INSTITUTO TECNOLÓGICO DE COLIMA
EFECTO DE LA INHIBICIÓN DE METALOPROTEÍNASAS (MMPS) SOBRE LA PROLIFERACIÓN DE LÍNEAS CELULARES DE CÁNCER
CERVICO-UTERINO: ESTUDIO PRECLÍNICO IN VITRO.
OPCION I
TESIS PROFESIONAL
Que para obtener el título de:
INGENIERO BIOQUIMICO
Presenta:
ALEJANDRO DAVID SORIANO HERNANDEZ.
Asesores: Universidad de Colima
DIRECTOR DE TESIS: Doctor.- Iván Delgado Enciso. Instituto Tecnológico de Colima
ASESOR: M.C. - Luís Alfonso Núñez Plascencia.
DEDICATORIA.
Quiero dedicar mi formación profesional a ese hombre que todo nos ha dado que casi de sol a sol a trabajado que su único afán era sacar a su familia adelante que nos a dado todo su amor que es lo más importante.a ese hombre el cual yo no se si será el mejor del mundo, el mas fuerte, el mas listo, el mas prudente eso no lo se, pero de una cosa si estoy seguro y es que para mi eres un gran hombre, gracias jefe por estar siempre conmigo y nunca dejarnos.
Deseo agradecer profundamente a la casualidad que la vida me otorgó al haberme puesto en un hogar maravilloso al nacer.
Agradezco a dios por haber permitido el tener a una jefa como la mía, gracias madre por estar siempre conmigo y por brindarme tu apoyo incondicional.
Agradezco a mis hermanos ya que sin ellos el placer cotidiano de vivir sería simple monotonía. Es difícil imaginar cómo sería el andar cotidiano sin recordar su comprensión, su apoyo inmenso, nuestras pequeñas diferencias y su amor. Gracias hermanos por compartir y dedicar gran parte de sus vidas conmigo hacia la perspectiva de un nuevo día; de verdad serán inolvidables.
Agradezco a mis tíos que siempre han estado cerca de mí y quienes siempre han velado por que esta meta fuera alcanzada, quienes siempre me han apoyado y quienes nunca perdieron la fe en mi, les agradezco que si alguna vez vieron que en algún momento empecé a flaquear siempre estuvieron ahí para apoyarme, GRACIAS TIOS: Leopoldo, Carmen, Miguel Ángel, Marisela, Gloria, Roberto.
A todos mis primos.
A mi Director de Tesis: Dr. Iván Delgado Enciso por su asesoramiento científico y estímulo para seguir creciendo intelectualmente.
A mis maestros del Instituto Tecnológico de Colima quienes me dieron parte de sus conocimientos y contribuyeron a mi desarrollo intelectual.
A las personas que aunque no estén físicamente pero siempre las recordaremos. A Dalia por apoyarme,por darme su comprensión, su cariño y su amor. Gracias por hacer de esos momentos un verdadero vivir
CONTENIDO PÁGINA
*.-RESUMEN……….1
1.- INTRODUCCION……….2
1.1.-Cáncer………..2
2.- ANTECEDENTES………3
2.1.- El Cáncer en México………..3
2.2.- ¿Qué es el Cáncer Cervico Uterino?...4
2.3.- Epidemiología e impacto………....5
2.4.- Oncogenesis………6
2.5.- Metaloproteinasas (MMPs)………6
2.6.- Inhibidores de MMPs y Anti-inflamatorios………7
2.7.- Inhibición de MMPs en Neoplasias………8
2.8.- Anti-inflamatorios en Neoplasias………...9
2.9.- Inhibidores Selectivos de COX-2……….10
2.10.- Amplio Espectro de Inhibidores de MMPs………12
3.- JUSTIFICACION………13
4.- HIPOTESIS……….13
5-OBJETIVO GENERAL………14
5.1-OBJETIVOS ESPECIFICOS……….14
6- MATERIALES Y MÉTODOS………15
6.1.- Metodología………..15
6.2.- Ensayo de Citotoxicidad………...15
6.3.- Secuencia de ensayos………16
6.4.- Análisis de Resultados………..17
7- RESULTADOS………18
7.1.- Primer ensayo………...18
7.2.- Segundo ensayo………24
7.3.- Tercer ensayo………28
8- DISCUSION………32
9- CONCLUSION………...34
10- PERSPECTIVAS………..35
INDICE DE FIGURAS PÁGINA Figura 1. Tejido con células cancerosas………..4
Figura 2.- Efecto sobre las células HELA tras la exposición……….…18 a los diferentes fármacos
Figura 3.- Efecto sobre las células VIPA tras la exposición……….….19 a los diferentes fármacos
Figura 4.- Efecto sobre las células INBL tras la exposición………..20 a los diferentes fármacos
Figura 5.- Efecto sobre las células SIHA tras la exposición………..21 a los diferentes fármacos
Figura 6.- Fármacos más efectivos sobre la línea celular HELA; ………….…22
Figura 7.- Fármacos más efectivos sobre la línea celular VIPA; ………….….22
Figura 8.- Fármacos más efectivos sobre la línea celular INBL; ………….….22
Figura 9.-Fármacos más efectivos sobre la línea celular VIPA; ………...22
Figura 10.- Efectividad promedio de los cinco mejores fármacos…………....23 sobre las líneas celulares de Cáncer Cérvico-Uterino,
Figura 11.- Promedio de la Viabilidad de las Líneas Celulares………...25 al ser expuestas a los fármacos:
Figura 12.- Promedio de la Viabilidad de las Líneas Celulares……….25 al ser expuestas a los fármacos
Figura 13.- Promedio de la Viabilidad de las Líneas Celulares………...26 al ser expuestas a los fármacos:
Figura 14.- Promedio de la Viabilidad de las Líneas Celulares……….26 al ser expuestas a los fármacos:
Figura 15.- Promedio de la Viabilidad de las Líneas Celulares………….……26 al ser expuestas a los fármacos:
Figura 16.- Quimioterapeuticos aplicados a las líneas celulares…………..….29 de manera individual.
Figura 17.- Quimioterapeutico y combinación….……….…....30
Figura 18.- Quimioterapeutico y combinación……….…...30
INDICE DE TABLAS PÁGINA
Tabla1.- Líneas celulares de cáncer………...15 Cérvico-uterino
Tabla2.- concentración de los inhibidores……….16 y/o anti-inflamatorios
Tabla3.- Concentraciones utilizadas de anticancerosos………17
Tabla 4.- Mejores fármacos seleccionados………...23
Tabla 5.-Concentraciones altas y bajas……….24 utilizadas en el segundo ensayo, concentraciones alcanzadas
en plasma con las dosis habituales de los fármacos en humanos.
Tabla 6.- Fármacos utilizados en el segundo ensayo………24
Tabla 7.- Porcentajes de Viabilidad celular………..27 tras la exposición a las mejores combinaciones de fármacos.
Tabla8.- Concentraciones utilizadas de anti-cancerosos………...…...28
Tabla 9.- Esquema de combinaciones y
RESUMEN
Dentro de las neoplasias malignas, el cáncer cérvico-uterino (CaCU) es uno de los principales problemas de salud pública a nivel mundial. En México es de los tumores que más muertes causa en la población femenina. Dentro de las enzimas que recientemente se han involucrado en la génesis y propagación se encuentran las metaloproteinasas de la matriz extracelular (MMPs). Estas enzimas están presentes en los individuos sanos pero son producidas en mayor cantidad en varios tipos de neoplasias. Recientemente se ha propuesto que la inhibición de MMPs puede ser una herramienta terapéutica que ayude a combatir a las neoplasias malignas.
Se determinó la eficiencia de ocho inhibidores de MMPs: Celecoxib, Sulindaco,
Dexametasona, Nimesulide, Doxiciclina, Ac meclofenámico, Ciprofloxacina, Griseofulvina, los cuales han sido poco estudiados en líneas celulares de Cancer
Cérvico-Uterino, para disminuir la proliferación neoplásica de líneas celulares de Cáncer Cérvico-Uterino.
