Fundamentos. Citometría de flujo SISTEMAS INTEGRANTES DE UN CITÓMETRO DE FLUJO

Citometría de flujo

Introducción: Fundamentos

Dra. Edith Cortés Barberena

Departamento de Ciencias de la Salud 1

Fundamentos

Sistema de fluidos

2

¿Qué población es la de mayor tamaño? ¿Cómo se sabe esto?

Dispersión de luz por la célula en células de sangre Dispersión de luz por la célula en células de sangre

completa lisada completa lisada 3 Corriente de la muestra Fuente de luz Sistema óptico (Filtros ópticos) Tamaño Complejidad Verde Rojo Detectores Gráficas para análisis Punto de interrogación Fluido envolvente

S

ISTEMAS INTEGRANTES DE UN CITÓMETRO DE FLUJO Amarillo

Sistemas que componen un Citómetro de Flujo: Sistemas que componen un

Citómetro de Flujo:

• Fluidos:

• Ópticos:

• Electrónicos:

Los avances en cada uno de estos sistemas ha

permitido el desarrollo de citómetros con

mayores capacidades en la medición de células.

• Fluidos:

• Ópticos:

• Electrónicos:

Los avances en cada uno de estos sistemas ha

permitido el desarrollo de citómetros con

mayores capacidades en la medición de células.

5

Sistemas que componen un

Citómetro de Flujo:

Sistemas que componen un

Citómetro de Flujo:

• Fluidos

: Para introducir y alinear a las células para ser medidas.

– Aire: Actualmente no se usa.

– Líquidos

• Fluidos

: Para introducir y alinear a las células para ser medidas.

– Aire: Actualmente no se usa.

– Líquidos

Sistema de fluidos

Sistema de fluidos

Bomba de aire Regulador de fluido Filtro Celda de flujo Depósito de fluido Filtro de aire Regulador de la muestra Tubo de muestra Desperdicio 7

Hay

dos

tipos de cámaras

Abiertas Cerradas

Dirección del flujo

8 Punto de interrogación Punto de interrogación Punto de interrogación

Sistema de equipos BD

Los citómetros BD usan

este tipo de cámara ₉

SISTEMA DE INYECCIÓN DE MUESTRA SISTEMA DE INYECCIÓN DE MUESTRA

Flujo de la muestra Flujo de la muestra Tubo externo Tubo externo Dirección del Dirección del flujo de la flujo de la muestra muestra Tubo interno Tubo interno Aire Aire 10

Cámara tipo BD

Cerradas Láser Fluido

envolvente Fluido de la muestra Punto de interrogación 11 • Este tipo de sistema de fluidos permite el paso suave, continuo y no pulsátil de la muestra.

Velocidad alta (60µL/min) Velocidad baja (12µL/min)

Flujo de la muestra

Flujo de la muestra

La diferencia de presión entre los fluidos ayuda a alinear a las células frente al láser.

Otros sistemas de fluidos

Otros controles de fluidos • Otros equipos usan bombas

peristálticas en combinación con frenos de fluidos y

microprocesador para controlar directamente el fluido de la muestra.

• Ventaja: Disminución de costos. Compacto. Mantenimiento de bajo costo. En parte lo hace el usuario.

• Desventaja: Se obstruye frecuentemente.

Cambios en SIP

Tubo externo de acero inoxidable (como los otros). Tubo interno de polímero que baja al fondo del tubo. Sistema de retro-alimentación dual en el diseño fluídico que controla la velocidad del flujo envolvente.

Ventajas:El cambio en el SIP asegura que se tome toda la muestra. Se asegura la estabilidad del flujo de la muestra con el control del flujo envolvente.

Desventajas¿?

13

Otros sistemas de fluidos

Otros cambios en el SIP • El inyector de aire está separado

del tubo inyector. • Hay dos electrodos con

diferentes alturas que detectan el volumen de la muestra leída. • Ventaja: Se puede hacer conteo

celular (céls/ml). • Desventajas: ¿? 14 Electrodo Inyector de aire Tubo inyector de la muestra Tubo de la muestra Electro do

Otros sistemas de fluidos:

Celda de flujo microcapilar • Se modifica para evitar el uso del

flujo envolvente.

