CARTOGRAFÍA CROMOSÓMICA

CARTOGRAFÍA CROMOSÓMICA

Bateson, Saunders y Punnett: segregación anómala en guisante ≠ 9:3:3:1 (P= AABB + aabb → clases AB y ab aumentadas)

Drosophila:

Morgan: algunas parejas de genes no cumplen la ley de la

transmisión independiente de Mendel,

fenotipos ≠ parentales

. Hipótesis: están en el mismo cromosoma

Nuevo enfoque para comprender el proceso de herencia de estos genes y predecir los tipos de descendencia que resultarán de ellos.

Sturtevant: La variación en la fuerza del ligamiento indicaba la

forma en que los genes se ubicaban en el cromosoma (aditivas)

1

_{mapa genético}

B C P R M 00 10 30.7 33.7 57.6

y w v m r yellow white vermillon miniature rudimentary wings

Recordatorio: Herencia de genes ligados (en el mismo cromosoma) y genes no ligados ( en distintas parejas de homólogos)

A B C a b c a b c A B C A B C a b c a b c A B C

Sin entrecruzamiento (X) Con entrecruzamiento (Y)

(½ AB: ½ ab) * (½ C: ½ c)

0% ligados (X) FR

50% no ligados

¼ ABC: ¼ ABc:1/4 abC:1/4 abc

(¼ AB: ¼ ab: ¼ Ab: ¼ aB) * (½ C: ½ c)

1/8 ABC: 1/8 abC: 1/8 AbC: 1/8 aBC 1/8 ABc: 1/8 abc: 1/8 Abc: 1/8 aBc

50% ligados (Y) FR

50% no ligados

FR ligados = X*0 + Y*0,5 ≤50%; FR no ligados = (x+y)*0,5 = 50% A B C a b c a b c A B C a b C a b C A B c A B c A B C a b c a B c A b C a b C a B C A b c A B c

Valor máximo de recombinación = 50%

♂

♀

Parentales ABC abc

- Cuando dos genes están en el mismo cromosoma, es decir, en un par de

homólogos, decimos que están ligados y pertenecen a un grupo de ligamiento

(tantos como cromosomas = n).

- Los reconocemos porque su frecuencia de recombinación (FR%) es < 50%

- El entrecruzamiento tiene lugar en el estado de 4 cromátidas, entre cromátidas no hermanas

- Recuerden que los quiasmas son la imagen visible de los entrecruzamientos (sólo la mitad de los productos son recombinantes) FR = ½ Frecuencia de quiasmas - Un entrecruzamiento es la rotura de dos moléculas de ADN en una misma

posición y su reunión posterior en dos combinaciones recombinantes recíprocas. - Las combinaciones originales las llamamos parentales

- Siempre se escriben los genes en el mismo orden. Se separan por una / los genes que están en distintos homólogos de cada pareja. Ej: AB/ab C/c

- Los parentales pueden estar en acoplamiento (cis), si ambos dominantes ó ambos salvajes se presentan en el mismo padre (DD ó RR ó ++ ó mm) o en repulsión

(trans) si en el mismo padre coinciden un dominante y un recesivo ó un mutante y un silvestre.

Cálculo de la FRECUENCIA DE RECOMBINACIÓN

Sturtevant: Cuanto mas alejados estén los genes, mayor probabilidad de que ocurra un entrecruzamiento entre ellos  mayor frecuencia de recombinación.

CARTOGRAFÍA

Frecuencia de recombinación es la frecuencia de progenie recombinante que se produce a partir de un cruzamiento.

