes con Leucemia Linfoide Aguda tipo B. Para esto se realizó en primer lugar un análisis bioinformático de las regiones interexónicas de interés entre los exones 4 y 5, y los exones 6 y 7 del gen IKZF1 en las cuales se sospecha la presencia de un splicing alternativo en búsqueda de sitios de splicing crípticos. Este análisis resultó en la identificación de cuatro posibles sitios de splicing alternativos correspondientes a dos inserciones a los extremos de los exones 4 y 5 de 129pb y 48pb correspondientemente, una inserción en el extremo del intrón 7 de 69pb y una deleción de 30pb del extremo del intrón 6 la cual ya ha sido reportada previamente en pacientes con Leucemia Linfoide Aguda de células T. Finalmente, se realizó caracterización molecular mediante clonación y secuenciación de las regiones interexónicas amplificadas, sin embargo, no se ha logrado obtener resultados concretos todavía.
Palabras claves: Factor de transcripción, Ikaros, splicing alternativo, leucemia linfoide aguda tipo B.
Introducción
La familia de factores de transcripción Ikaros es esencial en la regulación de genes involucrados en el desarrollo de las líneas celulares hematopoyéticas (Dovat & Payne, 2010). Los genes más importantes a este respecto son los genes Íkaros, Helios y Aiolos, mientras que Eos y Pegasus tienen funciones menos conocidas. Es bien sabido que el factor de transcripción Íkaros se encuentra involucrado en varios niveles dentro
del control de la hematopoyesis. Este control que ejerce Ikaros, en conjunto con otros genes de la misma familia, viene determinado por un control específico de los niveles de expresión de las distintas isoformas del gen (Ruiz et al., 2004).
Cambios en los perfiles de expresión de las isoformas de estos genes se han visto relacionadas con el desarrollo de trastornos hematopoyéticos debido a una supuesta falta de su función como supresores de tumores (Westman, Mackay, &
Gell, 2002). La identificación de los perfiles de expresión de estos genes en pacientes con neoplasias hematológicas permitiría una mayor comprensión de estas enfermedades (Meleshko et al., 2008) y en un futuro un diagnostico más preciso.
El splicing alternativo de estos genes da como resultado la obtención de diferentes mRNAs y proteínas con distinta actividad y capacidad de unión al ADN (Meleshko et al., 2008). Sin embargo, existe una correlación directa entre la probabilidad de que un gen sea catalogado como causante de una enfermedad y el número de intrones presentes en dicho gen (López-Bigas, Audit, Ouzounis, Parra, & Guigó, 2005). La edición precisa del pre-ARN requiere de un complicado control en el interior de la célula, y mientras mayor sea la cantidad de modificaciones postranscripcionales que sufra un pre-ARN, mayor será la probabilidad que se produzcan errores en dicho procesamiento (López-Bigas et al., 2005). En el caso del gen Ikaros (IKZF1), la sobreexpresión de ciertas isoformas producidas por un splicing alternativo con un comportamiento dominante negativo se ha visto relacionada en muchas ocasiones con neoplasias hematopoyéticas, particularmente en pacientes con LLA-B (Davis, 2011).
En un trabajo previo del grupo de investigación se estandarizó un nuevo método cuantitativo para la evaluación de los niveles de expresión del gen Ikaros que permitió de una manera costo-efectiva y sencilla diferenciar diversos tipos de neoplásicas basándose en la amplificación de las regiones inter-exónicas. De este modo se pudo diferenciar de un modo altamente significativo el grupo de Leucemias mieloides crónicas (LMC), Leucemias linfoides crónicas (LLC) y Mielomas multiples (MM).
