BIOLOGÍA MOLECULAR
FUNDAMENTOS Y APLICACIONES
BIOLOGÍA MOLECULAR
FUNDAMENTOS Y APLICACIONES
Dr. en C. CARLOS BEAS ZÁRATE
Químico Farmacobiólogo y Doctorado en Ciencias de la SaludInvestigador titular del Centro de Investigación Biomédica de Occidente del IMSS Profesor titular de Biología Molecular del Departamento de Biología Celular y Molecular del Centro Universitario de Ciencias Biológicas y Agropecuarias de la Universidad de Guadalajara
Profesor titular en los Posgrados de Ciencias Biomédicas y de Biología Molecular en Medicina
Dr. DANIEL ORTUÑO SAHAGÚN
Investigador Titular de la Universidad de Guadalajara Maestro en Ciencias en Biología Celular
Doctor en Ciencias en Biología Molecular en la Universidad Autónoma de Madrid Posdoctor por el Instituto Cajal de Neurociencias, en Madrid, España
Coordinador en el CUCBA del Doctorado en Ciencias Biomédicas de la Universidad de Guadalajara
Dr. JUAN SOCORRO ARMENDÁRIZ BORUNDA
Doctorado en Bioquímica en el Centro de Investigación y de Estudios Avanzados del Instituto Politécnico Nacional Posdoctorado en Biología Molecular en la Universidad de Tennessee Jefe del Departamento de Biología Molecular y Genómica, Centro Universitariode Ciencias de la Salud de la Universidad de Guadalajara
Ex Presidente de la Asociación Mexicana de Biología Molecular en Medicina
MÉXICO • BOGOTÁ • BUENOS AIRES • CARACAS • GUATEMALA LISBOA • MADRID • NUEVA YORK • SAN JUAN • SANTIAGO • SAO PAULO
AUCKLAND • LONDRES • MILÁN • MONTREAL • NUEVA DELHI SAN FRANCISCO • SIDNEY • SINGAPUR • ST. LOUIS • TORONTO
BIOLOGÍA MOLECULAR Fundamentos y aplicaciones
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ISBN 13: 978-970-10-6921-9
1234567890 08765432109
Impreso en México Printed in Mexico
NOTA
La medicina es una ciencia en constante desarrollo. Conforme surjan nuevos conocimientos, se requerirán cambios de la terapéutica. El (los) autor(es) y los editores se han esforzado para que los cuadros de dosifi cación medicamentosa sean precisos y acordes con lo establecido en la fecha de publicación. Sin embargo, ante los posibles errores humanos y cambios en la medicina, ni los editores ni cualquier otra persona que haya participado en la preparación de la obra garan-tizan que la información contenida en ella sea precisa o completa, tampoco son responsables de errores u omisiones, ni de los resultados que con dicha información se obtengan. Convendría recurrir a otras fuentes de datos, por ejemplo, y de manera particular, habrá que consultar la hoja informativa que se adjunta con cada medicamento, para tener certeza de que la información de esta obra es precisa y no se han introducido cambios en la dosis recomendada o en las contra-indicaciones para su administración. Esto es de particular importancia con respecto a fármacos nuevos o de uso no frecuente. También deberá consultarse a los laboratorios para recabar infor-mación sobre los valores normales.
Editora de desarrollo: Norma Leticia García Carbajal Corrección de estilo: Eduardo Grijalva Gómez Diseño de portada: Wolfgang Rodolfo Wender Composición y formación: Arturo Rocha Hernández Supervisora de producción: Ángela Salas Cañada
v
Dra. en C. Adriana María Salazar Montes. Instituto de
Biología Molecular en Medicina y Terapia Génica, CUCS, Universidad de Guadalajara. Instituto de Bio-logía Molecular, Centro Universitario de Ciencias de la Salud, Universidad de Guadalajara. Capítulo 5
Dra. Airam Jenny Dávalos Marín. Laboratorio de
Neu-roinmunobiología Celular y Molecular, División de Neurociencias, C.I.B.O., IMSS. Capítulo 12
Dra. Ana Rosa Rincón Sánchez. Instituto de Enferme-dades Crónico Degenerativas, CUCS, Universidad de Guadalajara. Capítulo 10
Dra. en C. Ana Soledad Sandoval Rodríguez. Instituto
de Biología Molecular en Medicina y Terapia Génica, CUCS, Universidad de Guadalajara. Instituto de Bio-logía Molecular, Centro Universitario de Ciencias de la Salud, Universidad de Guadalajara. Capítulo 5
Dra. Argelia E. Rojas Mallorquín. Departamento de
Biología Celular y Molecular, C.U.C.B.A., Universi-dad de Guadalajara. Capítulo 8
Dr. en C. Arturo Becerra Bracho. Departamento de
Biología Evolutiva, Facultad de Ciencias, Univer-sidad Nacional Autónoma de México, México, D. F. Capítulo 14
Dr. Carlos Beas Zárate. Laboratorio de
Neurobiolo-gía Celular y Molecular, División de Neurociencias, C.I.B.O., IMSS. Laboratorio de Desarrollo y Regene-ración Neural, Instituto de Neurociencias, Departa-mento de Biología Celular y Molecular, C.U.C.B.A., Universidad de Guadalajara. Introducción, Capítu-los 4, 6, 11
Dr. Daniel Ortuño Sahagún. Laboratorio de Desarro-llo y Regeneración Neural, Instituto de Neurocien-cias, Departamento de Biología Celular y Molecular,
C.U.C.B.A., Universidad de Guadalajara. Introduc-ción, Capítulo 8
Dr. Eduardo Vázquez Valls. Unidad de Investigación
Médica en Epidemiología Clínica, UMAE, Hospital de Especialidades, CMNO, IMSS y Laboratorio de Inmunodefi ciencias y Retrovirus Humanos, Centro de Investigación Biomédica de Occidente, IMSS. Capítulo 13
Dra. Graciela Gudiño Cabrera. Laboratorio de
Desa-rrollo y Regeneración Neural, Instituto de Neurocien-cias, Departamento de Biología Celular y Molecular, C.U.C.B.A., Universidad de Guadalajara. Capítulo 11
Dra. Irinea Yáñez Sánchez. Instituto de Biología
Mole-cular en Medicina y Terapia Génica, CUCS, Universi-dad de Guadalajara. Instituto de Biología Molecular, Centro Universitario de Ciencias de la Salud, Univer-sidad de Guadalajara. Capítulo 7
Dr. Juan Armendáriz Borunda. Instituto de Biología Molecular en Medicina y Terapia Génica, CUCS, Uni-versidad de Guadalajara. Introducción, Capítulos 5, 10, 11
Dra. en C. María del Pilar Alatorre Carranza. Instituto
de Biología Molecular en Medicina y Terapia Génica, CUCS, Universidad de Guadalajara. Instituto de Bio-logía Molecular, Centro Universitario de Ciencias de la Salud, Universidad de Guadalajara. Capítulo 7
Dr. en C. Mario Eduardo Flores Soto. Laboratorio de Neurobiología Celular y Molecular, División de Neu-rociencias, C.I.B.O., IMSS. Capítulo 4
Dra. en C. Martha Escoto Delgadillo. Unidad de
Inves-tigación Médica en Epidemiología Clínica, UMAE, Hospital de Especialidades, CMNO, IMSS y
torio de Inmunodefi ciencias y Retrovirus Humanos, Centro de Investigación Biomédica de Occidente, IMSS. Capítulo 13
Dra. en C. Miriam Ruth Bueno Topete. Instituto de
Biología Molecular en Medicina y Terapia Génica, CUCS, Universidad de Guadalajara. Instituto de Bio-logía Molecular, Centro Universitario de Ciencias de la Salud, Universidad de Guadalajara. Capítulo 7
Dra. en C. Mónica Elisa Ureña Guerrero. Laboratorio
de Neurobiología, Departamento de Biología Celular y Molecular, C.U.C.B.A., Universidad de Guadalajara, Guadalajara, Jalisco, México. Capítulo 2
Dr. en C. Óscar Kurt Bitzer Quintero. Laboratorio de Neuroinmunobiología Celular y Molecular, División de Neurociencias, C.I.B.O., IMSS. Capítulo 12
Dr. Reinhard Schliebs. Paul Flechsig Institute for Brain
Research, Department of Neurochemistry, University of Leipzig, Jahnallee 59, D-04109 Leipzig, Germany. Capítulo 11
Dr. Rodolfo Hernández Gutiérrez. Centro de
Investi-gación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Esta-do de Jalisco A. C. CIATEJ. Capítulo 1
Dra. Rosalba Gutiérrez Rojo. Laboratorio de
Microbio-logía Molecular, Centro de Investigación y Asistencia en Tecnología y Diseño del Estado de Jalisco. Capí-tulo 9