Se suele expresar en porcentaje y se estima a partir de cruzamientos de prueba. Se realizó el cruce de prueba a un dihíbrido de hojas normales (M, dominante

sobre moteadas (m)) y planta alta (D, dominante sobre bajas (d)). En la F₁ se obtuvieron los siguientes fenotipos 55 MD: 53 md: 8 Md y 7 mD

Parentales = 55 + 53 = 108 Recombinantes = 8+7 = 15 Total = 123

FR= Número de progenie recombinante _{Número total de la progenie} FR% = FR *100 FR% = 15 x 100 = 12,2% = 12,2 centimorgan

123

Unidad de mapa genético (u.m.): como la distancia entre genes en la que se produce un recombinante de cada 100

productos meióticos.

FR% = 1/100 x 100 = 1%

Por ello, la FR de 10,7% de Morgan son 10,7 u.m.

La unidad de mapa es conocida como centimorgan (cM). Sturtevant demostró la linealidad de los mapas:

(A-B) + (B-C) = (A-C)

CARTOGRAFÍA

CARTOGRAFÍA

Representación gráfica:

A 3 C 2 B

pr 11,0 vg

Doble dirección: conocida la distancia genética podremos conocer la frecuencia de recombinantes esperada.

Predicción de los resultados de cruzamientos con genes ligados

CARTOGRAFÍA

Se realiza el cruce de prueba a una hembra diheterocigóticas, dominante, hija del cruce ♀ prvg/prvg ♂ ++/++. Si obtenemos 1000 descendientes, ¿cuántos serán de cada fenotipo?

Fenotipo de la hembra (en notación gamética) Nº de gametos recombinantes

Nº de gametos parentales

Entrecruzamientos múltiples pueden afectar a 2, 3 ó 4 cromátidas no hermanas.

Los intercambios dobles de material genético dan lugar a dobles recombinantes (DR).

Entrecruzamientos múltiples

Para detectarlos tenemos que estudiar simultáneamente tres genes (en heterocigosis).

Por probabilidad, los DR serán más escasos que los recombinantes sencillos (DR = R₁ x R₂)

AB AB ab ab AB Ab ab aB Ab AB aB ab Ab Ab aB aB FR_AB = 50% ACB AcB aCb acb ACB Acb aCb acB ACb AcB aCB acb ACb Acb aCB acB P P P P P R P R R P R P R R R R P DR DR P P R1 DR R2 R2 DR R1 P R2 R1 R1 R2 FR_AC = 50%; FR_CB = 50%; FR_AB > 50% 2 genes 3 genes C C c c C C c c C C c c C C c c

MAPAS DE 3 PUNTOS

Condiciones:

a) El organismo en estudio tiene que ser heterocigótico para los 3 genes

b) El cruce debe hacerse de manera que cada clase fenotípica refleje el genotipo de un tipo de gametos.

Por ejemplo: CRUCE DE PRUEBA: estudiando el fenotipo de la F₂ conocemos los gametos del individuo de estudio.

c) Deben contarse un gran número de descendientes

b) Gametos frecuencias semejantes dos a dos en los complementarios (ej: ABC/abc ó Abc/aBC…)

- 2 con frecuencias = y Altas - 2 con frecuencias = e intermedias - 2 con frecuencias = e intermedias ≠ de la anterior - 2 con frecuencias = muy bajas

Pasos:

a) Para hacer el estudio teórico asumimos un orden al azar.

c) Los más abundantes = PARENTALES; los menos abundantes = DR

Comparándolos y viendo que gen es diferente en los gametos, sabremos cuál es el GEN CENTRAL

Por los DR no sumados en la distancia larga, ya que para esos dos marcadores son “parentales”, cuando en realidad deberían ser

sumados 2 veces, pues sufren 2 procesos de entrecruzamiento.

d) Por ello, debemos identificar cuáles son P, R_I, R_II y DR (= R_I y R_II)

FR_I%= FR_AC%= recombinantes I *100 /total = (R_I + DR)*100/total FR_II%= FR_CB%= recombinantes II *100 /total = (R_II + DR)*100/total FR_I,II% = FR_AB%= recombinantes (I+II)*100/total =

(R_I + R_II + 2*DR)*100/total

Si ahora calculamos la distancia entre las 3 parejas, la distancia entre los mas alejados no es la suma de los otros dos ¿por qué?

