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UNIVERSIDAD NACIONAL DE TRUJILLO ESCUELA DE POSGRADO
UNIDAD DE POSGRADO EN FARMACIA Y BIOQUÍMICA
Actividad antimicrobiana y sus metabolitos bioactivos de partes aéreas de Momordica charantia L.
TESIS
PARA OPTAR EL GRADO ACADÉMICO DE
DOCTOR EN FARMACIA Y BIOQUÍMICA
Autor: Ms. Villarreal La Torre, Víctor Eduardo
Asesor: Dr. Sagástegui Guarniz, William Antonio
TRUJILLO – PERÚ 2022
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JURADO DICTAMINADOR
Dr. RUIZ REYES Segundo Guillermo PRESIDENTE
Dr. VENEGAS CASANOVA Edmundo Arturo SECRETARIO
Dr. SAGÁSTEGUI GUARNIZ William Antonio ASESOR
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DEDICATORIA
A mis padres y hermanos
A mi querida esposa
A mi asesor
Villarreal La Torre, Víctor Eduardo
Willfredo, Amalia, Luis, David yMariagracia. Quienes me guían y me ha dado las fuerzas para continuar en este proceso, lograr metas y anhelos más deseados.
Claudia Narro. Por todo el esfuerzo y dedicación que involucra soportarme, por enseñarme a nunca rendirme, ser perseverante y afrontar conmigo los obstáculos que son parte de la vida, eres la persona a la que más valoro. Te amo.
William Sagástegui por todo su tiempo, apoyo, paciencia y orientación brindado para el logro de este trabajo de investigación.
Carmen, Abhel y Cinthya, por brindar, más que tiempo y apoyo, su amistad.
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AGRADECIMIENTO
A todos los que de alguna u otra forma, ayudaron al desarrollo de este trabajo, a mi asesor, Dr. William Sagástegui Guarniz, por su tiempo y dedicación, a Carmen, Abhel y Cinthya, por todos los esfuerzos y ayudas brindadas, a Claudia, mi esposa, por su tiempo y amor.
En especial a ti, estimado lector, por leer esta tesis en busca de conocimiento.
Villarreal La Torre, Víctor Eduardo
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PRESENTACIÓN
SEÑORES MIEMBROS DEL JURADO DICTAMINADOR:
De conformidad con las disposiciones legales y vigentes del reglamento de grados y títulos de la Universidad Nacional de Trujillo, me es grato someter a vuestra consideración y elevado criterio el presente informe de tesis intitulado:
“Actividad antimicrobiana y sus metabolitos bioactivos de partes aéreas de Momordica charantia L.”
Es propicia esta oportunidad para manifestar mi más sincero reconocimiento y agradecimiento a nuestra alma mater y toda su plana docente, por su meritoria labor de educadores en la formación de profesionales altamente capacitados y de gran valor humano.
Dejo a vuestra consideración señores miembros del jurado, la respectiva calificación del presente informe de investigación científica y de antemano muy agradecido por el tiempo brindado.
Trujillo, agosto de 2022
VILLARREAL LA TORRE Víctor Eduardo Candidato a Doctor
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ÍNDICE
JURADO DICTAMINADOR ... ii
DEDICATORIA ... iii
AGRADECIMIENTO ... ivv
PRESENTACIÓN ... v
ÍNDICE ... vii
RESUMEN ... vii
ABSTRACT ... viii
I. INTRODUCCIÓN ... 1
II. MATERIAL Y MÉTODO ... 5
1. MATERIAL Y EQUIPOS ... 5
2. MÉTODO ... 6
III. RESULTADOS ... 11
IV. DISCUSIÓN ... 17
V. CONCLUSIONES ... 22
VI. RECOMENDACIONES ... 23
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ... 24
ANEXOS ... 30
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RESUMEN
Momordica charantia es una especie vegetal cada vez más estudiada debido a las diversas actividades que se le atribuyen. Las actividades antimicrobianas que se le atribuyen cada día son más consolidadas debido al incremento de publicaciones, siendo la actividad antibacteriana la más investigada, seguida de la actividad antifúngica; sin embargo, no se ha identificado aún los metabolitos responsables de dichas actividades. Es por lo que se ha realizado este estudio a partir de diferentes extractos de hojas, flores, frutos y semillas de esta planta para determinar en cuál de ellos se encuentran los metabolitos responsables de la actividad antimicrobiana, utilizando solventes como cloroformo, acetona, metanol y etanol, individualmente, y su actividad antimicrobiana contra S. aureus, P. aeruginosa y C.
