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UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR
SISTEMA DE POSTGRADO UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR
PROGRAMA DE MAESTRÍA EN CLÍNICA Y CIRUGÍA EN CANINOS
TESIS DE INVESTIGACIÓN COMO REQUISITO PREVIO PARA LA OBTENCIÓN DEL TÍTULO DE
MAGISTER EN CLÍNICA Y CIRUGÍA CANINA
DETERMINACIÓN DE LA RESISTENCIA MICROBIOLÓGICA EN HEMOCULTIVO Y ORINA A LA ENROFLOXACINA EN
PERROS QUE ASISTEN A CONSULTA DE LA CLÍNICA VETERINARIA DRA. ZAPATA 2013
DRA. MATILDE LORENA ZAPATA SAAVEDRA
DIRECTOR DE TESIS:
Dr. Rafael Alarcón Carló, M.Sc.
GUAYAQUIL-ECUADOR 2014
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SISTEMA DE POSTGRADO UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR
CERTIFICACIÓN
Yo: Dr. Rafael Alarcón Carló, M.Sc. docente de la Universidad Agraria del Ecuador, en mi calidad de Director CERTIFICO QUE: He revisado la Tesis de Investigación Titulada: DETERMINACIÓN DE LA RESISTENCIA MICROBIOLÓGICA EN HEMOCULTIVO Y ORINA A LA ENROFLOXACINA EN PERROS QUE ASISTEN A CONSULTA DE LA CLÍNICA VETERINARIA DRA.
ZAPATA 2013, la misma que ha sido elaborada y presentada por la maestrante:
Matilde Lorena Zapata Saavedra; la cual cumple con los requisitos técnicos y legales exigidos por la Universidad Agraria del Ecuador para este tipo de estudios.
Atentamente,
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Dr. M.Sc. Rafael Alarcón Carló.
Guayaquil, 13 de Marzo del 2014
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UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR
SISTEMA DE POSTGRADO UNIVERSIDAD AGRARIA DEL ECUADOR
TEMA
DETERMINACIÓN DE LA RESISTENCIA MICROBIOLÓGICA EN HEMOCULTIVO Y ORINA A LA ENROFLOXACINA EN PERROS QUE ASISTEN A CONSULTA DE LA CLINICA VETERINARIA DRA. ZAPATA 2013
AUTOR
MATILDE LORENA ZAPATA SAAVEDRA
TESIS DE INVESTIGACIÓN
APROBADA Y PRESENTADA AL CONSEJO DE POSTGRADO COMO REQUISITO PREVIO A LA OBTENCION DEL TITULO DE
MASTER EN CIENCIAS EN CLÍNICA Y CIRUGÍA CANINA
TRIBUNAL DE SUSTENTACIÓNDra. María Emén Delgado M.Sc.
PRESIDENTE
Dr. Rafael Alarcon Carló M. Sc. Dra. Fabiola Mieles Soriano M. Sc.
EXAMINADOR PRINCIPAL EXAMINADOR PRINCIPAL
Dr. Manuel Pulido Barzola M. Sc.
EXAMINADOR SUPLENTE
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AGRADECIMIENTO
Quiero agradecer a todos aquellos quienes colaboraron no solo en este trabajo, sino en mi formación personal y profesional en el campo educativo:
A los miembros del comité de mi tesis, Dra. María Emén M. Sc., Dr. Manuel Pulido M. Sc., Dr. Rafael Alarcón M. Sc. y Dra. Fabiola Mieles M. Sc., invalorables guías de conocimiento, soporte académico y entusiasmo en la realización de este trabajo.
A mis maestros de la Maestría de Clínica y Cirugía de Caninos, quienes con su gran sabiduría, profesionalismo y calidad humana me han ayudado a explotar mis potencialidades y a confirmar que la Educación es la ciencia más hermosa, por intermedio de la cual se puede cambiar vidas positivamente. Mil gracias
Quiero agradecerle a mi director de tesis, el Dr. Rafael Alarcón Carló M. Sc., sus conocimientos invaluables que me brindo para llevar a cabo esta investigación y sobretodo su gran paciencia para esperar a que este trabajo pudiera llegar a su fin.
Agradezco a aquellas grandes personas que hacen posible el conocimiento en las aulas de la sección, los excelentes profesores del programa de maestría. A mis compañeros de la generación, por todos los buenos y malos momentos que viví con ellos. A todos los que alguna vez han compartido sus conocimientos para enriquecernos todos.
El autor
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DEDICATORIA
El Señor mi pastor; nada me faltará. Salmo 23:1 quiero dedicar este esfuerzo a mi Dios, quien dio su vida, al morir por mí en la cruz del calvario, por El y para El culmino esta etapa de mi vida académica.
A mis amados padres Romel y Nelly, quienes me han apoyado incondicional desde niña y que han sido mi ejemplo. A ellos que me enseñaron a salir adelante, afrontando los retos y a vencer las dificultades que se presentan en cada etapa de mi vida.
Para mis pequeños traviesos Jean, Javi y Nicole a quienes, con el corazón lleno de tristeza, tuve que robarte horas de convivencia y juegos para poder terminar mi carrera pero con sus sonrisas y mil besos, son el impulso de mi mayor ilusión, mi valentía, mi fuerza, mi alegría... la razón de mi vida..
A mis hermanas y sobrina por su amor y apoyo incondicional en esta larga lucha de cada día.
Matilde Lorena Zapata Saavedra
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RESPONSABILIDAD
La originalidad del presente trabajo, criterios, opiniones, conclusiones y recomendaciones, son de exclusiva responsabilidad de la autor.
Matilde Lorena Zapata Saavedra
Cuando la sabiduría entrare en tu corazón, y la ciencia fuere grata a tu alma, la discreción te guardará; te preservará la inteligencia, para librarte del mal camino...
Proverbios 2:10-12
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RESUMEN
En el trabajo que aquí se presenta, se aborda el estudio de la presencia de resistencias bacterianas en perros que llegaron a consulta con temperaturas superiores a 39.5 ° para esto se realizó tomas de muestras de orina y sangre con las que se procedió a cultivar y determinar la presencia de géneros bacterianos y se estudió el grado de resistencia de las bacterias aisladas, a la enrofloxacina.
Los agentes etiológicos bacterianos asilados en las muestras de sangre fueron 66 entre los que se encontraron: Stafilococcus spp, Streptococcus spp,Enterobacter spp , Pseudomonae spp, Vibrio spp . Los agentes etiológicos bacterianos asilados en las muestras de orina fueron 60 agrupados en:
Stafilococcus spp, Streptococcus spp,Enterobacter spp , Pseudomonae spp, Vibrio spp El cultivo y antibiograma de las muestras en hemocultivo estableció un 30.60% la resistencia bacteriana a la enrofloxacina mientras que en el cultivo de orina se estableció un 43.18% de resistencia. Los resultados de la resistencia microbiológica a la enrofloxacina en las muestras de sangre determinaron que en machos es del 17% mientras que en las hembras alcanzaron el 15.22%. Sin embargo en las muestras de orina existe una diferencia más amplia en machos con un 22.73 % y en hembras con un 15.9%. Los porcentajes más altos de resistencia encontrados de acuerdo en la edad están a los 18 meses con un 10.87% en hemocultivo y con 9.10 % en el cultivo de orina.
Palabras clave: enrofloxacina, abuso, resistencia bacteriana, uso de antibióticos.
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SUMMARY
In the work presented here , the study of the presence of bacterial resistance in dogs that arrived in consultation with temperatures above 39.5 ° for this sampling urine and blood with which it proceeded to determine cultivar was performed and is discussed the presence of bacterial genera and the degree of resistance of the isolated bacteria were studied to enrofloxacin . Asylees bacterial etiological agents in 66 blood samples were found among them: Staphylococcus spp , Streptococcus spp , Enterobacter spp , Pseudomonae spp , Vibrio spp. Asylees bacterial etiological agents in 60 urine samples were grouped in Staphylococcus spp , Streptococcus spp , Enterobacter spp , Pseudomonae spp Vibrio spp The culture and sensitivity of blood culture samples established a 30.60 % bacterial resistance to enrofloxacin while urine culture one 43.18 % resistance was established. The results of the microbiological resistance to enrofloxacin in blood samples found that in males is 17% while in females reached 15.22 %. However, in the urine samples there is a wider difference in a 22.73% males and 15.9% females. The highest percentages of resistance found according to age are at 18 months with 10.87% in blood culture and 9.10 % in the urine culture.