Cartografía en maíz de genes mutantes recesivos, ligados en el cromosoma 5: bm (nervadura marrón); v (brote virescente); pr (aleurona púrpura)

a) Si la ♀ es triheterocigótica, de padres desconocidos, ¿qué genotipo tiene que tener el ♂ para que la cartografía tenga éxito? bm v pr/bm v pr

b) ¿Quiénes son P y quienes DR? ¿Cuál es el gen central? ¿Cuál el genotipo de la ♀? P= + v bm/pr + + DR= pr v bm/+ + +  el central es pr ORDEN = v pr bm Genotipo ♀: v + bm/ + pr + c) ¿Quiénes son P, R1, R2 y DR? P R₁ R₂ DR

d) ¿Cuál es la distancia entre cada par de genes?

Total = 467+161+395+86 = 1109 R_v-pr = R₁ + DR = 161 + 86 = 247

R_bm-pr = R₂ + DR = 395 + 86 = 481 R_v-bm = R₁ + R₂ + 2. DR = 161 + 395 + 2*86 = 728

P R₁ R₂ DR FR_v-pr = 24700/1109 = 22,27% Dist_v-pr = 22,3cM FR_v-pr = 48100/1109 = 43,37% Dist_v-pr = 43,4cM FR_v-pr = 72800/1109 = 65,64% Dist_v-pr = 65,6cM

¿Por qué frec. de recombinación > 50% para v-pr?

A partir de la información obtenida podríamos calcular

(multiplicando las probabilidades) la probabilidad de dobles

entrecruzamientos = 0,223 x 0,434 = 0,097 = 9,7%; sin embargo sólo detectamos 7,8% ¿Por qué?

INTERFERENCIA

Se denomina coeficiente de coincidencia (C) a la relación entre DR_obs/DR_esp = 7.8/9.7 = 0,804

DR esperados en independencia = FR_I x FR_II

Lo podemos calcular también con los valores observados = nº DR_obs/ DR_esp

en este caso: DR esperados en independencia = FR_I x FR_II * nº total

Los entrecruzamientos en regiones adyacentes del cromosoma ¿son sucesos independientes? ¿Favorecen o dificultan?

En general inhiben: un entrecruzamiento en una región del cromosoma inhibe un segundo entrecruzamiento en regiones cercanas.

Se usan las clases DR para deducir la magnitud de esta interferencia

Interferencia (I) = 1-C varía entre 0 y 1 ( entre 0 y 100%) para C>0 I = 1-0,804 = 0,196

Problema ¿Cómo calcular los gametos obtenidos si hay interferencia? 1º calculamos DR, luego R1 y R2 y el resto = parentales

Si DR_obs > DR_esp interferencia positiva (es la más frecuente). Ej: Drosophila: para una dist = 10, la I = 1(completa)

Si DR_obs < DR_esp interferencia negativa (Muy rara)

Dado el mapa genético:

A B C 0,2 0,45

de un organismo diploide con una interferencia de 0.2, determinar las frecuencias de los gametos producidos por un individuo ABC/abc

DR = FR1*FR2*C = (0,2*0,45)*0,8= 0,072 R_I = FR1-DR = 0,2-0,072 = 0,128 R_II = FR2-DR = 0,45-0,072 = 0,378 P = 1- DR - R_I – R_II = 1-0,072-0,128-0,378 =0,422 0,036 AbC : 0,036 aBc 0,064 Abc : 0,064 aBC 0,189 ABc : 0,189 abC 0,211 ABC : 0,211 abc

Cartografía del segmento diferencial del cromosoma X

Los genes ligados al cromosoma X, se heredan juntos  se comportan como un único bloque en relación al segmento pseudoautosómico.