Dra. en C. Silvia Josefi na López Pérez. Laboratorio de Neurobiología, Departamento de Biología Celular y Molecular, C.U.C.B.A., Universidad de Guadalajara, Guadalajara, Jalisco, México. Capítulo 3
Dra. en C. Verónica Chaparro Huerta. Laboratorio de
Neurobiología Celular y Molecular, División de Neu-rociencias, C.I.B.O., IMSS. Laboratorio de Desarrollo y Regeneración Neural, Instituto de Neurociencias, Departamento de Biología Celular y Molecular, C.U.C.B.A., Universidad de Guadalajara. Capítulos 4, 6
Dr. en C. Vidal Delgado Rizo. Instituto de Biología
Molecular en Medicina y Terapia Génica, CUCS, Uni-versidad de Guadalajara. Instituto de Biología Mole-cular, Centro Universitario de Ciencias de la Salud, Universidad de Guadalajara. Capítulo 7
Introducción
Cronología y evolución histórica
de la biología molecular . . . 1 Dr. Carlos Beas Zárate,
Dr. Daniel Ortuño Sahagún y Dr. Juan Armendáriz Borunda
PARTE I
Capítulo 1
Estructura molecular, función y métodos de
estudio de las proteínas . . . 5 Dr. Rodolfo Hernández Gutiérrez
Capítulo 2
Composición y estructura
de los ácidos nucleicos . . . 17 Dra. Mónica Elisa Ureña Guerrero
Capítulo 3
Replicación del ácido
desoxirribonucleico (DNA). . . 33 Dra. Silvia Josefi na López Pérez
Capítulo 4
Transcripción del ácido ribonucleico (RNA). . . 46 Dr. Carlos Beas Zárate,
Dr. Mario Eduardo Flores Soto y Dra. Verónica Chaparro Huerta
Capítulo 5
Regulación de la transcripción. . . 59 Dra. Adriana María Salazar Montes,
Dra. Ana Soledad Sandoval Rodríguez y Dr. Juan Armendáriz Borunda
Capítulo 6
Síntesis de proteínas . . . 71 Dra. Verónica Chaparro Huerta
y Dr. Carlos Beas Zárate
Capítulo 7
Transducción de señales . . . 87 Dr. Vidal Delgado Rizo,
Dra. Miriam Ruth Bueno Topete, Dra. Irinea Yañez Sánchez
y Dra. María del Pilar Alatorre Carranza
PARTE II
Capítulo 8
Técnicas de DNA recombinante . . . . 105 Dr. Daniel Ortuño Sahagún
y Dra. Argelia E. Rojas Mayorquín
Capítulo 9
Aplicaciones de la biología molecular
en la biotecnología . . . . 115 Dra. Rosalba Gutiérrez Rojo
C o n t e n i d o
Capítulo 10
Aplicaciones de la biología molecular
en la terapia génica . . . . 122 Dr. Juan Armendáriz Borunda
y Dra. Ana Rosa Rincón Sánchez
Capítulo 11
Terapia génica en enfermedades
neurodegenerativas . . . . 130 Dr. Carlos Beas Zárate,
Dra. Graciela Gudiño Cabrera, Dr. Juan Armendáriz Borunda y Dr. Reinhard Schliebs
Capítulo 12
Neuroinmunorregulación . . . . 143 Dr. Óscar Kurt Bitzer Quintero
y Dra. Airam Jenny Dávalos Marín
Capítulo 13
Mecanismos moleculares de resistencia del virus de la inmunodefi ciencia humana
a los antirretrovirales . . . . 154 Dr. Eduardo Vázquez Valls
y Dra. Martha Escoto Delgadillo
Capítulo 14
Biología molecular y evolución
de las primeras células . . . . 166 Dr. en C. Arturo Becerra Bracho
La presente obra consta de 14 capítulos organizados en dos partes. La primera se enfoca a los aspectos básicos de la biología molecular y sus fundamentos, desde la forma en que están compuestas y estructuradas las principales biomoléculas: proteínas y ácidos nucleicos, hasta cómo se realiza y se regula su síntesis. Además de referirse a los mecanismos de almacenamiento y transferencia de la información genética, así como a la expresión génica y sus procesos de regulación, los cuales son activados en función de los sistemas de señalización intracelular. La segunda parte inicia con un panorama amplio de las prin-cipales técnicas de biología molecular e ingeniería genéti-ca, aplicadas a diferentes campos del conocimiento, como la biotecnología, la terapia génica, las enfermedades neu-rodegenerativas, la neuroinmunobiología, y fi naliza con el abordaje de aspectos evolutivos de la célula desde el punto de vista molecular.
Este libro fue concebido como un texto de referencia para los estudiantes de ciencias médicas, biológicas, qui-micofarmacobiológicas y agropecuarias, para la consulta
de aspectos básicos como de temas aplicados a sus dife-rentes áreas de formación profesional. Asimismo, resulta de gran utilidad para el docente de dichas áreas, como material de apoyo didáctico para sus cursos. Finalmente, constituye una referencia importante para el profesionis-ta que esté interesado en conocer más sobre el mundo de la biología molecular, ya que se presenta en un lenguaje claro y accesible.
Los autores de los diferentes capítulos son investi-gadores activos con reconocimiento nacional e interna-cional, que han hecho su mejor esfuerzo, conociendo las necesidades como docentes, en generar un material de consulta claro y conciso, que incorpore y relacione con-ceptos recientes del campo de la biología molecular.
Los autores desean que el lector de la presente obra encuentre la respuesta a sus dudas y que le motive no solamente el interés por la biología molecular, sino ade-más que surja en él el gusto por el estudio profundo y el entendimiento de la vida a nivel molecular.
P r ó l o g o
ix
Carlos Beas Zárate Daniel Ortuño Sahagún Juan Socorro Armendáriz Borunda
Cronología y evolución histórica
de la biología molecular
Dr. Carlos Beas Zárate
Dr. Daniel Ortuño Sahagún
Dr. Juan Armendáriz Borunda
Históricamente, podemos referir una serie de aconte-cimientos que contribuyeron de manera decisiva en el estudio de los fenómenos biológicos y establecieron la pauta para el abordaje a nivel molecular de los mismos. Sin embargo, es posible fi jar el punto de partida de la his-toria más reciente del estudio de la vida a nivel molecu-lar en el año de 1866, cuando Gregor Mendel publicó los resultados de sus experimentos relativos a los principios de recombinación y segregación independiente de las características genéticas. Poco después, en 1869, el cien-tífi co suizo Friedrich Miescher descubrió en el núcleo de las células una sustancia de carácter ácido a la que llamó nucleína. Luego, en el segundo decenio del siglo xx, el químico alemán Robert Feulgen, mediante una tinción específi ca, descubrió que el DNA estaba localizado en los cromosomas. A partir de este descubrimiento, todo sucedió muy rápido. En 1944, Avery, McCleod y McCarty comprobaron que el DNA es el portador de la información genética. En 1953, Watson y Crick revelaron la estruc-tura del DNA como una doble hélice complementaria, que recuerda la estructura de una escalera de caracol. Desde entonces y de manera exponencial, se suceden los descubrimientos (enzimas de restricción, polimerasas, etc.) que conducirían a lo que se conoce como la biología molecular y la tecnología del DNA recombinante.
A continuación se presenta una muy breve reseña his-tórica desde los primeros estudios empíricos, realizados por el ser humano, relacionados con el funcionamiento biológico, hasta los más recientes avances del conoci-miento de los mecanismos de función intrínseca de los seres vivos, los cuales constituyen en la actualidad una sólida base del conocimiento científi co más avanzado y que se refi eren en la primera parte de este libro a lo largo de los primeros siete capítulos. En la segunda parte, se presentan las aplicaciones concretas en diversas áreas del conocimiento de la biología molecular, así como sus repercusiones y perspectivas, que de manera conjunta con la bioinformática podrían ser factibles de desarro-llarse en el muy próximo futuro.
C
RONOLOGÍA
DE
LA
BIOLOGÍA
• 1750 a.C. Los sumerios fabrican la cerveza. • 1000 a.C. Los babilonios celebran con ritos
religio-sos la polinización de las palmeras.
• 323 a.C. Aristóteles especula sobre la naturaleza de
la reproducción y la herencia.