Keywords: enrofloxacin, abuse, bacterial resistance, antibiotic use.
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INDICE
I. INTRODUCCIÓN ... 1
1.1. CARACTERIZACIÓN DEL TEMA ... 1
1.2. PLANTEAMIENTO DE LA SITUACIÓN PROBLEMÁTICA ... 2
1.3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA ... 2
1.4. OBJETIVOS ... 2
1.5. TESIS A DEFENDER ... 3
1.6. APORTE TEORICO ... 3
1.7. APLICACIÓN PRÁCTICA ... 4
1.8. ACTUALIDAD CIENTÍFICA ... 5
II. CAPITULO 1 ... 7
MARCO TEÓRICO ... 7
2.1. FUNDAMENTACIÓN TEORICA ... 7
2.1.1. Definición de Bacterias ... 7
2.1.2. Consumo de Medicamentos en Veterinaria ... 7
2.1.3. Enrofloxacina ... 8
2.1.4. Resistencia a los Antibióticos ... 14
2.2. FUNDAMENTACIÓN LEGAL ... 21
2.3. FUNDAMENTACIÓN TÉCNICA ... 21
2.3.1. Cultivos ... 21
2.3.2. Toma De Muestras Para Cultivos ... 23
2.3.3. Técnicas De Cultivo ... 24
2.3.4. Métodos manuales ... 25
2.3.5. Método de Lisis Centrifugación ... 25
2.3.6. Método de Sistemas Automatizados ... 26
2.3.7. Método Normal de Inoculación de Placas de Cultivo ... 26
2.3.8. Pruebas de Sensibilidad ... 28
x
2.3.9. Lectura de la Prueba ... 30
2.3.10. Categoría De Interpretación De Los Resultados Del Método De Difusión Con Discos: ... 31
2.4. SISTEMA DE HIPOTESIS ... 31
III. CAPITULO 2 ... 32
ASPECTOS METODOLÓGICOS ... 32
3.1. METODOS ... 32
3.1.1. Modalidad y Tipo de Investigación ... 32
3.1.2. Variables ... 33
3.1.2.1. Variable dependiente ... 33
3.1.3. Estadística descriptiva ... 33
3.1.4. Población y Muestra ... 34
3.1.5. Técnicas ... 34
3.1.6. Cronograma de Actividades ... 37
RESULTADOS... 38
DISCUSIÓN ... 43
CONCLUSIONES Y RECOMENDACIONES ... 47
BIBLIOGRAFÍA ... 49
ANEXOS ... 53
1
I. INTRODUCCIÓN
1.1. CARACTERIZACIÓN DEL TEMA
Los antibióticos son sustancias químicas producidas por ciertos microorganismos que inhiben o matan el crecimiento de otros. Son productos de la actividad
bacteriana y se producen en gran escala.
El uso de los antibióticos ha alcanzado un grado importante. El descubrimiento y el uso clínico de los mismos han ido paralelo a la aparición de bacterias
resistentes a su acción.
Las fluorquinolonas son un grupo de agentes antibacterianos sintéticos usados en medicina tanto humana como veterinaria para el tratamiento de una variedad de enfermedades infecciosas. Aunque se han sintetizado muchas de ellas, las más conocidas entre las desarrolladas y usadas en medicina veterinaria incluyen la amifloxacina, ciprofloxacina, danofloxacina, enrofloxacina,marbofloxacina, norfloxacina y sarafloxacina.
El panorama se torna grave, pues su resistencia induce el empleo de mayores concentraciones de antibióticos para su tratamiento, lo que puede propiciar procesos tóxicos. Otro de los inconvenientes incide en la salud pública, pues se acorta la vida media de los medicamentos y se hace necesaria la creación de otros para proteger a humanos y animales sujetos a régimen.
El médico veterinario necesita de instrumental, medios diagnósticos y de herramientas preventivas y terapéuticas sin las cuales no podría dar a los animales los cuidados que merecen y necesitan para conservar un buen estado de salud y bienestar. En nuestro país, aún no se desarrolló ningún programa con estas características para aislamientos de origen animal, por tal motivo no se cuenta con información acerca de cómo se comportan los diferentes
microorganismos. Por este motivo es importante la determinación de la resistencia
2 microbiológica en hemocultivo y orina a la enrofloxacina en perros que asisten a consulta de la clínica veterinaria Dra. Zapata 2013.
1.2. PLANTEAMIENTO DE LA SITUACIÓN PROBLEMÁTICA
La resistencia antibiótica es considerada como la capacidad que tienen los microorganismos de resistir los efectos de un antibiótico. Cada día las bacterias son más resistentes y los antibióticos. El uso inadecuado de los medicamentos, parece ser uno de los problemas fundamentales.
En veterinaria, los antimicrobianos se emplean en animales de compañía y de producción; en estos últimos, con fines terapéuticos, profilácticos o como promotores del crecimiento. En cualquiera de los casos, son los mismos
productos que se utilizan para el tratamiento de infecciones en humanos. Dada la importancia del problema, en muchos países del mundo ya se han puesto en marcha programas de vigilancia y monitoreo de la resistencia. Éstos están principalmente orientados al estudio de patógenos humanos, microorganismos zoonóticos y bacterias indicadoras de la flora intestinal normal de los animales.
1.3. PLANTEAMIENTO DEL PROBLEMA
El problema de fondo está en la posible aparición de microorganismos cuya resistencia haga prácticamente imposible el tratamiento, y ocupen el espacio ecológico que otros gérmenes más sensibles dejen incrementando su mortalidad, letalidad, utilización de servicios sanitarios y costos de tratamiento.
Por tal razón se ha creído importante realizar el estudio para determinar la
existencia de la resistencia microbiológica a la enrofloxacina a través de siembras de muestras y antibiogramas en sangre y orina de los perros que asistan a
consulta de la Clínica Veterinaria Dra. Lorena Zapata.
1.4. OBJETIVOS
Por lo antes expuesto el presente trabajo busco conseguir el siguiente objetivo general:
Determinar la resistencia microbiológica en hemocultivo y orina a la
erofloxacina en perros que asisten a consulta de la Clínica Veterinaria Dra.
Zapata 2013.
3 Además los siguientes objetivos específicos:
Determinar los agentes etiológicos bacterianos por genero causantes de la enfermedad
Establecer las posibles resistencias bacterianas a la enrofloxacina en hemocultivos y muestras de orina.
Determinar si existe una relación entre el sexo, la edad y la posible presencia de resistencia microbiológica a la enrofloxacina.
1.5. TESIS A DEFENDER
La terapia antimicrobiana necesita de un uso racional de los fármacos para disminuir en lo posible los errores en la elección del medicamento o en su dosificación ya que estos pueden ser la causa de un fracaso terapéutico, de la aparición de efectos secundarios (tóxicos, residuos en alimentos y
medioambiente). Esto exige un amplio conocimiento de las características farmacológicas de cada compuesto y del comportamiento cinético de los antimicrobianos en las distintas especie animales, ya que se han demostrado diferencias en diversos fármacos, y concretamente las fluoroquinolonas, en los procesos de absorción, distribución, metabolismo y excreción, en diferentes especies e incluso dentro de la misma especie en diferentes edades o estados fisio-patológicos.
Los medio de cultivo y las pruebas de sensibilidad otorgan al doctor veterinario una herramienta eficaz en el tratamiento de enfermedades sin embargo no es aprovechada por la mayoría de colegas.
Por las razones antes mencionadas en importante determinar si existe resistencia a los antibióticos en los perros que llegan a consulta para realizar la elección del fármaco correcto y disminuir el tiempo de tratamiento.
1.6. APORTE TEORICO
Los antibióticos, considerados como una de las sustancias más valiosas que se hayan descubierto, están perdiendo eficacia por el aumento progresivo de la
4 resistencia microbiana, lo que constituye un problema de primera línea para la salud pública global. (Organización Mundial de la Salud 2002)
(Rodriguez, Campoamor y Zaforteza 1998) menciona que debido a sus beneficios terapéuticos y al impacto sanitario y económico que conlleva su empleo, se los considera como un grupo de fármacos de gran importancia.
