Práctica 4 bioquímica

Instituto Tecnológico de Tijuana

Unidad Tomas Aquino.

Materia: Bioquímica.

Practica de laboratorio # 4

Reacciones Características de Aminoácidos y Proteínas.

-Catedrático: Dra.

María del Socorro Heredia

Equipo de Laboratorio # 9:



Huerta Gallardo Jesús Antonio.



Solis Solis Ivan Gilberto.



Gómez Cabrera Héctor.

Carrera:

Ingeniería Bioquímica

Grupo B

Resumen

En esta cuarta práctica de laboratorio de bioquímica llamada Reacciones Características de Aminoácidos y Proteínas preparamos cerca de 10 soluciones: reactivo de millón, reactivo de Hopkins-Cole, 3 de NaOH (al 10%, 40%, 2N), sulfato de cobre al 0.5%, acetato de plomo al 5%, ninhidrina al 0.1%, bicarbonato de sodio al 0.5% y ácido clorhídrico al 1M.

Una vez preparadas todas las soluciones hicimos pruebas coloridas con aminoácidos [6 soluciones de tirosina, cisteína y prolina (pesamos 0.02 gr y disolvimos en 3 ml de agua destilada)]. Colocamos cada solución de aminoácido en un tubo de ensayo y

1. A porciones de 3 ml de cada solución de aminoácidos les agregamos 2 ml de NaOH al 10% y de 3 a 5 gotas e sulfato de cobre al 0.5% y observamos su coloración.

2. A porciones de 3 ml de cada solución de aminoácido le agregamos de 2 a 5 gotas del reactivo de millón y calentamos a baño maría. Nuevamente observamos la coloración.

3. A porciones de 3 ml de cada solución de aminoácido, agregamos 2 ml de NaOH al 40% y calentamos suavemente con el mechero.

4. A porciones de 3 ml de cada solución de aminoácido, agregamos 5 gotas de reactivo de Hopkins-Cole.

Índice

Resumen………..2

Introducción………..4

Antecedentes………..5

Objetivos………...6

Metodología……….7

Preparación de Reactivos……….9

Resultados……….11

Cuestionario………..13

Conclusiones………14

Introducción

Las proteínas son sustancias orgánicas nitrogenadas complejas que se hallan en las células animales y vegetales. Son polímeros lineales en los que las unidades monoméricas son los aminoácidos, que se pliegan en una notable diversidad de formas tridimensionales, que les proporcionan una correspondiente variedad de funciones. Actúan como componentes estructurales de mensajeros y de receptores de mnesajeros. Algunas proteínas se unen al ADN y regulan la expresión de los genes, otras participan en la replicación, la transcripción y la traducción de la información genéticas. En la práctica número cuatro realizada el 27 de febrero hicimos reaccionar unos pocos aminoácidos (prolina, triptófano, cisteína y tirosina) con unas soluciones para así poder identificar qué tipo de aminoácidos y proteínas eran. Algunas de las reacciones características con aminoácidos fueron las siguientes: Reacción de la ninhidrina, reacción de Biuret, reacción de Millón, reacción de Satin, reacción de Sakaguchi, reacción de Pauli, reacción de Xantoproteica, reacción de Hopkins-Cole, reacción de la Vainilina. Debido a la gran complejidad de las proteínas, la precipitación se debe a dar a diferentes factores en cada caso, pero predomina el efecto del pH en la ionización de los grupos R, la constante dieléctrica del solvente usado y su efecto sobre los grupos polares, la alteración de la estructura terciaria por calentamiento, cambios de fuerza iónica del solvente por adición de sales, y reacción de algunos aminoácidos con metales pesados

Antecedentes

Los aminoácidos van a representar las reacciones características de sus grupos carboxilo, alfa-amino y R; van hacer las reacciones típicas de los grupos R las que nos van a permitir diferenciar entre los aminoácidos. No todos los grupos R de los aminoácidos presentan reacciones típicas; algunas de estas son:

-Reacción de la ninhidrina: Positiva para todos los grupos alfa-amino.

-Reacción de Biuret: Color azul producido por moléculas con dos o más enlaces peptídicos.

-Reacción de Millón: Color rojo al reaccionar con la tirosina.

-Reacción de Satin: Específica para la prolina e hidroxiprolina.

-Reacción de Sakaguchi: Para la arginina.

-Reacción de Pauli: Para la histidina y tirosina.

