1 ACTIVIDAD ALELOPÁTICA Y ANTIBACTERIANA DE FRACCIONES POLARES F1-C, F1-D Y F1-F OBTENIDAS DE Henriettella trachyphylla Triana
(MELASTOMATACEAE)
TRABAJO DE GRADO
Requisito parcial para optar al título de Tecnólogo Químico
Presentado por:
NATALIA CARDONA CLAVIJO MELINA SALAZAR OSORIO
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA FACULTAD DE TECNOLOGÍA
ESCUELA DE QUÍMICA GRUPO POLIFENOLES
2 ACTIVIDAD ALELOPÁTICA Y ANTIBACTERIANA DE FRACCIONES POLARES F1-C, F1-D Y F1-F OBTENIDAS DE Henriettella trachyphylla Triana
(MELASTOMATACEAE)
TRABAJO DE GRADO
Requisito parcial para optar al título de Tecnólogo Químico
Presentado por:
NATALIA CARDONA CLAVIJO MELINA SALAZAR OSORIO
Director
FRANCISCO JAVIER JIMÉNEZ GONZÁLEZ
Asesor
Esp. Microbiología Industrial JOSÉ RAFAEL RODRÍGUEZ
UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA FACULTAD DE TECNOLOGÍA
ESCUELA DE QUÍMICA GRUPO POLIFENOLES Pereira, Noviembre de 2012
3 NOTA DE ACEPTACIÓN DEL TRABAJO DE GRADO
ACTIVIDAD ALELOPÁTICA Y ANTIBACTERIANA DE FRACCIONES POLARES F1-C, F1-D Y F1-F OBTENIDAS DE Henriettella trachyphylla Triana
(MELASTOMATACEAE)
Presentado por:
NATALIA CARDONA CLAVIJO MELINA SALAZAR OSORIO
El suscrito director y jurados del presente trabajo de grado, una vez revisada la
versión escrita y presenciado la sustentación oral, decidimos otorgar la nota de:
______________________
Con la connotación: ______________________
Para constancia firmamos en la ciudad de Pereira hoy
_____________________________
El director: _________________________________ Francisco Javier Jiménez González
Jurado: _______________________________ Dr. Oscar Marino Mosquera
4 DEDICATORIA
No me alcanzaría la vida para agradecer a mis padres por su apoyo incondicional durante todo este tiempo, por su amor, y por su esfuerzo para que culminara esta etapa en mi vida. Gracias por confiar en mí y por enseñarme hacer mejor persona cada día ¡LOS AMO!
A mi hermana, mi novio y las personas más allegadas a mí por apoyarme en los momentos en que estuve a punto de desfallecer y alentarme para que saliera adelante ¡MUCHAS GRACIAS POR ESTAR A MI LADO!
A mi abuelita que aunque ya no está conmigo fue uno de mis motivos para seguir adelante ¡SIEMPRE ESTARAS EN MI CORAZÓN!
NATALIA CARDONA CLAVIJO
A Dios, que es el gran motor de mi vida, lo más grande y sublime, lo inentendible e inalcanzable, el mejor químico que me ha iluminado incondicionalmente.
A mi madre Liliana Osorio, quien me ha brindado el mejor ejemplo para ser una mujer virtuosa, por sus consejos de aliento y por tantas noches de insomnio a mi lado. A mi padre José Fernando Salazar, por siempre brindarme su apoyo e inculcarme el amor de Dios, a mi abuela Nubia Ramírez, por alimentarme con el amor más puro que pueda existir y por enseñarme con dulzura lo que significa la palabra disciplina.
A toda mi familia, por la cual siento un gran orgullo y agradecimiento, aquí incluyo a mi amigo del alma Jhon Fredy Sánchez, por todos los momentos que vivimos juntos.
Y a Natalia Cardona, por ser una excelente compañera y apoyarme cuando más la necesite.
5 AGRADECIMIENTOS
En primer lugar agradecemos a Dios por darnos la oportunidad de estudiar, acompañarnos en este camino y poder lograr esta meta.
A nuestro director el profesor Francisco Javier Jiménez por su dedicación, apoyo y asesoría en la realización de este proyecto.
A todos los profesores de la Escuela de Tecnología Química que contribuyeron a nuestra formación académica y personal.
Por último al grupo Polifenoles por darnos la oportunidad de desarrollar este trabajo en sus instalaciones y prestarnos todos sus servicios.
6 TABLA DE CONTENIDO Pág. RESUMEN ... 13 INTRODUCCIÓN ... 15 1. ANTECEDENTES ... 17
1.1 SURGIMIENTO DEL PROBLEMA ... 20
1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA ... 21
1.3 OBJETIVOS ... 21
1.3.1 Objetivo general ... 21
1.3.2 Objetivos específicos ... 21
1.4 JUSTIFICACIÓN ... 22
2. MARCO TEÓRICO ... 23
2.1. Descripción y distribución de la familia melastomataceae ... 23
2.1.1 Farmacognosia de la familia melastomataceae ... 23
2.2 Descripción y componentes químicos del género Henriettella y la especie Henriettella trachyphylla ... 24
2.2.1 Henriettella Naudin ... 24
2.2.2 Henriettella trachyphylla Triana. ... 25
2.3 Aleloquímicos ... 25
2.3.2 Germinación ... 27
2.4 Actividad antibacteriana ... 29
2.4.1 Descripción de bacterias empleadas ... 29
2.4.2 Descripción de antibióticos empleados ... 31
2.5 Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC) ... 32
3. SECCIÓN EXPERIMENTAL ... 34
3.1 Materiales y reactivos ... 34
3.2 Disolventes ... 34
3.3 Equipos ... 34
3.4 Material vegetal ... 34
3.5 Prueba preliminar para selección de semillas de lechuga o tomate ... 36
3.5.1 Semillas ... 36
3.5.2 Agua pretratada ... 36
7
3.5.4 Ensayo de germinación de semillas de lechuga y tomate ... 37
3.6 Ensayo de germinación para semillas de lechuga frente a las fracciones C, F1-D y F1-F ... 39
3.6.1 Esterilización de las semillas ... 39
3.6.2 Preparación de las fracciones ... 39
3.6.3 Germinación ... 39
3.6.4 Toma de datos y análisis estadístico ... 39
3.7 Actividad antibacteriana ... 40
3.7.1 Microorganismos ... 40
3.7.2 Antibiograma ... 40
3.7.3 Ensayo de actividad antibacteriana de las fracciones polares ... 40
3.7.4 Medio de cultivo ... 40
3.7.5 Preparación del inoculo ... 40
3.7.6 Controles ... 41
3.7.7 Preparación de antibióticos estándar ... 41
3.7.8 Preparación de las fracciones ... 41
3.7.9 Evaluación de la actividad inhibitoria ... 42
3.8 Pruebas de caracterización para flavonoides ... 45
3.8.1 Prueba de cloruro férrico ... 45
3.8.2 Prueba con acetato de plomo ... 45
3.8.3 Prueba de Shinoda ... 46
3.8.4 Prueba con gelatina–sal ... 46
3.8.5 Prueba de taninos hidrolizables ... 47
3.8.6 Prueba de taninos condensados ... 48
3.9 Análisis fitoquímico preliminar ... 49
3.9.1 Análisis por cromatografía de capa delgada (CCD) ... 49
3.9.2 Análisis por espectroscopía UV ... 49
3.9.3 Separación cromatográfica en columna de la fracción F1-F ... 49
3.9.4 Cromatografía Preparativa ... 50
4. RESULTADOS Y DISCUSIÓN ... 51
4.1 Ensayo de germinación para semillas de lechuga y tomate ... 51
4.2 Ensayo de germinación para semillas de lechuga frente a las fracciones C, F1-D y F1-F. ... 53
8
4.3 Evaluación de la actividad antibacteriana ... 56
4.4 Pruebas de caracterización química ... 58
4.5 Análisis cromatográfico por HPLC de las fracciones F1-C, F1-D y F1-F ... 59
4.5.1 Perfiles cromatográficos de las fracciones F1-C, F1-D y F1-F a 260 nm ... 59
4.5.2 Perfiles cromatográficos de las fracciones F1-C, F1-D y F1-F a 330 nm ... 60
4.5.3. Análisis por cromatografía de capa delgada (TLC) ... 61
4.5.4 Pruebas de desplazamiento para la determinación de núcleos de flavonoides 61 4.6 Separación cromatografía en columna de la fracción F-1 F ... 63
4.7 Análisis de espectros de RMN 1H, 13C y HSQC .. ¡Error! Marcador no definido. 5. CONCLUSIONES ... 72
RECOMENDACIONES ... 78
9 Índice de Tablas
Pág.