El incremento de la resistencia a los antibióticos y la diseminación de las bacterias resistentes se ven favorecidos por las fuertes presiones selectivas derivadas de la utilización en forma excesiva e inapropiada de estas drogas en medicina humana y veterinaria y en las prácticas agrícolas, la plasticidad genética de los
microorganismos y los deficientes hábitos higiénicos de amplios sectores de la población mundial. (Barbosa T M 2001)
(Gervas 1999) considera otro aspecto, la aparición de un número cada vez mayor de bacterias resistentes y de nuevos mecanismos de resistencia, que provocan una mayor morbilidad, prolongan las internaciones y ocasionan mayores costos directos (tratamientos) e indirectos (lucro cesante, incremento de la duración del tratamiento, mayores posibilidades de contagio y propagación).
También, ocasionan costos sociales, por cuanto individuos sanos que contactan con los infectados con estas cepas resistentes pueden a su vez infectarse, existiendo la posibilidad de que se originen brotes, tal como se ha reportado con Streptococcus pneumoniae resistente a antibióticos beta lactámicos o
Enterococcus faecalis resistente a vancomicina. (Jasovich y Prieto 2001) 1.7. APLICACIÓN PRÁCTICA
El Cultivo de sangre en una de las pruebas más importantes del laboratorio de microbiología, pues a través, de el podemos establecer con certeza el diagnostico etiológico de bacteriemia o fungemía, en pacientes con o sin foco aparente de infección.
5 Las bacterias sensibles a los antibióticos son uno de los recursos naturales que se han ido agotando en las últimas 5 décadas el determinar la resistencia a los diferentes antibióticos ayudara a salvar muchas vidas al obtener mejores resultados en los diferentes tratamientos que se apliquen a las mascotas.
La enrofloxacina que está entre los más comunes en la practicidad posológica, la eficacia terapéutica, la seguridad de uso justifican el cuidado con el que
debemos manejarlas para prolongarle la vida útil como terapéuticos antimicrobianos.
Por estas y más razones se convierte en una aplicación práctica en la clínica veterinaria por que pretende servir como base para orientar y mejorar el uso de antibióticos y contener la resistencia bacteriana en el sector veterinario.
1.8. ACTUALIDAD CIENTÍFICA
El hemocultivo tiene una importancia capital no solo porque establece con certeza el diagnóstico etiológico, sino también porque la identificación del microorganismo causal y el estudio de su sensibilidad a los antimicrobianos permite elegir el
tratamiento más eficaz. (Romero 2010)
Las fluorquinolonas tienen un mecanismo de acción único, que las convierte en uno de los grupos de antibacterianos más promisorios en medicina veterinaria. Su actividad bactericida de amplio espectro y su versatilidad, particularidades que permiten su utilización en diversas especies animales, han dado lugar a una gran difusión de su uso. Si bien se trata de un grupo de drogas a las que las bacterias no desarrollan resistencia con facilidad, se han detectado cepas resistentes tanto en pacientes humanos como en animales.
Esto implica que se deba proceder con mucho cuidado en su uso para evitar un aumento en la tasa de resistencia y la aparición de serios problemas en la práctica de clínica menor. (Organización Mundial de la Salud 1995)
6 La resistencia bacteriana a los agentes antimicrobianos no puede ser vista como un problema local, ni siquiera nacional, se trata de un problema global, visto desde el sector productivo como para la salud de los seres humanos. (Naula 2011)
7
II. CAPITULO 1
MARCO TEÓRICO
2.1. FUNDAMENTACIÓN TEORICA 2.1.1. Definición de Bacterias
Las bacterias son microorganismos unicelulares procariotas que presentan un tamaño de unos pocos micrómetros y diversas formas incluyendo esferas, barras, sacacorchos, y hélices. Las bacterias pueden vivir en cualquier habitad; incluso algunas especies sobreviven en el espacio exterior. Estas características
convierten a las bacterias en organismos más abundantes del mundo: pueden convivir 40 millones de células bacterianas en apenas un gramo de tierra. (Vadillo y Mateos 2002)
2.1.2. Consumo de Medicamentos en Veterinaria
La mitad de la producción mundial de antibióticos se destina al uso veterinario, para tratamiento de animales enfermos, como promotores de crecimiento del ganado o para eliminar organismos destructores de productos agrarios. (Güerri Santos 2002)
(Gonzalez 2004) considera que el mejoramiento de la orientación y formación básica del estudiante de las disciplinas a fines a la salud humana y/o animal, a fin de que pueda discernir las condiciones en que corresponde emplear un
antibiótico, conozca los riesgos de su mala utilización y los costos que originan las cepas resistentes.
(Palermo y Górnica 2007), menciona que la clasificación de antimicrobianos se eleva en consideración al aspecto de acción con mayor interés en la práctica veterinaria. Una clasificación de antimicrobianos o mecanismo de acción puede auxiliar los posibles efectos colaterales o tóxicos sobre las células de
8 hospedadores, una vez que pueda también acceder algún efecto nocivo sobre las células del hospedador.
Los medicamentos destinados a los animales de compañía deben usarse siempre desde la responsabilidad, tanto por parte de los profesionales como por los
dueños de las mascotas que deben seguir, de manera estricta, las indicaciones de los veterinarios. (Asociación Empresarial Española de la Industria de Sanidad y Nutrición Animal 2012)
Los antibioticos no solo se han sometido a evalución, sino que su uso en dietas para animales durante decadas reporto importantes beneficios al sector pecuario pero se prohibio en España , esto permitio poner remedio a la polemica tras la detección de resistencias bacterianas abriendo multiples puertas a la comunidad cientifica a fin de incrementar nuevas alternativas para en diferentes explotaciones de animales. (Estévez Reboredo y Cutuli 2012)
2.1.3. Enrofloxacina
2.1.3.1. Mecanismo de acción
El principal mecanismo de acción de las quinolonas es la inhibición de la DNAgirasa, una enzima bacteriana involucrada en la mayoría de los procesos biológicos que comprometen al DNA, tales como la transcripción, recombinación, replicación y reparación del mismo. La DNAgirasa es una Topoisomerasa tipo II, y es la única de su tipo capaz de introducir un enrrollamiento helicoidal negativo dentro de la molécula de DNA, desempeñando un rol crítico en el mantenimiento de la densidad genómica superhelicoidal. Las quinolonas inhiben, además, a la Topoisomerasa IV, otra topoisomerasa tipo II esencial en la segregación
cromosómica de las células procariotas. Recientes investigaciones han sugerido que en los organismos Gram positivos es esta enzima la principal diana para algunas quinolonas. En algunas especies de bacterias, tales como E. coli, la diana principal es la DNA-girasa mientras que en otras, como S. aureus, lo es la Topoisomerasa IV. Considerando que estas enzimas tienen funciones algo
9 distintas, es probable que las bacterias difieran en sus respuestas a las
quinolonas de acuerdo a cuál sea la diana principal. Todas las quinolonas tienen el mismo mecanismo básico de acción -llamado mecanismo que requiere RNA y síntesis de proteínas, así como División celular, para ejercer acción bactericida.
(Ocampo y Sumano 2004)
Algunas nuevas quinolonas exhiben otro mecanismo, llamado B, son capaces de matar bacterias que no se están dividiendo, y en ausencia de síntesis de RNA o proteínas. Y unas pocas quinolonas mantienen actividad bactericida en ausencia de multiplicación celular, pero requieren síntesis activa de proteínas y RNA. Este es el llamado mecanismo C. El tipo de mecanismo de acción puede depender del microorganismo en cuestión. (Montoya 2008)
Aun así, se ha demostrado que esta topoisomerasa eucariota tiene una secuencia parcial de aminoácidos homóloga a la enzima bacteriana, que podría representar un sitio de acción para las quinolonas. Se pensaba que las quinolonas eran incapaces de inducir daño genético en células de mamíferos, debido a una afinidad de muy inferior por la topoisomerasa tipo II de los mamíferos. Sin embargo, estudios recientes han producido evidencias de una posible
enotoxicidad de las quinolonas sobre sistemas eucariotas. (Güerri Santos 2002)
2.1.3.2. Actividad antimicrobiana
Al actuar específicamente sobre el DNA, las fluorquinolonas son rápidamente bactericidas, activas a muy bajas concentraciones, y muestran efecto post antibiótico.