• 100-300 Se escriben en la India textos metafóricos
sobre la naturaleza de la reproducción humana. 1
• 1590 Se inventa el microscopio.
• 1663 Robert Hooke describe por primera vez a la
célula.
• 1676 Se confi rma la reproducción sexual en las plantas.
• 1677 Se contempla el esperma animal a través del
microscopio.
• 1802 Aparece por primera vez referida la palabra
biología.
• 1830 Se descubren las proteínas. • 1833 Se aísla la primera enzima.
• 1838 Se descubre que todos los organismos vivos
están compuestos por células.
• 1859 Charles Darwin hace pública su teoría sobre la
evolución de las especies.
• 1866 Gregor Mendel describe, en los guisantes, las
unidades fundamentales de la herencia (que poste-riormente recibirán el nombre de genes).
• 1871 Se aísla el DNA en el núcleo de una célula. • 1883 Francis Galton acuña el término eugenesia. • 1887 Se descubre que las células reproductivas
constituyen un linaje continuo, diferente de las otras células del cuerpo.
• 1908 Se establecen modelos matemáticos de las
fre-cuencias génicas en poblaciones mendelianas.
• 1909 Las unidades fundamentales de la herencia
biológica reciben el nombre de genes.
• 1925 Se descubre que la actividad del gen está
rela-cionada con su posición en el cromosoma.
• 1927 Se descubre que los rayos X causan
mutacio-nes genéticas.
• 1943 Se identifica el DNA como la molécula
genética.
• 1940-1950 Se descubre que cada gen codifi ca una
única proteína.
• 1953 Se propone la estructura en doble hélice del
DNA.
• 1956 Se identifi can 23 pares de cromosomas en las células del cuerpo humano.
• 1966 Se descifra el código genético completo del
DNA.
• 1972 Se sintetiza la primera molécula de DNA
recombinante en el laboratorio.
• 1973 Tienen lugar los primeros experimentos de
ingeniería genética, en los que genes de una especie se introducen en organismos de otra especie y funcio-nan correctamente.
• 1975 La conferencia de Asilomar evalúa los riesgos
biológicos de las tecnologías de DNA recombinante, y aprueba una moratoria de los experimentos con estas tecnologías.
• 1975 Se obtienen por primera vez los hibridomas
que producen anticuerpos monoclonales.
• 1976 Se funda en Estados Unidos Genentech, la
pri-mera empresa de ingeniería genética.
• 1977 Mediante técnicas de ingeniería genética, se
fabrica con éxito una hormona humana en una bacte-ria.
• 1977 Se desarrollan las primeras técnicas para
se-cuenciar con rapidez los mensajes químicos de las moléculas del DNA.
• 1978 Se clona el gen de la insulina humana. • 1980 El Tribunal Supremo de Estados Unidos
dicta-mina que se pueden patentar los microbios obtenidos mediante ingeniería genética.
• 1981 El primer diagnóstico prenatal de una
enfer-medad humana por medio del análisis del DNA. • 1982 Se genera el primer ratón transgénico
(“super-ratón”), al insertar el gen de la hormona del crecimien-to de la rata en óvulos de ratón hembra fecundados. • 1982 Se produce insulina humana mediante
técni-cas de DNA recombinante.
• 1983 Se desarrolla la técnica de la reacción en
cade-na de la polimerasa, que permite replicar (copiar) genes específi cos con gran rapidez.
• 1984 Producción de las primeras plantas
trans-génicas.
• 1985 Se inicia el uso de interferones en el
trata-miento de enfermedades víricas.
• 1985 Se utiliza por primera vez la “huella genética”
en una investigación judicial en Gran Bretaña. • 1986 Se autorizan las pruebas clínicas de la
vacu-na contra la hepatitis B obtenida mediante ingeniería genética.
• 1987 Propuesta comercial para establecer la
secuen-cia completa del genoma humano (proyecto Genoma), compuesto aproximadamente por 100 000 genes. • 1987 Comercialización del primer anticuerpo
mono-clonal de uso terapéutico.
• 1988 Primera patente de un ser vivo producido
mediante ingeniería genética.
• 1989 Comercialización de las primeras máquinas
automáticas de secuenciación del DNA.
• 1990 Primer tratamiento con éxito mediante terapia
génica en niños con trastornos inmunitarios (“niños burbuja”). Se ponen en marcha numerosos procedi-mientos experimentales de terapia génica para inten-tar curar enfermedades cancerosas y metabólicas. • 1994 Se comercializa en California el primer vegetal
modifi cado genéticamente (un tomate) y se autoriza en Holanda la reproducción del primer toro transgé-nico.
• 1995 Se completan las primeras secuencias de
genomas de seres vivos: se trata de las bacterias Hae-mophilus infl uenzae y Mycoplasma genitalium. • 1996 Por vez primera se completa la secuencia del
genoma de un eucarionte, la levadura de la cerveza “Saccharomyces cerevisiae”. Por otra parte, el catálo-go de genes humanos que Victor McKusick y colabora-dores de la Universidad Johns Hopkins actualizan cada
Perspectivas y futuro de la biología molecular con la informática 3
semana contiene ya más de 5 000 genes conocidos. El Proyecto Genoma, coordinado por HUGO (Human Genome Organization), avanza a buen ritmo.
• 1997 Clonación del primer mamífero, una oveja
lla-mada “Dolly”.
• 1999 Se completa la secuenciación del genoma
(175 Mb) de Drosophila melanogaster (mosca de la fruta).
• 2000 Se termina la primera versión del genoma humano (3 200 Mb) y se completa la secuencia de
Arabidopsis thaliana (157 Mb).
• 2002 Presentación del genoma humano por Celera
Genomics y el grupo de colaboradores de laboratorios fi nanciados por fundaciones públicas.
• 2007 Primer “trasplante” de un genoma completo
de una bacteria a otra. Se publica como “transmuta-ción de una especie biológica en otra” en Science el 28 de junio de 2007.
P
ERSPECTIVAS
Y
FUTURO
DE
LA
BIOLOGÍA
MOLECULAR
CON
LA
INFORMÁTICA
• 2010 Completar el proyecto para el entendimiento de la función de todos los genes dentro de la
organi-zación celular.
• 2050 Completar el primer modelo computacional de una célula completa, o quizá por último de un
organismo completo.
Después de esta breve descripción histórica sobre la evolución de la biología, la genética, la bioquímica y en buena parte del desarrollo tecnológico en paralelo, es posible entender el porqué esta obra se presenta en dos partes: En la primera se establecen los fundamentos bási-cos esenciales que permiten al principiante entender lo más elemental de la biología molecular y el manejo de las principales moléculas de la vida, como son: la estructura y composición de las proteínas, la composición y propie-dades de los ácidos nucleicos, así como el almacenamien-to y la transferencia de la información génica en la célula a través de la replicación del DNA, la transcripción del RNA y la síntesis de proteínas, así como algunas formas de regulación intracelular de la expresión génica y meca-nismos de transducción intracelular que infl uyen sobre dicha expresión.
En la segunda parte, se presenta una serie de capítu-los que muestran desde el desarrollo de la tecnología del DNA recombinante y cómo esta tecnología ha permitido su aplicación en la biotecnología y en la terapia génica, así como lograr entender mejor diversos aspectos relacio-nados con la salud del ser humano, como son los procesos neurodegenerativos e inmunológicos, hasta llegar a com-prender cómo ha sido posible la evolución de la célula con base en el análisis a nivel metabólico y molecular. De esta manera, los autores consideran que la presente obra puede ser un buen apoyo para los estudiantes de biología, medicina, farmacobiología y áreas afi nes, ya que les per-mitirá un mejor entendimiento de la biología molecular y el contexto de sus posibles aplicaciones.
P
ROTEÍNAS
Nuestros cuerpos y los diversos organismos vivos contie-nen un número enorme de moléculas diferentes entre sí. En una sola célula, puede haber miles y miles de molécu-las; casi todas ellas las fabrican los propios organismos. Los ácidos nucleicos (DNA y RNA) y las proteínas son algunas de estas moléculas, las cuales son sintetizadas en el interior de nuestras células y de las células de todos los organismos vivos.
Las proteínas son macromoléculas, polipéptidos natu-rales y uno de los componentes fundamentales y más abundantes de las células; participan y se encuentran en los procesos y estructuras más importantes de los orga-nismos y muestran una gran diversidad en sus propieda-des físicas, propieda-desde las enzimas solubles en agua, hasta la queratina insoluble del pelo. Los componentes básicos de las proteínas son los aminoácidos; las cadenas grandes de estos aminoácidos son las proteínas.