• Ventaja: Sistema compacto. Se usan menos células. Se producen menos desechos. El usuario puede remover la celda para la limpieza (menor costo de mantenimiento)

• Posible desventaja: Que se tape muy seguido la celda.

Enfoque acústico.

• Las células son enfocadas en una sola línea por ondas sonoras al pasar por una pieza que produce ultrasonido.

• Ventajas: Permite una mayor amplitud de concentración celular. Aumento o disminución de velocidad del fluido sin afectar alineación. Compacto. • Desventaja: ¿?

15

Demostración de alineación

acústica (enfoque)

Enfoque acústico apagado (OFF). Muestra desalineada.

Enfoque acústico encendido (ON). Muestra alineada 16

Fundamentos

Sistema óptico 17

Características de

Características de Análisis: Luz

Análisis: Luz

Dispersión de la luz (Tamaño y Complejidad) Fluorescencias: Fluorescencias: FL1 FL1, , FL2FL2, , FL3FL3, , FL4FL4, , FL5 FL5….….

Dispersión de luz por la célula Dispersión de luz por la célula

Luz del láser Luz del láser Dispersión lateral (SSC) Dispersión lateral (SSC) Dispersión frontal (FSC) Dispersión frontal (FSC)₁₉

¿Cómo se identifican otras características?

• Uso de anticuerpos u otras proteínas conjugadas con fluorocromos.

• Intercalantes de ADN fluorescentes.

• Fluorocromos sensibles a pH, especies reactivas de O, etc. • SE REQUIERE GENERAR UNA

SEÑAL FLUORESCENTE. 20

Colorantes Fluorescentes

Colorantes Fluorescentes

Colorantes Fluorescentes

Colorantes Fluorescentes

FITC FITC FITC FITC PE PE PE PE PerCP PerCP PerCP PerCP APC APC

Para detectar a los

anticuerpos unidos a las células, se requiere el uso de fluorocromos.

21

Sistemas que componen un

Citómetro de Flujo: Óptico.

Sistemas que componen un

Citómetro de Flujo: Óptico.

• Óptica de excitación: Una fuente de excitación para generar las señales.

• Óptica de colección: Filtros de luz que permiten el paso luz en longitudes de onda específica y refleja aquella que sea diferente.

• Óptica de excitación: Una fuente de excitación para generar las señales.

• Óptica de colección: Filtros de luz que permiten el paso luz en longitudes de onda específica y refleja aquella que sea diferente.

22

Sistemas que componen un

Citómetro de Flujo:

Sistemas que componen un

Citómetro de Flujo:

• Óptica de excitación:

Comprende una

fuente de excitación para generar las señales de luz y lentes para enfocar la luz en el punto de interrogación.

• Fuentes de luz:

– Láseres: Argón, kriptón ion, HeNe, etc.

– Lámparas de arco (como los microscopios de fluorescencia): Mercurio y mercurio-xenón.

• Óptica de excitación:

Comprende una

fuente de excitación para generar las señales de luz y lentes para enfocar la luz en el punto de interrogación.

• Fuentes de luz:

– Láseres: Argón, kriptón ion, HeNe, etc.

– Lámparas de arco (como los microscopios de fluorescencia): Mercurio y mercurio-xenón.

23

Fuentes de luz

• Se requiere que emita un número relativamente grande de fotones. • ¿Por qué?

– Un tercio de la luz colectada se pierde en los filtros ópticos.

– Los detectores de diodo solo convierten la mitad de la señal luminosa a electrónica, mientras que los fotomultiplicadores solo un cuarto.

Características de las fuentes de

luz.

25

Lámparas de arco y filamento,

LEDs

• Requieren filtros para seleccionar la longitud de onda deseada.