Tabla 1. Desviaciones y media de la fracción F1-C……….………54
Tabla 2. Desviaciones y media de la fracción F1-D.……….…...………55
Tabla 3. Desviaciones y media de la fracción F1-F……….……55
Tabla 4. Resultados actividad antibacteriana………...……57
10 Índice de Figuras
Pág.
Figura 1. Estructuras químicas de agentes alelopáticos presentes en diferentes plantas. 18
Figura 2. Compuestos aisladas de H. fascicularis ... 25
Figura 3. Etapas de la germinación en dicotiledóneas (Jean-Yves et al., 2006). ... 28
Figura 4. Escherichia coli ... 30
Figura 5. Pseudomonas aeruginosa ... 30
Figura 6. Amoxicilina ... 31
Figura 7. Ampicilina ... 32
Figura 8. Equipo HPLC ... 33
Figura 9. Procedimiento de extracción de las hojas de Henriettella trachyphylla (Isaza et al., 2005). ... 36
Figura 10. Lavado de semillas ... 37
Figura 11. Germinación de semillas en agua ... 37
Figura 12. Germinación de semillas en DMSO ... 38
Figura 13. Control con glifosato ... 38
Figura 14. Esterilización de semillas de Lechuga ... 39
Figura 15. Diluciones para la preparación de antibióticos ... 41
Figura 16. Diluciones para la preparación de fracciones ... 42
Figura 17. Diagrama de siembra en profundidad ... 43
Figura 18. Diagrama de distribución y elaboración de los pozos ... 44
Figura 19. Diagrama de medición del halo de inhibición. ... 45
Figura 20. Reacción de cloruro férrico ... 45
Figura 21. Reacción con solución de acetato de plomo ... 46
Figura 22. Reacción del anillo benzopirona en presencia de ácido clorhídrico y magnesio ... 46
Figura 23. Reacción de la prueba con gelatina-sal ... 47
Figura 24. Estructuras de los componentes de un tanino hidrolizable ... 47
Figura 25. Reacción coloreada para taninos condensados ... 48
Figura 26. Separación cromatográfica de la fracción F1-F ... 50
Figura 27. Germinación de semillas de lechuga con agua ... 51
Figura 28. Germinación de semillas de tomate en agua ... 52
Figura 29. Germinación de semillas de tomate con glifosato ... 52
Figura 30. Porcentaje germinación para de la fracción F1-C ... 54
Figura 31. Porcentaje germinación para de la fracción F1-D ... 54
Figura 32. Porcentaje germinación para de la fracción F1-F ... 55
Figura 33. Evaluación de antibióticos frente a microorganismos de prueba ... 57
Figura 34. Cromatograma fracción F1-C a 260 nm ... 59
Figura 35. Cromatograma fracción F1-D a 260 nm ... 59
Figura 36. Cromatograma fracción F1-F a 260 nm ... 59
Figura 37. Cromatograma fracción F1-C a 330 nm ... 60
11
Figura 39. Cromatograma fracción F1-F a 330 nm ... 60
Figura 40. Cromatoplacas de la fracción F1-F obtenidas con el sistema H2O–i-PrOH (6:4) ... 61
Figura 41. Espectro fracción F1-C en MeOH ... 62
Figura 42. Espectro fracción F1-D en MeOH ... 62
Figura 43. Espectro fracción ... 62
Figura 44. Espectro fracción F1-C con CH3ONa ... 62
Figura 45. Espectro fracción F1-D con CH3ONa ... 62
Figura 46. Espectro fracción F1-F con CH3ONa ... 62
Figura 47. Espectro fracción F1-C con CH3COONa ... 62
Figura 48. Espectro fracción F1-D con CH3COONa ... 62
Figura 49. Espectro fracción F1-F con CH3COONa ... 62
Figura 50. Espectro fracción F1-C con AlCl3 ... 63
Figura 51. Espectro fracción F1-D con AlCl3 ... 63
Figura 52. Espectro fracción F1-F con AlCl3 ... 63
Figura 53. Cromatoplaca #1 de las fracciones obtenidas del fraccionamiento de la fracción F1-F ... 63
Figura 54. Cromatoplaca #2 de las fracciones obtenidas del fraccionamiento de la fracción F1-F ... 64
Figura 55. Cromatoplaca #3 de las fracciones obtenidas del fraccionamiento de la fracción F1-F ... 64
Figura 56. Cromatoplaca y espectro UV de la fracción F1-F1 ... 65
Figura 57.Cromatoplaca y espectro UV de la fracción F1-F2 ... 65
Figura 58. Cromatoplaca y espectro UV de la fracción F1-F3 ... 65
Figura 59. Cromatoplaca y espectro UV de la fracción F1-F4 ... 66
Figura 60. Cromatoplaca y espectro UV de la fracción F1-F5 ... 66
Figura 61. Cromatoplaca y espectro UV de la fracción F1-F6 ... 66
Figura 62. Cromatoplaca y espectro UV de la fracción F1-F7 ... 67
Figura 63. Porcentaje de rendimiento de las fracciones F1-F1 hasta F1-F7 ... 67
Figura 64. Cromatoplaca preparativa fracción F1-F3 ... 68
Figura 65. Cromatoplaca preparativa fracción F1-F4 ... 68
Figura 66 Cromatoplaca preparativa fracción F1-F5 ... 69
Figura 67. Cromatoplaca de la fracción F1-F3 ... 69
Figura 68. Cromatoplaca de la fracción F1-F4 ... 70
Figura 69. Cromatoplacas de la fracción F1-F5 ... 70
12 Índice de Anexos
Pág. ANEXO 1. Tablas primer ensayo germinación de semillas de lechuga. ... 79 ANEXO 2. Tablas primer ensayo de germinación semillas de tomate ... 87 ANEXO 3. Antibiograma ... 95
13 RESUMEN
En este estudio, fueron evaluadas la actividad alelopática y antibacteriana de las fracciones polares F1-C, F1-D y F1-F obtenidas de Henriettella trachyphylla Triana., pertenecientes a la familia melastomataceae frente a semillas de lechuga (Lactuca sativa L.) y cepas de las bacterias Gram negativas Escherichia coli (ATCC 25922) y Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853).
La fracción F1-F se separó en columna cromatográfica empacada sobre Toyopearl HW-40C, utilizando como fase móvil isopropanol - agua- metanol en diferentes proporciones. Obteniéndose siete fracciones, las cuales fueron monitoreadas por TLC en fase reversa, y nombradas como F1-F1 hasta F1-F7.
La fracción F1-F5 mostró bandas características de color azul, las cuales fueron recogidas por placa preparativa sobre sílicagel en fase reversa, siendo nombradas como F1-F5-A hasta F1-F5-G. Las fracciones F1-F5-D, F1-F5-F y F1-F5-G fueron purificadas y llevadas a análisis por CG/EM y RMN de protón para su posterior determinación estructural.
La actividad alelopática frente a la germinación de semillas de lechuga (Lactuca sativa L.) de la fracción F1-C presentó a una concentración de 0,05 mg/mL un porcentaje de germinación (75,56%), la fracción F1-D a una concentración de 0,8 mg/mL obtuvo un porcentaje de germinación (31,11%), y la fracción F1-F a una concentración de 0,8 mg/mL obtuvo el mayor valor (44,44%) de germinación, lo que sugiere que esta fracción puede actuar mejor como agente promotor de germinación mientras que F1-D inhibe la germinación de las semillas. Esta evaluación se presentó a las 36 horas de iniciado el ensayo.
En la evaluación de la actividad antibacteriana realizada a las fracciones F1-C, F1-D, F1-F, no presentó inhibición frente al crecimiento de E. coli y P. aeruginosa a las concentraciones de 1000, 500, 250, 125 y 62,5 mg/mL.
Palabras clave: Escherichia coli, Henriettella trachyphylla, Lactuca sativa,
14 ABSTRACT
In this study, were evaluated allelopathic and antibacterial activity of polar fractions F1-C, F1-D and F1-F obtained from Henriettella trachyphylla Triana, belonging to melastomataceous family against lecttuce (Lactuca sativa L.) seeds and Gram negative strain bacterias Escherichia coli (ATCC 25922) and Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853), respectively.