-Reacción de Xantoproteica: Color amarillo con la fenilalanina, tirosina y triptófano.

-Reacción de Hopkins-Cole: Específica para el triptófano.

-Reacción de la Vainilina: Para identificar el triptófano.

Estas reacciones coloridas también pueden aplicarse a proteínas, y sirven para detectar la presencia de un aminoácido en particular. Las proteínas también van a presentar una serie de reacciones de precipitación, que en última instancia van a reflejar su composición de aminoácidos y las interacciones que existen entre ellos en la molécula.

Debido a la gran complejidad de las proteínas, la precipitación se debe a diferentes factores en cada caso, pero predomina el efecto del pH en la ionización de los grupos R, la constante dieléctrica del solvente usado y su efecto sobre los grupos polares, la alteración de la estructura terciaria por calentamiento, cambios en la fuerza iónica del solvente por adición de sales, y reacción de algunos aminoácidos con metales pesados.

Objetivos

Identificar a los aminoácidos y a las proteínas a través de sus

reacciones características.

Materiales y Reactivos

Reactivos

Materiales

Aminoácidos: prolina, tirosina y cisteína.

20 tubos de ensaye y medianos.

NaOH Gradilla

HNO3 Pipeta de 5.0 ml

HCl Pipetas graduadas de 10 ml

Embudo Pizeta

Metodología

Procedimiento:

a) Pruebas coloridas para aminoácidos:

Se va a efectuar cada una de ellas con las seis soluciones de tirosina, triptófanos, cisteína y prolina. Cada solución se prepara pesando 0.002 gramos de aminoácidos y se disuelven en 3 ml de agua destilada.

1) Reacción de Biuret:

A porciones de 3 ml de cada solución de problema, agregar 2 ml de NaOH al 10% y de 3 a 5 gotas de sulfato de cobre al 0.5% mezclar bien y observar si se forma un color violeta o un precipitado. Si no se presenta reacción inmediata, dejar reposar 10 a 15 minutos y observar.

2) Reacción de Xantoproteica:

A proporciones de 2 ml de cada solución problema, agregar 1 ml de ácido nítrico concentrado y calentar cuidadosamente ( de preferencia en la campana).

Observe si hubo algún cambio en el color, enfríe bien y estratifique cuidadosamente con unas gotas de NH4OH concentrado. Observe si se forma un color anaranjado en la interfase.

3) Reacción de Millón:

A proporciones de 3 ml de las soluciones problema, agregar de 2 a 5 gotas del reactivo de Millón, y caliente en baño maría. La formación de un color rojo indica que es positiva la prueba. El reactivo de Millón es muy venenoso y corrosivo.

4) Prueba para el azufre:

A proporciones de 3 ml de cada solución problema, agregar 2 ml de NaOH al 40% y caliente suavemente. Añada de 5 a 10 gotas de acetato de plomo y caliente nuevamente, observando si existe formación de un precipitado negro de PbS.

5) Reacción de la ninhidrina:

6) Reacción de Hopkins-Cole:

A porciones de 2 ml de cada solución problema, se agregan 5 gotas de reactivo de Hopkins-Cole (solución de ácido glioxílico), mezclando bien. Estratificar cuidadosamente con ácido sulfúrico concentrado, procurando que se forme un límite bien definido entre ambos líquidos; observar la interfase, con formación de un anillo violeta-rojizo en presencia de triptófano.

b) Precipitación y desnaturalización de proteínas:

Se va a efectuar cada una de ellas con soluciones de gelatina, peptona y albúmina. Cada solución se prepara pesando 0.02 gramos (proteína) y se disuelven en 3 ml de agua destilada.

Cada una de estas pruebas se va a efectuar con las tres soluciones de proteínas (gelatina, peptona y albúmina).

1. Por calentamiento:

Coloque 3 ml de cada solución de proteína en tubos de ensayo, calentándolos con el mechero hasta ebullición, observando los cambios que ocurran en su apariencia.

2. Por cambios de pH:

Usando 9 tubos de ensaye en total, ponga 3 porciones de 3 ml de cada una de las proteínas. Acomode los tubos en grupos de 3 proteínas diferentes; al primer grupo agregue cada uno de los tubos 3 ml de NaOH 2 M, agite bien y observe los cambios que ocurren, anotando el efecto de una base fuerte sobre las proteínas. Al segundo conjunto de tres tubos agregue 3 ml de bicarbonato de sodio al 0.5 %, agitando bien y observando el efecto de una base débil. A los tres tubos restantes, agregar 3 ml de HCl 1M y observe el efecto de un ácido fuerte sobre las proteínas.