La información para la síntesis de una proteína está codifi cada en el DNA, pero realmente son las proteínas y no el DNA las que determinan la forma de las células así como las funciones de reconocimiento, regulación y catálisis; en otras palabras, las proteínas son las
molé-culas a través de las cuales se expresa la información genética.
Aminoácidos
Todas las proteínas están constituidas por aminoácidos unidos en una secuencia lineal mediante un tipo específi -co de enlace -covalente (enlace peptídi-co) formado entre el grupo amino de un aminoácido (—NH2) y el grupo carboxilo (—COOH) del aminoácido precedente. Cabe señalar que las células tienen la capacidad de sintetizar proteínas muy diversas, en cuanto a su tamaño, activi-dad o función biológica mediante el uso combinado de los 20 aminoácidos. A partir de estas combinaciones, las células tienen la capacidad de sintetizar proteínas, como anticuerpos, enzimas, hormonas, proteínas estructura-les y más. Todos los aminoácidos que se hallan en las proteínas son alfaaminoácidos; es decir, en todos ellos el carbono α (alfa) es asimétrico y está unido a cuatro gru-pos diferentes: el grupo carboxilo, el grupo amino, un grupo R y un átomo de hidrógeno (fi g. 1-1). Debido a la disposición tetraédrica de los orbitales de enlace alrede-dor del carbono α, los cuatro grupos pueden ocupar dos disposiciones diferentes en el espacio; a estas dos formas se les denomina enantiómeros o estereoisómeros. Hay
P
ARTE
I
C a p í t u l o
1
1
Estructura molecular,
función y métodos de estudio
de las proteínas
Dr. Rodolfo Hernández Gutiérrez
entonces dos tipos de estereoisómeros: los L (levógiros: disposición a la izquierda) y los D (dextrógiros: dispo-sición a la derecha). Los símbolos L y D se refi eren a la confi guración de los cuatro componentes alrededor del carbono quiral. Excepto cuando el grupo R (o cadena lateral) es H, los aminoácidos presentan actividad óptica. Todos los aminoácidos de las proteínas tienen confi gura-ción L y difi eren entre sí por la estructura de sus cadenas laterales o grupos R.
En la síntesis de proteínas se utilizan 20 aminoácidos diferentes. Nuestras células carecen de los mecanismos bioquímicos para producir todos los aminoácidos; pue-den fabricar sólo 11 de los 20 necesarios para la síntesis de proteínas; los nueve restantes deben ser ingeridos en la dieta y se denominan aminoácidos esenciales. Los ami-noácidos se representan por lo general con dos símbolos para cada aminoácido (cuadro 1-1). Uno de ellos consta de las tres primeras letras del aminoácido y son relativa-mente fáciles de recordar; el otro se compone de una sola
letra usado para mostrar la composición y la secuencia de los aminoácidos, además de facilitar la comunicación y escribir secuencias de proteínas grandes en espacios pequeños.
Los aminoácidos presentan propiedades acidobási-cas; son compuestos anfotéricos, es decir, pueden ceder o ganar electrones, contienen tanto grupos ácidos como grupos básicos. Debido a ello, tienen carga neta que depende de la naturaleza de la unión. La carga de una molécula infl uye en el tipo de interacción con otras moléculas; esta propiedad es útil para el aislamiento y purifi -cación de los aminoácidos y proteínas.
Las cadenas laterales de los aminoácidos no forman una serie natural, por lo que no es fácil aprender sus estructuras. Es fácil clasifi carlos según sean polares o no polares, aromáticos o alifáticos, o ácidos o básicos; no obstante, estas clasifi caciones no son mutuamente exclu-yentes. El aminoácido más simple es la glicina, el cual sólo tiene un átomo de hidrógeno como cadena lateral (fi g. 1-2); le sigue la alanina con un grupo metilo (fi g. 1-3); los aminoácidos con cadenas laterales de tres o cua-tro carbonos de largo son valina, leucina e isoleucina (fi g. 1-4), cuyas cadenas laterales alifáticas son hidrófo-bas, es decir que tienen una aversión al agua. La prolina también tiene una cadena lateral alifática, pero difi ere de los otros 19 aminoácidos en que su cadena lateral está unida al átomo de hidrógeno y al carbono α (fi g. 1-5). La estructura cíclica es importante en la estructura de las proteínas.
Hay tres aminoácidos con cadenas laterales aromá-ticas: la tirosina, el triptófano y la fenilalanina. El
ani-Aminoácido Glicina Alanina Valina Leucina Isoleucina Prolina Fenilalanina Tirosina Triptófano Cisteína Metionina Serina Treonina Lisina Arginina Histidina Aspartato Glutamato Asparagina Glutamina
Cuadro 1-1 Simbología y propiedades de los aminoácidos
Símbolo de tres letras
Gly (hdrófilo) Ala (hidrófobo) † Val (hidrófobo) †* Leu (hidrófobo) †* Ile (hidrófobo) †* Pro (hidrófobo) † Phe (hidrófobo) †* Tyr (hidrófilo) δ* Trp (hidrófobo) † Cys (hidrófilo) δ Met (hidrófobo) †* Ser (hidrófilo) δ Thr (hidrófilo) δ* Lys (básico) * Arg (básico) * His (básico) * Asp (ácido) Glu (ácido) Asn (hidrófilo) δ Gln (hidrófilo) δ
Símbolo de una letra
G A V L I P F Y W C M S T K R H D E N G
δ Polares sin carga. † No polares sin carga.
* Aminoácidos esenciales. La arginina se considera esencial en la población pediátrica Glicina (Gly, G) Figura 1-2 Alanina (Ala, A) Figura 1-3 Figura 1-1 Estructura básica de un aminoácido.
Valina
(Val, V) Leucina(Leu, L) Isoleucina(Ile, I)
Proteínas 7
llo aromático de tirosina contiene un grupo hidroxilo unido (fi g. 1-6), lo que la hace menos hidrófoba que la fenilalanina; el triptófano tiene un anillo unido al grupo metileno; la fenilalanina y el triptófano son altamente hidrófobos. La metionina y la cisteína contienen un
áto-mo de azufre en sus cadenas laterales, la metionina en un enlace tioéter y la cisteína en forma de grupo sulfhi-drilo (fi g. 1-7); ambas cadenas laterales son hidrófobas y el grupo sulfhidrilo de la cisteína es altamente reactivo y juega un papel importante en la estabilización de algunas proteínas mediante la formación de puentes disulfuro.
La serina y la treonina contienen grupos hidroxilo ali-fáticos (fi g. 1-8), los cuales los hacen mucho más hidrófi los y reactivos que la alanina y la valina. Los aminoácidos con cadenas laterales muy polares son muy hidrófi los. La lisina y la arginina (fi g. 1-9) tienen las cadenas laterales más grandes de los 20 aminoácidos y están cargadas posi-tivamente a pH neutro. La histidina puede estar no car-gada o carcar-gada positivamente, dependiendo del medio en que se encuentre; su anillo imidazol (fi g. 1-10) juega un papel importante y por él este aminoácido se halla en los sitios activos de las enzimas; estos tres aminoácidos se nombran aminoácidos básicos. Hay dos aminoácidos con cadenas laterales ácidas, el ácido aspártico y el ácido glutámico; por lo general se llaman aspartato y gluta-mato (fi g. 1-11). Los derivados sin carga son glutamina y asparagina, los cuales tienen un grupo amida terminal en lugar de un carboxilato (fi g. 1-12).
Enlace peptídico
En las proteínas, el enlace peptídico es un enlace cova-lente que se establece entre el grupo carboxilo de un ami-noácido y el grupo amino de otro. La formación de un dipéptido a partir de dos aminoácidos conlleva la pérdida de una molécula de agua (fi g. 1-13). La unión de varios aminoácidos mediante enlaces peptídicos forma una Prolina (Pro, P) Figura 1-5 Fenilalanina (Phe, F) Tirosina (Tyr, Y) Triptófano (Trp, W) Figura 1-6 Cisteína (Cys, C) Metionina (Met, M) Figura 1-7 Serina (Ser, S) Treonina (Thr, T) Figura 1-8 Lisina
(Lys, K) Arginina(Arg, R)
cadena polipeptídica, la cual no es ramifi cada (fi g. 1-14). En una cadena polipeptídica o proteína, a un aminoácido se le denomina residuo; esta cadena consiste en una parte repetida regularmente llamada cadena principal y de una parte variable que corresponde a las cadenas laterales de los aminoácidos. El peso promedio de un residuo de ami-noácido es de alrededor de 110 daltones (un daltón es igual a una unidad de masa atómica). Por ejemplo, una proteína con peso molecular de 30 000 tiene una masa de 30 000 daltones o 30 kDa.