albicans, por la técnica de microdilución en placas de 96 pocillos, encontrando un CIM de 2mg/mL contra S. aureus y C. albicans del extracto acetónico. Se fraccionó este último extracto, y se encontró actividad contra C. albicans con una CIM de 0,25 mg/mL en las fracciones F1 y F2, por lo que se realizó un análisis exploratorio UPLC-MS/MS a fin de encontrar los metabolitos presentes, encontrando Charantoside V, Charantoside VI, Chlorogenic acid, Cucurbitadienol, Kuguacin M, Momordicoside F1, Momordicoside G y Vicine entre ambas fracciones. Mediante técnicas quimioinformáticas, se determinó que los Momordicosidos F1 y G son las más activa contra Exo-beta-1,3-glucanasa, sin embargo, tienen una eficiencia de enlace de -0,209, por lo que no podrían ser considerados compuestos candidato a fármaco antifúngico, sin embargo, es necesario continuar con las investigaciones debido a que, tras el análisis realizado, las estructuras de naturaleza triterpénica como cucurbitano podrían ser candidatos como precursores de sustancias antifúngicas.
Palabras clave: Antimicrobiano, Triterpenoides, Momordica charantia, UPLC-MS/MS, in silico.
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ABSTRACT
Momordica charantia is a plant species increasingly studied due to the various activities attributed to it. The antimicrobial activities attributed to it are becoming more consolidated every day due to the increase in publications, with antibacterial activity being the most investigated, followed by antifungal activity; however, the metabolites responsible for these activities have not identified yet. That is why this study has carried out from different extracts of leaves, flowers, fruits, and seeds of this plant to determine which of them found metabolites responsible for the antimicrobial activity, using solvents such as chloroform, acetone, methanol, and ethanol, individually, and its antimicrobial activity against S. aureus, P. aeruginosa, and C. albicans, by the microdilution technique in 96-well plates, finding a MIC of 2mg/mL against S. aureus and C. albicans from the acetone extract. This last extract was fractionated, and activity against C. albicans was found with a MIC of 0.25 mg/mL in fractions F1 and F2, for which was performed an exploratory UPLC-MS/MS analysis to find the metabolites present, finding Charantoside V, Charantoside VI, Chlorogenic acid, Cucurbitadienol, Kuguacin M, Momordicoside F1, Momordicoside G and Vicine between both fractions. Through chemoinformatic techniques was determined that Momordicosides F1 and G are the most active against Exo-beta-1,3-glucanase; however, they have a binding efficiency of -0.209, so they could not be considered antifungal drug candidate compounds;
however, it is necessary to continue with the investigations because, after the analysis carried out, the structures of a triterpene nature such as cucurbitane could be candidates as precursors of antifungal substances.
Keywords: Antimicrobial, Triterpenoids, Momordica charantia, UPLC-MS/MS, in silico.
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I. INTRODUCCIÓN
Las plantas siempre han sido una parte muy importante para el desarrollo de la civilización, siendo las de uso medicinal, de gran relevancia para el avance de la industria farmacéutica (1). Técnicamente, todas las plantas medicinales han aportado metabolitos precursores de utilidad para la síntesis de los medicamentos de uso en la actualidad, habiendo sido muchos de ellos modificados estructuralmente para optimizar sus propiedades terapéuticas (2,3), una labor que viene siendo realizada hasta la actualidad (4). Momordica charantia, es una planta que ha despertado el interés investigativo en los últimos años por sus relevantes propiedades antidiabéticas, antimicrobianas y anticancerígenas (5–10).
La actividad antimicrobiana de M. Charantia es una de las propiedades biológicas que en la actualidad despierta gran interés, debido a la resistencia bacteriana como uno de principales problemas a nivel mundial. En un ensayo publicado en la revista “PLOS Medicine”, un ensayo donde mencionan que para el año 2050 la resistencia bacteriana podría ser la causante de innumerables muertes alrededor del mundo (11) y es que, el mal uso de antimicrobianos es uno de los causantes de múltiples mecanismos de resistencia microbiana (12,13). La resistencia a los antimicrobianos está aumentando en todo el mundo a niveles peligrosos, principalmente en países como el nuestro, donde se puede adquirir antibióticos sin receta médica para uso humano o veterinario.