Una de las características de estas drogas es que la relación entre la
concentración in vitro del antimicrobiano y la muerte bacteriana describe una curva de tipo bifásico, con disminución del efecto bactericida a muy altas concentraciones. (Medina 2000)
Esto probablemente se deba a una inhibición de la síntesis de RNA a muy altas concentraciones de la droga, síntesis necesaria para que Haya efecto
10 bactericida. Algunos autores sostienen que este efecto hace que las
fluorquinolonas sean considerablemente menos eficaces a concentraciones mucho mayores que su concentración inhibitoria mínima. Sin embargo, en la práctica debería alcanzarse una concentración plasmática inusual antes de que el efecto sea clínicamente aparente. (Otero y Colaboradores 2002)
Las fluorquinolonas actúan como antibióticos concentración - dependientes para las bacterias Gram negativas. Sin embargo, contra bacterias Gram positivas el efecto es tiempo - dependiente, o una combinación de ambos efectos.
Se ha observado que las fluorquinolonas ejercen efecto post antibiótico (EPA) sobre varias puede depender del microorganismo en cuestión, cepas bacterianas, incluyendo, K. pneumoniae y P. aeruginosa (1). La ciprofloxacina y la
norfloxacina inducen EPA de 1,8 a 2,4 horas sobre E. coli, S. aureus y P.
aeruginosa, y la marbofloxacina ha demostrado EPA de 2 a 3 horas contra S.
intermedius.
Enrofloxacina tiene un efecto post antibiótico de 1 a 4 horas de duración (según dosis y microorganismo) contra S. intermedius, P. multocida, E. coli, P.
aeruginosa, S. typhimurium y S. aureus.
Aún a concentraciones por debajo de la CIM las fluorquinolonas inhiben la división celular, reducen la tasa de crecimiento bacteriano, inducen cambios en la
ultraestructura de la superficie bacteriana que previenen la colonización de tejidos específicos, interfieren en la expresión de factores de virulencia, y aumentan la susceptibilidad de algunos microorganismos a la fagocitosis. Además, durante la fase pos antibiótica podrían deprimirse algunos de los mecanismos de resistencia bacteriana. (Otero y Colaboradores 2002)
En ocasiones la eficacia de las fluorquinolonas es afectada por el pH del medio.
Se ha comprobado menor actividad contra bacterias Gram negativas en medio ácido que en medio básico.
11 Sin embargo, la eficacia frente a bacterias Gram positivas, no parece ser
afectada por el pH del medio. Algunos de los compuestos exhiben una actividad considerablemente menor (de hasta 100 veces) en presencia de orina, aunque otros, como la marbofloxacina, han mantenido su actividad bactericida en orina por hasta cinco días luego de una sola aplicación demostró que en pH
ligeramente ácido (característico de tejidos inflamados, abscesos o fagocitos) se reduce la tasa de muerte de algunas bacterias en presencia de enrofloxacina. En contraste, a pH 8 la actividad bactericida de la enrofloxacina casi no varía.
Las fluorquinolonas en general tienen poca actividad contra los anaerobios y son menos eficaces contra anaerobios facultativos desarrollados en condiciones anaeróbicas. El mecanismo de resistencia intrínseca de este tipo de bacterias es poco conocido. Sin embargo, la eficacia de algunos compuestos como la
ciprofloxacina no es afectada por las condiciones anaeróbicas y el pH ácido característico del medio purulento de un absceso. La presencia de cationes divalentes en el medio disminuye la susceptibilidad microbiana a las
fluorquinolonas.
MIRANDA indica que se ha detectado un incremento en la aparición de cepas bacterianas con menos susceptibilidad e incluso resistentes en animales destinados al consumo. Se ha registrado resistencia a la enrofloxacina en Escherichia coli y en distintas especies de Campylobacter y Salmonella.
2.1.3.3. Eficacia en Perros
Los ensayos experimentales y clínicos han mostrado resultados positivos en infecciones de la piel y de los tractos respiratorios, digestivos y genitourinarios en perros, así como en otitis externas e infecciones de heridas. En tejidos y fluidos prostáticos la enrofloxacina alcanza concentraciones mayores que las CIM de casi todos los microorganismos causantes de infecciones del tracto urinario. También es eficaz en el tratamiento de piodermitis causadas por Staphylococcus
intermedius, constituyéndose en una buena alternativa frente a cepas meticilino resistentes. (Mesura Grupo 2000)
12 Las altas concentraciones de antimicrobiano alcanzadas en macrófagos
alveolares y en el Fluido del epitelio de revestimiento pulmonar, permiten asegurar el éxito de una terapéutica en infecciones de las vías respiratorias altas de los perros. Sin embargo las concentraciones alcanzadas en los tejidos -a las dosis recomendadas por el fabricante- no son totalmente eficaces cuando las
infecciones son causadas por Pseudomonas aeruginosa.
La enrofloxacina es eficaz en infecciones causadas por Rickettsia rickettsii y Staphylococcus spp. -hemolíticos, y demuestra sinergia con la estreptomicina frente a cepas referencia de Brucella canis RM.
2.1.3.4. Resistencia Bacteriana
El amplio espectro de actividad antimicrobiana, y el excelente comportamiento farmacocinético, han hecho de las nuevas fluorquinolonas agentes muy atractivos para el tratamiento de enfermedades infecciosas severas, tanto en el hombre como en los animales. Sin embargo, se ha informado una alarmante tasa de resistencia bacteriana en aislados clínicos humanos, y hay evidencias que indican la emergencia de bacterias resistentes en animales tratados. La mayor incidencia de bacterias resistentes a las fluorquinolonas en personas no expuestas a estos agentes podría ser el resultado del uso extensivo de estos antimicrobianos en medicina veterinaria. (Otero y Colaboradores 2002)
Para (Moreno Garcia 2006) uno de los ejemplos más sorprendentes de los ultimos años es el desarrollo de resistencias al grupo de antibioticos de las
fluroquinolonas. Esta resistencia se detecto primero en Holanda donde a las aves se administraba en el agua de bebida enrofloxacina fue seguida de la aparicion de cepas de Campylobacter resistentes a la fluoroquinolonas, no solo en aves sino también en personas constantandose lo mismo en otros paises, siempre como sonsecuencia de su utilización en el tratamiento de infecciones de los animales productores de alimentos.
La resistencia bacteriana a las fluorquinolonas se debe a mutación cromosómica.
Hasta el momento no se ha demostrado resistencia mediada por plásmidos,
13 probablemente debido a que estas drogas inhiben la conjugación. Tampoco se ha descripto inactivación de quinolonas y fluorquinolonas por enzimas microbianas.
(Otero y Colaboradores 2002)
La mutación cromosómica confiere resistencia a las quinolonas por varios mecanismos: (a) alteración de las enzimas blanco; (b) alteración en la permeabilidad de la membrana celular, y c) mecanismo de expulsión activa.
El principal mecanismo de resistencia a las fluorquinolonas se debe a alteraciones en las enzimas diana, y se origina en mutaciones espontáneas de los genes gyrA y gyrB que modifican las subunidades de la DNAgirasa, y en los genes parC (grlA) y pare (grlB) que codifican las subunidades de la topoisomerasa IV. La resistencia puede deberse a mutaciones puntuales en uno o más genes, a mutaciones en más de un sitio del mismo gen, o a mutaciones múltiples, particularmente en gyrA y parC (grlA) en forma simultánea. Las secuencias aminoacídicas de las regiones determinantes de resistencia a las fluorquinolonas son altamente conservadas.
El mecanismo de resistencia por impermeabilidad se ha descripto únicamente en las bacterias Gram negativas y se produce por disminución en la expresión de algún tipo de proteína de la membrana externa (porinas OmpF, OmpC en E. coli), o debido a modificaciones de los lipopoli-sacáridos. Esto resulta en una menor acumulación del antimicrobiano, y en una consecuente disminución de la susceptibilidad microbiana. (Loza Fernandez, Planes y Rodriguez 2003)
El desarrollo de la resistencia bacteriana es un punto a considerar en la actualidad, ye que muchos casos se aislaron Pseudomonas aeruginosas
resistentes a la enrofloxacina. La resistencia ocurre por mutaciones en partículas con Pseudomonas, Klebsiellas pneumoniae, Acinetobacter y enterococos pero no se cree que ocurre la resistencia moderada por plasmidos. (Plumb 2010)
La resistencia cruzada entre quinolonas se observa con mayor frecuencia entre las más antiguas, como el ácido nalidíxico y el flumequine, pero puede existir entre éstas últimas y las fluorquinolonas y entre fluorquinolonas entre sí.