F1-F fraction was separated on chromatography column packed with Toyopearl HW-40C, obtained seven fractions, which were monitored by reverse phase plate TLC, namely as F1-F1 to F1-F7.
F1-F5 fraction showed blue color spots, which were collected after separated by preparative plate on silice gel reverse phase, namely as F1-F5-A to F1-F5-G. F1-F5-E, F1-F5-F and F1-F5-G fractions were purified and carried to GC/MS and proton-carbon NMR structural determination.
Allelopathic activity against to lecttuce (Lactuca sativa L.) seeds germination from F1-C fractions presented percentage germination (75,56%) to 0,05 mg/mL concentration, F1-D fraction presented germination percentage (31,11%) to 0,8 mg/mL concentration, and the F1-F fraction at a concentration of 0.8 mg/mL had the lowest value (44.44%) of germination, which suggests that this fraction can act better as promotor agent. This assay was presented at 36 hours into the test.
The evaluation of the antibacterial activity F1-C, F1-D and F1-F fractions weren´t showed inhibition against the growth of E. coli and P. aeruginosa to 1000, 500, 250, 125 and 62.5 mg/mL concentrations.
Keywords: Escherichia coli, Henriettella trachyphylla, Lactuca sativa, Pseudomonas
15 INTRODUCCIÓN
Este estudio se centra en la evaluación de la actividad alelopática y antibacteriana de fracciones polares obtenidas a partir del extracto en i-PrOH-agua (65:35) de Henriettella trachyphylla Triana., especie perteneciente a la familia melastomataceae. La alelopatía en su definición más tradicional, postulada por Rice, descrita como “cualquier efecto directo o indirecto causado por una planta (incluyendo microrganismos) sobre otras a través de la producción de compuestos químicos que se escapan al medio ambiente” (Macías et al., 2009). Con el ánimo de englobar otras interacciones, se ha orientado una definición más amplia, como ha sido la desarrollada por la IAS (Sociedad Internacional de Alelopatía) en 1996, como “cualquier proceso que involucre metabolitos secundarios producidos por plantas, algas, bacterias y hongos, que influyan en el crecimiento y desarrollo de sistemas agrícolas y biológicos, tanto con efectos positivos como negativos”.
En la parte experimental de este trabajo se llevó a cabo la actividad germinativa, utilizando semillas de lechuga (lactuca sativa L) como una especie receptora. Esta actividad germinativa se determina por la emergencia y el desarrollo de las estructuras esenciales del embrión, manifestándose su capacidad de dar origen a una plántula normal, bajo condiciones ambientales favorables.
Durante las últimas décadas, muchas investigaciones que se han realizado han conllevado a explorar el potencial alelopático en cultivos y otras plantas, para controlar las malas hierbas. Por ejemplo, Dzyubenko y Petrenko en 1971, encontraron que las secreciones de raíces de maíz (Zea mays L.) inhiben el crecimiento de Chenopodium album L., mientras Cheema et al. En 1988, demostró que los extractos acuosos de paja de trigo inhiben significativamente la germinación y el crecimiento de correhuela ó cahiruela (Convolvulus arvensis L.) (Javaid et al., 2006). Además, con esta actividad se ha demostrado que gran variedad de plantas poseen efectos inhibitorios sobre el crecimiento y la población de otras plantas vecinas o de sucesión por la liberación de sustancias alelopáticas en el suelo, ya sea como exudados de tejidos de plantas vivas o por descomposición de los residuos vegetales (Kato-Noguchi y Macías, 2005).
En la parte experimental se utilizaron semillas de lechuga (Lactuca Sativa L.), usadas como material de bioensayo, para evaluar la actividad germinativa de las fracciones polares.
La actividad antibacteriana se define como la actividad in vitro de un antibiótico frente a un microorganismo determinado y refleja su capacidad para inhibir el crecimiento de una bacteria o población bacteriana (Niño et al., 2006).
La permanencia de enfermedades infecciosas causadas por cepas patógenas resistentes es un problema de salud a nivel mundial. Las cepas patógenas resistentes han surgido principalmente en los hospitales a consecuencia de varios factores, como son el amplio uso de antibióticos, las dosis utilizadas, el tiempo de tratamiento, la eliminación de la mitad de la droga que no se alcanza a metabolizar en su totalidad, otros elementos que influyen son las altas posibilidades de transmisión o contagio y el estado
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inmunocomprometido de los pacientes que los hace susceptibles a infecciones con patógenos oportunistas (Luján, 2006).
Las opciones de agentes antimicrobianos utilizadas en las terapias para el tratamiento de las enfermedades infecciosas causadas por las bacterias con resistencia múltiple están por lo tanto seriamente limitadas. Las compañías farmacéuticas están buscando drogas alternativas de otras fuentes incluyendo las plantas y los animales. Las plantas medicinales son consideradas como una fuente potencial de nuevas drogas quimioterapéuticas debido a su contenido de fitoquímicos y a su poco o nulo efecto tóxico. Ciertamente, las plantas poseen un enorme y desconocido reservorio de sustancias derivado de sus sistemas de defensa en contra de microorganismos, insectos y herbívoros. Aunque se han identificado algunas sustancias simples como fenoles, derivados de los fenoles (quinonas, flavonas, flavonoides, flavonoles, taninos y cumarinas, terpenoides, aceites esenciales, alcaloides lectinas y polipéptidos. Uno de los mecanismos para la inducción de la resistencia es la presión selectiva a la que se someten las bacterias, pero como el uso de extractos vegetales a nivel hospitalario es limitado, las bacterias no han desarrollado mecanismos de resistencia en su contra. Siendo esto posible que los extractos pueden inhibir el crecimiento de cepas con resistencia múltiple (Luján, 2006).
Por lo anterior se busca valorar la actividad antimicrobiana in vitro de las fracciones polares F1-C, F1-D, F1-F contra cepas Gram negativas Escherichia coli (ATCC 25922) y Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853).
17 1. ANTECEDENTES
En los últimos años la actividad alelopática se ha presentado como una alternativa viable para incrementar los niveles de producción por cosecha y prevenir el uso indiscriminado de herbicidas sintéticos, los cuales generan costos elevados en la producción y conllevan a problemas de contaminación por residuos de los mismos en el producto recolectado, o como en otras ocasiones contaminación cruzada a otros cultivos y ríos cercanos en áreas de actividad agrícola (Macías et al., 2000).
La manipulación adecuada de los cultivos, utilizando la alelopatía para la mejora de la productividad de los mismos, ayuda a la protección del medio ambiente a través del eco-amigable control de malezas y plagas, la conservación de nitrógeno en la tierra de cultivo y la síntesis de nuevos productos agroquímicos a base de productos naturales, han ganado la atención prominente del científico dedicado a esta investigación (Sang-Uk et al., 2005).
Se ha confirmado que los metabolitos secundarios constituyen una fuente de productos naturales con actividad biológica diversa, comprobándose su actividad antibacteriana, antifúngica, antiviral, antineoplásica, anticancerígena, anticoagulante, citotóxica entre otras. Esta gama de propiedades, permite a estos compuestos tener un gran potencial de aplicación, ya sea aislados o usando directamente el extracto o infusión del compuesto al que se le ha detectado una actividad biológica específica, empleándose como precursor en la síntesis de compuestos orgánicos o para caracterizar la estructura de sus centros activos con el fin de modelar nuevas sustancias con propiedades prestablecidas.
El creciente interés por el estudio de los metabolitos secundarios ha dado origen a la descripción de un gran número de compuestos. Esto ha sido motivado por inquietudes farmacológicas en un principio y, posteriormente, por conocer el rol que estos metabolitos desempeñan durante el ciclo vital de los organismos que los sintetizan, así como, llegar a comprender cómo estos compuestos contribuyen al funcionamiento de los sistemas ecológicos (Organization for Tropical Studies).
La naturaleza química de los agentes alelopáticos es muy variada. (Rivenshield, 2008) Según estudios, los compuestos fenólicos tales como los ácidos ferúlico (Fig. a) y caféico (Fig. b) identificados en los tejidos de las plantas y en los exudados de raíces de tomate, pepino, alfalfa, arroz y avenilla pueden inducir efectos fitotóxicos en tomate, lechuga y pepino (Loffredo et al.,2005).
Un compuesto que causa inhibición del crecimiento ha sido recientemente aislado de los exudados de arroz, y su estructura química fue determinada por los datos espectrales como momilactona B (Fig. c), la cual impidió el crecimiento de plántulas de berro y de lechuga a concentraciones superiores de 3 y 30 mmol/L respectivamente (Kato-Noguchi et al.,2005).
