Una vez producido el DNA a clonar, es necesario incor- porarlo a un sistema en el cual pueda ser expresado. Esto implica la inserción del fragmento en cuestión en un vec- tor, para lo cual es indispensable la elaboración de un mapa de restricción, que permita localizar el número y la posición de los sitios de corte de las endonucleasas que se utilizarán. Los vectores usados más a menudo son plás- midos bacterianos, es decir, pequeños DNA circulares que no forman parte del genoma bacteriano y que son capaces de replicarse de manera autónoma a éste. Por tanto, cuan- do el plásmido se replique, se copiará también el fragmen- to que le fue insertado. Dado que el sistema bacteriano es capaz de replicar, transcribir y traducir la información contenida en estos plásmidos, es posible, al menos en teoría, que ocurra lo mismo con la secuencia de nuestra elección que haya sido insertada en dicho sistema, lo que permite producir la proteína correspondiente.
A fi n de lograr la clonación o inserción del fragmen- to de DNA de interés en el vector correspondiente, uti- lizamos una o varias enzimas de restricción. Una forma de hacerlo es identifi cando primero una secuencia única de corte en el vector, que permita abrirlo para insertar des- pués el fragmento correspondiente mediante una ligasa de DNA. Por supuesto, no debe haber un sitio de corte identifi cable por esa enzima dentro del inserto, ya que lo
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partiría impidiendo su inserción. Podemos sintetizar quí- micamente pequeños fragmentos de DNA que contengan diversos sitios de corte para endonucleasas de restricción específi cas y luego ligarlos a ambos extremos del DNA a clonar, o incluso en el vector mismo.
Cuando actúa una endonucleasa de restricción, se producen dos tipos de extremos en la molécula de DNA: los extremos romos, cuando el corte se efectúa de modo exacto en el mismo nucleótido en ambas cadenas, y los extremos cohesivos, cuando se hace a diferente distancia en ambas cadenas (de uno a cinco nucleótidos de dife- rencia), quedando, por tanto, una cadena más larga que la otra. En ambos casos, la molécula (inserto) que se liga- rá después de manera covalente debe tener el mismo tipo de corte, sea con extremos romos o cohesivos, para poder ligarse adecuadamente (fi g. 8-1).
La efi ciencia del proceso de clonación dependerá de diversos factores, entre los cuales los más importantes son: una acción completa de la endonucleasa de restric- ción (digestión del fragmento), los tamaños y cantidades relativos de inserto y vector, la acción de la ligasa, así como del tipo de extremos que se quiera ligar.
Transformación
Una vez que el complejo vector-inserto se ha formado, debe incorporarse a una bacteria. Este procedimiento se denomina transformación. El mecanismo preciso de cómo ocurre la incorporación de dicho complejo a tra- vés de la membrana bacteriana aún no es completamen- te conocido. Sin embargo, se sabe que comprende un cambio transiente en la permeabilidad de la membrana, y que es un proceso lento y poco efi ciente, por lo que una vez realizado deben determinarse cuidadosamente cuáles bacterias han incorporado el plásmido y cuáles no. El método más común para monitorear el proceso de transformación es el uso de plásmidos que contengan un gen que confi era a la bacteria que lo incorpore, una resistencia específi ca a ciertos antibióticos.
Cuando se han transformado, las bacterias son cre- cidas en un medio selectivo en presencia del antibióti- co correspondiente. Sólo las bacterias transformadas podrán crecer en estas condiciones. Este procedimiento se realiza en placas de Petri, de suerte que cada colonia obtenida se originó de una sola bacteria transformada, y todas las bacterias de esa colonia derivan de ella, por lo cual cada una constituye un clon, pues todas las bacte- rias que la conforman son idénticas. A este proceso se le llama clonación.
Como se mencionó, no todos los plásmidos obtenidos luego del proceso de inserción y ligamiento contienen el fragmento de DNA, por lo cual es necesario seleccionar- los. Por otra parte, en los experimentos de clonación de genes en los que partimos de RNAm para producir DNAc de doble cadena, también es muy heterogénea la pobla- ción de moléculas utilizadas; por ello, en estos casos debe hacerse una cuidadosa selección de aquel clon bacteriano que contenga exactamente el inserto de interés y no otro. Se ha diseñado una amplia variedad de procedimientos para poder detectar el clon de interés, así como su pro- ducto, una proteína.
Si el fragmento de DNA no codifi ca para una proteí- na, el método usado con mayor frecuencia para identifi - carlo es el marcaje de un fragmento complementario a aquel que interesa identifi car. Dicho marcaje puede ser radiactivo, mediante P32, o químico, con digoxigenina.
El DNA de los clones será extraído e hibridado con esta sonda, lo cual permitirá identifi car de manera especí- fi ca el fragmento correspondiente. Por otra parte, si el inserto codifi ca para una proteína, la elección del pro- cedimiento dependerá de las propiedades de ésta. Por ejemplo, si la proteína a identifi car cataliza una reacción enzimática específi ca o posee alguna actividad biológica característica, esto nos permitirá detectarla. Otro méto- do muy utilizado es el uso de anticuerpos marcados, sea radiactivamente o con fl uorescencia. Estos anticuerpos pueden ser preparados a partir de inyectar a un animal la proteína contra la cual se quieren obtener. El sistema
Fragmento A Fragmento B Fragmento A Fragmento B
Extremos cohesivos Extremos romos
inmunitario reconocerá esta proteína como extraña a él y producirá entonces anticuerpos que la reconozcan de manera específi ca. Los anticuerpos así producidos pue- den ser aislados y marcados.
Los experimentos de clonación génica también se utilizan para purifi car fragmentos específi cos de DNA. Si sólo se puede obtener por síntesis o aislamiento una pequeña cantidad de determinado fragmento de DNA, su clonación nos puede permitir obtener grandes cantida- des de dicho fragmento. Una vez obtenido un clon bac- teriano que contenga el fragmento, a partir de este clon es posible obtener prácticamente cualquier cantidad de copias del mismo.