14 La resistencia cruzada entre las fluorquinolonas usadas en animales y aquellas de uso humano es un aspecto particularmente importante para la Salud Pública.
Existe una asociación temporal entre la introducción de las fluorquinolonas en la crianza de aves y el sustancial aumento en la prevalencia de Campylobacter jejuni resistentes a quinolonas aislados de aves, carne de aves y humanos
infectados. Además, estudios recientes han confirmado la similitud entre cepas de Campylobacter spp. Resistentes a las fluorquinolonas, aisladas de animales y humanos. Existe también una relación entre la introducción de las fluorquinolonas en la producción animal y la aparición de cepas de Salmonella typ himurium DT104 y variantes de S. typhimurium DT204 resistentes a estos antimicrobianos.
Varios países han informado un aumento en la emergencia de cepas bacterianas con menor susceptibilidad a las fluorquinolonas en animales luego de la
introducción de estos compuestos para su uso en producción animal. Hay que destacar que ya se ha reportado resistencia a la enrofloxacina en E. coli , Campylobacter jejuni y C. coli.
2.1.4. Resistencia a los Antibióticos
La resistencia es la pérdida de sensibilidad de un microorganismo a un
antimicrobiano al que originalmente era susceptible. Esto involucra un cambio permanente en el material genético del microorganismo, que se transmite a sus descendientes, los que por este motivo resultan también insensibles al
antimicrobiano en cuestión. Cuando se prueba inicialmente una droga
antimicrobiana se le define el espectro de microorganismos sobre los cuales es eficaz o ineficaz (Chirinos 1999).
La velocidad con la que surge y se extiende en poblaciones microbianas esta con frecuencia determinada por la cantidad de antibióticos concretos usados en un ambiente dado. Existe por ello la posibilidad de retrasar su aparición y limitar su extensión con un juicioso uso de antibióticos tanto en animales como en humanos (Medina 2000)
15 El uso de los fármacos antibacterianos selecciona bacterias resistentes y tal selección tiende a suceder en incrementos graduales. Por motivos no
comprendidos en su totalidad, las bacterias resistentes tiendes a adquirir múltiples mecanismos de resistencia. Una vez que la bacteria adquiere un mecanismo de resistencia, tiende a retenerlo. El uso de estos fármacos no crea resistencia sino que elimina las bacterias susceptibles en el huésped y conserva la resistentes.
Por ello el empleo de fármacos antibacterianos proporciona la fuerza selectiva del proceso darwiniano de la selección natural. Solo la bacteria resistente “mas apta”
sobrevive a los fármacos antibacterianos. Por cierto, el uso de los antibacterianos durante los últimos 50 años ha modificado la forma significativa la frecuencia de los diferentes tipos de infecciones microbianas observadas en animales y
personas. El potencial para la mutación de una bacteria y el intercambio genético entre bacterias, combinado con el escaso tiempo de generación de las bacterias, pueden producir poblaciones resistentes con rapidez, las cuales serán
seleccionadas con el uso de fármacos antibacterianos, aunque este efecto selectivo a menudo tiene especificidad de especie no es inevitable. El desarrollo de una resistencia por lo común sigue a la introducción de nuevos fármacos
antibacterianos. (Como Hacer frente al aumento dela resistencia a los antibioticos 2000)
La OMS ha enfatizado la necesidad de que cada país integre un grupo nacional de trabajo para mejorar el uso de los antibióticos y contener la resistencia
bacteriana, el cual deberá estar constituido por representantes de los ministerios de salud y agricultura, organizaciones de profesionales y consumidores, grupos académicos y de la industria. (Deser 2009)
2.1.4.1. Significado de Resistencia
La resistencia en un organismo se puede definir de dos maneras. Primero, se puede definir en relación con la población como un conjunto del cual el organismo es una parte. A menudo existe un límite entre la susceptibilidad in vitro de las bacterias susceptibles y resistentes dentro de una población. Segundo, se puede definir la resistencia en relación con la concentración media sérica o tisular de un fármaco antimicrobiano administrado en la dosis usual por la vía acostumbrada.
16 Esta relación puede emplearse para definir un punto límite en la interpretación de los datos de susceptibilidad in vitro, un valor que en ocasiones también obtenidos al estudiar las bacterias susceptibles y resistentes dentro de la población de la especie particular examinada. (Kumar 1997)
(Silva García, y otros 2006) Define la resistencia como la disminución o ausencia de susceptibilidad de un microorganismo aun determinado antimicrobiano. Las Bacterias han ido aumentando su nivel de resistencia frente a los antibioticos, actuales, debido al mal uso que se realiza de los mismos y la snuevas cepas resistentes que han aparecido.
2.1.4.2. Tipos y Mecanismos de Resistencia
Un aspecto preocupante de la adquisición de resistencias es su difusión en el mundo microbiano. La adquisición de los diferentes mecanismos de resistencia puede ser originada por el propio microorganismo, fruto de errores en su
replicación, o bien por adquisición de material genético que codifique genes de resistencia. (Ausina Ruiz y Moreno Guillén 2006)
La resistencia e clasifica como intrínseca (constitutiva) o adquirida.
Resistencia Intrínseca
Las bacterias pueden ser intrínsecas o naturalmente resistentes a los antibióticos debido a la ausencia de los mecanismos celulares requeridos para la acción antibiótica. Entre los muchos ejemplos están los de resistencia intrínseca de la Enterobacteriaceae a la vancomicina y de los gram positivos a la polimixina B.
Asimismo, las bacterias que son susceptibles in vitro pueden ser resistentes in vivo. Por ejemplo a veces las bacterias gran positivas pueden perder su pared celular y luego persistir en el cuerpo como formas L, las cuales son resistentes a los antibióticos beta-lactámicos. (Prescott 2002)
17 Resistencia Adquirida
La resistencia adquirida está basada en la genética y puede derivar de la mutación cromosonal, o de mayor importancia, mediante la adquisición de material genético transferible. Existen muchos mecanismos de resistencia
adquirida que incluyen la activación de bombas de egreso del fármaco e inducción de enzimas que degradan el agente antibacteriano. La resistencia adquirida no es un problema en todas las especies bacterianas. Las bacterias grampositivas, excepto los estafilococos, a menudo carecen de la capacidad para adquirir plasmidos R, de modo que su importancia como causales de enfermedad en los animales y personas para una serie de especies, ha declinado de forma
considerable desde que comenzó la era antibiótica. (Prescott 2002)
Dos factores contribuyen a la gravedad del problema una vez que desarrolla organismos multirresistentes: pueden persistieren el huésped o en el ambiente en ausencia de la selección antibiótica y pueden obrar como reservorios de genes de resistencia que pueden diseminarse hacia otras bacterias. Las bacterias que son resistentes a un antibiótico tienden a volverse resistentes a otros antibióticos por razones no muy comprendidas pero que pueden relacionarse con la presencia de defectos mutacionales en el ADN en desproporción con los mecanismos
reparadores cromosomal y al intercambio promiscuo del ADN entre especies.
2.1.4..3. Mutación cromosomal de la resistencia
Las mutaciones cromosomales que conducen a la resistencia a menudo producen cambios estructurales en la célula bacteriana, mientras que la resistencia trasferible tiende a codificar las enzimas que metabolizan a los antibióticos. Las mutaciones que provocan antibioticorresistencia son eventos espontáneos consistentes en cambios de la secuencia de nucleótidos
cromosomales no influidos por la presencia de antibióticos. La resistencia cromosomal en general es un proceso escalonado, gradual, mientras que la transferible a menudo es un alto nivel del todo o nada. Una excepción a esta
18 generalización es la inducción en ciertas especies bacterianas de beta-lactamasas cromosomales por las nuevas cefalosporinas y otros fármacos beta-lactámicos recientes produciendo resistencia de alto nivel y amplio espectro a los agentes beta-lactámicos. La aparición de resistencia con base cromosomal puede ser un problema mayor. Por ejemplo, una serie de incrementos en la resistencia entre las fluoroquinolonas como resultado de mutaciones de nucleótidos individuales en diferentes genes, puede conducir con rapidez a la ineficiencia del fármaco. Las mutaciones antibioticorresistentes aparecen con menor frecuencia in vivo que in vitro porque las defensas del huésped destruyen a muchas de ellas. El desarrollo de la resistencia mutacional estaría favorecido por la subdosificación y frecuencia.