• Luz dispersa en todas direcciones. • Son insuficientes para la fluorescencia

débil.

• Son una alternativa barata.

• Principal aplicación: cuantificación de ADN.

26

Láser

• Una sola longitud de onda.

• Rayo de un punto pequeño. Iluminación uniforme.

• La mayoría producen entre 10 a 25 mW. • Enfriamiento depende del poder del láser:

– 10 a 25 mW, enfriamiento por aire. – 200 mW, enfriamiento por agua.

27

Láser

• Alineamiento del láser solo por personal del proveedor.

• Si se dañan, el costo del cambio es alto.

28

Óptica de excitación

Laser Longitud de onda Fluorocromos Azul Argon-ión

488 nm FITC, PE, PerCP, PerCP-Cy5

Rojo Diodo

635 nm APC

Violeta 407 nm Pacific Blue, Alexa Fluor 407 y 430, otros. 29 Lente de enfoque Fotodetector Filtro de barrera Filtro dicroico Celda FL1 verde SSC azul FL2 naranja FL3 rojo FSC azul Láser

Esquema general del sistema óptico

Lente de enfoque Fotodetector Filtro de barrera Filtro dicroico Celda FL1 verde PMT SSC PMT FL2 PMT FL3 FSC azul Láser azul

Esquema general del sistema óptico

PMT FL4

Láser rojo

Filtros de luz y semi-espejos

(lentes dicroicos)

32 Longpass (LP) De longitud amplia Shortpass (SP) De longitud corta Bandpass De intervalo Ancho de banda 500 520 480 500 520

*¿Creían que era paso de banda? ¡A bailar!

500 400 600 400 500 600 400 500 600 4 8 0 5 0 0 5 2 0 LP500 SP500 500/50

Óptica de adquisición

Detector Filtro Color Fluorocromos

FL1 530/30 nm Verde FITC FL2 585/42 nm Amarillo-naranja PE

FL3 670nm LP Rojo PerCP, PerCP-Cy5.5 FL4 661/16

nm

Rojo-naranja APC

33 Celda de flujoCelda de flujo

Láser de 488nm Láser de 488nm SSC FL1 FL3 FL4 FL2 Lente de enfoque

Lente de enfoque 488/10488/10 Diodo de FSCDiodo de FSC 530/30 530/30 488/10 488/10 585/42 585/42 661/16 661/16 670LP 670LP Divisor de haz 90/10 Divisor de haz 90/10

Láser de diodo rojo Láser de diodo rojo

Espejo dicroico 560SP Espejo dicroico 560SP Espejo dicroico 640LP Espejo dicroico 640LP Semi-espejo Semi-espejo

*Modificado del manual del FACSCalibur 34 Cambios en la óptica Diseño de pastel • Arreglo de fotomultiplicadores en forma de pastel.

• Se reemplazan los lentes de enfoque y se disminuye el número de semi-espejos. • Incrementa la captación de la luz

al evitar la pérdida. • Se reducen los problemas de la

alineación de los láseres. • Sistema muy compacto.

Diseño octagonal

• Láseres

• Lentes para moldear y enfocar los láseres

• Uso de fibra óptica.

• Se simplifica el cambio de filtros y espejos. 35 Arreglo octagonal D F H A C B E G Señal del láser azul Fibra óptica Filtro de intervalo Filtro dicroico 36

Citometría de flujo

Sistema electrónico: Detección de

señales

37

Sistema electrónico

Convierte las señales ópticas a señales electrónicas usando detectores de luz y amplificadores de señal.

•Cada medida tomada de cada detector es referida como un parámetro.