Junto a la cuantificación de la expresión de cada región inter-exónica a estudio, otra característica interesante en dicho estudio fue la presencia de procesamientos no canónicos, característica ya conocida en diversas isoformas de la familia como puede ser la deleción de 30 pb al final del exón 6 de Ikaros en pacientes con LLA o una inserción de 60 pb al final del exón 2 (Sun et al., 1999). El diseño inter-exónico de los amplicones estaba desarrollado para este fin, de modo que se pudo constatar a través de la valoración de la curva de melting de algunos inter-exones la presencia de dos picos de melting asociados a la presencia de un procesamiento no canónico. Concretamente se puedo observar como la presencia de dos picos de melting en el interéxón 4-5 era algo muy específico de los casos de LLA-B, en los que más del 80% de los casos lo presentaban.
Teniendo esto en cuenta, en el presente estudio se planteó caracterizar molecularmente estos procesamientos encontrados en los pacientes de LLA-B. Para ello los amplicones que obtuvieron dos picos de melting se clonaron y secuenciaron. Adicionalmente, se realizó un estudio bioinformático para estudiar la posible presencia de sitios de splicing crípticos que puedan explicar teóricamente la presencia de dichos procesamientos no canónicos. La comprobación de un mismo patrón de splicing en todos los casos de LLA-B supondría un hallazgo excepcional ya que supondría una característica muy importante de la enfermedad y con un alto nivel de poder discriminatorio, para la cual se podrían diseñar sistemas de cribado rápido y efectivo para este tipo de neoplasia.
Materiales y métodos
Análisis bioinformático
En primer lugar se procedió a la identificación de sitios crípticos de splicing alternativo, éste se
realizó con ayuda del programa ESEfinder (2001-2006, Cold Spring Harbor Laboratory). Posteriormente se realizó la predicción de los sitios de unión a secuencias potenciadoras exónicas (ESEs) en los alrededores de los sitios de splicing crípticos identificados empleando el programa Alamut 2.3 (2013, Interactive Biosoftware Ltd.). Posteriormente, coempleando el programa Geneious (2005-2013, Biomatters Ltd.), se seleccionaron las mutaciones que no presentaran cambios en el marco de lectura y se construyeron las diferentes isoformas teóricas que pudieran ocurrir por la selección de uno de los sitios de splicing alternativos encontrados. Para finalizar, empleando el mismo programa, se examinó la existencia de modificaciones en los dominios de la proteína.
Caracterización molecular
Se utilizaron las muestras de los interexones amplificados por RT-PCR de los pacientes donde se observó la presencia de dos picos en la curva de melting. La ligación se realizó utilizando el plásmido pGEM®-T Easy (Promega) y ligasa T4. La transformación con el plásmido se realizó en bacterias E. coli supercompetentes mediante un protocolo de shock térmico y fueron cultivaron en
placas de 2xTY con Ampicilina, IPTG y X-gal para la selección de transformantes. Las plasmipreps de las colonias seleccionadas se realizaron mediante un protocolo de lisis alcalina y precipitación salina. Para la comprobación de la presencia del inserto, se realizaron digestiones con ADN plasmídico obtenido de cada clon empleando la enzima EcoR1 (Promega) y posteriormente se observaron mediante electroforesis en gel de agarosa al 2%.
La secuenciación de los clones se realizó por el método Sanger en el Laboratorio de Secuenciación de ADN del Departamento de Ciencias Biológicas de la Universidad de los Andes. Solo se secuenciaron los clones donde se observó la presencia de una banda correspondiente a la presencia del inserto en la electroforesis después de la digestión.
Resultados
Los análisis bioinformáticos revelaron la presencia de posibles sitios de sitios de splicing no canónicos tanto en los extremos de los intrones como dentro de los exones.
Figura 1. Ubicación espacial de los sitios de splicing canónicos y los posibles sitios de splicing alternativos ubicados en los extremos de los intrones 4, 6 y sus exones adyacentes.
Figura 2. Regiones de reconocimiento de secuencias consenso de unión de factores potenciadores de splicing. Se muestran subrayados en rojo los punto de corte alternativo ubicados an (a) 129 pb dentro del extremo 5’ del intrón 4, (b) a 48 pb dentro del extremo 3’ del intrón 4 (c) a 30 pb dentro del extremo 3’ del exón 6 y (d) a 69 pb dentro del extremo 3’ del exón 6. (e) leyenda de relación entre colores y el reconocimiento de alguna de las proteínas potenciadores del splicing.