(Prescott 2002)
2.1.4.4. Resistencia Transferible
El intercambio genético originado por la resistencia antibacteriana es de capital importancia. La transferencia de material genético produce resistencia epidémica o infecciosa, a menudo a varios antibióticos al mismo tiempo e incluso, aunque poco corriente, en ausencia de antibióticos que seleccionan organismos
resistentes. EL ADN extracromosomal responsable por la resistencia puede autorreproducirse dentro de la célula y después diseminarse a otras células mediante mecanismos. La adquisición de genes de resistencia transferibles por una bacteria susceptible por lo general se asocia con marcado incremento en la resistencia.
Las poblaciones bacterianas tienen notable capacidad para compartir información genética que permite promover su sobrevida en ambientes adversos. La ausencia de una membrana nuclear hace que los genes se puedan mover con fcilidad entre el cromosoma y otros elementos genéticoscelulares y desde allí, mediante
bacteriófagos, plásmidos o conjugación por transposones, o sencilla
trasformación, hacia otras bacterias en la población. El interés científico limitado en gran medida a documentar sólo la adquisición progresiva de resistencia por los patógenos pudo haber descuidado la adquisición progresiva de la resistencia antimicrobiana por los miembros apatógenos de la flora indígena de animales y
19 personas, y pudo haber subestimado el importante reservorio de genes de
resistencia que esta flora puede albergar. (Prescott 2002)
2.1.4.5. Resistencia Cruzada
La resistencia cruzada sucede cuando un organismo, por volverse resistente a un antibiótico, se transforma en resistente a otro. Ejemplo clásico está dado por los aminogluósidos, en los cuales la resistencia cromosomal a un nuevo fármaco como la gentamicina se asocia con la resistencia a fármacos antiguos como la neomicina. La resistencia cruzada es común entre los macrolidos y las
fluoroquinolonas. (Prescott 2002)
2.1.4.6. Extensión Antibioticorresitencia
En medicina veterinaria, la tendencia se ha focalizado sobre la aparición de resistencia bien documentada en ciertas cepas de Salmonella, las cuales causan infección zoonótica, y en otras bacterias entéricas, especialmente Escherichia coli,en parte porque el intestino es el principal sitio de transferencia de la antibioticorresistencia. El estudio sistemático del desarrollo de la resistencia en patógenos no entéricos y oportunistas en los animales ha sido relativamente exiguo. La antibioticorresistencia en los patógenos oportunistas es un problema mayor en los hospitales humanos, pero existen pocos informes de tales
inconvenientes en los hospitales veterinarios. (Palermo y Górnica 2007)
El conocimiento de resistencia de las bacterias no es nuevo. Por lo menos desde hace 25 años comenzaron a aparecer cepas, en principio reistentes a un solo antibiotico. Desde hace poco m{as de una d{ecada no es extraordinario aislar gérmenes resistentes a 10 o mas fármacos antimicrobianos. Por lo general los medicos tienen temor a la amenaza de una infección descontrolada y la sensación falsa de seguridad que brindan los antibioticos los lleva a recetar estos
medicamentos sin antes haber realizado un diagnostico completo y preciso.
(Salvatierra González y Benguigui 2000)
20 2.1.4.7. Avances resistentes en el empleo de antibióticos para animales de abasto
Uso de fluoroquinolonas, fue aprobada en los Estados Unidos para empleo en el agua de bebida con el propósito de tratar las infecciones de E. coli en pollos en 1995 el problema era que las fluoroquinolonas son la única clase importante de antibióticos desarrollados en la década y la resistencia a ellos emergía con rapidez. En Europa se ha desarrollado resistencia de las fluoroquinolonas en Campylobacter jejuni aislados en aves siendo la principal fuente de infección humana. La enrofloxacina fue aprobada para el tratamiento de las infecciones con E. coli en pollo y Pasteurella multocida en pavos. (Prescott 2002)
2.1.4.8. Control Antibioticorresistencia
Hasta hace poco, el problema de la resistencia a fármacos antimicrobianos está superado en gran medida con el desarrollo de nuevos antibióticos, pero el costo, ineficiencia y naturaleza autofrustrante de esta política son foco de interés en la preservación de la eficiencia de los fármacos existentes. Puesto que existe una relación directa entre el uso de antimicrobianos y la selección de resistencia entre las bacterias en general, el principal medio para controlar la resistencia a los antimicrobianos es la reducción del empleo de tales agentes. El control de la antibioticorresistencia, en caso de ser posible, depende del uso cuidadoso y apropiado de los antibióticos por veterinarios que cooperen con los microbiólogos clínicos cuando adoptan las medidas para el control del problema.
2.1.4.9. Factores que Favorecen la Aparición y Diseminación de la Resistencia.
Son múltiples los factores que originan este problema. Sin embargo, el factor más importante es probablemente el uso excesivo e inapropiado de antibióticos. El Uso intensivo de antibacterianos en la comunidad se debe, en países con el nuestro, a que los antibióticos se venden sin prescripción médica y aun teniendo la receta, el paciente muchas veces no cumple con el tratamiento indicado.
También influyen por parte del prescriptor, la falta de diagnósticos etiológicos y el uso excesivo de agentes de amplio espectro y la última generación para la
21 profilaxis y tratamiento de la infecciones ante el tenemos de estar ante una cepa resistente. Esto es aún más frecuente al haberse incrementado el número de pacientes inmuno comprometidos, con enfermedades críticas, pacientes
debilitados o ancianos donde los médicos tienden a administrar agentes de amplio espectro para el tratamiento empírico ante una sospecha de infección, ya que una infección nosocomial por microorganismos resistentes en estos pacientes es de mal pronóstico. Además por parte de los organismos de salud hay una alta de información que oriente los tratamientos empíricos y normas severas para restrinjan el uso indiscriminado de antibióticos. Otro factor que ha contribuido al proceso de selección de bacterias resistentes ha sido el uso de agente
antimicrobianos en el ganado y aves para promover el engorde y crecimiento o para prevenir o tratar infecciones. Las bacterias resistentes en los animales destinados al consumo humano pueden luego causar enfermedad en humanos (Avellana Mariscal 2000)
2.2. FUNDAMENTACIÓN LEGAL
La constitución de la republica del ecuador no posee hasta la actualidad leyes de protección o salud animal.
2.3. FUNDAMENTACIÓN TÉCNICA
2.3.1. Cultivos
(Montoya 2008) indica que un medio de cultivo es un sustrato o solución de nutrientes en los que crecen y se multiplican los microorganismos en el
laboratorio, con el objeto de aislar diferentes especies bacterianas, proceder a su identificación y llevar a cabo una serie de estudios complementarios.
(Stanchi 2007) menciona que las entre las finalidades de un medio de cultivo están:
Aislamiento de microorganismos en colonias puras
22
Estudio de características culturales
Estudios de actividades metabólicas
Preparación de vacunas y antígenos
Conservación de gérmenes en colección
Obtención de grandes masas microbianas para estudios físicos y químicos
Obtención de gérmenes con fines industriales como preparación de productos
(Cuerpo de Funcionarios Técnicos 2002), Indica que las pruebas de laboratorio que nos pueden ayudar a realizar un diagnóstico certero son: hemocultivo realizando la extracción de la sangre en un pico febril, conseguiremos aislar la bacteria al menos el 75% de los casos.