•Los datos son adquiridos como una lista de valores de cada parámetro (variable) por cada evento (célula)

38 Láser Dispersión lateral (SSC) Dispersión frontal (FSC) Fotodiodo Fotodiodo Filtro

Señales generadas al incidir el láser en

la célula

39 Celda de flujo Celda de flujo Láser de 488nm Láser de 488nm SSC FL1 FL3 FL4 FL2 Lente de enfoque

Lente de enfoque 488/10488/10 Diodo de FSCDiodo de FSC 530/30 530/30 488/10 488/10 585/42 585/42 661/16 661/16 670LP 670LP Divisor de haz 90/10 Divisor de haz 90/10

Láser de diodo rojo Láser de diodo rojo

Filtro 560SP Filtro 560SP Filtro 640LP Filtro 640LP Semi-espejo Semi-espejo Detectores: PMT Detector: Diodo 40

Detección de señales

Tiempo Tiempo Tiempo

Láser Láser Láser

41

Fotodiodo

• Es un semiconductor. • Sensible a la luz.

• No requiere de fuente de poder externa para funcionar.

Detección de la dispersión de luz frontal

Láser FITC FITC PE PE FSC SSC Fotodiodo Fotodiodo Filtro

El detector de FSC convierte luz dispersada hacia delante en un pulso de voltaje proporcional al tamaño de la célula o partícula. 43

Tiempo FS C Fotón Fotodiodo LIN LOG LIN Pulsos en voltaje

Conversión de las señales ópticas en señales proporcionales electrónicas.

Niveles Levels E00 E01 E02 E03 E-1 Pre-amplificador FACSCalibur Parámetro FSC 44 El detector de

El detector de FSCFSC convierte luz convierte luz dispersada hacia delante en un pulso dispersada hacia delante en un pulso de voltaje proporcional al tamaño de la de voltaje proporcional al tamaño de la célula o partícula. célula o partícula. Láser Dispersión lateral (SSC) Dispersión frontal (FSC) Fotodiodo Fotodiodo Filtro

Dispersión lateral y fluorescencia

45 El detector de SSC convierte la luz dispersada

lateralmente en un pulso de voltaje proporcional al contenido en orgánulos membranosos (granularidad).

Fotomultiplicador (PMT)

Componentes electrónicos para generar el gradiente de voltaje - - - --- -- - -- _--_- -Tubo al vacío Fotocátodo Electrones Suministro de alto voltaje Dinodo Salida de la corriente de la señal

Modificado de Bogh y Duling, 1993. 46

Partes de un tubo fotomultiplicador

(PMT)

• Fotocátodo. • Sistema de entrada electro-óptica. • Multiplicador de electrones. • Ánodo. 47 Tiempo S S C FL4 FL1 FL2 FL3 Fuente de poder del PMT Fotón Salida de la señal Voltaje 150-999 v LIN LOG LOG Pulsos en voltaje

Conversión de la señales ópticas en señales proporcionales electrónicas. Parámetro Parameter SSC FL1 FL2 FL3 FL4 48

Tiempo

Vo

lt

s

Cuantificación de un pulso de voltaje.

A ltu ra d el p u ls o

Ancho del pulso

Área del pulso

Ancho del pulso

Área del pulso

49

Láser Célula Láser

Tiempo Tiempo Tiempo Tiempo Tiempo

S S C F S C F L 1 F L 2 F L 3 Convertidor análogo-digital 0.01v/canal Interfase GP10 1000 0

Análisis de la altura del pulso

Análisis de la altura y conversión digital.

50

Amplificación de señales

• Lineal

• (intervalos regulares)

• apropiada para: – Señales que oscilan en

un intervalo limitado (0-1,000)

– Con distribuciones con picos estrechos como el contenido en DNA. • Logarítmica • (intervalos crecientes) – Cubre un intervalo más amplio de variación de la señal (0-10,000). 51

Sistema electrónico

•La conversión de la señal de voltaje analógico a digital da como resultado valores que son mostrados en un eje dividido en canales.

•Cada canal corresponde a un valor de voltaje de la señal.

256 0 64 128 192 0 64 128 192 256

52

Sistema electrónico: Datos

Event Param1 FS Param2 SS Param3 FITC Param4 PE 1 50 100 80 90 2 55 110 150 95 3 110 60 80 30

Datos de adquisición en modo de lista

53

Sistema electrónico: visualización

Los datos se muestran en forma de una gráfica a través de un programa (software).