Se realizaron tres ensayos, el primer ensayo fue de selección y determinación de la concentración optima de los fármacos, en el segundo ensayo con los mejores fármacos seleccionados se llevaron a cabo combinaciones entre ellos para determinar la mejor combinación, en el tercer ensayo las mejores combinaciones se potenciaron con los quimioterapéuticos, 5-Fluorouracil y Epirubicina.
Se encontró que los inhibidores; Ac Meclofenámico, Griseofulvina, Ciprofloxacina, Doxiciclina y Nimesulide, de manera individual o combinada con los quimioterapéuticos presentan un porcentaje del 40% al 12% de muerte celular sobre las líneas celulares de Cáncer Cérvico-Uterino.
En conclusión los inhibidores de MMPs pueden en un futuro ser una alternativa en el tratamiento del Cáncer Cérvico-Uterino.
1. INTRODUCCION
1.1 CANCER
El cáncer surge cuando las células de alguna parte del cuerpo comienzan a crecer sin control. Aunque existen muchos tipos de cáncer, todos comienzan debido al crecimiento
sin control de células anormales1. Las células normales del cuerpo crecen, se dividen y
mueren en una forma ordenada. Durante los primeros años de vida de una persona, las células normales se dividen con más rapidez hasta que la persona alcanza la edad adulta. Posteriormente, las células normales de la mayoría de los tejidos sólo se dividen para reemplazar las células desgastadas o moribundas y para reparar las lesiones1.
Debido a que las células cancerosas continúan creciendo y dividiéndose, son diferentes de las células normales. En lugar de morir, viven más tiempo que las células normales y continúan formando nuevas células anormales. Las células cancerosas surgen como consecuencia de daños en el ADN. Esta sustancia se encuentra en todas las células y dirige sus funciones. La mayoría de las células en las que su ADN se daña, la célula muere o ésta puede reparar el ADN. En las células cancerosas el ADN no se repara. Las personas pueden heredar ADN dañado, que es responsable de los tipos de cáncer hereditarios. Sin embargo, en la mayoría de las ocasiones el ADN de las personas se
daña como consecuencia de alguna exposición ambiental como el fumar1.
El cáncer usualmente asume forma de tumores. Algunos tipos de cáncer, como la leucemia, no forman tumores, sino que estas células cancerosas afectan la sangre y los órganos que producen la sangre (la médula ósea, el sistema linfático y el bazo) y circulan a través de otros tejidos en los que se pueden acumular.
Recuerde que no todos los tumores son cancerosos. Los tumores benignos (no cancerosos) no se propagan y, con muy raras excepciones, no constituyen una amenaza
para la vida.Los diferentes tipos de cáncer pueden comportarse de maneras diferentes.
2. ANTECEDENTES
2.1 EL CÁNCER EN MÉXICO
Las enfermedades oncológicas en México representan pérdidas millonarias para los diversos institutos y sistemas de salud que brindan atención médica, debido a que en el país no existe una verdadera cultura de prevención2.
El Hospital Oncológico del IMSS es uno de los centros más importantes de la República Mexicana y debido a la concentración de especialidades médicas e infraestructura tecnológica, en él se atiende a pacientes de zonas con mayor incidencia de cáncer, como son Morelos, Querétaro, Chiapas, Guerrero y el Distrito Federal. Sin embargo, a pesar de los esfuerzos realizados en torno al padecimiento, en el hospital fallecen
mensualmente 35 personas2.
A partir de la década de los noventa, los tumores malignos son la segunda causa de muerte en el país después de las enfermedades cardiovasculares, y de acuerdo con el
Registro Histopatológico de Neoplasias de 1993 a 1996, el cérvico-uterino se
encontraba en el primer lugar, registrando 22 mil casos por año; luego el de mama, con 11 mil 139; el de próstata, con 6 mil 146; y de ganglios linfáticos, con 4 mil 594 casos, en población general. Del total de los casos de cáncer, el 63.5 por ciento fueron de sexo femenino y el 35.3 de masculino3.
El cáncer cérvico-uterino (CaCU), se registra con mayor prevalencia en entidades del sur de la República que en las del norte, y esto se debe a diferentes factores que tienen que ver con el medio ambiente, la edad, la dieta y el estilo de vida de las mujeres. Aunque en el 98% de los casos la neoplasia puede ser detectada en forma temprana con la citología cervical (Papanicolau), la realidad es que sólo 126 mujeres de cada 100 mil entre 15 y 49 años de edad recurren a este examen. De ahí, que en México se presenten
15 mil 500 casos nuevos y 4 mil 500 defunciones por año a causa del mal3.
Aunque los programas de detección temprana están ampliamente implementados en nuestro país, la mayoría de las mujeres aún son diagnosticadas en estadios invasores, en muchos de los cuales la intervención quirúrgica no es una opción terapéutica recomendable4,5.
2.2 ¿QUÉ ES EL CÁNCER CÉRVICO-UTERINO?
El cáncer del cuello de la matriz o cérvico-uterino (CaCu) es un problema de salud pública a nivel mundial, que afecta con mayor intensidad a mujeres de habla hispana y en particular a las latinoamericanas de edad productiva siendo la causa número uno de
mortalidad por neoplasia maligna en las mujeres de países en vías de desarrollo6. Se
estima que la tasa de incidencia de CaCu desde 1980 se ha incrementado considerablemente y que desde ese mismo año ocupa la segunda causa de muerte por cancer en mujeres en todo el mundo. Los trabajos desarrollados al respecto indican que la gran mayoría de los casos se encuentran en poblaciones latinas3.
Las mujeres latinas de 35 a 55 años de edad padecen con mayor frecuencia CaCU, a pesar de las campañas de detección oportuna de cáncer (DOC). En los sistemas de salud de América Latina, el CaCu y el cáncer de mama, están incluidos en los programas prioritarios de atención médica; sin embargo la mortalidad por estas dos entidades no ha mejorado en forma significativa debido a las bajas coberturas existentes7.
El cáncer cérvico uterino, una clase común de cáncer en la mujer, es una enfermedad en la cual se encuentran células cancerosas (malignas) en los tejidos del cuello uterino. El cuello uterino es la abertura del útero, el órgano hueco en forma de pera donde se desarrolla el feto, y lo conecta con la vagina (canal de nacimiento)8.
El cáncer cérvico uterino suele crecer lentamente por un período de tiempo. Antes de
que se encuentren células cancerosas Figura-1, en el cuello uterino, sus tejidos
experimentan cambios y empiezan a aparecer células anormales (proceso conocido como displasia) 8.
La prueba de Papanicolaou generalmente encuentra estas células. Posteriormente, las células se transforman y adquieren un fenotipo maligno o canceroso por lo que comienzan a crecer y se diseminan con mayor profundidad en el cuello uterino y en las áreas circundantes8 y finalmente a órganos vitales.
Ya que en general no hay síntomas asociados con el cáncer cérvico-uterino, el médico debe hacer una serie de pruebas para buscar el cáncer. La primera prueba es la de Papanicolaou, que se lleva a cabo usando un pedazo de algodón, un cepillo o una espátula de madera pequeña para raspar suavemente el exterior del cuello uterino con el fin de recoger células. La paciente puede sentir algo de presión, pero generalmente no se siente dolor8.
Si se encuentran células anormales, el médico tendrá que extraer una muestra de tejido (biopsia) del cuello uterino que es analizada a través del microscopio para ver si hay células cancerosas. Para efectuar una biopsia sólo se necesita una pequeña cantidad de tejido y puede hacerse en el consultorio médico. Si para hacer la biopsia el médico necesita extraer una muestra mayor en forma de cono (conización), la paciente quizás tenga que ir al hospital. El pronóstico (posibilidades de recuperación) y la selección del tratamiento dependen de la etapa en que se encuentra el cáncer (si se encuentra en el cuello uterino o si se ha diseminado a otros lugares) y el estado de salud en general de la paciente8.