Estructura de las proteínas
La conformación de una proteína se defi ne por cuatro niveles estructurales: 1) estructura primaria, 2) estruc-tura secundaria, 3) estrucestruc-tura terciaria y 4) estrucestruc-tura cuaternaria.
Estructura primaria
Se refi ere al orden lineal y número de los aminoácidos presentes en dichas proteínas (fi g. 1-14). Los enlaces peptídicos son los que determinan esta estructura. Las proteínas tienen dirección porque están sintetizadas en cierto orden, y presentan dos extremos, un extremo ami-noterminal (izquierdo) donde el aminoácido es el número uno y tiene libre a su grupo amino α, y otro extremo car-boxiloterminal (derecho) en el cual el último aminoácido tiene su grupo carboxilo α libre. Por convención, el extre-mo aminoterminal se toma coextre-mo el inicio de una cadena polipeptídica y el extremo carboxiloterminal como el fi n de ésta (fi g. 1-15).
La secuencia de aminoácidos de una proteína es importante por varias razones: primera, el conocimiento de la secuencia de una proteína es muy útil, pues indi-ca su meindi-canismo de acción; segunda, las alteraciones en la secuencia de aminoácidos pueden producir funciones anormales y enfermedades crónicas y letales como la fi brosis quística, y tercera, la secuencia de una proteína revela datos de su historia evolutiva.
Estructura secundaria
Se defi ne como el orden en el que se encuentran los ami-noácidos y la disposición espacial estable que adquieren durante la síntesis de proteínas. Este tipo de estructura así como la estructura terciaria y cuaternaria son deter-minadas por las características de los grupos funcionales y por enlaces de tipo no covalente. En general, el plega-miento de las proteínas se agrupa en dos grandes clases Histidina (His, H) Figura 1-10 Aspartato (Asp, D) Glutamato (Glu, E) Figura 1-11 Asparagina (Asn, N) Glutamina(Gln, G) Figura 1-12 Enlace peptídico Figura 1-13 Enlace peptídico.
Proteínas 9
con base en su estructura secundaria, proteínas globula-res o proteínas fi brilaglobula-res. Las proteínas globulaglobula-res están plegadas compactadamente y de modo helicoidal, en tan-to que las proteínas fi brilares son más bien fi lamentan-tosas o alargadas. En una sola proteína, las múltiples regiones de la cadena polipeptídica pueden asumir diferentes confor-maciones, las cuales son determinadas por la secuencia primaria de los aminoácidos. La estructura secundaria de las proteínas puede estar organizada en estructuras regu-lares combinadas, como la hélice α y la hoja plegada β, las cuales se pueden repetir u organizarse al azar.
Hélice 𝛂
La hélice α es una estructura secundaria encontrada de manera común en las proteínas globulares. La formación de la estructura de hélice α es espontánea y se forma al enrollarse helicoidalmente sobre sí misma la estructura primaria. La estabilidad de la hélice α se debe a la forma-ción de enlaces de puentes de hidrógeno que se establecen entre los grupos carboxilo (C=O) de un aminoácido con el cuarto grupo amino (—NH—) de los aminoácidos que le proceden (fi g. 1-16). No todos los aminoácidos favore-cen la formación de la hélice α; los aminoácidos A, D, I, L y M favorecen la formación de esta estructura, en tanto que G y P actúan de manera contraria, lo cual también es importante, ya que introducen un plegamiento adicional de la cadena polipeptídica para dar lugar a la forma-ción de proteínas globulares.
Hoja plegada 𝛃
Mientras que la hélice α está formada de un arreglo lineal simple de aminoácidos dispuestos helicoidalmente, en las hojas plegadas β la estructura se halla siempre completa-mente extendida (fi g. 1-17); las cadenas laterales de los aminoácidos se sitúan de manera alternada a la derecha y a la izquierda del esqueleto de la cadena polipeptídica. Las estructuras β de una misma cadena o de distintas cadenas polipeptídicas pueden interaccionar entre sí mediante puentes de hidrógeno, dando lugar a estruc-turas laminares llamadas por su forma hojas plegadas u hojas β (fi g. 1-17). Las cadenas adyacentes en una hoja β pueden encontrarse en dirección opuesta (hoja antipara-lela β) o en la misma dirección (hoja paralela β).
Estructura supersecundaria
Algunas proteínas presentan una organización ordenada de las estructuras secundarias y forman distintos domi-nios funcionales o motivos estructurales denominados estructuras supersecundarias. Algunos ejemplos son el dominio hélice-vuelta-hélice de proteínas bacterianas que regulan la transcripción y los “zipper” de leucina, los dominios hélice-burbuja-hélice y los dedos de cinc que son reguladores de la transcripción en eucariontes.
Estructura terciaria
La estructura terciaria se refi ere a la estructura tridimen-sional completa de las unidades peptídicas de una proteína dada, incluyendo en esta descripción la relación espacial entre las diferentes estructuras secundarias de una cade-na polipeptídica y cómo esas estructuras secundarias se pliegan sobre sí mismas para la formación de la estructu-ra tridimensional de la proteína. Esta conformación tridi-mensional facilita la solubilidad en el agua, lo que permite realizar las funciones enzimáticas, de transporte, hormo-nales, etcétera. La estructura secundaria de las proteínas la constituyen diversos dominios, y la estructura terciaria
arg asp glu gln met trp gly pro his ile ser arg val phe
Figura 1-14 Estructura primaria.
Extremo aminoterminal
Extremo carboxiloterminal
también describe la relación entre los diferentes dominios de una misma proteína. La interacción de los diferentes dominios está gobernada por distintos tipos de fuerzas que son las que determinan la estructura tridimensional de las proteínas: los puentes de hidrógeno, los puentes disulfuro, las fuerzas hidrófobas, las fuerzas electrostáti-cas y las fuerzas de van der Waals (fi g. 1-18).
Puentes de hidrógeno
Las cadenas polipeptídicas contienen numerosos donado-res y aceptodonado-res de protones tanto en la cadena principal como en las cadenas laterales (o grupo R) que permiten la formación de este tipo de enlaces.
Puentes disulfuro
Son enlaces covalentes que se establecen entre dos resi-duos de cisteína que espacialmente se encuentren
próxi-mos; son el producto de la oxidación de dos grupos tiol (uno de cada cisteína). Este tipo de enlace sólo puede for-marse en el ambiente oxidante del retículo endoplásmico, por lo que en general los puentes disulfuro se encuentran en proteínas de membrana y de secreción.
Fuerzas hidrófobas
Las proteínas están compuestas de aminoácidos que con-tienen grupos R de carácter tanto hidrófi lo como hidró-fobo. Es la naturaleza de la interacción de los diferentes grupos R con el medio acuoso la que juega el papel prin-cipal en las estructuras de las proteínas. El plegamiento espontáneo de las proteínas globulares es un refl ejo del balance entre las fuerzas energéticas opuestas del puente de hidrógeno, los grupos hidrófi los R y el medio acuoso, y la repulsión del medio acuoso por los grupos hidrófobos R. La hidrofobicidad de ciertos grupos R de los amino-ácidos tiende a dirigirlos hacia el interior de las proteí-nas. Estas fuerzas restringen las conformaciones en las cuales las proteínas pueden plegarse.
Fuerzas electrostáticas
Las fuerzas electrostáticas son principalmente de tres tipos: carga-carga, carga-dipolo y dipolo-dipolo. Las inter-acciones típicas carga-carga que favorecen el plegamien-to de las proteínas se dan entre dos grupos R con carga opuesta. La interacción carga-dipolo se da entre un grupo R ionizado y el dipolo de una molécula de agua. La forma dipolar de los grupos R afecta la interacción con el agua. Por tanto, es entendible que la mayoría de los aminoáci-dos que se encuentran en la superfi cie de las proteínas globulares contienen grupos R cargados o polares. Fuerzas de van der Waals
Son fuerzas de atracción y repulsión que controlan el ple-gamiento de las proteínas. Las fuerzas de atracción se dan entre dos átomos no cargados y no unidos, pero que provocan la formación de dipolos. Fuerza de repulsión es la que se establece entre dos átomos no cargados que se encuentran muy cerca, pero que no inducen dipolos. Las fuerzas de van der Waals son extremadamente débiles en comparación con las otras fuerzas que gobiernan la conformación de las proteínas; por tanto, son las nume-rosas interacciones de este tipo las que hacen signifi can-te su presencia en el plegamiento de las procan-teínas.