Parámetro 1 P ar ám et ro 2 54

Análisis de datos

O como se pueden visualizar los

datos.

55

Vocabulario

• Parámetro: Característica física o química de una célula.

– Intrínseca: Se obtiene sin necesidad de reactivos. Ej. Desviación de luz, autofluorescencia.

– Extrínseca: Se usan reactivos para revelarlos.

Por cierto, se le dicen pruebas al uso de reactivos en citometría.

56

Histograma

Histograma de side scatter (90°) de una muestra de sangre lisada y marcada con anticuerpos fluorescentes. Shapiro, 2004.

57

Gráficos de punto (Dot plots)

• Se obtienen gráficos por combinación de dos parámetros. • Mejor visualización de poblaciones. • En este ejemplo se grafican linealmente la desviación frontal y la lateral de luz. Linfocitos Monocitos Granulocitos 58

Picos y valles

• Una manera que era

muy utilizada es el histograma de dos parámetros. • En este ejemplo se grafica SSC y la fluorescencia en escala logarítmica. 59

Gráficas de punto tridimensionales

• Shapiro les llama gráficos de nube. • Es difícil interpretar

estas gráficas. • Una población puede

quedar cubierta por otra.

Gráfica de densidad

• Los colores o la intensidad de un color indican abundancia de eventos. 61

Gráficos de contorno

62

Gate

• ¿Qué es un “gate”?

• ¿Qué significa hacer un “gating”?

Linfocitos Monocitos Granulocitos Tamaño relativo Tamaño relativo C o m p le ji d a d r e la ti v a C o m p le ji d a d r e la ti v a 63 Con “gating”

Gate

• Se puede definir como la selección de una región de análisis para visualizar una población en otra gráfica y parámetros.

Linfocitos Monocitos Granulocitos Tamaño relativo Tamaño relativo C o m p le ji d a d r e la ti v a C o m p le ji d a d r e la ti v a T B Sin “gating” 64

Vocabulario

• Citometría multiparamétrica: Se realizan mediciones simultáneas de un número de diferentes substancias en las células.

65

Vocabulario

• FSC: Desviación de luz frontal o de ángulo pequeño. Las siglas se derivan de las palabras en inglés “forward scattering”.

Vocabulario

• SSC: Desviación de luz lateral, ortogonal, 90°o de ángulo amplio. Las siglas se derivan de las palabras en inglés “side scattering”. 67

¿Qué es la fluorescencia?

¿Qué es la fluorescencia?

¿Qué es la fluorescencia?

¿Qué es la fluorescencia?

Las

Las moléculasmoléculas fluorescentesfluorescentes tienentienen lala capacidadcapacidad dede absorber

absorber energíaenergía dede lala luzluz.. SeSe lesles conoceconoce comocomo fluorescencia

fluorescencia oo fluoróforofluoróforo.. El

El fluorocromofluorocromo liberalibera lala energíaenergía enen formaforma porpor::

••VibraciónVibración yy disipacióndisipación dede calorcalor.. Las

Las moléculasmoléculas fluorescentesfluorescentes tienentienen lala capacidadcapacidad dede absorber

absorber energíaenergía dede lala luzluz.. SeSe lesles conoceconoce comocomo fluorescencia

fluorescencia oo fluoróforofluoróforo.. El

El fluorocromofluorocromo liberalibera lala energíaenergía enen formaforma porpor::

••VibraciónVibración yy disipacióndisipación dede calorcalor..

488 nm

Energía de

luz incidente Energía de _{luz incidente}

> 530 nm

Estructura

en común 68

Vocabulario

• Fotoblanqueamiento: El fotón blanquea una molécula fluorescente por

rompimiento de un doble enlace.

488 nm Energía de luz incidente No hay fluorescencia. Estructura en común

Se rompe el doble enlace.