Esto nos permite calcular la distancia entre un gen, situado en la región apareante, y el segmento diferencial.

En una especie en la que las hembras son XX y los machos son XY, el locus A,a se

encuentra en el segmento diferencial del cromosoma X, siendo el alelo A (negro) > a

(gris). El locus B,b , en el cuál el alelo B (ojos marrones) es dominante sobre b (ojos

azules), está situado en el segmento no diferencial (=apareante) de los cromosomas

sexuales. Se cruza una hembra homocigótica recesiva, con un macho negro de ojos

marrones, obteniéndose 74 ♀negras de ojos azules ( ), 27 ♀ negras de ojos marrones

( ), 23 ♂ grises de ojos azules ( ) y 76 ♂ grises de ojos marrones ( ).

Ab AB Yb YB

Parentales = XAb _{(74) + Y}B _{(76) = 150}

Recombinantes = XAB _{(27) + Y}b _{(23) = 50} FR = 50/200 = ¼ = 25%

MAPAS CROMOSÓMICOS EN HUMANOS PUNTUACIÓN LOD

Se usa el método de la puntuación lod (Z = log of the odds) para saber si dos

genes están ligados y cuál es su frecuencia de recombinación. Puntuación Z > 3 se consideran ligados.

(1-R)K _R(N-K) _{R = frecuencia de recombinación}

Z = log_{10 ---} K = nº de parentales

pN _{N = nº total de individuos (K + recombinantes)}

p = probabilidad de cada uno de los tipos de gametos bajo la hipótesis de segregación independiente = 0,5

ó también la podríamos escribir: (P₁)K1 _(P

2)K2 R1C1R2C2 P1 = P2 = frecuencia de cada gameto parental = (1-R)/2 Z = log_{10 ---} R₁ = R₂ = frecuencia de cada gameto recombinante= R/2

qN _K

1 y K2 = nº de parentales de ambos tipos ( K = K1+K2)

C₁ y C₂ = nº de recombinantes de ambos tipos N = nº total de individuos (K₁ + K₂ + C₁ + C₂) q = probabilidad de cada uno de los 4 tipos de gametos, bajo la hipótesis de segregación independiente = ¼

Z = log₁₀ (prob. de los genotipos dado R/probabilidad suponiendo segregación independiente) =

(1-R)K _R(N-K)

Z = log_{10 --- =} pN

Un síndrome muy raro viene determinado por el alelo dominante A, mientras que el alelo

recesivo a produce, en homocigosis, individuos normales. El cruce entre un hombre con el

grupo sanguíneo NN y una mujer del grupo sanguíneo MN y heterocigótica para el

síndrome produjo la siguiente descendencia: 8 hijos MN, 2 hijos MN con el síndrome, 3 hijos NN y 7 hijos NN con el síndrome.

a. Calcular la frecuencia de recombinación suponiendo que ambos genes estén ligados

b. Calcule, la puntuación LOD

a) ♂NN aa x ♀ MN Aa

FR = 5/20 = ¼

1,136 < 3 No están ligados

MAPAS CROMOSÓMICOS EN HUMANOS HIBRIDACIÓN DE CÉLULAS SOMÁTICAS

Dos células somáticas se fusionan formando un heterocarión (un citoplasma con dos núcleos), que mediante las técnicas adecuadas se transforma en un sincarión, por fusión de los núcleos.

Si se cultiva durante muchas generaciones, se van perdiendo los cromosomas de una de las especies paternas. Si hombre-ratón, se pierden los del hombre si un producto humano se sintetiza en el sincarión, tiene que estar en uno de los cromosomas humanos presentes en ese sincarión.