2.3 EPIDEMIOLOGÍA E IMPACTO.
El cáncer cérvico-uterino (CaCU) es la cuarta causa de muerte por cáncer en mujeres a
nivel mundial9, pero en México es una de las dos principales causas de mortalidad por
cáncer en el sexo femenino (tasa de mortalidad: 14.0/100,000 mujeres mayores de 15 años)9. Este cáncer tiene un enorme impacto sobre la estructura familiar y social, ya que estas mujeres mueren en una etapa aún productiva (tasa de mortalidad grupo etáreo
45-64 años: 32.3/100,000 mujeres del mismo grupo)10. Aunque los programas de detección
2.4 ONCOGÉNESIS:
El CaCU es una enfermedad multifactorial y hasta la fecha, el único factor identificado directamente con su desarrollo, es la infección crónica por los papilomavirus humanos
(PVHs) de alto riesgo (tipos 16, 18, 31, 45, etc.)12. Durante un ciclo normal del PVH,
éste es capaz de replicarse (ciclo lítico). Sin embargo, alteraciones en el genoma viral pueden modificar el patrón normal de expresión y bloquear el ciclo lítico. Esto puede ser causado por la integración viral al genoma celular, lo cual inactiva secuencias necesarias para la replicación; o por la acumulación de mutaciones que modifican secuencias reguladoras del virus. Esto puede traer como consecuencia la
sobre-expresión de los oncogenes virales E6 y E7 en el estrato basal del epitelio cervical, lo
cual propicia la transformación maligna mediante dos mecanismo básicos: la desregulación del ciclo celular y el bloqueo de la apoptosis. Estos son básicamente los eventos moleculares que desencadenan la transformación maligna. Sin embargo, un sin numero de genes celulares son estimulados por los oncogenes virales (E6/E7), muchos de los cuales favorecen la transformación maligna, el crecimiento neoplásico y/o la diseminación tumoral. Recientemente un grupo de genes celulares, las Metaloproteinasas de la Matriz Extracelular (MMPs), han sido involucrados en los procesos de transformación y diseminación neoplásica, mostrando que son piezas
importantes de la biología molecular del CaCU y de muchas otras neoplasias12.
2.5 MMPs (Metaloproteinasas).
Las MMPs son una gran familia de 20 enzimas proteolíticas. Estas enzimas están presentes en los individuos sanos pero son producidas en mayor cantidad en varios tipos de neoplasias. Históricamente las MMPs fueron consideradas importantes en la invasión del cáncer y en aparición de metástasis, pues son capaces de degradar las barreras
neoplásicas impuestas por la matriz extracelular y la membrana basal13,14.Sin embargo,
recientemente se ha demostrado que las MMPs están también involucradas en varios pasos del desarrollo del cáncer, ya que son capaces de modular la proliferación celular,
la apoptosis y la respuesta inmune15. Las MMPs además de hidrolizar o degradar al
colágeno, el cual es el mayor componente estructural de la membrana basal16, también
factor-binding protein, en ingles) con la subsiguiente liberación del factor de crecimiento, el cual es bien conocido que tiene un fuerte efecto sobre la estimulación de la proliferación celular e inhibición de la apoptosis12. Por otra parte, la MMP-1, a través de su receptor PAR-1, se ha demostrado que puede promover el crecimiento y la
invasión del cáncer de mama17. La MMP-3 puede modificar la invasividad del cáncer de
mama mediante una vía no muy clara, pero que se sabe involucra la activación del
plasminógeno.18 Adicionalmente, se ha hipotetizado que la MMP-2 y -9 son capaces de
modificar la expresión (directa o indirectamente) de genes supresores de tumores19.
Estas actividades sustentan la creencia de que las MMPs pueden estar involucradas tanto en la génesis de neoplasias como en su diseminación.
Se ha observado que la expresión de E7 (de los PVHs de alto riesgo) es capaz de activar a miembros de las MMPs, siendo esto un indicio de que las MMPs pueden jugar un papel importante en el ciclo del PVH durante la transformación maligna de cérvix
uterino20. También se ha demostrado que durante las primeras fases de invasión del
CaCU, es más importante la expresión de MMP-2 y MMP-9 que la propia expresión de
las oncoproteínas virales E6/E7 de PVH21. En biopsias de CaCU, se ha observado una
sobre-expresión de MMP-1, -2 y -9, determinándose que a mayor expresión de MMPs,
las pacientes presentan un peor pronóstico y/o mayor invasividad tumoral22,23,24,25,26.
Debido a esta activa participación de las MMPs en los procesos de transformación maligna, crecimiento, diseminación e incluso en la angiogenesis de los tumores, actualmente se comienza a proponer la inhibición de estas proteínas como estrategia terapéutica en contra del cáncer27.
2.6 INHIBIDORES DE MMPS Y ANTI-INFLAMATORIOS: Algunos de los
fármacos más estudiados para inhibir a las MMPs son antibióticos, siendo17, la
doxiciclina (una tetraciclina) 18 una de las que más se han investigado. La inhibición de MMPs por estos antibióticos es un efecto colateral y no tiene relación con el efecto
antimicrobiano de estos componentes18. Los anti-inflamatorios son fármacos que
generalmente tienen efectos analgésicos así como actividad antirreumática. En ensayos realizados se presume que algunos de estos anti-inflamatorios presentan inhibición en la síntesis reguladora de prostaglandinas por consiguiente son fármacos que intervienen directamente en la inhibición de prostaglandinas vía síntesis de ciclooxigenasa (COX)
2.7 INHIBICIÓN DE MMPS EN NEOPLASIAS:
Diversos inhibidores de MMPs han sido probados exitosamente en ensayos preclínicos
(estudios in Vitro o in vivo) y clínicos (en humanos) para diversas neoplasias. El
inhibidor sintético AG3340, fue capaz de inhibir el crecimiento en un 78% y de
incrementar al doble la supervivencia de ratones con tumores de glioblastoma18. El
inhibidor TIMP-3 causó reducción del crecimiento de líneas celulares de carcinoma de colon. Un extracto de B. diffusa, el cual inhibe a MMP-2 y MMP-9, reduce un 87% la
aparición de metástasis en un modelo murino de melanoma20. La doxiciclina fue capaz
de restar el crecimiento y disminuir la invasividad de células de carcinoma de colon, lo
cual fue potenciado cuando se combinó con un inhibidor de COX-2 21. Sin embargo, el
resultado más relevante, es el obtenido en ensayos clínicos (en humanos) en pacientes con cáncer pancreático, en donde un inhibidor de MMPs llamado Marimastat, tuvo efectos antineoplásicos al mismo nivel que los quimiotratamientos establecidos, por lo
que es postulado como un fármaco que podría ser de primera línea para esta neoplasia22.
2.8 ANTI-INFLAMATORIOS EN NEOPLASIAS.
Muchos anti-inflamatorios son capaces también de inhibir a las MMPs y pueden ocasionar efectos antineoplásicos al inhibir a estas proteínas. Sin embargo, los anti-inflamatorios pueden tener efectos anti-neoplásicos a través de inhibir otras proteínas como la enzima COX-2, o inhibir la producción de metabolitos como las prostaglandinas17, 18.
Se ha sugerido que diversos fármacos anti-inflamatorios y/o inhibidores de MMP-2 pueden tener efectos antineoplásicos, aunque no han sido nada o poco estudiados contra el CaCU 19.
Entre los fármacos que tienen efectos anti-inflamatorios y/o inhiben a las MMPs y que podrían tener efecto antineoplásico destacan los siguientes:
-Doxiciclina. -Nimesulide. -Celecoxib. -Griseofulvina. -Ciprofloxacina. -Ac Meclofenámico. -Sulindac.
-Dexametasona.
1.- Doxiciclina:
Está indicada en infecciones causadas por Rickettsias, Mycoplasma pneumoniae, Chlamydia, Borrelia y en una gran variedad de gérmenes gramnegativos y Gram positi-vos, entre los que destacan los Streptococcus sp y Staphylococcus aureus. Los efectos adversos son poco frecuentes27.
Se ha demostrado que la doxiciclina es capaz de inhibir directa o indirectamente al menos a MMP-1,-3 y 9, siendo esto suficiente para lograr efectos benéficos (en estudios
in vitro o modelos animales) en enfermedades donde las MMPs tienen un efecto
adverso23,24,25,26. Sin embargo, la doxiciclina no es capaz de inhibir a la MMP-2, por lo que se ha observado que cuando se combina con fármacos que inhiben a MMP-2, como lo son los inhibidores selectivos de la ciclo-oxigenasa-2 (COX-2), sus efectos (como
2.9.-INHIBIDORES SELECTIVOS DE COX-2: Entre los medicamentos más
empleados se encuentran la Nimesulide y el Celecoxib.