Estructura cuaternaria
Las proteínas que contienen más de una cadena polipep-tídica representan otro nivel de organización estructural. Cada cadena polipeptídica en este nivel de organización recibe el nombre de subunidad. La estructura cuaternaria se refi ere al arreglo espacial de subunidades de proteína y Estructura de hélice α
Figura 1-16 Estructura secundaria.
Estructura plegada β
Proteínas 11
la naturaleza de sus interacciones (fi g. 1-19). Las proteí-nas con múltiples subunidades se denominan oligoméri-cas; pueden estar compuestas por subunidades idénticas (homooligoméricas) o distintas (heterooligoméricas). Un ejemplo de estructura cuaternaria es la hemoglobina, la cual consta de dos subunidades α y dos β (heterooligo-méricas).
Estructuras proteínicas complejas
Muchos de los 20 aminoácidos que forman las proteínas son susceptibles de ser modifi cados después de la sínte-sis de una cadena polipeptídica (traducción); por tanto, se les denomina modifi caciones postraduccionales. Esas modifi caciones determinan funciones especializadas de las proteínas. Por ejemplo, el extremo aminoterminal de muchas proteínas es acetilado, lo cual hace que esas proteínas sean menos susceptibles a degradación. En el caso del colágeno, muchos residuos de prolina se hidroxi-lan para formar hidroxiprolina, lo cual estabiliza las fi bras de colágeno. Las proteínas que tienen carbohidratos uni-dos covalentemente reciben el nombre de glucoproteínas; éstas son de dos clases dependiendo del tipo de unión que se establece entre la proteína y el carbohidrato: N-glu-cosídico y O-gluN-glu-cosídico; el primero se forma al unirse el carbohidrato con el grupo amida de la asparagina, y el segundo al unirse el carbohidrato con el grupo hidroxi-lo de la serina, treonina y con una baja frecuencia a la hidroxilisina. Otra modifi cación postraduccional a la cual están sujetas las proteínas son la incorporación de lípidos mediante uniones no covalentes. La adición de carbohi-dratos a las proteínas las hace más hidrófi las, y a la inver-sa, la adición de ácidos grasos a un grupo amino α o grupo sulfhidrilo de la cisteína las hace más hidrófobas. Muchas proteínas son hidrolizadas (procesadas) después de su sín-tesis; como un ejemplo, se pueden mencionar las enzimas
digestivas, las cuales son sintetizadas como precursores inactivos que pueden ser almacenadas de manera segura en el páncreas, y después de ser liberadas en el intestino se activan mediante la hidrólisis de un enlace peptídico.
Para comprender la estructura química de las pro-teínas, es necesario determinar la secuencia de sus ami-noácidos. Además de éstos, algunas proteínas contienen otros compuestos; a estas proteínas se les conoce como proteínas conjugadas, y la parte que no es aminoácido se denomina grupo prostético. Las glucoproteínas y los proteoglucanos contienen carbohidratos unidos median-te enlaces covalenmedian-tes, en tanto que las lipopromedian-teínas con-tienen como grupo prostético a los lípidos.
Funciones de las proteínas
El papel medular de las proteínas en las células queda plasmado en el hecho de que la información genética se expresa fi nalmente en forma de proteína. Para cada proteína expresada en algún momento biológico existe un segmento de DNA (gen) que codifi ca la información de la secuencia de aminoácidos de la proteína. Una célu-la es capaz de sintetizar miles de proteínas diferentes a la vez, cada una de ellas codifi cada por un gen y encar-gada de una función específi ca dentro de la biología de la célula o del organismo del cual ésta forma parte. Todas las funciones biológicas de los organismos, sean éstos unicelulares o pluricelulares, incluyen la participación de una o hasta varias proteínas. Las proteínas actúan como estructuras con funciones mecánicas o de soporte, como catalizadores de reacciones enzimáticas y realizan-do un gran número de funciones. Se conocen numerosas funciones de una gran cantidad de proteínas (y segura-mente es mucho más lo que se desconoce). A continua-ción se mencionan de manera breve algunos ejemplos. Interacción hidrófoba Puente eléctrico Puente disulfuro Puente eléctrico 1 2 3 4
Figura 1-18 Estructura terciaria.
Catálisis
Casi todas las reacciones químicas dentro de una célula son catalizadas por proteínas. Un proceso, como la obten-ción de energía a partir de la glucosa, requiere el funciona-miento y la coordinación de un gran número de enzimas.
Transporte
El oxígeno que respiramos es transportado en la sangre al resto del organismo por una proteína llamada hemoglobi-na, presente en los eritrocitos.
Almacenamiento
El hierro se almacena dentro del organismo en el hígado formando un complejo con una proteína llamada ferritina.
Movimiento
Las proteínas son fundamentales como componentes de los músculos.
Soporte y estructura
El colágeno es una proteína que proporciona la propiedad de tensión de la piel y huesos. La elastina es una proteína elástica que brinda a los tejidos, como arterias y pulmo-nes, la capacidad de estirarse. Estos ejemplos muestran la versatilidad de las propiedades físicas de las proteínas.
Respuesta inmunitaria
El sistema inmunitario, el encargado de protegernos de organismos patógenos, está constituido por cientos de proteínas y requiere de la precisa interacción de éstas. Los anticuerpos y las interleucinas son ejemplos de pro-teínas que participan en los mecanismos de la respuesta inmunitaria.
Impulsos nerviosos
Los impulsos nerviosos se transmiten al interior de las células por iones que pasan a través de canales de tipo proteínico.
Métodos de estudio de las proteínas
Una de las principales metas de la bioquímica es investi-gar cómo las secuencias de aminoácidos determinan las conformaciones de las proteínas. Es importante saber cómo las proteínas se unen a sustratos específi cos y otras moléculas y cómo intervienen en la catálisis y transfi e-ren energía e información. Un paso indispensable en esos estudios es la purifi cación de las proteínas de interés.
Algunas de las metodologías para estudiar, purifi car y analizar proteínas son la electroforesis, la cromatografía y la secuenciación.
Aislamiento y purifi cación de proteínas
A menudo, el primer paso para la purifi cación de proteí-nas implica separar las moléculas de proteíproteí-nas de solutos de bajo peso molecular. Después puede llevarse a cabo algún grado de separación de diferentes proteínas con base en propiedades físicas, como la carga eléctrica, el tamaño y la solubilidad diferencial en distintos solventes. Por último, es posible obtener un alto grado de purifi ca-ción, dependiendo de la afi nidad específi ca de las proteí-nas hacia ciertos compuestos que están unidos a alguna forma de soporte sólido; a este proceso se le conoce como cromatografía de afi nidad.
Diálisis
Por defi nición, las moléculas de proteínas son de alto peso molecular, en general mayor a 5 000 daltones, por lo que no pasan a través de membranas semipermeables (de celulosa con poros) que sí permiten el libre paso de moléculas más pequeñas. Esta permeabilidad selectiva es la base del proceso denominado diálisis. Por lo general, ésta se realiza colocando la solución de proteína dentro de una bolsa de celofán y sumergiendo la bolsa en un volumen considerable de solución amortiguadora. Las proteínas que tienen dimensiones mucho más grandes que el diámetro del poro son retenidas dentro de la bolsa de diálisis, en tanto que las moléculas más pequeñas y iones difunden hacia el amortiguador a través de la bol-sa. Esta metodología es útil cuando, durante el proceso de obtención de proteínas de las células, se utilizó algún compuesto que pueda interferir con el siguiente paso de análisis de proteínas.
Solubilidad selectiva
La solubilidad de la mayoría de las proteínas es baja en altas concentraciones de sal, pero difi ere de una proteí-na a otra; por ejemplo, el fi brinógeno, uproteí-na proteíproteí-na séri-ca, precipita a concentraciones de 0.8 M de sulfato de amonio, y la albúmina sérica a concentraciones de 2.4 M. Las proteínas pueden precipitarse selectivamente de una mezcla de diferentes proteínas agregando sales neutras como sulfato de amonio, solventes orgánicos como etanol o acetona, o potentes agentes precipitantes como el ácido tricloroacético. Las proteínas son menos solubles en un solvente dado cuando el pH es igual a su punto isoeléc-trico. En el punto isoeléctrico, la proteína no lleva carga eléctrica neta, y por tanto es mínima la repulsión elec-trostática entre las moléculas de proteínas. Aunque en su punto isoeléctrico una proteína puede llevar grupos
car-Proteínas 13
gados positiva y negativamente, la suma de estas cargas es cero. A valores de pH superiores al punto isoeléctrico, la carga neta será negativa, en tanto que a cifras de pH inferiores la carga neta será positiva. Esta metodología se utiliza cuando se requiere hacer una separación burda de proteínas de un extracto total de células; también es una manera de concentrar y enriquecer proteínas para su análisis.