Tabla I. Secuencias consenso identificadas como posibles sitios de splicing con su ubicación relativa con respecto al sitio canónico y el puntaje. En amarillo se encuentran los sitios de splicing alternativos que conservan el marco de lectura y en negrita los nucleótidos donde ocurre el splicing.
Tabla I. Secuencias consenso identificadas como posibles sitios de splicing con su ubicación relativa con respecto al sitio canónico y el puntaje. En amarillo se encuentran los sitios de splicing alternativos que conservan el marco de lectura y en negrita los nucleótidos donde ocurre el splicing.
La Figura 1 muestra la presencia de los posibles sitios de splicing identificados por la búsqueda de secuencias conservadas consistentes tanto con los sitios donantes como los receptores utilizando el programa ESEfinder (2001-2006, Cold Spring Harbor Laboratory). En la Tabla I se presentan las secuencias de los sitios de splicing predichos por el programa con su posición relativa al sitio de splicing canónico y con un valor de puntaje otorgado por el mismo. Este valor corresponde a un puntaje relativo basado en el parentesco de la secuencia identificada con respecto a las secuencias consenso manejadas por el programa.
Mediante la predicción de la proteina que se formaría tomando en cuenta los sitios de corte encontrados, se confirmo la presencia de un sitio de splicing alternativo posible en cada extremo del intrón, los cuales permiten que se mantenga el marco de lectura sin alterar la integridad del resto de la proteína. En la región interxónica 4-5 se identificaron dos inserciones: una de 129pb al extremo del exón 4 y otra de 48pb al extremo del intrón 5. En la región interexónica 6-7 se identificó una inserción en el extremo del intrón 7 de 69pb y una deleción de 30pb del extremo del intrón 6
(Tabla I y Figura 3).
Tabla I. Secuencias consenso identificadas como posibles sitios de splicing con su ubicación relativa con respecto al sitio canónico y el puntaje. En amarillo se encuentran los sitios de splicing alternativos que conservan el marco de lectura y en negrita los nucleótidos donde ocurre el splicing.
Figura 3. Construcción, predicción de estructuras terciarias y ubicación de dominios funcionales de distintas isoformas hipotéticas. Ik.1: isoforma canoníca. El número de las isoformas alternativas indica el exón donde ocurrió la modificación. Signo + o – indica presencia de inserción o deleción respectivamente en el exón, mientras que su posición indica el lugar de la modificación, en el extremo 5’ (derecha) o 3’ (izquierda) del exón. Dominios funcionales en rojo en la parte inferior de la isoforma. Estructura terciaria (rosado: hélices alfa, amarillo: láminas beta, azul: giros) en la parte superior
El estudio de las ESEs reveló una alta presencia de sitios de unión para una gran cantidad de proteínas potenciadoras del splicing alrededor de los cuatro sitios de splicing crípticos encontrados. Como se puede observar en la figura 2, estos posibles sitios de unión se concentran principalmente en la región exónica de cada sitio de corte alternativo como es esperado.
Al construir las diferentes isoformas teóricas que pueden ser formadas por la selección de los sitios de splicing alternativo y evaluar los cambios tanto en los dominios funcionales como en la estructura secundaria de la proteína, se observó que en ninguno de los caso se presentaban cambios significativos en la estructura de las proteínas. Los dominios funcionales importantes para su funcionamiento, tales como lo son los cuatro dominios para la unión al ADN y los dos dominios de dimerización se mantienen intactos en todos los casos, y con la excepción de la pérdida o ganancia de unas pequeñas regiones de hélices alfa y pequeños giros, no se presenta un cambio significativo evidente (Figura 3).