3. Por sales:

4. Por solventes orgánicos neutros:

Agregue 3 ml de alcohol etílico al 95%, a 3 ml de cada una de las soluciones de proteínas, agitando bien y observando los efectos en la disminución de la constante dieléctrica del disolvente.

5. Por metales pesados:

Prepare 3 tubos con 3 ml de cada una de las soluciones de proteína, agregando unas gotas de acetato de plomo a cada tubo. Agite y observe los efectos del plomo en la solubilidad de las proteínas.

Preparación de Reactivos

Cuidadosamente agregar 30 gramos de óxido rojo de mercurio a una mezcla de 22.5 ml de HNO3 concentrado y 25 ml de agua destilada.

Disuelto el óxido, se le añade 2 ml de una solución de nitrito de sodio al 30%.

2) Reactivo de Hopkins-Cole:

Disolver 5 gramos de ácido glioxílico en ácido acético glacial, aforado a 50 ml de agua destilada.

3) NaOH al 10%:

Pesar 2 gramos y llevar a 250 ml con agua destilada.

4) Sulfato de cobre al 0.5%:

Pesar 0.78 gramos de CuSO4 y llevar a 100 ml con agua destilada.

5) NaOH al 40%:

Pesar 100 gramos y llevar a 250 ml con agua destilada.

6) Acetato de plomo al 5%:

Pesar 2.5 gramos de acetato de Pb y llevar a 50 ml con agua destilada.

7) Ninhidrina al 0.1%

8) NaOH 2N:

Pesar 20 gramos y llevar a 200 ml con agua destilada.

9) NaHCO3 al 0.5%:

Preparar 250 ml (1.25 gramos de bicarbonato).

10) HCl 1M

Pesar 9 gramos y llevar a 250 ml con agua destilada.

11) (NH4) SO4 saturado:

Cuestionario

1. ¿Mencione los factores que causan la precipitación de las proteínas?

Las proteínas se desnaturalizan cuando pierden su estructura

tridimensional y así el característico plegamiento de su estructura. Como en algunos casos el fenómeno de la desnaturalización es reversible, es posible precipitar proteínas de manera selectiva mediante cambios en: -La polaridad del disolvente.

-La fuerza iónica. -El pH.

-La temperatura.

2. ¿Cuál es el fundamento de la reacción de la ninhidrina?

La ninhidrina es un poderoso agente reactivo común para visualizar las bandas de separación de aminoácidos por cromatografía o electroforesis. El átomo de carbono de un carbonilo tiene una carga positiva parcial, por lo que el C central es menos estable y más electrofílico que una cetona simple. En la mayoría de los compuestos, un carbonilo es más estable que la forma dihidroxi. Sin embargo la ninhidrina es un hidrato de carbono estable del C central porque esta forma no tiene el efecto desestablizador de los centros adyacentes de carbonilo parciales positivo. La reacción de ninhidrina es una de las más sensibles para identificar aminoácidos en general, ya que detecta una arte de aminoácido en 1,500,00 partes de agua. Aminoácidos y muchas aminas primarias dan un color violeta característico. La prolina da coloración amarilla. (1)

3. ¿Cuál es el fundamento de la reacción de millón?

4. Un aminoácido problema de positiva la reacción de la ninhidrina, negativa la de millón, positiva la xantoproteica y positiva la de Hopkins-Cole. ¿De qué aminoácido se trata?

La cisteína.

5. ¿Por qué si añadimos solventes orgánicos a una solución de proteína, la proteína precipitada?

Para desnaturalizar a la proteína, o sea que pierda su estructura de orden superior (secundaria, terciaria, cuaternaria), quedando la cadena polipeptídica reducida a un polímero estadístico sin ninguna estructura tridimensional fija. (3)

6. ¿Por qué las sales de metales pesados precipitan a las proteínas?

Estas sales de metales pesados se combinan con las proteínas por su carga ya que los aminoácidos son moléculas anfóteras y así es como se van formando proteinatos insolubles. (3)

Conclusiones

Huerta Gallardo Jesús Antonio. 12211007

Bibliografía

1. Lehninger, A. Bioquímica. Ed Omega. 1991. Barcelona. España.

2. Ott, D.D. Manual de Laboratorio de Ciencia de los Alimentos. Ed. Acribia, 1992. Zaragoza, España.