Filtración en gel
Las proteínas pueden separarse según su tamaño por medio de fi ltración en gel. Esta técnica se basa en la difu-sión de las moléculas a través de los poros de una matriz de gel en una columna. El dextrán o la agarosa son polí-meros de carbohidratos y son el tipo de gel usado por lo general en forma de esferas muy pequeñas; este material se consigue comercialmente como Sefadex, Sefarosa y Bio-gel, con tamaños de poros muy variados. La muestra de proteínas se aplica en la parte superior de la colum-na, y el resultado es que las proteínas que son de mayor tamaño que el poro de la matriz no difunden dentro de las esferas y se eluyen rápido, en tanto las más pequeñas pueden difundir libremente dentro de las esferas del gel y eluyen de la columna más tarde después que un volu-men mayor de regulador ha pasado a través de ella. Se debe observar que el orden de elusión de las proteínas sometidas a fi ltración en gel es inverso al orden obser-vado en la electroforesis en gel. Esta metodología es útil para separar grandes cantidades de proteínas. Se pueden separar proteínas de alto peso molecular de otras de bajo peso, pero la resolución es mucho más baja que en la electroforesis en gel.
Electroforesis
El movimiento de las moléculas de proteína eléctrica-mente cargadas en un campo eléctrico se denomina electroforesis. Es un método importante para separar proteínas y otras moléculas como DNA y RNA. Las sepa-raciones electroforéticas casi siempre se realizan en geles (o en soportes sólidos como papel). En la electroforesis, las moléculas que son más pequeñas que el poro del gel migran más rápido que las moléculas más grandes que el poro, y las moléculas de tamaño intermedio migran a través del gel con diverso grado de movilidad. Los geles de poliacrilamida son químicamente inertes, y los tamaños del poro pueden ser controlados mediante la elección de las concentraciones de poliacrilamida y metilbisacrilami-da. Las proteínas pueden ser separadas con base en su masa mediante electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones desnaturalizantes (SDS-PAGE). El duode-cilsulfato de sodio (SDS) es un detergente aniónico que rompe todas las uniones no covalentes de una proteína natural. El β-mercaptoetanol y el ditiotreitol son
reduc-tores que rompen los puentes disulfuro. Estos tres com-puestos se utilizan por lo regular en la electroforesis de proteínas. Los aniones del SDS se unen a la cadena de proteínas en una relación de una molécula de SDS por cada dos residuos de aminoácidos, lo que da como resul-tado un complejo SDS-proteína desnaturalizada con una carga negativa neta proporcional a la masa de la proteína; la carga negativa del complejo SDS-proteína es más gran-de que la gran-de la proteína natural. La dirección gran-de la elec-troforesis es de arriba hacia abajo y las proteínas se sitúan como bandas en zonas estrechas, pero para ser visualiza-das se utilizan métodos de tinción como la plata (capaz de detectar hasta ∼0.02 μg de proteína) y el azul Coomassie (que permite detectar hasta ∼0.1 μg de proteína); tam-bién se puede hacer marcaje radiactivo y las proteínas se visualizan al colocar una placa de rayos X sobre el gel (autorradiografía). El SDS-PAGE es un método sensible, rápido y con un alto grado de resolución (permite identi-fi car proteínas con una diferencia de tamaño de 1 kDa); esta metodología combinada con la de la inmunoelec-trotransferencia (Western blot) es una herramienta con enormes ventajas en el estudio de las proteínas.
Isoelectroenfoque o electroforesis en dos dimensiones (2D)
Las proteínas también se pueden separar electroforética-mente con base en su contenido relativo de residuos áci-dos o básicos. El punto isoeléctrico de una proteína es el pH en el cual su carga neta es cero; a ese pH, su movilidad electroforética es igual a cero. Si una mezcla de proteínas se somete a electroforesis en un gradiente de pH en un gel en ausencia de SDS cada proteína se moverá hasta alcanzar una posición en el gel en la cual el pH es igual al punto isoeléctrico de la proteína. El gradiente de pH en un gel se forma por la electroforesis de una mezcla de polianfolitos que tienen muchos valores de punto isoeléc-trico. El isoelectroenfoque puede resolver proteínas que difi eren hasta de 0.01 de punto isoeléctrico; se combina con SDS-PAGE para realizar separaciones de proteínas de muy alta resolución; primero se separan las proteí-nas por su punto isoeléctrico y luego por su peso mole-cular. Esta metodología permite identifi car proteínas de interés que pueden ser sometidas a secuenciación para la identifi cación del tipo de proteína así como para el dise-ño de oligonucleótidos para hacer pruebas de reacción en cadena de la polimerasa para diagnóstico, clonación de genes, o ambas cosas.
Cromatografía de intercambio iónico
Las proteínas pueden ser separadas con base en su carga neta mediante cromatografía de intercambio iónico. Se basa en la interacción electrostática entre una proteína cargada positiva o negativamente con una partícula fi ja
de resina de intercambio iónico/catiónico que tiene una carga opuesta. Por ejemplo, si una proteína tiene una car-ga neta positiva a pH de 7.0, ésta se unirá a la columna que tiene grupos carboxilo (carga neta negativa), y de manera contraria, otra proteína con carga neta negativa no se unirá a la columna. Una proteína con carga positiva que está unida a la columna puede ser eluida (liberada) con incremento en la concentración de cloruro de sodio u otras sales en la solución amortiguadora de elusión. Los iones de sodio compiten por unión a la columna con los grupos de la proteína cargados positivamente. Las pro-teínas que tienen una baja densidad de carga neta positi-va eluyen primero de la columna que las que tienen una densidad de carga neta positiva mayor.
Las proteínas cargadas negativamente (aniónicas) deben ser separadas mediante cromatografía de inter-cambio catiónico, es decir, columnas con carga positiva como la dietilaminoetil-celulosa (DEAE-celulosa) y las proteínas cargadas positivamente (catiónicas) mediante cromatografía de intercambio aniónico como la columna de carboximetilcelulosa (CM-celulosa). Es un paso inter-medio y una técnica muy utilizada en el proceso de puri-fi cación de proteínas.
Cromatografía de afi nidad
Es otra metodología bastante útil y poderosa utilizada en la purifi cación de proteínas; se basa en la alta afi nidad que presentan muchas proteínas por grupos químicos específi cos de otras moléculas. Un ejemplo es una proteí-na de las plantas, la concaproteí-navaliproteí-na A (Con A), la cual pre-senta una alta afi nidad por la glucosa. En una columna que tiene residuos de glucosa unidos covalentemente, se pasa un extracto crudo de proteínas y la Con A se une a la columna, en tanto que las otras proteínas no; la elusión de la Con A unida a la columna se realiza con una solu-ción concentrada de glucosa; la glucosa de la solusolu-ción desplaza a la Con A unida a los residuos de glucosa de la columna.
Peso molecular
Cada proteína tiene un peso molecular único, de modo que, bajo condiciones específi cas, el tamaño o peso mole-cular de una proteína la distingue de otras proteínas. Las proteínas que poseen una estructura cuaternaria están formadas por varias cadenas polipeptídicas que se man-tienen juntas por interacciones no covalentes. Cuando se analizan estas proteínas en condiciones de disociación (p. ej., urea 8.0 M para debilitar los enlaces por puente de hidrógeno y las interacciones hidrófobas; mercaptoetanol 1 mM para romper puentes disulfuro), puede determinar-se el peso molecular de las cadenas que la conforman. Al comparar con el peso molecular natural, casi siem-pre es posible saber cuántas cadenas polipeptídicas están incluidas en la cadena natural.
Determinación de la secuencia
del extremo aminoterminal
Antes de la secuenciación de los péptidos, es necesario eli-minar los puentes disulfuro en los péptidos y entre éstos. El tratamiento más común es usar 2-β-mercaptoetanol o ditioteitrol; ambos compuestos reducen los puentes disulfuro. Una de las principales técnicas para secuen-ciar péptidos y proteínas del extremo aminoterminal es la degradación de Edman: este método permite obtener secuencia completa de un péptido dado; consiste en el marcaje con fenilisotiocianato del residuo aminoterminal y de su hidrólisis del resto de la cadena peptídica sin alte-rar la constitución del resto de ésta; se elimina de manera secuencial y cíclica un residuo a la vez del extremo ami-noterminal, lo que permite identifi car cada aminoácido de la secuencia, empezando por el extremo amino. El fenilisotiocianato reacciona con el grupo aminoterminal no cargado del péptido para formar un derivado feniltio-carbamilo; en condiciones ligeramente ácidas, se libera un derivado cíclico del aminoácido aminoterminal y deja intacto el resto del péptido; el derivado cíclico puede ser identifi cado por técnicas cromatográfi cas; la reacción se repite de nuevo sobre el péptido restante una y otra vez hasta completar, determinar la secuencia completa del péptido, o ambas cosas.