Un estudio más reciente, sugiere que la radiación UV no sólo aumenta la concentración de la momilactona B en las semillas de arroz, sino también su secreción a la rizósfera, proporcionándole una ventaja competitiva a través de la inmovilización local de los
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microorganismos del suelo, y la inhibición del crecimiento de las especies de plantas competidoras (Kato-Noguchi et al., 2005).
CH3 OH O O CH3 CH3 OH O OH HO O H O O (a) (b) (c)
Figura 1. Estructuras químicas de agentes alelopáticos presentes en diferentes plantas.
Krautmann et al., en 2001 demostraron como fracciones cromatográficas diferentes de la especie Tridax procumbens L. (asteraceae), inhibían el crecimiento de semillas pregerminadas de L. sativa. De esta manera se definió el efecto alelopático negativo. Otra investigación sugerida por Waller et al., 1992, donde se evaluaron los extractos de las hojas de la especie Vigna radiata L. (fabaceae) y encontraron actividad alelopática positiva sobre el crecimiento de la radícula de L. sativa y de V. radiata, al observar que las semillas crecieron más que en el testigo absoluto; con lo que se tuvo el concepto de efecto alelopático positivo, que fue atribuido a una saponina triterpénica.
Del género Henriettella se tiene el reporte de H. fascicularis (Sw.), de la cual se aislaron ácido palmítico, ácido betulínico, β-sitosterol, (-)-pinoresinol, 4´,5,7-trihidroxi-6-8-dimetilisoflavona y taxifilina. La presencia de taxifilina, un glicósido cianogénico indica la toxicidad potencial de esta planta en herbívoros (Calderon et al., 2003).
Estudios realizados por el grupo Polifenoles, para el extracto en i-PrOH-agua (65-35) de H. trachyphylla, y sus respectivas fracciones frente a plántulas de lechuga (L. sativa L.), mostraron actividad alelopática tanto inhibitoria como promotora del crecimiento; algunas de sus fracciones activas presentaron compuestos de tipo flavonoide según pruebas de caracterización (Isaza y Jiménez, 2005).
Un estudio más reciente realizado por este grupo evaluó la actividad alelopática del extracto en cloroformo de Henriettella trachyphylla Triana, el extracto en acetato de etilo de Miconia coronata (BONPL.) D.C., pertenecientes a la familia melastomataceae y sus respectivas fracciones, frente a plántulas de lechuga.
El extracto en cloroformo de H. trachyphylla fue separado en columna cromatográfica empacada sobre sílicagel, obteniendo diez fracciones, las cuales nombraron como HtCHF1 hasta HtCHF10.
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Las fracciones HtCHF1, HtCHF2 y HtCHF3 provenientes del extracto en cloroformo de H. trachyphylla, fueron separadas por cromatografía preparativa en capa fina sobre sílicagel. De las cuales obtuvieron 5 subfracciones de HtCHF1 nombradas como (F1A, F1B, F1C, F1D, F1E), 4 de HtCHF2 (F2A - F2D) y 6 subfracciones de HtCHF3 (F3B - F3F).
Teniendo como resultado que el extracto en cloroformo de H. trachyphylla, presento un máximo de actividad alelopática inhibitoria en hipocótilo (-38,8%), y del 6,8% como promotor de crecimiento en epicótilo para el segundo día del ensayo, mientras que las fracciones F10A1 y F10A2 exhibieron efecto inhibidor, tanto para el hipocótilo como para epicótilo. Las fracciones Fr1, Fr3, Fr4 y Fr5 de M. coronata mostraron actividad alelopática.
Inhibitoria de crecimiento en hipocótilo con máximo de -19,4% (quinto día), -7,1% (quinto día), -64,5% (segundo día), -44,7% (segundo día), respectivamente; mientras que para epicótilo se observó inhibición de crecimiento al tercer día del -20,3%, -33,3%, 47,8%y -43,5% (Erira y Jiménez, 2012).
En actividad alelopática se han empleado diversidad de semillas por otros investigadores, entre las cuales se encuentran la especie L. sativa, R. sativus, Allium cepa (alliaceae), O. basilicum L (lamiaceae) y O. sativa. A las semillas mencionadas se les evaluó el crecimiento y desarrollo frente a un extracto determinado; los resultados obtenidos permitieron concluir que dentro del grupo seleccionado L. sativa fue la que mostró mayor sensibilidad a los aleloquímicos, elevado ritmo de crecimiento y de absorción de nutrientes en el desarrollo del ensayo (Aportela et al., 2001; Chi-Ming et al., 2002; Olaya, 2005).
A través del tiempo, las plantas son conocidas por producir moléculas bioactivas que reaccionan con otros organismos en el medio ambiente (Basile et al., 2000). Estas sustancias pueden inhibir el crecimiento de hongos y bacterias, atribuyendo propiedades interesantes para su posible síntesis y/o semi-síntesis, además de convertirse en una alternativa para el fortalecimiento de la investigación científica en el campo de los antimicrobianos.
Actualmente, estos fitoquímicos están siendo empleados a escala comercial para prolongar la vida humana y mejorar la seguridad en diversos aspectos. Es por esta razón que se ha desarrollado un creciente interés en la búsqueda de extractos y compuestos naturales de plantas, para sustituir los actuales agentes antimicrobianos sintéticos.
El uso de plantas medicinales se ha dado desde tiempos prehistóricos hasta los tiempos actuales; el hombre por ensayo y error utilizó los elementos que la naturaleza le brindaba para curar sus enfermedades y las de sus animales, este conocimiento se transmitió de generación en generación y fue perfeccionándose con la experiencia (Hoogesteger, 1994).
20 1.1 SURGIMIENTO DEL PROBLEMA
Cada día los herbicidas sintéticos no representan un instrumento adecuado para el control de algunas malezas en desarrollo de resistencia. El control de las malezas a través de la alelopatía es una estrategia para solucionar los numerosos problemas derivados de la insuficiencia de las prácticas de la cultura, y el abuso de herbicidas sintéticos (Singh et al., 2003; Macías et al., 2003; Hao et al., 2007).
La comprensión de los mecanismos de acción de los aleloquímicos permite la utilización de estos compuestos para mejorar la producción de cultivos y el desarrollo de una agricultura más sostenible, incluyendo el control de plagas y de malezas a través de la rotación de los cultivos, manejo de residuos y una variedad de enfoques en bio-control (Popaa et al., 2008).
La prevalencia de enfermedades infecciosas causadas por cepas patógenas de bacterias, ha surgido como respuesta al uso indiscriminado de los antibióticos. Esta resistencia es debida en muchos casos a la utilización inadecuada de las dosis y al tiempo de tratamiento que no es el recomendado por el médico. Esto ha llevado a promover la resistencia de los microorganismos frente a antibióticos. La utilización de plantas medicinales en nuestro medio, y el hecho que en gran cantidad de vegetales se encuentran principios activos empleados en el tratamiento de diversas enfermedades, ha incrementado el interés por su estudio.
La actividad antimicrobiana de los extractos vegetales y productos naturales ha revelado el potencial de las plantas superiores como fuente de agentes anti-infectivos, permitiendo de esta manera un avance al uso empírico de las especies vegetales medicinales con una base científica (López et al., 1997). Los efectos negativos sobre otras especies pueden deberse a una variedad de procesos, incluyendo la reducción de división celular en las raíces, la reducción de la absorción de iones, la inhibición de la fotosíntesis y la respiración, la inhibición de la síntesis de proteínas, la inhibición de proteínas de la actividad enzimática y una menor permeabilidad de la membrana celular. Algunos de los aleloquímicos con más frecuencia encontrados son los flavonoides, los cuales, han sido frecuentemente implicados en la inhibición de la germinación de semillas y crecimiento de raíces (Taylor et al., 2005).
Actualmente, a nivel mundial existe una problemática relacionada a la resistencia que presentan algunos microorganismos frente a antibióticos que se consideran de amplio espectro. Es por esta razón que se pretende buscar nuevas alternativas de antimicrobianos naturales, logrando ser un aporte innovador en este campo.
21 1.2 FORMULACIÓN DEL PROBLEMA
La información anterior condujo a determinar el problema objeto de estudio de esta investigación en las siguientes preguntas:
¿Poseen las fracciones polares F1-C, F1-D y F1-F actividad antibacteriana frente a las bacterias Escherichia coli (ATCC 25922) y Pseudomonas aeruginosa (ATCC 27853)? ¿Presentan las fracciones polares F1-C, F1-D y F1-F actividad inhibitoria frente a la germinación de semillas de lechuga (Lactuca sativa L.)?