2) Nimesulide: Este medicamento esta indicado como analgésico, antipirético y
anti-inflamatorio del tejido blando; como coadyuvante en el tratamiento de padecimientos que cursen con inflamación, dolor y fiebre27.
3) Celecoxib: Se usa para aliviar el dolor, sensibilidad, inflamación (hinchazón) y la
rigidez causada por la osteoartritis y la artritis reumatoide y la espondilitis anquilosante, el dolor menstrual, entre otros usos. 23.
Se ha demostrado que los inhibidores de COX-2, como la nimesulide, son capaces de
reprimir en un 25 a 30% la expresión y actividad de MMP-2 y MMP-923, con lo cual se
ha logrado disminuir el crecimiento celular23 y el crecimiento tumoral y reducir la
invasividad de ciertas neoplasias en ensayos pre-clínicos (cultivo celular y modelos murinos)23,24, 25.
4.- Griseofulvina: La Griseofulvina es un producto metabólico de ciertas especies de
Penicillium. Aún no se conoce el mecanismo de acción preciso de la Griseofulvina, que es fungostática y no fungicida en altas concentraciones. Interfiere en la síntesis de las proteínas y los ácidos nucleicos de la pared celular de hongos en crecimiento activo.
La Griseofulvina ha demostrado ser antiinflamatoria28. Aunque no se ha estudiado su
efecto en la expresión de MMPs existen evidencias de que podría influir en este proceso. Se ha demostrado que la griseofulvina tiene efectos anti-inflamatorios, además de ser capaz de propiciar fibrosis hepática en ratones, los cuales son fenómenos que se
asocian frecuentemente con inhibición de MMPs29.
5.- Ciprofloxacina:
La ciprofloxacina es un agente antimicrobiano de la clase de las fluoroquinolonas. Es activo frente a un amplio espectro de gérmenes gram-negativos aerobios, No es activo frente a gérmenes anaerobios28.
Se ha demostrado en diversos ensayos con células de tendón humano, así como de
6.- Ac Meclofenámico: El ácido meclofenámico es un agente anti-inflamatorio no
esteroídico. El ácido meclofenámico se utiliza como analgésico y para aliviar la dismenorrea primaria. También se utiliza en el tratamiento de la artritis reumatoide y osteoartritis. Tiene actividad antipirética. Los efectos anti-inflamatorios de este fármaco resultan de una inhibición periférica de la síntesis de prostaglandinas producida por la
inhibición de la enzima ciclooxigenasa28. No se estudiado la utilidad antineoplásica de
este fármaco.
7.- Sulindac: El sulindac se usa para aliviar el dolor, sensibilidad, inflamación
(hinchazón) y la rigidez causada por la osteoartritis (artritis causada por un deterioro del recubrimiento de las articulaciones), la artritis reumatoide (artritis causada por la hinchazón del recubrimiento de las articulaciones) y la espondilitis anquilosante (artritis que afecta principalmente la columna vertebral), entre otros males. Funciona al detener la producción de una sustancia que causa dolor, fiebre e inflamación28.
Aunque el sulindaco es un quimiopreventivo y tiene propiedades antitumorales su mecanismo molecular que propicia esta inhibición tumoral aún no esta bien definido. Se cree que existen dos quinasas (Akt/protein kinase B, serie/threonine kinase) que están implicadas en la invasividad del cáncer y regulando a éstas con sulindac se tendrían mejores efectos al inhibir la producción de MMP-2 y la invasividad de células glioblastomales. Los resultados proporcionan pruebas que la regulación de Akt y MMP-2 puede ser uno de los mecanismos por los cuales sulindac y su metabolitos inhiben la invasión de célula glioblastomal34.
8.- Dexametasona: La dexametasona y sus derivados, dexametasona fosfato sódico y
dexametasona acetato son glucocorticoides sintéticos utilizados como anti-inflamatorios e inmunosupresores. La dexametasona es considerada el corticoide de elección para tratar el edema cerebral ya que es el que mejor penetra en el sistema nervioso central. Como glucocorticoide, la dexametasona es unas 20 veces más potente que la hidrocortisona y 5 a 7 veces más potente que la prednisona. Además es uno de los
corticoides de acción más prolongada28. Se ha demostrado que el uso de
glucocorticoides reduce la función de la membrana celular así como reducir la
2.10 AMPLIO ESPECTRO DE INHIBIDORES DE MMPS
Todos los fármacos anteriormente mencionados tienen dos características que los hacen
atractivos para su estudio: 1) han probado que son capaces de inhibir a MMPs y 2) Son
medicamentos ampliamente estudiados para su uso en humanos y la gran mayoría están disponibles en los sistemas de salud pública de México. Por lo anterior, estos fármacos resultarían idóneos como tratamiento para CaCU. Sin embargo, es necesario valorar la eficacia antitumoral de estos fármacos en modelos de estudio pre-clínicos para conocer si pueden brindar beneficios a pacientes humanos. Los estudios pre-clínicos son aquellos que se realizan en sistemas no humanos y que sirven para valorar la eficacia o toxicidad de un fármaco antes de valorar su uso en humanos. Los ensayos preclínicos generalmente re realizan in Vitro (en líneas celulares-células humanas) y en modelos animales (generalmente murinos).
En el presente trabajo nos propusimos probar la actividad antineoplásica de los
3. JUSTIFICACIÓN
Siempre es necesario abordar un padecimiento desde varios niveles, tanto preventivos como terapéuticos, ya que en países como México, la mortalidad por CaCU es un problema de salud pública; pues aunque los programas de detección temprana de CaCU están ampliamente implementados en nuestro país, un gran número de las mujeres con CaCU aún son diagnosticadas en estadios avanzados. En estos estadios (IIb o superiores) el tratamiento quirúrgico (único con potencial curativo) ya no es una opción recomendable y solo se pueden utilizar la quimioterapia y la radioterapia. Estos últimos, además de ser únicamente paliativos en la mayoría de los casos, pueden no ser eficaces en el control de la enfermedad y suelen ser acompañados de efectos adversos que interfieren con la calidad de vida de la paciente. Bajo los tratamientos actuales, se ha estimado que la supervivencia a cinco años en pacientes con estadio III o IV no es superior al 35 %. Por lo anterior, son necesarios nuevos esquemas terapéuticos que ayuden a mejorar la supervivencia y calidad de vida de los pacientes que padecen CaCU. En este contexto, la inhibición de las MMPs es una nueva estrategia prometedora en la lucha contra el cáncer, la cual no ha sido explorada para el tratamiento de CaCU, siendo esto ultimo la principal justificación del estudio. Adicionalmente es importante mencionar que la inhibición de MMPs se puede generar con la administración de fármacos poco tóxicos y muy accesibles en nuestro medio.
4. HIPÓTESIS.
5. OBJETIVO PRINCIPAL
Determinar la eficiencia de fármacos inhibidores de metaloproteínasas (Celecoxib, Sulindaco, Dexametasona, Nimesulide, Doxiciclina, Ac meclofenámico, Ciprofloxacina, Griseofulvina) para disminuir la proliferación neoplásica de líneas celulares del cervix-uterino.
5.1. OBJETIVOS ESPECIFICOS
1.- Establecer la utilidad de los inhibidores de MMPs, Celecoxib, Sulindaco,
Dexametasona, Nimesulide, Doxiciclina, Ac meclofenámico, Ciprofloxacina, Griseofulvina para el tratamiento del CaCU en un modelo in Vitro, de manera
individual y combinada.
2.- Establecer la utilidad de los mejores fármacos estudiados en combinación con los
6. MATERIALES Y METODOS
6.1 Metodología.
Líneas celulares: Las células humanas de CaCU que se emplearon se presentan en la
tabla1:
Tabla1.- Líneas celulares de cáncer Cérvico-uterino
Línea celular. Tipo de Cáncer.
Siha Cervix.
Hela Cervix.
INBL Cervix.
VIPA Cervix.