Teóricamente el método de Edman debería permitir la secuenciación completa de una proteína, pero en la práctica no se pueden secuenciar más de 50 residuos de aminoácidos. Con base en esto, se desarrollaron otras metodologías para secuenciar proteínas, las cuales junto con la de Edman dan resultados favorables. Éstas consis-ten en la degradación parcial de las proteínas o péptidos de interés mediante métodos químicos o enzimáticos. La degradación de péptidos con bromuro de cianógeno sólo rompe enlaces peptídicos en el lado carboxilo de los resi-duos de metionina. La tripsina es una enzima proteolítica que rompe cadenas polipeptídicas en el lado carboxilo de la arginina o lisina. Los péptidos obtenidos median-te estos tipos de rompimiento son separados por algún método cromatográfi co, y la secuencia de cada péptido purifi cado se determina por el método de Edman; el aná-lisis de la secuencia se puede hacer por métodos compu-tacionales utilizando una base de datos.
NOTA: con la conclusión del Proyecto Genoma Humano y la secuenciación de genomas completos de varios organismos procariontes y eucariontes, no se ha descifrado ni descifrará la compleja biología de los seres vivos; tampoco se han alcanzado las expectativas que se tenían. La comunidad científi ca ha confi rmado con mayor énfasis que las proteínas juegan papeles impres-cindibles en todos los sistemas biológicos, por lo que aho-ra se ha hecho hincapié en el estudio de las proteínas. Esto ha dado lugar al resurgimiento con mayor fuerza de la ciencia de la proteómica que consiste en el estudio de
Proteínas 15
las proteínas expresadas por los diferentes tipos celulares y organismos. El término proteoma se refi ere a todas las proteínas expresadas por un genoma; por tanto, la pro-teómica incluye la identifi cación de proteínas así como su papel en las funciones fi siológicas y fi siopatológicas en un organismo dado. En teoría, los aproximadamente 30 000 genes defi nidos por el Proyecto Genoma Humano se traducen entre 300 000 y un millón de proteínas, si se considera el proceso de ajuste (corte y empalme) alter-nativo y las modifi caciones postraduccionales. Un peque-ño ejemplo de la importancia de la proteómica consiste en que ésta ha permitido identifi car nuevos marcadores (proteínas) de enfermedades en el ser humano y se tiene la confi anza que la identifi cación de éstos será útil para el diagnóstico temprano de enfermedades y el desarrollo de nuevos fármacos, por lo que el futuro de la biotecnología y la medicina será impactado grandemente por la proteó-mica, “el estudio de las proteínas”.
Preguntas
1. ¿Qué son las proteínas? Escriba una defi nición pro-pia.
2. ¿Cuáles son las funciones de las proteínas? Defi na y explique al menos cinco.
3. ¿Qué son los aminoácidos? Defi na cuántos son, cuá-les son los esenciacuá-les y los no esenciacuá-les; mencione tres de sus propiedades.
4. ¿Qué es el enlace peptídico? Escriba su defi nición. 5. ¿Cuáles son los niveles de organización de las
pro-teínas?
6. Defi na cada uno de los niveles de organización de las proteínas.
7. ¿Qué es la hélice α y la hoja plegada β?
8. ¿Cuáles son los tipos de fuerzas que defi nen la es-tructura terciaria de las proteínas?
9. Escriba por lo menos cinco métodos que se utilizan en el estudio de las proteínas.
10. ¿Qué método o métodos usaría para identifi car el peso molecular y el punto isoeléctrico de una proteí-na dada, considerando que ya la purifi có por croma-tografía de afi nidad?
11. Describa a manera de ensayo breve la importancia de las proteínas en los sistemas biológicos.
GLOSARIO
Anión: ion cargado negativamente. Catión: ion cargado positivamente.
Célula: unidad fundamental de los organismos vivos,
por lo general de tamaño microscópico, capaz de reproducción independiente y formada por un citoplasma y un núcleo rodeados por una membrana.
DNA: ácido desoxirribonucleico. Constituye el material
genético de las células y contiene en su secuencia la información para la síntesis de proteínas.
Enlace covalente: tipo de enlace que tiene lugar entre
átomos al compartir pares de electrones.
Enzima: proteína que cataliza específi camente cada
una de las reacciones bioquímicas del metabolismo.
Ion: átomo o agrupación de átomos que por pérdida o
ganancia de uno o más electrones adquiere carga eléctrica.
Molécula: unidad mínima de una sustancia que
conserva sus propiedades químicas. Puede estar formada por átomos iguales o diferentes.
Patógeno: microorganismo que tiene la capacidad
de desarrollar o provocar una enfermedad o de producir daño en otro.
Polipéptido: molécula formada por la unión covalente
de dos o más aminoácidos.
RNA: ácido ribonucleico. Según su función se divide en
BIBLIOGRAFÍA
Sitios web recomendados
http://sebbm.bq.ub.es/BioROM/contenido/av_biomo/material. html http://sebbm.bq.ub.es/BioROM/contenido/av_biomo/Mat3b. html http://prospector.ucsf.edu/ucsfhtml4.0/msdigest.htm http://www.expasy.ch/
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C a p í t u l o
2
2
Composición y estructura
de los ácidos nucleicos
Dra. Mónica Elisa Ureña Guerrero
I
NTRODUCCIÓN
El estudio de los seres vivos debe comenzarse con el conocimiento de los componentes moleculares que los estructuran: las biomoléculas o moléculas de la vida. Este tipo de moléculas se rige por las mismas leyes físicas y químicas que rigen a la materia inerte; sin embargo, su grado de complejidad y organización es propio de la materia viva.
Las biomoléculas se componen principalmente de átomos de carbono (C), hidrógeno (H), oxígeno (O) y nitrógeno (N). Los átomos de carbono se unen entre sí a través de enlaces covalentes y forman cadenas o esque-letos moleculares de base, cuyas valencias libres pueden interactuar con H, O y N, o bien, con grupos funcionales o radicales formados por diferentes combinaciones de éstos. Así, dentro de los seres vivos, C, H, O y N, solos o en combinación con otros elementos, forman compuestos de bajo peso molecular (biomoléculas) como los monosa-cáridos, ácidos grasos, aminoácidos y nucleótidos, que constituyen los sillares monoméricos de macromolécu-las (biopolímeros) como los polisacáridos, los lípidos, macromolécu-las proteínas y los ácidos nucleicos, respectivamente.
Cada tipo de biomolécula y biopolímero se ha seleccio-nado, a través de miles de millones de años de evolución, para cumplir con un grupo de funciones específi cas. Así, en esta sección se describen las características
molecu-lares (composición y estructura) de los ácidos nucleicos, los cuales se han seleccionado para almacenar y codifi car la información genética (genotipo), de manera que pueda ser traducida para determinar las características morfo-lógicas y funcionales de cada individuo (fenotipo).
C
OMPOSICIÓN
DE
LOS
ÁCIDOS
NUCLEICOS
Todos los seres vivos (procariontes y eucariontes) cuen-tan con dos tipos de ácidos nucleicos, el ácido desoxi-ribonucleico (DNA) y el ácido desoxi-ribonucleico (RNA), cada uno de ellos constituido por nucleótidos específi cos. Cada nucleótido tiene tres componentes característicos: una base nitrogenada, un azúcar de 5 carbonos (pentosa) y al menos un fosfato (fi g. 2-1).
Las bases nitrogenadas son moléculas heterocícli-cas, cuyos anillos moleculares están estructurados tanto por carbono como por nitrógeno. Derivan de dos tipos de compuestos conocidos como purina (estructura cícli-ca de nueve puntas, hexágono-pentágono fusionados) y pirimidina (estructura cíclica de seis puntas, hexagonal) (fi g. 2-2). La adenina (A) y la guanina (G) son bases púricas comunes a ambos tipos de ácidos nucleicos, en tanto que la citosina (C) también está presente en ambos tipos de ácidos nucleicos; la timina (T) exclusiva 17