A B C D E F Eno-1 - + - + + -Mdh-1 + + - + - + Pep S + - + - - -Pgm-1 - + - + + -1 - + - + + -2 + + - + - + 3 + + - - + -4 + - + - - -5 - + + + + + Eno en B D E, Crom 1y 5(+C+F) Mdh en A B D F, Crom 2 Pep en A y C, Crom 4 Pgm en B D E, Crom 1y 5(+C+F) Eno y Pgm en crom 1 Mdh en crom 2 Pep en crom 4

Cartografía con marcadores moleculares

:

El análisis directo de las moléculas de ADN ha revelado una gran

cantidad de variación, a veces relacionada con cambios fenotípicos y a veces no (“silenciosa”)

SNP = single nucleotide polimorphism SSLP = simple sequence lenght polimorphism

Las variantes moleculares son tan comunes que muchos individuos son

heterocigotos moleculares en muchos loci diferentes del genoma. Un locus constituido por un polimorfismo molecular puede

cartografiarse igual que cualquier otro locus “fenotípico” A,a Estos loci de heterocigosidad molecular se conocen como

MARCADORES MOLECULARES.

Muy usados para localizar genes de interés (por su ligamiento a los mismos). Los más usados son: SNP y SSLP

RFLP = Restriction fragments length polymorphism

Enzimas de restricción de tipo II reconocen pequeñas secuencias (dianas) en las cadenas de ADN y cortan la molécula

ATTG GATTC TAGnnnnnCGA

TAAC CTAAG ATCnnnnnGCT

5’ GTATCGAAATCT A3’ ganancia pérdida

5’GT AAATCT A3’ 5’GTATCGAAATCTACTGA3’

Cambio de 1 base

Electroforesis (+ hibridación) nos permite detectar los

fragmentos producidos

La asociación no es completa y observamos recombinantes: descendiente 8 que es Dd es 1,1; cuando esperábamos que fuese 1,2

__ __

_{__ __}

__ __

SSLP (VNTR) = Polimorfismos de longitud de secuencia simple

Muchos genomas tienen secuencias de DNA repetitivo, de diferentes tamaños:

SSLP tiene muchos alelos (Ej: 15)  podemos seguir la pista de un cromosoma en una genealogía. Mas usados: micro- y mini-satélites

Minisatélites:

Unidad general 15-100 nuc ; en humanos 1-5 kb

Usados en forense: huella digital (corta DNA total e hibrida con una sonda homóloga del minisatélite

Microsatélites:

Unidad = 2 a 6 nuc; muchos alelos Si usamos la técnica de la PCR, y la electroforesis, se comportan como genes mendelianos multialélicos

Microsatélites Alelo asociado a la enfermedad 8 5 3 2

SNP (snips) = Polimorfismo de un único nucleótido

Hay varias cartografías de SNPs:

1.- SNP silenciosos dentro de genes (sin efecto fenotípico “aparente”: usados como marcadores de alelos recesivos.

5’-ATTCGGA-3’ 5’-ATTTGGA-3’ 3’-TAAGCCT-5’ 3’-TAAACCT-5’

Muy abundantes y, muchos de ellos, muy polimórficos en las poblaciones.

2.- SNP en los que un alelo del SNP produce un fenotipo mutante que sigue una herencia monogénica, es decir, produce un fenotipo discreto. Ej: PKN ó Anemia falciforme (detectamos antes de que aparezca la enfermedad)

3.- SNP en poligenes (QTL). Se usan para descubrir poligenes que contribuyen al fenotipo continuo.

4.- SNP intergénicos. Sirven para cartografiar genes. Acercarnos a su posición. Ej: en la posición 5000 de un cromosoma aparece el par AT y en el homólogo aparece el par GC

Análisis de pedigrís lo asociaron al cromosoma 7 Otros marcadores moleculares, restringen la zona: 1,5 Mb a 0,5 Mb Clonación posicional 4 genes: estudios de vinculación y expresión (hibridación) donde se expresa 68% enfermos

Otros: mutaciones en el gen CFTR

FIBROCIS CÍSTICA

Autosómico recesivo; 5% de los caucásicos son portadores

Gen regulador de la conductancia transmembrana de la fibrocis cística

Cartografía mediante el uso de haplotipos de SNP

Haplotipo: conjunto de marcadores genéticos que se encuentran un segmento cromosómico.