1.3 OBJETIVOS
1.3.1 Objetivo general
Determinar la actividad alelopática y antibacteriana de las fracciones polares F1-C, F1-D y F1-F obtenidas de Henriettella trachyphylla Triana (Melastomataceae).
1.3.2 Objetivos específicos
1.3.2.1 Realizar ensayos de actividad alelopática a las fracciones F1-C, F1-D y F1-F
sobre la germinación de semillas de lechuga (Lactuca sativa L).
1.3.2.2 Desarrollar ensayos de actividad antibacteriana de las fracciones F1-C, F1-D y
F1-F frente a cepas de Escherichia coli y Pseudomonas aeruginosa.
1.3.2.2 Separar por columna cromatográfica empacada con Toyopearl HW40 la fracción
22 1.4 JUSTIFICACIÓN
La tendencia de volver a lo natural y el uso creciente de los fitoquímicos como agentes terapéuticos para el tratamiento de diversas enfermedades, ha llevado desde hace algunos años al grupo Polifenoles de la Universidad Tecnológica de Pereira a investigar sustancias con potencial biológico obtenidas de algunas plantas de la Eco-región Eje Cafetero, y en especial las pertenecientes a la familia melastomataceae.
En nuestra región, el uso tradicional de estos fitoquímicos ha llevado al descubrimiento y obtención de estructuras que son reconocidas por tener alguna actividad biológica frente a organismos, ya sea contra bacterias como antibacterianos, contra hongos como antifúngicos, o los que intervienen en el proceso de inhibición del crecimiento y muerte de otras especies vegetales, como pueden ser los agentes alelopáticos. En la actualidad, este uso ha permitido en otras latitudes desarrollar muchos agentes farmacéuticos o agroquímicos que tengan como base los compuestos naturales, además de las posibles modificaciones de los mismos por medio de biosíntesis, síntesis química y/o semi-síntesis.
Según la OMS (Gómez et al., 2011), se estima que el 80% de los habitantes de los países en vía de desarrollo dependen de las plantas medicinales para satisfacer sus necesidades de atención primaria en salud. Lo anterior, se basa en la confianza que producen los tratamientos con fitoterapéuticos, al evitar los efectos secundarios producidos por fármacos sintéticos, además de su alta disponibilidad y bajo costo (Mongeli et al., 2000). Del mismo modo, estas sustancias podrían ser utilizadas como potenciadores de germinación, controladores biológicos en el diseño de sistemas de cultivos intercalados y en el manejo de la rotación de los mismos (Gliessman, 2002).
Por medio de esta investigación se busca proveer una alternativa para conseguir antibacterianos, herbicidas o potenciadores de germinación que sean competitivos e innovadores, que favorezcan el desarrollo de nuestro país y la Eco-región Eje Cafetero, además de ser un aporte significativo para ampliar el conocimiento de nuestro recurso natural.
De esta forma, y teniendo antecedentes de otras investigaciones llevadas a cabo a partir de las plantas melastomatáceas, se pretende seguir contribuyendo al desarrollo en la búsqueda de nuevos agentes antimicrobianos y alelopáticos. Para este trabajo de investigación se pretenden estudiar las fracciones polares F1C, F1D y F1F obtenidas de Henriettella trachyphylla Triana, ya que esta ha sido poco estudiada frente a su fitoquímica y farmacognosia.
23 2. MARCO TEÓRICO
2.1. Descripción y distribución de la familia melastomataceae
Melastomataceae Juss, comprende arbustos, trepadoras, leñosas, hierbas y árboles. Es la séptima familia más diversa del planeta con 4570 especies en 150 a 166 géneros (Popaa et al., 2008). Se reconoce fácilmente por el patrón de nerviación de las hojas. Muchas especies se caracterizan por tener flores, siendo estas aprovechas por su importancia como ornamentales (Quiñones. 2001).
La familia melastomatácea, se producen en todos los biomas tropicales, particularmente de las regiones del Nuevo Mundo. En Suramérica se encuentran 166 géneros, ninguno de ellos existe en el viejo mundo. Para Colombia se registran aproximadamente 900 especies y 61 géneros, distribuidas en los Andes, Chocó y Amazonía. En la Orinoquía se encuentran 38 géneros y alrededor de 180 especies (Quiñones. 2001).
2.1.1 Farmacognosia de la familia melastomataceae
Las plantas melastomataceaes han sido usadas para medicina tradicional, especialmente en Asia y Latinoamérica, como astringentes, hemostáticos, como remedios para diarrea, disentería, leucorrea y enfermedades de la piel; contra afecciones respiratorias, malaria, cálculos en la vejiga y otras enfermedades del tracto genitourinario, irritaciones en las encías y como diurético. En Colombia, algunas especies de la familia son usadas como medicina tradicional para el tratamiento de la malaria, infecciones, heridas en la piel, enfermedades respiratorias, cálculos en la vejiga y otras dolencias genitourinarias, como diurético, y como un remedio tópico para irritaciones en la encía (García. 1974 ).
Según información de pobladores en Riosucio Caldas, indican que Tibouchina ciliaris y Monochaetum multiflorum han sido usadas tradicionalmente para el tratamiento de infecciones en heridas de la piel.
2.1.2 Fitoquímica de la familia melastomataceae
Muchos de los constituyentes químicos de las plantas melastomatáceas son de tipo polifenólico; sin embargo, también han sido reportados algunos triterpenoides y aquilbencenos.
Se han detectado alcaloides en clidemia hirta D. Don. y Sonerila heterostemon Naudin, pero aún no se han aislado. En la planta Clidemia floribunda Planch. Se ha detectado el ácido caféico. Molisch, describió en 1928 la presencia de antocianinas en las raíces de algunas especies de melastomataceaes, como Centradenia grandiflora Endl. Ex. Walp, Monochaetum umbellatum Naudin, Tibouchina semidecandra Cogn, Medinillina magnifica Linl, Bertolonia aenea Naudin, B. Marmorata Naudin, y B. Vittata.
24
La mayor parte de los constituyentes de las plantas melastomatáceas son taninos hidrolizables. Hasta ahora los taninos hidrolizables aislados de especies de melastomatáceas son representativos de grupos galotaninos y elagitinanos.
La composición de los taninos hidrolizables oligoméricos de Tibouchina multiflora colectada en colombia, fueron similares a los de T. Semidecandra, incluyendo 1, 2, 3, 6 tetragaloiglucopiranosa, casuarictin, pterocarianin C, pedunculagin, y los nobotaninos A-A-E aislados de las hojas de Monochaetum multiflora, junto con nueve nuevos nobotaninos O-W, dimeros, trimeros y tetrámeros (Isaza y Jiménez, 2005).
2.2 Descripción y componentes químicos del género Henriettella y la especie
Henriettella trachyphylla
2.2.1 Henriettella Naudin
El género Henriettella Naudin, se caracteriza por árboles o arbustos con flores tetrámeras o pentámeras, hojas cartáceas a subcoriáceas, pétalos ovados a lanceolados, obtusamente agudos a obtusos apicalmente, blancos o amarillentos (Tropicos.org. 2012). Este género cuenta con alrededor 40 especies, que se distribuyen desde Guatemala hasta Bolivia y el sur oriente de Brasil. En Colombia se registran 16 especies en las regiones del Chocó, Magdalena Medio, Andes, Sierra Nevada, Orinoquía, las Guayanas y Amazonía, entre los 0 y los 2800 metros de altitud (Mendoza et al., 2006).
De la fracción en acetato de etilo de Henriettella fascicularis condujo al aislamiento de taxyphyllin (a) el cual ha mostrado potencial toxicidad en los herbívoros (Calderon et al., 2003). A partir de la fracción en diclorometano de H. fascicularis se registraron el β-sitosterol (b), 4´,5,7-trihidroxi-6,8-dimetilisoflavona (c) y ácido
(3E,6S)-6- [(1R,5Z,3aS,9R,10Z,12aR)-1,2,3,3a,4,7,8,9,12,12a-decahidro-9-hidroxi-3a-6,10-trimetilciclopentamocicloundecano-1-il]-2-metil-hept-2-enoico (d). O HO HO OH OH O CN OH Taxyphyllin a. HO -sitosterol b.
