CINÉTICA DE CRECIMIENTO CELULAR

CINÉTICA DE

2

Crecimiento Celular

Estequiométrico:

 la concentración final de células depende de la concentración y composición del medio de cultivo.

 balance de materia y energía de los procesos de crecimiento celular

.

Cinético:

velocidad en la que se desarrolla el proceso

Aspectos que intervienen en la interacción entre las células y el medio ambiente a lo largo de su

crecimiento Condiciones ambientales (medio) multicomponente reacciones en solución equilibrio ácido-base.

cambio de las propiedades reológicas

multifásico (gas, líquido)

distribución espacial no unifrome.

Población celular

multicomponente

heterogeneidad en cada célula individual

mutiples reacciones

mecanismos de control interno adaptabilidad variabilidad genética nutrientes sustratos productos calor interacciones mecánicas

Modelos de crecimiento celular

Modelos no estructurados

segregados

Modelos no segregados

Multicomponente. Población celular heterogénea.

Caso real Multicomponente.

Descripción de las células como promedio. Un solo componente. Población celular heterogénea. Caso ideal Un solo componente.

Descripción de las células como promedio Estructurado No Estructurado No Segregado Segregado

Sistemas de cultivo

Discontinuo (Batch)

Continuo

45

Cultivo Batch o Discontinuo

Reservorio F_I X S P V constante F_S F_I = F_S X S P S_R

Continuo

Continuo

V₀ V_F F, S_R X VX S ≈ 0 VP

Discontinuo alimentado (fed

Discontinuo (batch).

Las concentración de los distintos

componentes varía a lo largo del proceso. Características

Tiempos cortos de procesos lo que permite trabajar en condiciones asépticas, sobre todo cuando se trata de medios de cultivos ricos en nutrientes.

Períodos muertos: lavado, esterilizado, etc. Opera a baja densidad celular.

Distintas fases en el crecimiento de un organismo

en un proceso en batch

Suponemos que las células crecen en condiciones homogéneas en cuanto a transferencia de nutrientes (fte. de carbono, nitrógeno, minerales, vitaminas, etc.)

Xn = biomasa después de n generaciones

Xo = biomasa inicial

n = número de generaciones

Xn

=

Xo * 2

Discontinuo (batch).

Discontinuo (batch).

El crecimiento de un microorganismo puede describirse a través de una ecuación exponencial de acuerdo a:

Las concentraciones de nutrientes y de biomasa del cultivo varían a través del tiempo.

También puede decirse que la biomasa se incrementará en dX en un determinado intervalo de tiempo dt de acuerdo a la ecuación:

Integrando la ecuación 2 se obtiene:

o bien dX = Xo m dt Xt = Xo * e m t ln Xt = ln Xo +

m

Discontinuo (batch).

la velocidad específica de crecimiento depende:

• características intrínsecas del organismo

• factores externos (fte. de carbono, O2, T, etc.)

donde µ es la velocidad específica de crecimiento de un organismo y tiene unidades de t-1 _(min-1_{, h} -1 _{o d}-1_).

Cálculo de parámetros cinéticos en cultivos en

batch

Graficando

ln X

vs.

tiempo

el cálculo de la recta de

regresión en la zona de crecimiento exponencial es

igual a

m

. También es posible calcular la fase

lag

de acuerdo a lo que se describe en el gráfico.

Otro parámetro importante a conocer en un proceso en batch es el tiempo de duplicación de la biomasa (td), por la ecuación 4 podemos reemplazar t = td y Xt= 2 Xo ln 2Xo = ln Xo + m * td m = ln 2 = 0.693 td td td = 0.693 m (7) (6) (5)

Discontinuo (batch).

Discontinuo (batch).

Fase

Fase DescripciónDescripción µµ

lag

lag Las células se adaptan al nuevo Las células se adaptan al nuevo ambiente

ambiente

µ ≈ 0 µ ≈ 0

aceleración

aceleración Comienza el crecimientoComienza el crecimiento µ < µµ < µmaxmax

exponencial

exponencial Se alcanza la velocidad máxima de Se alcanza la velocidad máxima de crecimiento

crecimiento

µ = µ µ = µmaxmax

desaceleración

desaceleración Crecimiento disminuye por falta de Crecimiento disminuye por falta de nutrientes o inhibidores

nutrientes o inhibidores

µ < µ µ < µmaxmax

estacionaria

estacionaria Se detiene el crecimientoSe detiene el crecimiento µ = 0µ = 0

muerte

muerte Las células pierden viabilidad y se Las células pierden viabilidad y se lisan

lisan

µ < 0 µ < 0

Influencia del substrato limitante en el crecimiento microbiano

La biomasa final obtenida es un proceso de cultivo esta dada por la relación de rendimiento:

Yxs= gr. de peso seco de biomasa obtenida por gr. de substrato consumido.