● Todas las líneas celulares fueron manejadas en campana de flujo laminar clase II A2,
mantenidas en medio DMEM (Sigma, St. Louis, MO, USA) suplementadas con 10% (v/v) de suero bovino fetal (SBF) (GIBCO, Gaithersburg, MD, USA) a 37 °C, 5% CO2 y 97% de humedad relativa.
6.2 Ensayo de Citotoxicidad
● El efecto antineoplásico de los fármacos en las líneas celulares se determinó mediante
un ensayo de medición de actividad metabólica con un agente redox (Azul Alamar®). Para estos estudios se utilizó un formato de plato de cultivo de 96 pozos, en el cual se
sembro 1x104 células en medio DMEM con 2% de SBF, descartando los pozos
6.3 Secuencia de Ensayos:
Primer ensayo: Se determino la citotoxicidad con los fármacos aislados, de donde se
seleccionaron a los mejores fármacos, definidos como aquellos fármacos que causaron más del 10% de muerte celular con respecto al control en 2 o más líneas celulares de CaCU.
Los fármacos probados se presentan en la tabla 2, para este ensayo inicial y de
selección se probaron tres diferentes concentraciones para poder establecer un criterio de citotoxicidad de los fármacos sobre las Líneas Celulares.
Tabla2.- Concentración de los inhibidores y/o anti-inflamatorios
Concentraciones (µM) Medicamento
1 2 3
Ac Meclofenámico. 10 100 200
Nimesulide. 10 100 200
Sulindaco. 10 100 200
Doxiciclina. 10 100 200
Griseofulvina. 10 100 200
Celecoxib. 10 100 200
Ciprofloxacina. 10 100 200
Dexametasona. 10 100 200
● El efecto antineoplásico de los fármacos en las líneas celulares se determinó mediante
un ensayo de medición de actividad metabólica con un agente redox (Azul Alamar®), al tercer día de exposición.
Segundo ensayo: Con los mejores fármacos ya seleccionados en el primer ensayo se
llevaron a cabo combinaciones a concentraciones que son alcanzadas en plasma con las
dosis habituales de los fármacos en humanos. Se manejaron dos tipos de
concentraciones una concentración alta y una concentración baja.
● El efecto antineoplásico de los fármacos en las líneas celulares se determinó
mediante un ensayo de medición de actividad metabólica con un agente redox (Azul Alamar®), al cuarto día de exposición.
Tercer ensayo: Con las combinaciones de fármacos realizados en el segundo ensayo, se
procedió a utilizarlos junto con quimioterapéuticos anticancerosos. (5-Fluorouracil y Epirubicina) estos últimos empleados a concentraciones subclínicas (concentraciones bajas) y terapéuticas (concentraciones altas), ver tabla 3. Los anti cancerosos a emplear se seleccionaron por ser de los más usados en contra de estas neoplasias en nuestro medio41, 42, 43.
Tabla3.- Concentraciones utilizadas de anticancerosos.
Anti-Cancerigenos Concentración alta. Concentración baja.
5-Fluorouracil 2µgr/ml. 1µgr/ml.
Epirubicina. 12ngr/ml. 6ngr/ml.
● El efecto antineoplásico de los fármacos en las líneas celulares se determinó mediante
un ensayo de medición de actividad metabólica con un agente redox (Azul Alamar®), al cuarto día de exposición. .
6.4 Análisis de resultados.
7. RESULTADOS 7.1 PRIMER ENSAYO
Las células se expusieron a los ocho fármacos a tres diferentes concentraciones. En las siguientes figuras se presentan los efectos de los fármacos sobre las líneas celulares:
3er dia HELA (celecoxib.)
0 20 40 60 80 100
10 100 200
Concentracion (mM). % d e V ia b il id a d .
3er dia HELA (Sulindaco)
0 20 40 60 80 100
10 100 200
Concentracion (mM) % d e V ia b il id a d
3er dia HELA (dexametasona)
0 20 40 60 80 100
10 100 200
Concentracion (mM) % d e V ia b il id a d .
3er dia HELA (nimesulide)
0 20 40 60 80 100
10 100 200
Concentracion (mM) % d e V ia b ilid a d
3er dia HELA (doxiciclina)
0 20 40 60 80 100 120
10 100 200
Concentracion (mM) % d e V ia b ilid a d .
3er dia HELA (Ac Meclofenámico)
0 20 40 60 80 100
10 100 200
Concentracion (mM) % d e Via b ilid a d
3er dia HELA (Ciprofloxacina)
0 20 40 60 80 100
10 100 200
Concentracion (mM) % d e V ia b ilid a d
3er dia HELA (Griseofulvina)
0 20 40 60 80 100 120
10 100 200
Concentracion (mM) % d e V ia b il id a d
3er dia VIPA (Celecoxib) 0 20 40 60 80 100
10 100 200
Concentracion (mM) % d e V ia b ilid a d
3er dia VIPA (Sulindaco)
0 20 40 60 80 100
10 100 200
Concentracion (mM) % d e Via b ilid a d
3er dia VIPA (Dexametsona)
0 20 40 60 80 100
10 100 200
Concentracion (mM) % d e V ia b ilid a d
3er dia VIPA (Nimesulide)
0 20 40 60 80 100
10 100 200
Concentracion (mM) % d e V ia b ilid a d
3er dia VIPA (Doxiciclina)
0 20 40 60 80 100
10 100 200
Concentracion (mM) % d e V ia b ilid a d
3er dia Vipa (Ac Meclofenámico)
0 20 40 60 80 100 120
10 100 200
Concentracion (mM) % d e V ia b ilid a d .
3er dia VIPA (Ciprofloxacina)
0 20 40 60 80 100
10 100 200
Concentracion (mM) % d e Via b ilid a d
3er dia VIPA (Griseofulvina)
0 20 40 60 80 100
10 100 200
Concentracion (mM) % d e Via b il id a d
3er Dia INBL (Celecoxib) 0 20 40 60 80 100
10 100 200
Concentracion (mM) % d e V ia b ilid a d
3er Dia INBL (Sulindaco)
0 20 40 60 80 100
10 100 200
Concentracion (mM) % d e Vi a b ili d a d
3er Dia INBL (Dexametasona)
0 20 40 60 80 100
10 100 200
Concentracion (mM) % d e Vi a b ili d a d
3er Dia INBL (Nimesulide)
0 20 40 60 80 100
10 100 200
Concentracion (mM) % d e V ia b ilid a d
3er Dia INBL (Doxiciclina)
0 20 40 60 80 100
10 100 200
Concentracion (mM) % d e V iab il id ad
3er Dia INBL (Ac Meclofenámico)
0 20 40 60 80 100 120
10 100 200
Concentracion (mM) % d e Vi a b ili d a d .
3er Dia INBL(Ciprofloxacina)
0 20 40 60 80 100
10 100 200
Concentracion (mM) % d e V ia b ilid a d
3er Dia INBL (Griseofulvina)
0 20 40 60 80 100
10 100 200
Concentracion (mM) % d e Vi a b ili d a d
3er Dia SIHA (Celecoxib) 0 20 40 60 80 100
10 100 200
Concentracion (mM9 % de V ia bi li da d
3er Dia SIHA (Sulindaco)
0 20 40 60 80 100
10 100 200
Concentracion (mM) % de V ia bi li da d
3er Dia SIHA (Dexametasona)
0 20 40 60 80 100
10 100 200
Concentracion (mM) % d e V ia b ilid a d
3er Dia SIHA (Nimesulide)
0 20 40 60 80 100
10 100 200
Concentracion (mM) % d e V ia b ilid a d
3er Dia SIHA (Doxiciclina)
0 20 40 60 80 100
10 100 200
Concentracion (mM) % d e Via b ilid a d
3er Dia SIHA (Ac Meclofenámico)
0 20 40 60 80 100 120
10 100 200
Concentracion (mM) % de V ia bi li da d.