25 CH3 HO H3C OH O O OH 4´,5,7-trihidroxi-6,8-dimetilisoflavona c. HO COOH ácido sesterterpenoico d.
Figura 2. Compuestos aisladas de H. fascicularis
2.2.2 Henriettella trachyphylla Triana.
La especie de H. trachyphylla se caracteriza por árboles 4-5 m de altura; ramas y pecíolos densa a moderadamente verrucoso-hirsutos, hojas elípticas a elíptico-obovadas, flores densamente estrigosos, pétalos ovados, glabros en ambas superficies, blancos (Tropicos.org. 2012).
El fraccionamiento guiado por bioensayos del extracto en i-PrOH–agua (65:35) de H. trachyphylla sugieren la presencia de isoflavonas y flavonas (Isaza y Jiménez, 2005).
2.2.2.1 Indicios de actividad alelopática de Henriettella trachyphylla Triana
Estudios realizados de actividad alelopática del extractos en i-PrOH-agua (65:35) y fracciones de las hojas de H. trachyphylla, mostraron un efecto inhibidor de crecimiento de acción en hipocótilo, se debe a la presencia de compuestos con acción pesticida y se evidencia un efecto promotor en epicótilo, esto sugiere que los compuestos presentes en H. trachyphylla son potenciales de crecimiento, y sus productos de degradación actúan como fitohormonas (Isaza et al., 2005).
2.2.2.2 Indicios de actividad antibacteriana de Henriettella trachyphylla Triana
No se han encontrado estudios pertinentes en cuanto a la evaluación de la actividad antibacteriana sobre H. trachyphylla.
2.3 Aleloquímicos
Los aleloquímicos son en gran parte clasificados como metabolitos secundarios de lasplantas, que juegan un papel importante en interacciones o defensas en las plantas y en mecanismos ecológicos. Los aleloquímicos están presentes prácticamente en todos los tejidos vegetales, incluyendo hojas, flores, frutos, tallos, raíces, rizomas, las semilla y el polen. Pueden ser liberados de las plantas al medio ambiente a través de
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volatilización, lixiviación, exudación de las raíces, y la descomposición de residuos vegetales (An, 2003).
La producción de aleloquímicos en plantas vivas se ve afectada por: factores abióticos, como alta temperatura, modificación en la calidad de luz, características del suelo (pH, estructura, estado de los nutrientes, textura, presencia de contaminantes), la altitud y latitud, factores bióticos, como agentes patógenos, plagas, parásitos o herbívoros. Sin embargo, los efectos de las interacciones planta-planta son menos conocidos (Rivoal et al., 2011).
Con los años se ha demostrado que las plantas producen sustancias con propiedades químicas alelopáticas que afectan a algunas especies de plantas. Estas sustancias se distribuyen en diferentes partes de la planta, durante su ciclo de vida.
Cuando estas sustancias se liberan en cantidades suficientes, tienen efectos alelopáticos que se puede observar en la germinación, crecimiento y/o el desarrollo de la plantas. Los principales agentes alelopáticos son metabolitos secundarios de naturaleza química muy variada. A medida que avanza las investigaciones en el tema se incorporan nuevos grupos de sustancias a las cuales no se les atribuía esta actividad biológica. Se conocen alrededor de 10.000 metabolitos secundarios con acción alelopática como esteroides, ácidos grasos de cadenas largas, lactonas, flavonoides, cumarinas, naftoquinonas, antraquinonas, fenoles simples, taninos, terpenoides, aminoácidos (Santos, 2007; Vyvyan, 2008).
El efecto alelopático que puede tener una planta sobre otra, puede clasificarse como positivo, cuando estimula el crecimiento normal; negativo, cuando se inhibe el crecimiento o nulo, cuando los aleloquímicos no tienen ningún efecto sobre el desarrollo de la planta; dichos efectos dependen del comportamiento de cada aceptor frente al aleloquímico y de las propiedades tanto del aceptor como del aleloquímico (Krautmann et al, 2001; Waller et al, 1992).
2.3.1 Aleloquímicos como herbicidas naturales
Se denominan aleloquímicos a los herbicidas naturales obtenidos de diversas fuentes vegetales. La obtención de estos agroquímicos basados en fuentes naturales son atractivos por varias razones. Primero, la mayoría de ellos son solubles en agua, y como resultado, es posible que sean activos a muy bajas concentraciones, reduciendo su presencia en el ambiente. Los productos naturales tienen relativamente vida media corta. Algunos productos naturales son explotados comercialmente como son los herbicidas derivados de las tricetonas (Sampietro, 2008; Lopes et al., 2009).
Es importante señalar que los herbicidas sintéticos de amplio espectro, que son los más comerciales, además de controlar las arvenses influyen negativamente en la salud de los seres vivos, deterioran las fuentes hídricas y el suelo, puesto que muchos de ellos, por sus características físico-químicas son difíciles de degradar. El uso indiscriminado de estas sustancias ha generado efectos tóxicos en las comunidades aledañas a los cultivos,
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por lo cual se deben plantear nuevas alternativas de control (Nivia, 2000; Cuenca et al., 2004).
Los extractos vegetales con propiedades alelopáticas son de fácil degradación en el control de las arvenses y se pueden obtener de tal manera que sean selectivos dentro de los cultivos, lo cual regula las cantidades demandadas por el mismo. La importancia de avanzar en el estudio de la actividad alelopática de extractos vegetales, se manifiesta en la disminución de los costos de mantenimiento de los cultivos y en la reducción del impacto ambiental que causa el uso de herbicidas(Macías et al.,2000).
Las estrategias alelopáticas apuntan a la reducción de la polución ambiental y a mantener un balance ecológico en la flora y la fauna, con la disminución en el uso de pesticidas (insecticidas, fungicidas, nematicidas y herbicidas) sustituyendo estos por compuestos naturales (plantas y microorganismos); los aleloquímicos y fitoquímicos están libres de todos estos problemas asociados con la presencia de pesticidas. Por esto la alelopatía es un área prioritaria de investigación en la mayoría de los países del mundo (Min et al., 1997).
2.3.2 Germinación
Durante las dos últimas décadas, la ciencia de la alelopatía ha atraído un gran número de investigadores. Esto ha sido en gran medida, por las perspectivas de que la alelopatía es válida en la agricultura y la calidad en la producción de alimentos para humanos. En reducir los daños ambientales por la dependencia a los herbicidas sintéticos y los riesgos generados, en ocasiones por contaminación cruzada a otros cultivos y ríos cercanos en áreas de actividad agrícola (An et al., 2003).
Compuestos que inhiben la germinación son llamados fitotóxicos, producidos por plantas que tienen relación específica e inter-específica para la competición por nutrientes del medio. La búsqueda de aleloquímicos es un campo de investigación creciente, en relación a que dichos compuestos pueden ser desarrollados como herbicidas en la agricultura. Uno de los bioensayos más comunes para aleloquímicos es usar semillas de lechuga (Lactuca sativa L.) en la prueba de germinación en cajas de Petri, como esta es generalmente una especie sensible a los aleloquímicos, es de fácil adquisición y su germinación es rápida y uniforme. El aislamiento de los compuestos bioactivos es usualmente a partir del fraccionamiento de un extracto.
Para que el proceso de germinación ocurra es necesario que la semilla pase por tres fases (Jean-Yves et al., 2006) la fase de hidratación, la fase de germinación y la fase de crecimiento. La fase de hidratación, es donde todos los tejidos internos absorben agua y la semilla aumenta su proceso respiratorio. En la fase de germinación, se producen transformaciones bioquímicas y fisiológicas internas y se reduce el consumo de agua; dentro de esta fase se encuentran cuatro etapas como se ilustra en la (Fig. 3), desde el brote de la radícula hasta la formación de la primera hoja.
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Figura 3. Etapas de la germinación en dicotiledóneas (Jean-Yves et al., 2006).
La última es la fase de crecimiento en la cual se reactiva la absorción del agua, el proceso respiratorio y la fotosíntesis, (Jean-Yves et al., 2006). Las fases mencionadas anteriormente, son necesarias para la germinación de la semilla, y cuando se alteran, las semillas pueden impermeabilizarse, evitando la entrada de sustancias, (Bradford, 1995) o por el contrario, pueden absorber gran cantidad de agua, evitando su germinación (Zalacain et al., 2005).