El Cultivo de sangre en una de las pruebas más importantes del laboratorio de microbiología, pues a través, de el podemos establecer con certeza el diagnostico etiológico de bacteriemia o fungemía, en pacientes, en pacientes con o sin foco aparente de infección. El cultivo de sangre nos permite llegar a la identificación del microorganismo causal y podremos realizar estudios de sensibilidad a los antimicrobianos y elegir el tratamiento más eficaz. (Zurita 2000)
El cultivo de orina es esencial, puesto que permite conocer el número de colonias en la muestra sembrada, la posterior identificación del género, especie, fenotipo, biotipo y genotipo de la bacteria infectante. Estos datos son imprescinibles desde un punto de vista clinico y epidemiologico, para conocer la etiologia de la infección urinaria, dar un tratamiento adecuado, diferenciar reinfecciones de recaidas y también para poder realizar pruebas de sencibilidad a los diferentes
antimicrobianos. (Zaragoza 2007).
El urocultivo esta indicado realizarlo de forma rutinaria para confirmar o descartar una infección del tracto urinario. (Fidalgo Álvarez, y otros 2003)
23 Los análisis de orina, el cultivo de orina cuantitativo y el diagnóstico por imagen (radiografía simple y de doble contraste o ecografía) son necesarios para confirmar y buscar factores de predisposición de la urolitiasis. (Stevenson y Rutgers 2010)
2.3.2. Toma De Muestras Para Cultivos
La forma de obtención de la muestra de orina influye sobre las observaciones de las pruebas correspondientes, por ello es muy importante que se tenga en cuenta el metodo de colección que fue empleado. Los metodos mas comunes de
obtención de muestras son: colección directa, cateterización y por cistocentesis.
(Núñez y Bouda 2007)
(Chumbi y Lima 2010) indica que la cistocentesis consiste en insertar una aguja a través de la pared abdominal y vesical para obtener muestras de orina destinadas a su analisis o cultivo bacteriano. Esta técnica evita la contaminación de la orina por la uretra, tracto genital o piel y reduce el riesgo de infección iatrógena del tracto urinario.
(Kirk y Bistner 2007), menciona el siguiente procedimiento para realizar la cistocentesis:
a. Un asistente debe contener al perro en decubito lateral o dorsal, rasurar y preparar sépticamente la piel del lugar del abdomen ventral en el que se va a efectuas la cistocentesis.
b. Palpar el abdomen para localizar e inmovilizar a la vejiga urinaria.
c. Esta se practica colocando una aguja sobre la pared abdominal ventral, algo craneal (3ª 5 cm) a la unión de la vejiga con la uretra.
d. Introducir la aguja formando un ángulo de 45°
e. Aspirar la orina en la jeringa
f. Retirar la aguja y la jeringa del abdomen
g. No aplicar presión a lapared de la vejiga despues de la cistocentesis para minimizar la contaminación de la cavidad peritoneal con la orina. Anexo 2
24 Aunque este metodo es relativamente seguro, la vejiga debe tener un volumen razonable de orina, la punción no debe hacerse sin identificar e inmovilizar la vejiga (Kirk y Bistner 2007)
(Koneman 2008) sugiere que para reducir la posibilidad de contaminación con microorganismos de la piel el sitio de venopunción idealmente debe repararse siguiendo esta secuencia de pasos:
Lavar con jabón
Enjuagar con agua destilada
Aplicar tintura de yodo y dejar secar por 1-2 minutos y
Elimine el yodo con alcohol al 70%
Es muy útil el servicio de un ayudante experto en el manejo de animales, las venas cefálica y safena usadas comúnmente ene el perro. Con una mano el ayudante sujeta con suavidad la cabeza del animal y con la otra rodea por detrás, arriba del codo extendiéndolo un poco. Con el pulgar y los otros dedos de esta mano se fija la piel, floja para sujetar el vaso firmemente. El operador inmovilizar el vaso con el pulgar e insertar el agua arriba de este punto. Anexo 1. De la vena yugular se toma comúnmente sangre en perros pequeños. (BIOVET 2011)
Normas para recolectar la muestra en pacientes con fiebre de origen desconocido se debe recoger antes que la temperatura alcance un valor máximo sobretodo en pacientes pediátricos debido a que suelen tener concentraciones elevadas de bacterias en el torrente sanguíneo. (Gates 2004)
2.3.3. Técnicas De Cultivo
La mayoría de los medios de hemocultivo que se venden contienen
polianetolsulfonato sódico (SPS) como anticoagulante en concentraciones que varían entre 0,025% y 0,055. Además de sus propiedades anticoagulantes (la anticuagulación es el efecto deseado debido a que ciertas bacterias no crecen bien dentro de un coagulo donde la fagocitosis de los neutrofilos y los macrófagos permanece activa) el SPS inactiva los neutrofilos y ciertos antibióticos como
25 estreptomicina, kanamicina, gentamicina, polimixina y precipita el fibrinógeno y otros componentes. (Koneman 2008)
Hemocultivo y antibiograma es determinar la presencia de bacteriemia y ayudar a la identificación del organismo causal Para optimizar el resultado, se procesan dos muestras de sangre por separado antes de la administración de antibióticos.
(Swearinger 2008)
Los métodos para la realización de los hemocultivos varían en sensibilidad y rapidez y son: Modos manuales o convencionales, semiautomatizados o lisis centrifugación y los automatizados como BACTEC. (Zurita 2000)
2.3.4. Métodos manuales
Las botellas de hemocultivo deben contener SPS como anticoagulante y como inhibidor de la actividad bactericida del suero, del complemento, además que neutraliza lisozimas y la fagocitosis. También tiene la particularidad de inhibir la actividad de los aminoglucosidos. Este método tiene más desventajas que el SPS que inhibe el crecimiento de algunas bacterias y además tiene mayor riesgo de contaminación pues requiere ser aireados y pinchados para las tinciones y subcultivos. (Zurita 2000)
2.3.5. Método de Lisis Centrifugación
Este método semicuantitativo utiliza un tubo de lisis especial “sistema de vacutainer”, la sangre se centrifuga a alta velocidad lo que le permite la concentración de microorganismos en el sedimento. Este se siembra
directamente en las cajas petri con los medios de cultivo específicos. La ventaja de este método es que permite una valoración semicuantitativa por recuento de colonias aisladas y consigue mejorar en un 25 a 50% de la detección de hongos levaduriformes y filamentosos, facilita la detección de bacterias y permite la realización de hemocultivos cuantitativos para diagnóstico de bacteriemia
relacionada a catéter venoso central. La desventaja es que requiere manipulación
26 de la muestra con la consiguiente posibilidad de contaminación y se debe
procesar tubo por tubo aumentando la necesidad de personal en el laboratorio.
(Zurita 2000)
2.3.6. Método de Sistemas Automatizados
Estos consisten básicamente en un incubador, asociado a un computador y las botellas con diversos medios de cultivo. Estas botellas pueden o no contener resinas que capturan al antibiótico. El equipo incuba, agita constantemente las muestras y monitorea continuamente el crecimiento microbiano. El computador asociado a los equipos relaciona los mediciones con índices de crecimiento microbiano que dan un aviso sonoro cuando la detección sobrepasa un punto de corte una vez que el equipo da la señal las botellas son retiradas del equipo para hacer una tinción de Gram. (Zurita 2000)
2.3.7. Método Normal de Inoculación de Placas de Cultivo
El método normal de inoculación de placas de cultivo se hace como sigue (Trolldenier 1982)
1. Esterilizar el asa de siembra en la llama de un mechero Bunsen, dejar que se enfríe, y se llena el bucle con la muestra. Alternativamente, cuando la muestra es un hisopo, se saca éste de su envase.
2. Coger la mitad superior de la placa Petri, es decir, la mitad que contiene el medio de invertirla, de forma que la superficie del medio quede mirando hacia arriba.
3. Extender el material con el asa de siembra o hisopo, sobre un área pequeña en un lado de la placa para producir un “inóculo-fuente” o sencillamente fuente de bacterias.
4. Después se esterilizar el asa de siembra en la llama de un mechero Bunsen. Si se ha empleado un hisopo, éste se deja en un envase, y entonces se coge el asa de siembra y se esteriliza.
27 5. Con el asa de siembra se hacen 3 ó 4 estrías y cortas, todas en la misma dirección partir del “área-fuente”. Teniendo cuidado para no añadir o cortar la superficie del medio con el asa de siembra. Reesterilizar el asa y dejar enfriar.