Para la caracterización molecular de los procesamientos no canónicos se seleccionaron 6 muestras para secuenciación correspondientes a 4
pacientes diferentes. Las muestras fueron seleccionadas según el tamaño de la banda observada en el gel del producto digerido para asegurar que se encontrara el amplicón insertado (figura 4). Los resultados de la secuenciación mostraron la presencia del splicing canónico entre el exón 4 y el 5, sin embargo hasta los momentos no se ha logrado identificar la presencia del splicing aberrante por este método.
Discusión
En primera instancia, el estudio bioinformático de las regiones interexónicas de interés en las cuales se sospechaba la presencia de un splicing alternativo (sitio de splicing entre los exones 4 y 5 y los exones 6 y 7), reveló la presencia de posibles sitios de splicing crípticos.
Tomando en cuenta el sitio de splicing canónico reportado para el gen IKZF1, la amplificación del interexón 4-5 produciría un amplicón de 156pb, de los cuales 76pb pertenecen al exón 4 y 89pb al exón 5. Las curvas de melting de las RT-PCR realizadas para los pacientes con LLA-B mostraron para los 14 pacientes estudiados un pico alrededor de los 86.5oC en todos los casos. Sin embargo, en 13 de los 14 pacientes se
Figura 4. Digestiones del ADN plasmídico de las bacterias transformadas. Se observa en la parte superior el plásmido en dos conformaciones diferentes y una banda inferior correspondiente al fragmento del amplicon insertado. Las flechas indican las muestras que fueron seleccionadas para secuenciación
observó la presencia de un segundo pico a 84oC. Tomando en cuenta que el pico de 86.5oC se observó en la totalidad de los pacientes con LLA-B así como en todos los otros pacientes de las otras neoplasias hematopoyéticas estudiadas, se puede asumir que éste corresponde al splicing canónico del gen.
El programa ESEfinder (2001-2006, Cold Spring Harbor Laboratory) evalúa los posibles sitios de Splicing por su semejanza a una base de datos de sitios de splicing de exones constitutivos, otorgando un puntaje con valores arbitrarios dependiendo de dicha semejanza (Cartegni et al.,
2003). El programa establece un umbral cercano a 6.7 correspondiente al primer cuantil de todos los puntajes de los sitios de splicing en la base de datos. Mediante este programa, se encontraron 4 posibles sitios de splicing en esta región: 2 de ellos correspondientes a los sitios de splicing canónicos, y otros 2 dentro del intrón 4 cerca de sus extremos 5’y 3’.
La predicción de la proteína formada tomando en cuenta ambos sitios alternativos de splicing presentaría una inserción de 43 aminoácidos en el extremo del intrón 4, o de 16 aminoácidos en el extremo del intrón 5 y se mantiene el marco de lectura en ambos casos.
La amplificación del sitio de splicing entre el exón 6 y 7 produciría un amplicón de 152pb, de los cuales 50pb pertenecen al exón 6 y 102pb al exón 7. Las curvas de melting mostraron estudiados un pico a los 85oC para los 14 pacientes con LLA-B, adicionalmente, en 5 de los 14 pacientes se observó la presencia de un segundo pico a 82oC. Considerando que el pico de 85oC fue encontrado en todos los pacientes estudiados, es posible asumir que este corresponde al splicing canónico, mientras que el segundo pico encontrado en 5 pacientes con
LLA-B, puede corresponder a otra forma de splicing no canónica.
Al evaluar la presencia de sitios de splicing en los extremos del intrón 6 y en los exones 6 y 7, se encontraron un total de 10 posibles sitios de splicing: los 2 sitios de corte canónicos, 1 en el interior del exón 6, 2 dentro del intrón en el extremo cercano al exón 6, 3 dentro del intrón en el extremo cercano al exón 7, y 2 dentro del exón 7.
De los 8 sitios de splicing crípticos encontrados, solamente dos de ellos permitía la conservación del marco de lectura de la proteína sin la inserción de ningún codón de parada: un sitio de splicing 5’ encontrado a 30 pb dentro del exón 6, y un sitio de splicing 3’ ubicado a 69 pb dentro del intrón 6 en el extremo cercano al exón 7. La predicción de la estructura de la proteína muestra que un splicing alternativo en los sitios crípticos encontrados significaría una deleción de 10 aminoácidos del exón 6 o una inserción de 23 aminoácidos contiguos al exón 7 respectivamente.