3er Dia SIHA (Ciprofloxacina)
0 20 40 60 80 100
10 100 200
Concentracion (mM) % d e V ia b il id a d
3er Dia SIHA (Griseofulvina)
0 20 40 60 80 100
10 100 200
Concentracion (mM) % d e Vi a b ili d a d
Figura 5.- Se muestra el efecto sobre las células SIHA tras la exposición a los diferentes fármacos, se
Para la selección de los mejores fármacos se tomo en cuenta la concentración de 100mM. Se analizaron ocho fármacos (anti-inflamatorios e inhibidores de mmps) de los cuales solo cinco ocasionaron mas de 10% de muerte celular a la concentración de 100mM. En las figuras 5 a 8 se muestran a los ocho fármacos a 100mM en las cuatro líneas celulares de Cérvix. En ellas se resalta claramente a los 5 fármacos con mayor y constante efecto antineoplásico.
0 20 40 60 80 100 120
control cele suli dex nime doxi meclo cipro gris
Concentracion 100mM % d e V ia b il id a d
Figura 6.- Fármacos más efectivos sobre la línea celular HELA; Control 100% de viabilidad, Nimesulide 79% de viabilidad, Doxiciclina 68% de viabilidad, Ac Meclofenámico 17% de viabilidad, Ciprofloxacina 96% de viabilidad, Griseofulvina 33% de viabilidad.
0 20 40 60 80 100 120
control cele suli dex nime doxi meclo cipro gris
Concentracion 100mM % de V ia b il ida d
Figura 7.- Fármacos más efectivos sobre la línea celular VIPA; Control 100% de viabilidad, Nimesulide 100% de viabilidad, Doxiciclina 58% de viabilidad, Ac Meclofenámico 37% de viabilidad, Ciprofloxacina 89% de viabilidad, Griseofulvina 78% de viabilidad.
0 20 40 60 80 100 120
control cele suli dex nime doxi meclo cipro gris
Concentracion 100mM % de V ia b il ida d
Figura 8.- Fármacos más efectivos sobre la línea celular INBL; Control 100% de viabilidad, Nimesulide 81% de viabilidad, Doxiciclina 47% de viabilidad, Ac Meclofenámico 15% de viabilidad, Ciprofloxacina 83% de viabilidad, Griseofulvina 49% deviabilidad.
0 20 40 60 80 100 120
control cele suli dex nime doxi meclo cipro gris
Concentracion 100mM % d e Via b ilid a d
Los fármacos que presentaron mas del 10% de muerte celular promedio se muestran en la Tabla 4, aunque el Sulindaco y Celecoxib muestran un efecto importante en VIPA,
este no fue constante en el resto de las líneas Celulares por lo que no fueron seleccionados para pasar al segundo ensayo.
Tabla 4.- Mejores fármacos seleccionados.
Medicamentos. % de
Viabilidad promedio
Valor p*
Ac Meclofenámico. 23 0.029
Nimesulide. 84 0.11
Doxiciclina. 51 0.029
Ciprofloxacina. 77 0.029
Griseofulvina. 48 0.029
* Valor de p al comparar la viabilidad de las células (las cuatro líneas celulares), al ser
expuestas al fármaco vs la viabilidad de las células no expuestas a los fármacos
(controles).
En la figura 10 se presenta una grafica promedio en la cual se puede apreciar el efecto de los cinco mejores fármacos sobre las líneas celulares de Cáncer Cérvico-Uterino:
0 20 40 60 80 100 120
control nime doxi meclo cipro gris
Concentracion 100mM
%
d
e
Via
b
il
id
a
d *
* *
*
Figura 10.- Efectividad promedio de los cinco mejores fármacos sobre las líneas celulares de Cáncer Cérvico-Uterino, se muestra desviación estándar.
7.2 SEGUNDO ENSAYO
Con los cinco mejores fármacos seleccionados se realizaron las siguientes combinaciones, para este ensayo se utilizaron dos tipos de concentraciones, una concentración alta y una concentración baja, las cuales pueden ser alcanzadas en plasma
en humanos. Los fármacos se probaron de manera individual y en forma combinada (ver
Tabla 5).
Tabla 5.-Concentraciones altas y bajas utilizadas en el segundo ensayo,
concentraciones alcanzadas en plasma con las dosis habituales de los fármacos en humanos.
Concentración. µM/ml. Medicamento.
Concentración baja. Concentración alta.
Ac Meclofenámico. 15 30
Doxiciclina. 5 10
Griseofulvina. 4 8
Ciprofloxacina. 10 20
Nimesulide. 15 30
En la Tabla 6 se presentan los fármacos utilizados en el segundo ensayo:
Tabla 6.- Fármacos utilizados en el segundo ensayo.
Fármaco Concentración Combinación de
Fármacos.
Concentraciones.
1- Ac Meclofenámico Baja 11- doxiciclina +
ciprofloxacina Alta
2- Ac Meclofenámico. Alta 12- doxiciclina +
griseofulvina Alta
3- griseofulvina. Baja 13- doxiciclina +
nimesulide. Alta
4- griseofulvina. Alta 14- doxiciclina + Ac
meclofenámico Alta
5- doxiciclina Baja 15- ciprofloxacina +
griseofulvina Alta
6- doxiciclina Alta 16- ciprofloxacina +
nimesulide Alta
7- nimesulide Baja 17- ciprofloxacina +
Ac meclofenámico Alta
8- nimesulide Alta 18- griseofulvina +
nimesulide Alta
9- ciprofloxacina Baja 19- griseofulvina +
Ac meclofenámico Alta
10- ciprofloxacina Alta 20-Ac
meclofenámico + nimesulide
Las figuras, 11, 12,13, 14 y 15 muestran el efecto sobre la viabilidad de los fármacos aplicados a las líneas celulares de manera individual así como sus combinaciones. Estas gráficas muestran el promedio de las líneas celulares: SIHA, HELA, INBL Y VIPA. Cabe mencionar que se manejaron gráficas promedio debido a que los valores obtenidos son muy cercanos entre si. En las gráficas se muestra un control, el fármaco a la concentración de 100mM del primer ensayo, el fármaco individual a una concentración alta y a una concentración baja y el fármaco combinado con otro fármaco. Cabe destacar que en las combinaciones solo se llevaron a cabo concentraciones altas:
0 20 40 60 80 100 120
1 2 3 4 5 6 7
% d
e
Via
b
ilid
a
d
Figura 11.- Promedio de la Viabilidad de las Líneas Celulares al ser expuestas al fármaco Acido
Meclofenámico: 1.- control 100% de Viabilidad. 2.-Acido Meclofenámico concentración baja 98% de
Viabilidad, 3.-Acido Meclofenámico concentración alta 87% de Viabilidad 4.- Nimesulide+Ac Meclofenámico 87% de Viabilidad. 5.- Griseofulvina+ Ac Meclofenámico 67% de Viabilidad.6.-Doxiciclina+Ac Meclofenámico 84% de Viabilidad. 7.- Ciprofloxacina+Ac Meclofenámico 82% de Viabilidad.
0 20 40 60 80 100 120
1 2 3 4 5 6 7
%
d
e
Vi
a
b
il
id
a
d
Figura 12.- Promedio de la Viabilidad de las Líneas Celulares al ser expuestas al fármaco Griseofulvina: 1.- Control 100% de Viabilidad. 2.- Griseofulvina concentración baja 98% de Viabilidad.
0 20 40 60 80 100 120
1 2 3 4 5 6 7
% d e V ia b ilid a d .
Figura 13.- Promedio de la Viabilidad de las Líneas Celulares al ser expuestas al fármaco Doxiciclina:
1.- Control 100% de Viabilidad. 2.-Doxiciclina concentración baja 98% de Viabilidad.
3.-Doxiciclina concentración alta 97% de Viabilidad. 4.- Doxiciclina+Ciprofloxacina 97% de Viabilidad. 5.- Doxiciclina+ Griseofulvina 93% de Viabilidad. 6.-Doxiciclina+Nimesulide 94% de Viabilidad. 7.- Doxiciclina+Ac Meclofenámico 84% de Viabilidad.
0 20 40 60 80 100 120
1 2 3 4 5 6 7
% d e Via b ilid a d
Figura 14.- Promedio de la Viabilidad de las Líneas Celulares al ser expuestas al fármaco Nimesulide: 1.- Control 100% de Viabilidad. 2.- Nimesulide concentración baja 97% de Viabilidad.