Y

=

El primero en establecer una relación entre la concentración de substrato limitante y la velocidad de crecimiento fue Monod y hallo que se correspondía con una hipérbola rectangular similar a la descripta por Michaelis-Menten para un proceso enzimático estableciendo la siguiente relación:

µ =

µ_max s

Representación gráfica del modelo de

Representación gráfica del modelo de

Monod de sustrato limitante

Monod de sustrato limitante

Donde µ_max = es la máxima velocidad de crecimiento; s

es la concentración de substrato limitante y Ks= constante de saturación de substrato y es igual a la concentración de substrato que da una velocidad de crecimiento de µmax /2.

Si reemplazamos la ecuación 9 dentro de la 2 queda:

Si s>> Ks, s/(Ks+s) tiende a uno entonces el organismo crece a µ_max conforme s tiende a Ks entonces s/(Ks+s) tiende a cero reduciendo el crecimiento.

=

Energía de activación para el crecimiento

microbiano.

Efecto de la temperatura sobre

m

de un

Cinética de crecimiento en cultivos con

plásmidos

Posibilidad de pérdida del plásmido

Mutación del plásmido

Diferencia de velocidad de crecimiento

entre población con y sin plásmidos

X

_{: población con plásmidos}

X

_{: población sin plásmidos}

dX + ₌ (1-p) * X + * m +

dt

p: probabilidad de pérdida de plásmidos

dX

₌

p * X

*

m

₊

X

*

m

F: fracción de células con plásmidos.

F: fracción de células con plásmidos.

F = X + X+ + X -F = 1 - a - p 1 - a - 2 n( a + p - 1) p

a

₌

m

m

Relación de velocidad de crecimiento en

poblaciones libres y que portan plásmidos.

Fracción de la población que porta plásmidos en

un cultivo en batch después de 25 generaciones

Otros modelos de crecimiento

El modelo logístico describe el crecimiento de una población al momento del inicio del crecimiento de acuerdo a la siguiente ecuación:

al inicio X<<Xf y [1-X / Xf ] tiende a 1 entonces el organismo crece a µ_max en cambio cuando X = Xf [1-X / Xf ] tiende a 0 y dx/dt =0 entonces el crecimiento se detiene debido que la población llega a su densidad máxima. Si queremos evaluar entonces la velocidad de consumo de substrato reemplazamos por la ecuación 11 y queda:

m = m max * 1 - X Xf

[

]

[

]

t _{lag = t - 2.3 * lg X / Xo}

m_max

y también puede modificarse la ecuación de Monod :

Aparte de la forma gráfica descripta para hallar la duración de la fase lag, otros autores ha descripto otras formas matemáticas como ser:

Fase lag

Fase lag

(-t/t

m

₌

m

* s

_{1- e}

Ks + s

Cálculo de parámetros cinéticos en

cultivos en batch

Graficando

Cinética de muerte celular

La cinética de muerte celular puede describirse por la ecuación:

k_D =

-X 1

dt dx

Y haciendo la corrección en la ecuación 3 que describe el crecimiento de un microorganismo queda:

Xt = Xo e ( µ-kD ) t

El factor k_D es importante en procesos como los de degradación de efluentes, cuando se trabaja a bajas velocidades de crecimiento cuando se usan inóculos de baja viabilidad.

Modificaciones de las ecuaciones de Monod

calculando la fase lag y la velocidad de

Un incremento de biomasa dx se deberá a consumo ds y esa relación esta dada por la formula de rendimiento

entonces la velocidad de consumo de substrato si reemplazamos por la ecuación 2 se transforma en:

o bien

donde q_S es la velocidad específica de consumo de substrato

q_S tiene unidades de gr. de substrato limitante consumido por gr. de biomasa por tiempo (gr. sust * gr X -1 _{* h}-1_). Yxs = dx ds

-

-

En todo proceso además del substrato que se consume para crecimiento existe una energía necesaria para el mantenimiento de la biomasa (m_S), esta energía es utilizada por la célula para, por ejemplo mantener gradientes, pH, turnover de macromoléculas, etc. Se expresa en unidades de substrato consumido por gr. de X por tiempo. Podemos decir entonces que en todo proceso parte de la fuente de carbono será consumida para el crecimiento y parte para el mantenimiento. Por la estimación del coeficiente de mantenimiento podemos recalcular lo que es el Y_XS para crecimiento (Y_XS verdadero) del Y_XS observado por las siguientes ecuaciones, donde tenemos que la velocidad de consumo de substrato va a tener dos términos uno para el crecimiento y otro para el mantenimiento:

consumo de substrato para crecimiento ds = ds + ds

dt dt M dt G

ds dt M

consumo de substrato para mantenimiento

ds dt G

Formación de Productos

1) Componentes estructurales.