Al observar la estructura primaria y secundaria de las proteínas formadas empleando los sitios de splicing alternativos identificados se aprecia que, aunque se pierden o se ganan pequeñas porciones de estructuras secundarias, no se ve alterada a primera vista ningún motivo funcional de la proteína. Sin embargo, el cambio de las distancias entre los motivos existentes puede ser el responsable de los cambios en la actividad de la proteína. La expresión de isoformas de Ikaros presentando pequeñas inserciones o deleciones
in-frame, aunque no necesariamente esté inhibiendo por completo la funcionalidad de la proteína, puede estar afectando las interaciones específicas de dicha proteína con algún proceso celular en particular (Zhong et al., 2009).
El sitio de splicing críptico responsable de una deleción de 30pb en el extremo del exón 6, corresponde con los resultados encontrados por Sun y colaboradores (1999) los cuales reportaron la expresión de isoformas de Ikaros presentando esta deleción en pacientes con LLA de células T. Aunque no se conoce con exactitud cuál es el efecto que causa esta deleción en el funcionamiento de la proteína, como ya se ha mencionado, es probable que altere la distribución de los motivos funcionales y por lo tanto pudiendo alterar su capacidad de unión al ADN, de dimerización o hasta de localización subcelular (Sun et al., 1999).
Tomando en cuenta los valores del puntaje de los sitios de splicing encontrados por el software ESEfinder, los sitios de corte alternativos del extremo 3’ del intrón presentaron un puntaje muy bajo en comparación con los sitios de corte canónicos, sugiriendo que no se encuentran tan bien conservados y por lo tanto con una menor probabilidad de ser utilizado como sitio de splicing alternativo. Por otro lado, los sitios de corte 5’ en ambos casos si muestran un puntaje mayor al umbral establecido por el programa, e incluso, en el caso de la deleción en el intrón 6 ya reportada, presenta un puntaje mayor al del punto de corte canónico.
Al realizar la búsqueda de sitios de unión exónicos de potenciadores de splicing (ESEs), se observó que los cuatro sitios encontrados presentaban en sus alrededores una gran cantidad de posibles sitios de unión, los cuales se encontraban principalmente en las regiones exónicas. La presencia de estos sitios de unión a proteínas potenciadores del splicing no representan en ningún caso una prueba infalible de la ocurrencia de un splicing alternativo en los sitios crípticos identificados, sin embargo, como se ha demostrado en numerosos estudios (Krainer,
Conway, & Kozak, 1990; Long & Caceres, 2009; Swanson, Sherer, & Malim, 2010) la presencia de las proteínas de la familia SR como las SRp40 y SRp55, así como el factor SF2/ASF son componentes necesarios para que pueda ocurrir de forma correcta el splicing del pre-ARNm.
La caracterización molecular por clonación de cada uno de estos posibles eventos de splicing alternativo aclarará finalmente cual es la estructura del splicing aberrante. El análisis bioinformático ha permitido predecir los posibles diferentes cambios en el splicing que pueden explicar la presencia de dos amplicones al momento de estudiar los sitios de empalme entre los exones constitutivos.
Conclusiones
El análisis bioinformático permitió predecir
cuatro posibles sitios de splicing alternativos
que pueden explicar la presencia de los dos
picos en las curvas de melting de las regiones
interexónicas
estudiadas,
notoriamente
permitió la identificación de la deleción de
30pb en el exón 6 la cual ya ha sido reportada
también en estudios previos. La confirmación
de la presencia de estos procesamientos no
canónicos seria definitiva mediante la
secuenciación de estas regiones, sin embargo,
hasta este punto
los resultados de la caracterización molecular solamente han resultado en la identificación del splicing canónico. No obstante, se seguirán continuando los esfuerzos para lograr identificar estas posibles nuevas variantes de splicing.Referencias
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