La germinación puede ser afectada por sustancias aleloquímicas, que la inhiben o la favorecen. Entre las sustancias que inhiben la germinación, podemos encontrar los alcaloides y coumarinas, porque interfieren en los procesos respiratorios, retardando el desarrollo de la planta (Luzzet et al., 2004). Mientras que en el grupo de sustancias que favorecen la germinación, los lupanos triterpénicos estimulan la actividad germinativa (Macía et al., 1999). Por otra parte, la germinación de las semillas y su desarrollo rápido está determinada por factores intrínsecos y extrínsecos; los intrínsecos son aquellos referentes a la madurez y la viabilidad de las semillas (García et al., 2001). Esta viabilidad depende de variaciones genéticas y determinan para una especie que algunas variedades pueden adaptarse mejor a unas condiciones que a otras (Moreno et al., 2001). Mientras que, los factores extrínsecos están determinados por las condiciones ambientales, como la temperatura, la humedad relativa, la iluminación, entre otros;
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propiedades que pueden acelerar o retardar los procesos de crecimiento de las semillas (Bertín et al., 2011).
2.4 Actividad antibacteriana
La historia de los productos naturales bioactivos inició hace más de 100 años. En el sentido más amplio, éstos se definen usualmente como los compuestos químicos derivados y aislados de los organismos vivos de la naturaleza como las plantas, animales, microorganismos y especies marinas, sintetizados durante el metabolismo primario o secundario de los mismos ( Organization For Tropical Studies, 2012).
Por otra parte, estos componentes naturales exhiben tanto actividad antibacteriana como otra actividad en la mayoría de los casos. Esta capacidad antimicrobiana en extractos, se encuentra disponible en una serie de componentes de variadas estructuras, incluidos los de funcionalidad aldehído y fenoles. Las combinaciones naturales de estos compuestos son a menudo sinérgicos, dando lugar a una mayor actividad antimicrobiana en los extractos crudos que en los compuestos puros individuales.
La aceptación de la medicina natural en plantas, como una alternativa para el cuidado de la salud y la conservación de la calidad de vida para evitar la resistencia microbiana a los antibióticos ha llevado a muchos autores a investigar la actividad antibacteriana en plantas (Lou et al., 2001).
2.4.1 Descripción de bacterias empleadas
2.4.1.1 Estructura
Constan de un citoplasma y un material nuclear. Están separadas del exterior por una membrana citoplasmática, que está rodeada por una pared celular. No posee membrana nuclear, ni organelas celulares y el citoplasma está lleno de ribosomas. La membrana citoplasmática es el lugar de obtención de energía por respiración o fotosíntesis; toda la información genética del procariota se encuentra en un solo filamento de DNA. Esta molécula de DNA se presenta como una hebra circular y cerrada; su contorno mide de 0,25 mm a 3 mm. En muchas bacterias se ha encontrado DNA extra cromosómico; los cuales son moléculas pequeñas, igualmente circulares y cerradas, que se denominan plásmidos (Schiegel et al., 1997).
2.4.1.2 Escherichia coli
Escherichia coli (Fig. 4) es una de las especies bacterianas más minuciosamente estudiadas, y no solamente por sus capacidades patogénicas, sino también como sustrato y modelo de investigaciones metabólicas, genéticas, poblacionales y de diversa índole; Forma parte de la familia Enterobacteriaceae y está integrada por bacilos Gram negativos no esporulados, móviles con flagelos peritricos o inmóviles,
aerobios-30
anaerobios facultativos, capaces de crecer en agar MacConkey y en medios simples con o sin agregado de NaCl.
Son bacterias de rápido crecimiento y amplia distribución en el suelo, agua, vegetales y en gran variedad de animales.
Figura 4. Escherichia coli
Fuente: http://www.rightdiagnosis.com/phil/html/e-coli-food-poisoning/2112.html
2.4.1.3 Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa pertenece a la familia Pseudomonadaceae y es un bacilo Gram negativo aerobio con un flagelo polar. Cuando se cultiva en medios adecuados produce piocianina, un pigmento azulado no fluorescente. Muchas cepas producen también el pigmento verde fluorescente pioverdina.
Al igual que otras Pseudomonas fluorescentes, produce catalasa y oxidasa, así como amoniaco a partir de la arginina, y puede utilizar citrato como única fuente de carbono. Pseudomonas aeruginosa (Fig. 5) es un microorganismo común en el medio ambiente y puede encontrarse en las heces, el suelo, el agua y las aguas residuales. Puede proliferar en ambientes acuáticos, así como en la superficie de materias orgánicas propicias en contacto con el agua.
Figura 5. Pseudomonas aeruginosa
31 2.4.2 Descripción de antibióticos empleados
2.4.2.1 Amoxicilina
La amoxicilina (Fig. 6) es un antibiótico semisintético derivado de la penicilina. Se trata de una amino penicilina. Actúa contra un amplio espectro de microorganismos, tanto Gram positivos como Gram negativos. Por esto se emplea a menudo como primer remedio en infecciones de diferente gravedad, tanto en medicina humana como también en veterinaria. Se utiliza por vía oral o parenteral, aunque la forma parenteral (intramuscular ointravenosa) no está aprobada en todos los países debido a su comprobado daño al sistema auditivo y renal, causando en algunos casos sordera.
Como las demás penicilinas la amoxicilina impide en las bacterias la correcta formación de las paredes celulares. Concretamente inhibe la conexión entre las cadenas peptidoglicáneas lineares que forman la mayor parte de las paredes de los microorganismos Gram positivos. Al impedir que la pared celular se construya correctamente, la amoxicilina ocasiona, en último término, la lisis de la bacteria y su muerte. HO N O NH2 H N H H O S COOH CH3 CH3 Figura 6. Amoxicilina 2.4.2.2 Ampicilina
La ampicilina (Fig. 7) es un antibiótico penicilínico semisintético, de amplio espectro y activo por vía oral. Aunque es más activo que las penicilinas naturales no estable frente a las beta-lactamasa producidas por bacterias Gram positivas o Gram negativas. La ampicilina se utiliza para el tratamiento de infecciones debidas a organismos susceptibles como la otitis media, la sinusitis y las cistitis. Debido al aumento de resistencias ya no se recomienda la ampicilina para el tratamiento de la gonorrea.
Los antibióticos beta-lactámicos como la ampicilina son bactericidas. Actúan inhibiendo la última étapa de la síntesis de la pared celular bacteriana uniéndose a unas proteínas específicas llamadas PBPs (Penicillin-Binding Proteins) localizadas en la pared celular. Al impedir que la pared celular se construya correctamente, la ampicilina ocasiona, en último término, la lisis de la bacteria y su muerte.
32 NH2 NH N H O S CH 3 CH3 O OH O Figura 7. Ampicilina
2.5 Cromatografía Líquida de Alta Eficiencia (HPLC)
La cromatografía es un método físico de separación basado en la distribución de los componentes de una mezcla entre dos fases inmiscibles, una fija o estacionaria y otra móvil. En la cromatografía líquida, la fase móvil es un líquido que fluye a través de una columna que contiene a la fase fija.
La cromatografía líquida “clásica” se lleva a cabo en una columna generalmente de vidrio, la cual está rellena con la fase fija. Luego de sembrar la muestra en la parte superior, se hace fluir la fase móvil a través de la columna por efecto de la gravedad. Con el objeto de aumentar la eficiencia en las separaciones, el tamaño de las partículas de fase fija se fue disminuyendo hasta el tamaño de los micrones, lo cual generó la necesidad de utilizar altas presiones para lograr que fluya la fase móvil. De esta manera, nació la técnica de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC), que requiere de instrumental especial que permita trabajar con las altas presiones requeridas.
Para el presente estudio se utilizo esta técnica, pues en la actualidad ha llegado a ser una de las más importantes como herramienta analítica para separar y detectar compuestos químicos.
33 Figura 8. Equipo HPLC Fuente: Autor Sistema de elución Bomba Automuestreador inteligente Detector Interfase Columna Horno Software
34 3. SECCIÓN EXPERIMENTAL
3.1 Materiales y reactivos
El material de vidrio como cajas petri, cromatoplacas de sílica gel 60 F254 y en RP-18
F254s (Merck), así como reactivos DMSO grado analítico (Dimetil sulfóxido, Phyto
Technology Laboratories), Tween 20 y Glifosato comercial (648 g/L, Raundup Spectra, transorb Technology). Los medios de cultivo, como agar Mueller Hinton, agar nutritivo y caldo infusión cerebro corazón (BHI), se encuentran en el laboratorio del grupo Polifenoles. Los medio de cultivo se prepararon según indicación del fabricante. Las cepas de microorganismos empleadas Escherichia coli (ATCC 25922) y Pseudomona aeruginosa (ATCC 27853), estaban disponibles en el laboratorio de microbiología (Escuela de Química, UTP).