3.- Nimesulide concentración alta 99% de Viabilidad. 4.- Ac Meclofenámico+ Nimesulide 87% de Viabilidad. 5.- Griseofulvina+Nimesulide 98% de Viabilidad. 6.- Doxiciclina+Nimesulide 94% de Viabilidad. 7.- Ciprofloxacina+Nimesulide 98% de Viabilidad.
0 20 40 60 80 100 120
1 2 3 4 5 6 7
% d e V ia b ilid a d
Figura 15.- Promedio de la Viabilidad de las Líneas Celulares al ser expuestas al fármaco
Ciprofloxacina: 1.- Control 100% de Viabilidad. 2.- Ciprofloxacina concentración baja 95% de
Las mejores combinaciones, se muestran el la tabla 7:
Tabla 7.- Porcentajes de Viabilidad celular tras la exposición a las mejores
combinaciones de fármacos.
Combinación. % de Viabilidad *
Promedio. Valor P**
Ac meclofenámico (30µM/ml)+
nimesulide (30µM/ml)
87 0.11***
Griseofulvina (8µM/ml)+ Ac
meclofenámico (30µM/ml)
67 0.029***
Doxiciclina (10µM/ml)+ Ac
meclofenámico (30µM/ml)
84 0.029***
Ciprofloxacina (20µM/ml)+ Ac
meclofenámico (30µM/ml)
82 0.029***
* Promedio de la Viabilidad en las 4 Líneas Celulares (SIHA, VIPA, HELA, INBL). ** Valor de p al comparar la viabilidad de las células (las cuatro líneas celulares), al ser
expuestas al fármaco vs la viabilidad de las células no expuestas a los fármacos
(controles).
7.3 TERCER ENSAYO
Las combinaciones de fármacos con mayor efecto antineoplásico se combinaron con dos quimioterapéuticos. (Tabla 8). Los quimioterapéuticos seleccionados son de los más usados clínicamente contra el CaCU.
Tabla 8.- Concentraciones utilizadas de anticancerosos.
Anti-Cancerígenos Concentración alta. Concentración baja.
5-Fluorouracil 2µgr/ml. 1µgr/ml.
Epirubicina. 12ngr/ml. 6ngr/ml.
Los quimioterapéuticos fueron probados a una concentración alta y a una concentración baja como se presenta en la Tabla 8.
Como muestra la tabla 9, se combinaron 2 fármacos inhibidores de MMPs con 5-Fluorouracilo o Epirubicina a concentraciones bajas y altas.
Tabla 9.- Esquema de combinaciones y concentraciones empleadas en el tercer ensayo.
Quimioterapéutico. Conc. * Medicamento1. Medicamento2 Conc. *
5-Fluorouracil. Alta Ac meclofenámico. Cipro Alta
5-Fluorouracil. Alta Ac meclofenámico. Griseo Alta
5-Fluorouracil. Alta Ac meclofenámico. Nime Alta
5-Fluorouracil. Alta Ac meclofenámico. Dox Alta
5-Fluorouracil. Baja Ac meclofenámico. Cipro Alta
5-Fluorouracil. Baja Ac meclofenámico. Griseo Alta
5-Fluorouracil. Baja Ac meclofenámico. Nime Alta
5-Fluorouracil. Baja Ac meclofenámico. Dox Alta
Epirubicina. Baja Ac meclofenámico. Cipro Alta
Epirubicina. Baja Ac meclofenámico. Griseo Alta
Epirubicina. Baja Ac meclofenámico. Nime Alta
Epirubicina. Baja Ac meclofenámico. Dox Alta
5-fluorouracil Alta --- --- ---
5-fluorouracil Baja --- --- ---
Epirubicina Alta --- --- ---
Epirubicina Baja --- --- ---
En la figura 16 se presenta el porcentaje de viabilidad de los quimioterapéuticos de manera individual antes de ser aplicados a las células en combinación con las mejores combinaciones:
0 20 40 60 80 100 120
1 2 3 4 5
%
d
e
V
iab
il
id
ad
* *
Figura 16.- Quimioterapéuticos aplicados a las líneas celulares de manera individual.
1.-Control 100% de viabilidad. 2.-5-fluorouracil 2µgr/ml 69% de viabilidad. 3.-5-fluorouracil 1µgr/ml 84% de viabilidad 4.-Epirubicina 12ngr/ml 98% de viabilidad. 5.-Epirubicina 6ngr/ml 94 % de viabilidad.
* p<0.05 (al comparar con el control).
En las figuras 17, 18 y 19 se muestra el porcentaje de viabilidad promedio de los quimioterapéuticos ya combinados aplicados a las líneas celulares de cáncer Cérvico-uterino. Como se puede observar el efecto citotóxico de la combinación de quimioterapéuticos con inhibidores de MMPs es superior al efecto que cada grupo de fármacos presenta por separado, lo cual claramente sugiere un efecto potenciador de la combinación.
0 20 40 60 80 100 120
1 2 3-3* 4-4* 5-5* 6-6*
% d e V ia b il id a d
Combinacion con Quimioterapeutico. Combinacion sin Quimioterapeutico.
*
*
* *
Figura 17. Quimioterapéutico y combinación; 1.-Control 100% de viabilidad. 2.-5-fluorouracil 2µgr/ml
concentración alta 82% de viabilidad 3.-5-fluorouracil 2µgr/ml+ Ciprofloxacina (20µM/ml)+ Ac meclofenámico (30µM/ml) concentración alta 25% de viabilidad. 3*.- Ciprofloxacina (20µM/ml)+ Ac meclofenámico (30µM/ml) concentración alta 82% de viabilidad. 4.-5-fluorouracil 2µgr/ml+ Griseofulvina (8µM/ml)+ Ac meclofenámico (30µM/ml) concentración alta 34% de viabilidad. 4*.-Griseofulvina (8µM/ml)+ Ac meclofenámico (30µM/ml) concentración alta 67% de viabilidad 5.-5-fluorouracil 2µgr/ml+ Ac meclofenámico (30µM/ml)+ nimesulide (30µM/ml) concentración alta 37% de viabilidad 5*.-Ac meclofenámico (30µM/ml)+ nimesulide (30µM/ml) concentración alta 87% de viabilidad. 6.-5-fluorouracil 2µgr/ml+ Doxiciclina (10µM/ml)+ Ac meclofenámico (30µM/ml) concentración alta 24% de viabilidad. 6*.-Doxiciclina (10µM/ml)+ Ac meclofenámico (30µM/ml) 84% de viabilidad
* p<0.05 respecto a control, respecto a 5- Fluorouracil concentración alta y respecto a mezcla de inhibidores de MMPs/anti-inflamatorios.
0 20 40 60 80 100 120
1 2 3-3* 4-4* 5-5* 6-6*
% d e V ia b ilid a d
Combinacion con Quimioterapeutico. Combinacion sin Quimioterapeutico.
* * *
*
Figura 18. Quimioterapéutico y combinación 1.-Control 100% de viabilidad. 2.-5-fluorouracil 1µgr/ml
concentración baja 88% de viabilidad 3.-5-fluorouracil 1µgr/ml+ Ciprofloxacina (20µM/ml)+ Ac meclofenámico (30µM/ml) concentración alta 16% de viabilidad. 3*.-Ciprofloxacina (20µM/ml)+ Ac meclofenámico (30µM/ml) concentración alta 82% de viabilidad. 4.-5-fluorouracil 1µgr/ml+ Griseofulvina (8µM/ml)+ Ac meclofenámico (30µM/ml) concentración alta 21% de viabilidad. 4*.-Griseofulvina (8µM/ml)+ Ac meclofenámico (30µM/ml) concentración alta 67% de viabilidad 5.-5-fluorouracil 1µgr/ml+ Ac meclofenámico (30µM/ml)+ nimesulide (30µM/ml) concentración alta 29% de viabilidad 5*.-Ac meclofenámico (30µM/ml)+ nimesulide (30µM/ml) concentración alta 87% de viabilidad. 6.-5-fluorouracil 1µgr/ml+ Doxiciclina (10µM/ml)+ Ac meclofenámico (30µM/ml) concentración alta 20% de viabilidad. 6*.-Doxiciclina (10µM/ml)+ Ac meclofenámico (30µM/ml) 84% de viabilidad
0 20 40 60 80 100 120
1 2 3-3* 4-4* 5-5* 6-6*
%
de
V
ia
bi
li
da
d
Combinacion con Quimioterapeutico. Combinacion sin Quimioterapeutico.