2) Enzimas (intra o extracelulares).

Productos de bajo peso molecular

Clasificación de los productos de fermentación

de bajo peso molecular

Productos cuya síntesis no está claramente ligada directa o indirectamente a la generación de energía (no asociados al crecimiento): antibioticos, vitaminas.

Productos directamente asociados con la generación de energia en la célula (asociados al crecimiento): etanol, acido acético, ac. láctico , productos de las fermentaciones anaeróbicas.

Productos indirectamente asociados con la generación de energía (semiasociados al crecimiento):, aminoacidos, nucleótidos.

Formación de productos

1

Asociado al crecimiento

2

Semiasociado al crecimiento

3

No asociado al crecimiento

Tiempo Tiempo Tiempo

X( ) P(---)

Cinética formación de productos

A continuación se describe tres fórmulas de rendimiento de importancia: producción de producto en función del sustrato

Básicamente pueden describirse tres tipos de procesos con respecto a la formación de producto :

asociados al crecimiento parcialmente asociados

no asociados al crecimiento

Y

=

Es también posible formular la ecuación de formación de producto a través del tiempo según:

donde a es una constante asociada al crecimiento y b es una constante que no esta asociada al crecimiento. Y también podemos definir q_P s decir la velocidad específica de producción del producto

Y _PX = Y _PS Yxs

dp = a * dx + b * X

dt dt

q _P

₌

_*

Cinética formación de productos

producción de producto en función de la biomasa

Distintos Tipos de cinética de

formación de productos

Productividad de una fermentación en batch

t = 1 * ln X + t lag + t est + tlim

m max Xo

Q _p o P = X

Medidas de Performance de un Bioproceso

Productividad

mg / gr biomasa * h mg / L * h

Mas importante porque describe cuanto tiempo puede durar el bioproceso

Máxima Concentración de Producto mg / L

(importante cuando el costo de la recuperación y purificación del producto representa un porcentaje alto en el costo total del

bioproceso)

Rendimiento de Producto

gr de producto / gr de substrato

(importante cuando el costo nutriente representa un porcentaje alto en el costo total del bioproceso, no muy usual)

Inhibición del crecimiento

Alta

concentración

de

sustrato

y/o

productos,

cambios en las propiedades

fisico-químicas

del

medio

:presión

osmótica,

fuerza

iónica,

constante

dieléctrica, y actividad de solutos, pueden

alterar la fluidez de las membranas.

Posibles mecanismos de la acción de

inhibidores

Alteración de permeabilidad celular

Alteración de la actividad de las enzimas

Disociación de agregados enzimáticos

Afecta la síntesis de enzimas

Influencia en la actividad funcional de las

células

Otros modelos

Inhibición por sustrato

Andrews y Noack

Inhibición por producto

Jerusalimsky y Neronova

Modificaciones del Modelo de Monod.

m = m _max * s * 1

Ks + s (1+ (s / Kis))

Inhibición por altas concentraciones de substrato

donde Ki es la constante de inhibición .

Inhibición del crecimiento debido al producto

donde K_i,p es la constante de inhibición del producto y p es igual a la concentración del producto

m = m _max * s * K ip

Modificaciones del Modelo de Monod.

ln 1 - m = n lnP i - n lnPi *

mmax

Modelo de inhibición del crecimiento debido al producto de Luong:

Donde P_i es la concentración de producto y P_i* es la concentración crítica de producto en las cuales el crecimiento es cero. Y donde n es una constante que surge de graficar (ver gráfico ):

de no conocerse P_i* debe hallarse por prueba de ensayo y error para aquella recta de regresión que mejor ajuste tenga donde la pendiente será igual a n .

m = m_max * 1 - Pi n Pi*

ln P ln P ln [ 1 -µ /µ m ax ] n n ln Pi* 0 -3

Modificaciones del Modelo de Monod.

Otros modelos describen los casos para cuando se dan múltiples inhibiciones de productos y substratos,

m

=

m

*

1 - C

*

_{1 - P}