Haplotipo de SNP: segmento cromosómico definido por el conjunto específico de alelos de SNP que contiene.

Ejemplo: a cada SNP se le dio un nº ; ≠ alelos se distinguen por ‘

---1 2’ 3’ 4 5 --- Es un haplotipo; ---1 2 3’ 4 5 --- Es un haplotipo diferente

HT de distintos tamaños: de unas pocas bases a varias Kb

Generalmente se heredan como bloques, presentan desequilibrio en el ligamiento (asociación gamética)

Con el tiempo, los entrecruzamientos hacen que se pierda la asociación

HAPMAP: mapa de haplotipos humanos : islas separadas por puntos calientes de recombinación

El paso del tiempo

introduce nuevos alelos en los SNPs,  los que todavía quedan asociados indican la posición del gen de la

enfermedad

SNP humanos suelen estar a 1 kb, con lo que localizan el

Recombinación en cromosomas mitóticos

Son eventos muy raros, que se detectan como quimeras.

Stern: Drosophila: observó manchas mutantes en individuos

heterocigóticos

Mapas mitóticos:

- Contabilizamos el nº de quimeras en el que ha

participado el gen. Cuanto más participe, más alejado del centrómero está.

- las distancias se dan en referencia al locus más alejado del centrómero.

Recombinación entre cromátidas hermanas

Se ha demostrado que en la mitosis se dan intercambios entre las

cromátidas hermanas (ICH), pero al ser réplicas una de la otra, no dan lugar a nuevas combinaciones alélicas.

Técnica: tinción en presencia de Bromo-desoxi-uridina

MAPAS FÍSICOS

No existe una correlación exacta entre mapa físico y mapa genético

Causa: no todas las regiones recombinan con la misma frecuencia Técnicas:

-Mapeo por deleción

-Hibridación in situ (FISH): sondas fluorescentes -Secuenciación (librerías-clonaje)

Comparando con el

mapa físico, el orden de los genes es el mismo, pero sus distancias

relativas pueden ser diferentes

MAPAS en EUCARIOTAS HAPLOIDES

Muchos eucariotas unicelulares, haploides durante los estadios vegetativos, forman células reproductivas que se fusionan en la fecundación y dan lugar a un zigoto diploide

Chlamydomonas

Zigoto — meiosis células (+) y (-) 

colonias vegetativas —condiciones adversas

 isogametos  apareamiento: zigoto

Técnica:

Se aíslan 2 cepas de genotipos diferentes y se cruzan entre sí. Tras la meiosis los productos quedan juntos y se pueden analizar Ej:

Chlamydomonas ó Neurospora (ascas

ordenadas)

Las ascas ordenadas

permiten mapear el centrómero

Cartografía con tétradas desordenadas

Ditipo parental = DP

½ de cada tipo parental

Ditipo no parental = DNP

½ de cada tipo recombinante

Tetratipo = TT ¼ de cada clase DP DNP TT TT Frecuencia de DNP muy diferente (DNP + ½ TT)*100 FR = nº de tétradas Comparando DP y DNP sabremos si están ligados

Cartografía con tétradas ordenadas

Cartografía del centrómero

Sin entrecruzamiento: segregación en la 1ª división meiótica

aa++ (aaaa++++) ó ++aa (++++aaaa)

Con entrecruzamiento: ascas 2 a 2 = segregación en la 2ª división

meiótica

a+a+ ó a++a ó +aa+ ó +a+a

Distancia _{A-centrómero} = ½ (ascas que segregan en la 2ª división)*100/total de ascas Permitieron comprobar la recombinación recíproca y el

fenómeno de conversión génica

Segregación en la 1ª división meiótica Segregación en la 2ª división meiótica