* * *
*
Figura 19. Quimioterapéutico y combinacion1.-Control 100% de viabilidad. 2.-Epirubicina 6ngr/ml
concentración baja 98% de viabilidad 3.-Epirubicina 6ngr/ml+ Ciprofloxacina (20µM/ml)+ Ac meclofenámico (30µM/ml) concentración alta 15% de viabilidad. 3*.-Ciprofloxacina (20µM/ml)+ Ac meclofenámico (30µM/ml) concentración alta 82% de viabilidad. 4.-Epirubicina 6ngr/ml+ Griseofulvina (8µM/ml)+ Ac meclofenámico (30µM/ml) concentración alta 20% de viabilidad. 4*.-Griseofulvina (8µM/ml)+ Ac meclofenámico (30µM/ml) concentración alta 67% de viabilidad 5.-Epirubicina 6ngr/ml+ Ac meclofenámico (30µM/ml)+ nimesulide (30µM/ml) concentración alta 23% de viabilidad 5*.-Ac meclofenámico (30µM/ml)+ nimesulide (30µM/ml) concentración alta 87% de viabilidad. 6.-Epirubicina 6ngr/ml+ Doxiciclina (10µM/ml)+ Ac meclofenámico (30µM/ml) concentración alta 2017% de viabilidad. 6*.-Doxiciclina (10µM/ml)+ Ac meclofenámico (30µM/ml) 84% de viabilidad
8. DISCUSION
En el presente proyecto se probaron diversos fármacos anti-inflamatorios y/o inhibidores de MMP-2 que pueden tener efectos antineoplásicos, que no han sido nada o poco estudiados contra el CaCU. Los fármacos son: nimesulide, sulindac, doxiciclina, celecoxib, griseofulvina, ciprofloxacina, acido meclofenámico y dexametasona, los cuales se probaron sobre las líneas celulares, HELA, SIHA, VIPA e INBL.
Los mejores fármacos en un primer ensayo, a 100mM, resultaron ser: Acido Meclofenámico con un 77% de muerte celular, Griseofulvina con un 52% de muerte celular, Doxiciclina con un 49% de muerte celular, Ciprofloxacina con un 23% de muerte celular y Nimesulide con un 16% de muerte celular, destacando al Acido Meclofenámico como el fármaco que tuvo el porcentaje más bajo de supervivencia celular. Cabe mencionar que este ensayo a 100mM fue solo para valorar inicialmente el potencial terapéutico, pero lamentablemente, la concentración es demasiada alta para ser alcanzada en el humano y por tal motivo se exploraron concentraciones más bajas en los ensayos 2 y 3. El resultado con el Acido Meclofenámico es muy importante debido a que nunca antes había sido estudiada su utilidad antineoplásica y se demuestra que de manera individual y/o combinado puede llegar a ser un fármaco que ayude a contrarrestar el descontrolado crecimiento neoplásico. La Griseofulvina, que aunque su mecanismo de acción por el cual causa apoptosis sobre células cancerosas es un poco confuso y poco estudiado, en el presente trabajo se demostró que este fármaco, si es combinado con otros fármacos., pudiera llegar a ser una buena alternativa en el
tratamiento del cancer52. La Doxiciclina ha demostrado ser un buen inhibidor de
MMPs-1, 3,9, pero no MMPs-2 por lo que se ha observado que cuando se combina con fármacos que inhiben a MMP-2, como lo son los inhibidores selectivos de la
ciclo-oxigenasa-2 (COX-2), sus efectos (como inhibidor de MMPs) pueden ser potenciados38.
Sin embargo en el presente proyecto se observó que de manera aislada su efecto antineoplasico es pobre, pero puede ser potenciado al combinarse con otros fármacos, como el Acido Meclofenámico. En lo que respecta a Ciprofloxacina se ha visto que en cáncer de cabeza y cuello cuando esta se combina con fármacos más potentes para el tratamiento de estos cánceres ha presentado buenos resultados para el tratamiento de
estos cánceres53, en cáncer de Cérvix no ha sido probada. La Ciprofloxacina en
obtener resultados muy favorables. La Nimesulide, al ser un inhibidor de COX-2 ha demostrado que es capaz de reprimir en un 25 a 30% la expresión y actividad de
MMP-2 y MMP-939, con lo cual se ha logrado arrestar el crecimiento celular40, sin embargo
aquí se demostró que si este fármaco se combina con Acido Meclofenámico y/o un Quimioterapéutico, sus efectos pueden llegar a ser aún mayores.
En general todas las combinaciones de inhibidores de MMPs/ anti-inflamatorios
resultaron eliminar significativamente a las células neoplásicas del Cerviz Uterino in
Vitro, a excepción de la combinación Acido Meclofenámico/Nimesulide. Sin embargo
estas combinaciones al combinarse con antineoplasicos, todas sin excepción fueron significativamente eficaces en contra de las células neoplásicas.
Una vez que se probaron las combinaciones entre fármacos inhibidores de MMPs, las mejores resultaron ser solo cuatro, destacando la combinación de Acido Meclofenámico + Griseofulvina presentando 33% de muerte celular a concentraciones que podrían ser alcanzadas en el plasma humano. Nunca se había mezclado la Griseofulvina y Acido Meclofenámico para combatir algún cáncer y aquí observamos que esta combinación es muy citotóxica para las células de CaCU.
Como ya se menciono anteriormente el resultado mas relevante es que el Acido Meclofenámico solo y combinado con el resto de los fármacos ocasiona una gran muerte neoplásica. El mecanismo por el cual causa esta muerte celular es desconocido, pues esta cualidad fue descubierta en este trabajo, por lo que su mecanismo de acción deberá ser estudiado en futuras investigaciones.
9. CONCLUSION
De los fármacos inhibidores de metaloproteínasas (Celecoxib, Sulindaco, Dexametasona, Nimesulide, Doxiciclina, Ac meclofenámico, Ciprofloxacina, Griseofulvina), solo cinco presentaron porcentajes bajos de Sobrevivencia celular (concentración 100mM) sobre las líneas celulares de CaCU de manera individual como se demuestra en la tabla 4:
Tabla 4.- Mejores fármacos seleccionados.
Medicamentos. % de Viabilidad
promedio
Ac Meclofenámico. 23
Nimesulide. 84
Doxiciclina. 51
Ciprofloxacina. 77
Griseofulvina. 48
Por otra parte, las combinaciones que presentaron el porcentaje bajo de sobrevivencia celular son las siguientes tabla 7:
Tabla 7.- Porcentajes de Viabilidad celular tras la expocision a las mejores
combinaciones de fármacos.
Combinación. % de Viabilidad *
Promedio.
Ac meclofenámico (30µM/ml)+ nimesulide (30µM/ml)
87
Griseofulvina (8µM/ml)+ Ac meclofenámico (30µM/ml)
67
Doxiciclina (10µM/ml)+ Ac meclofenámico (30µM/ml)
84
Ciprofloxacina (20µM/ml)+ Ac meclofenámico (30µM/ml)
82
* Promedio de la Viabilidad en las 4 Líneas Celulares (SIHA, VIPA, HELA, INBL).
En lo que respecta a combinación con Quimioterapéutico se presentó un porcentaje del 10 al 38% de sobrevivencia celular para las cuatro combinaciones. Con lo anterior se demuestra la utilidad de estos fármacos como inhibidores de MMPs de manera
Se sugieren estudios in vivo para comprobar su seguridad y eficacia de estos inhibidores
y poder así determinar en un futuro un esquema terapéutico en contra de CaCU.
10. PERSPECTIVAS
El CaCU en México es una de las dos principales causas de mortalidad en el sexo
femenino (tasa de mortalidad: 14.0/100,000 mujeres mayores de 15 años)9, Aunque los
programas de detección temprana están ampliamente implementados en nuestro país, la mayoría de las mujeres aun son diagnosticadas en estadios invasores, en muchos de los
cuales la intervención quirúrgica no es una opción terapéutica recomendable9, 11. El
11. BIBLIOGRAFIA CITADA
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