6. Se continúa del mismo modo, para producir las estrías anotadas como B, C y D en la Fig. 1, esterilizando el asa de siembra entre cada grupo y nuevamente al final del proceso. De esta forma, de las bacterias que se han sembrado al final de las estrías C y D, pueden crecer colonias aisladas, y cada colonia representa una de las bacterias de la muestra original.
7. Colocar las dos mitades de la placa juntas, con la mitad que contiene el medio en la parte superior, y se rotula la superficie externa de la placa Petri (con un lápiz vidriográfico) poniendo los detalles del caso. Por ejemplo se marca con el nombre de identificación o número de muestra, la naturaleza de la muestra o hisopo, el lugar donde ha sido recogida (si es una muestra de un animal del que se han recogido varias) y la fecha d la inoculación de la placa.
8. Se coloca entonces en una estufa d cultivo a 37° C durante 18-24 horas, y se examina al día siguiente.
9. Si no se observa crecimiento, se debe volver a poner la placa en la estufa y se vuelve a examinar 48 horas después y si es necesario a las 72 horas. Si se presiente que los microorganismos pueden estar presentes, pero para que puedan crecer necesitan un periodo de tiempo mayor, se incuba entonces la placa durante un nuevo periodo de tiempo, aunque en este caso se cierran herméticamente los bordes de la placa (por ej., “Sellotape”) para evitar la evaporación del agua y que el medio de deseque.
28 Fig. 1. Inoculación de una placa de
cultivo que contiene un medio selectivo.
Fuente: (Trolldenier 1982)
2.3.8. Pruebas de Sensibilidad
Para (Hervás Maldonado y Prieto Prieto 2011)una de las pruebas más
importantes del mundo celular es el antibiograma, que define una característica fundamental: la orientación terapéutica y la presencia o usencia de resistencias.
En la prueba de sensibilidad se emplean discos impregnados de antibióticos:
1. Una colonia bacteriana aislada, que ha crecido en una placa de cultivo, se extiende sobre la totalidad de la superficie de una segunda placa, bien empleando uno de los métodos usados en el apartado b, o haciendo un
“inóculo-fuente” en el centro de la placa, y extendiendo después de la bacterias con un asa de siembra en sucesivas series de estrías A, B y D como se representa en la figura 2. Se aconseja un agar especial para prueba de diagnóstico (Oxoid), para su preparación en el laboratorio ya preparado en una placa, al que puede añadirse sangre si fuera necesario. Alternativamente, las pruebas de sensibilidad se pueden llevar a cabo en un medio agar-sangre
29 ordinario, aunque las sustancias de este medio pueden interferir con algunos agentes antibacterianos, particularmente sulfonamidas.
Hay que tener cuidado cuando se prepara o se selecciona una colonia de la primera placa de cultivo, de que se transfiera solamente una colonia aislada, puesto que pueda dar lugar a confusión si se mezclan dos o más microorganismos diferentes en la superficie de la misma placa de sensibilidad.
El asa de siembra se esteriliza antes de tomar una colonia de la primera placa y después de extender ésta sobre la superficie de la segunda.
2. Después de inocular la totalidad de la superficie de la placa de cultivo se deben aplicar los discos impregnados de antibióticos. Estos son discos de papel (=
discos de sensibilidad) impregnados con diferentes antibióticos y otros agentes antibacterianos, por ej., sulfonamidas, nitrofuranos, identificándose cada agente antibacteriano por una letra codificada impresa en el disco (Difco, Oxoid). Se escogen los discos que contienen fármacos a los cuales el microorganismo concerniente sea probablemente más sensible y se depositan regularmente sobre la superficie de la placa inoculada. Estos discos se pueden aplicar individualmente, esto es, un disco de cada tipo se extrae de su frasco o vial (con unas pinzas previamente esterilizadas en la llama de un mechero de Bunsen y ya frías) y se transfiere a la superficie de la placa.
Fig. 2. Método de inoculación de una placa para pruebas de sensibilidad.
Fuente: (Trolldenier 1982)
30 Mensura recomienda que la información que se obtenga de un antibiograma deba permitir:
a. Conocer y definir el perfil de un microorganismo determinado b. Facilitar la caracterización de los mecanismos de resistencia
c. Ofrecer opciones terapéuticas para la correcta selección del tratamiento antimicrobiano.
d. Evaluar los cambios en los comportamientos habituales de sensibilidad.
Es importante cuidar el control de calidad de los discos de sensibilidad, deben ser almacenados a temperaturas de -20 y +8 °C y al usarlos hay que esperar de 1-2 horas para que los viales alcancen la temperatura ambiente, procurar no colocar los discos de antibióticos bactericidas a lado de los antibióticos bacteriostáticos para evitar antagonismo. (Saéz Ramírez y Gómez Cambronero 2006)
2.3.9. Lectura de la Prueba
(Mesura Grupo 2000) indica que después de 18-24 horas, se puede ver que la superficie de la placa está cubierta completamente con el crecimiento de los microorganismos, excepto alrededor de algunos discos, donde el fármaco al difundirse ha inhibido el crecimiento bacteriano. Entonces las bacterias se pueden identificar como sensibles a los agentes antibacterianos, en aquellos discos que están rodeados por una zona en la que no hay crecimiento, y como resistentes a los agentes de otros discos. Normalmente es erróneo comparar la anchura de las zonas inhibitorias alrededor de varios discos, e interpretar una zona más ancha de inhibición con una mayor sensibilidad al agente en este disco, por dos razones:
(1) puesto que algunas sustancias antibacterianas se difunden en el medio de cultivo circundante mucho más rápidamente que otras (por ej., cloranfenicol), y (2) puesto que las concentraciones de los distintos fármacos en los discos no
guardan una relación constante en su dosis terapéutica normal, es decir la dosis que debe ser suministrada al paciente.
Los resultados se lee sensible (S), moderadamente sensible (MS) y resistente (R)
31 2.3.10. Categoría De Interpretación De Los Resultados Del Método De Difusión Con Discos:
SENSIBLE: Esta categoría clínica implica que una infección dada por la cepa en estudio puede ser tratada apropiadamente con la dosis de antibiótico
recomendada para el tipo de infección y la especie infectante, a menos que hubiera contraindicaciones.
INTERMEDIO: Esta categoría incluye cepas que pueden ser inhibidas por concentraciones de antibiótico más elevadas, siempre que las dosis usadas puedan ser aumentadas (por ejemplo, beta lactámicos) o que sean concentradas fisiológicamente en el tejido infectado (por ejemplo, beta lactámicos y quinolonas para infecciones del tracto urinario)
RESISTENTE: Las cepas resistentes no son inhibidas por las concentraciones séricas normalmente alcanzadas a dosis habituales y/o caen en el rango donde son comunes mecanismos específicos de resistencia microbiana y la eficacia clínica no ha sido comprobada.
2.4. SISTEMA DE HIPOTESIS
Los microorganismos aislados en hemocultivo y en orina en perros con fiebre son resistentes a la enrofloxacina.
32
III. CAPITULO 2
ASPECTOS METODOLÓGICOS
3.1. METODOS
3.1.1. Modalidad y Tipo de Investigación
La investigación es de tipo descriptiva y correlacional donde se analizan situaciones tal como se encuentra en el momento de la investigación.
El diseño de la investigación fue no experimental.
No se manipulan variables se observan fenómenos tal como se da el contexto para después analizarlo.
La investigación se realizara de acuerdo al siguiente protocolo:
1) Todos los perros de 8 meses en adelante que ingresaron a la consulta médica con temperatura desde 39,5 que se comprobó a través de la toma con un termómetro digital,
2) Se utilizó una ficha clínica para el ingreso de los datos relacionados a esta investigación como: filiación, edad, raza, temperatura.
3) Se empleó el cultivo selectivo como ACP, MACCONKEY, TCBS,
CTREMIDE, CHAPMAN, STREPTOCOCO, SS AGAR para identificar la presencia de las bacterias.
4) Con la presencia de bacterias en el cultivo se identificó el género de microorganismo luego se realizó un antibiograma con el uso de discos de antibióticos entre ellos la enrofloxacina, para verificar el efecto que
presente.
5) Se realizó las diferentes medidas terapéuticas a los propietarios de las mascotas.
6) Se correlacionó los resultados obtenidos.