3.2 Disolventes
Tanto en las separaciones cromatográficas, como en las cromatografías se utilizaron disolventes grado analítico (Merck). Para HPLC, estos se filtraron y sometieron a ultrasonido.
3.3 Equipos
Se utilizó un equipo de ultrasonido Fisher Scientific FS60H, balanza analítica OHAUS Advance, rotaevaporador Heidolph Laborota 4003-control, cámara de revelado UV Camag, incubadora Velp scientific FOC 225i y un espectrofotómetro UV/Vis Shimadzu UV-1700 PharmaSpec (laboratorio de Fitoquímica).
Para el análisis por HPLC, se empleo un equipo Jasco HPLC 2000 Plus. Sistema equipado con bomba de gradiente cuaternario PU-2089 Plus, automuestreador inteligente AS-2059 Plus, horno para columna CO-2065 Plus, columna Cromolith Performance RP-18 endcapped (100-4,6 mm), detector inteligente de arreglo de diodos MD-2015 Plus y LC Net II/ADC, controlado por el Software EZChrom Elite.
Sistema de elución isocrático con ácido fosfórico 0.05%-isopropanol (95:5), flujo 0.5 µL/min, volumen de inyección 15 µL, presión (0-250) bar, temperatura del horno 35 °C, tiempo de corrido 10 minutos.
3.4 Material vegetal
Henriettella trachyplylla Triana, se encontró disponible en el Laboratorio del grupo Polifenoles, la cual fue recolectada en la vereda Laguneta, vía Pereira-Armenia, e identificada por el Dr. Frank Almeda de la Academia de Ciencias de California.
35 3.4.1. Fracciones polares empleadas
Para este trabajo las fracciones polares se obtuvieron en investigaciones anteriores, realizando un fraccionamiento por cromatografía en columna de la fase acuosa F-1, la fase acuosa F-1 (2,2 L, 15,422 g) fue pasada por columna cromatográfica (d.i. 5 cm, 17 cm de largo) empacada con DIAION HP-20 (Mitsubishi Japón; resina de intercambio iónico), utilizándose como gradiente isopropanol-agua (0:100 ;10:90; 15:85; 20:80 ;30:70; 40:60; 50:50; 70:30; 100:0), finalizando con isopropanol-n-hexano (70:30), recogiendo 4 fracciones de 500 mL por cada etapa, para un total de 46 fracciones.
Cada fracción fue monitoreada por espectrofotometría UV a 280 nm (espectrofotómetro Génesis 10, laboratorio de análisis instrumental, UTP) midiendo en una celda de cuarzo y agua como blanco. Con base a las lecturas de absorbancia se realizó un cromatograma que permitió reunir las fracciones acorde con los picos cromatográficos y estas fueron nombradas desde F-1A hasta F-J. Las fracciones así reunidas (Fig. 9) se secaron en evaporador rotatorio (Buchi R-205, laboratorio de Fitoquímica) y monitoreadas por cromatografía en capa fina en fase normal, usando como fase estacionaria silica gel 60 (F254, Merck) y como sistema eluente n- hexano- acetato de etilo (7:3); n-hexano-acetona
(7:3) y en fase reversa (RP-18 F254s, Merck) con el sistema isopropanol-agua (60:40)
(Isaza et al., 2005).
36
Figura 9. Procedimiento de extracción de las hojas de Henriettella trachyphylla (Isaza et al., 2005).
3.5 Prueba preliminar para selección de semillas de lechuga o tomate
3.5.1 Semillas
Las semillas de lechuga (Lactuca sativa L.) y tomate (Lycopersicum esculentum Mill.) fueron compradas a Fercon Ltda, estas se mantuvieron y trataron a condiciones de laboratorio (laboratorio de Fitoquímica).
3.5.2 Agua pretratada
Se calentaron 300 mL de agua potable hasta ebullición por 5 minutos y se dejó enfriar hasta temperatura ambiente.
3.5.3 Lavado
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Figura 10. Lavado de semillas
3.5.4 Ensayo de germinación de semillas de lechuga y tomate
3.5.4.1 Germinación de semillas de lechuga y tomate en agua
Se depositaron 10 semillas de lechuga en forma radial sobre papel filtro, el cual se encuentra en una caja de petri impregnado con 5 mL de agua pretratada (Fig. 11a). El mismo procedimiento se realizó para las semillas de tomate (Fig. 11b). Los experimentos preliminares de germinación se realizaron por triplicado.
SEMILLAS DE LECHUGA EN AGUA PRETRATADA a. SEMILLAS DE TOMATE EN AGUA PRETRATADA b.
Figura 11. Germinación de semillas en agua
3.5.2.2 Germinación de semillas de lechuga y tomate en solución de DMSO
Se adicionaron 14,95 mL de H2O y 0,05 mL de DMSO sobre una hoja de papel filtro
colocada dentro de una caja de petri, para llegar así a una concentración final en DMSO del 0,33% esto con el fin de evaluar a esta concentración la actividad germinativa del DMSO para ser empleado como solubilizador de las fracciones a evaluar. Después de esto, se colocaron 10 semillas de lechuga sobre del papel (Fig. 12a). Se lleva a cabo el mismo procedimiento con las semillas de tomate (Fig. 12b). Este procedimiento se realizo por triplicado.
38 SEMILLAS DE LECHUGA EN AGUA PRETRATADA a. SEMILLAS DE TOMATE EN AGUA PRETRATADA b.
Figura 12. Germinación de semillas en DMSO
3.5.2.3 Control con glifosato
Se utilizó como control glifosato comercial a una concentración de 3,7x10-2 M. Esta se preparó disolviendo 0,7 mL de glifosato comercial en 49,3 mL de agua pretratada. Después, se adicionaron 10 semillas de lechuga sobre el papel de filtro (Fig. 13a). Se lleva a cabo el mismo procedimiento con las semillas de tomate (Fig. 13b), Este procedimiento se realizó por triplicado.
SEMILLAS DE LECHUGA EN AGUA PRETRATADA a. SEMILLAS DE TOMATE EN AGUA PRETRATADA b.
Figura 13. Control con glifosato
Después de tener las semillas en caja Petri para su germinación en agua, DMSO y glifosato se dejaron germinar durante 5 días (120 horas) a condiciones ambiente del laboratorio y privadas de la luz solar.
39 3.6 Ensayo de germinación para semillas de lechuga frente a las fracciones F1-C, F1-D y F1-F
3.6.1 Esterilización de las semillas
Las semillas de lechuga se esterilizaron en una solución al 5% (v/v) de hipoclorito de sodio durante 15 minutos, y se enjuagaron por cuatro veces con agua destilada estéril (Fig.14).
lavar con H2O
Semillas con hipoclorito al 5 %
Agua pretratada
Figura 14. Esterilización de semillas de Lechuga
3.6.2 Preparación de las fracciones
Se prepararon las soluciones de cada fracción a concentraciones de 0,05 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,5 mg/mL, y 0,8 mg/mL en metanol (Kato-Noguchi et al., 2005).
3.6.3 Germinación
Las soluciones preparadas a concentraciones de 0,05 mg/mL, 0,1 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,8 mg/mL. Se adicionaron sobre dos hojas de papel filtro colocadas dentro de una caja de Petri. Posterior a esto se mantuvieron en cámara de flujo laminar 25 °C hasta sequedad. Luego se adiciono a cada caja de Petri 4 mL de Tween 20 al 0.05%. El Tween 20 es utilizado a concentraciones menores de 0,05% en volumen en ensayos de actividad alelopática, sin que se presente alguna acción inhibitoria o promotora de germinación sobre las semillas de prueba. Por último se procedió a colocar 15 semillas bien distribuidas por caja, estas se dejaron en oscuridad por 36 horas a temperatura ambiente. Este ensayo se realizo por triplicado. Después de esto se contaron las semillas germinadas y se tomó el registro para su análisis posterior (Kato-Noguchi et al., 2005).
3.6.4 Toma de datos y análisis estadístico
Los resultados obtenidos a partir de las semillas germinadas por horas se reportan en las tablas de los anexos 1 y 2. Los datos obtenidos de las semillas germinadas se representan mediante signo positivo (+), las semillas que no germinan por signo negativo (-) y el