La Organización Mundial de la Salud (OMS) encabeza una lucha prioritaria contra la resistencia a los antibióticos. La Asamblea Mundial de la Salud aprobó en mayo de 2015 un plan de acción mundial sobre la resistencia a los antimicrobianos, sin embargo, también está en las manos de los investigadores el desarrollar y encontrar nuevas fuentes de antimicrobianos capaces de hacer frente a los microorganismos fármacorresistentes, siendo las plantas medicinales una fuente de agentes antimicrobianos que pueden ser usados con eficacia (14,15).
Muchos extractos vegetales han sido evaluados no únicamente como agentes antimicrobianos sino también como agentes modificadores de la resistencia, se evaluaron las fracciones de los extractos vegetales y los metabolitos aislados sin modificación alguna, así como también modificados químicamente y/o acoplados a nanopartículas; varios compuestos han mostrado efecto contra bacterias, realizando la actividad específica antibiótica, revertiendo la resistencia natural específica de la bacteria, promoviendo la
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eliminación de plásmidos, e inhibiendo las bombas de eflujo que expulsan el antibiótico del citoplasma bacteriano (16–19).
M. charantia (Cucurbitaceae), conocida comúnmente como “papayilla”, “melón amargo” o
“balsamina” (20,21), es una planta de sabor amargo, subtropical, originaria de la India e introducida en América (22,23). Varios flavonoides con actividades biológicas y farmacológicas han sido identificados en M. charantia, así como esteroides (charantin), terpenoides (cucurbitan) y la proteína MAP30 que han mostrado controlar efectivamente los niveles de azúcares en la sangre, actividad anti-VIH e insecticida, respectivamente (2,17,24).
Momordica charantia es una especie vegetal de la que se ha logrado identificar diversos metabolitos de interés farmacológico, es así como, a nivel de su raíz, Thiruvengadam et al (2014) han identificado compuestos fenólicos y flavonoides como quercetina y rutina, y Chen et al (2008) y Swarma & Ravindrham (2012), terpenoides tipo cucurbitanos como la Charantin (25–27). Otros autores como Bukhari et al (2019), Cuong et al (2018), Panlilio et al (2012) y Svobodova et al (2016), realizaron la identificación de compuestos fenólicos y flavonoides en hojas y tallos, encontrándose estos mucho más complejos y en mayor abundancia en relación a la raíz, a su vez, Panlilio et al (2012), Wang et al (2017) y Zhao et al (2014) identificaron terpenoides tipo cucurbitanos en las hojas tallos de esta planta, identificando, al igual que en la raíz, la presencia de Charantin; además de ello, Ajitha et al (2015) identificó taninos y alcaloides en las hojas de esta planta (8,18,21,28–31). Cuong et al, en el año 2018, realizó la identificación solo de flavonoides en las flores de M. charantia, existiendo un gran vacío en la identificación de metabolitos de esta parte de la planta (8).
Joseph & Jini (2013), Okabe et al (1982), Patel et al (2010), Perez et al (2014), Perez et al (2019) y Upadhyay et al (2015), han identificado diversos terpenoides tipo cucurbitanos dentro del fruto de M. charantia, en cantidades más abundantes y tipos más diversos, incluyendo tipos identificados tanto en hojas como raíz, Perez et al (2019) a su vez, ha realizado un screening de identificación de compuestos fenólicos, mas no ha identificado ninguna estructura de naturaleza flavónica dentro de esta parte de la planta (32–37). Las semillas de M. charantia también han sido estudiadas y en esta parte de la planta Makhija et al (2011) ha identificado el alcaloide Vicine, mientras que Cuong et al (2018), Horax et al (2005) han identificado compuestos fenólicos simples, pero ninguno de los compuesto era de estructura flavónica, por otro lado, Miyahara et al (1981), Okabe et al (1980) y Popovich et al (2010) identificaron terpenoides tipo cucurbitanos en bajas cantidades dentro de esta parte de M. charantia en relación a otras partes de la especie (8,38–42). La presencia de
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ácidos grasos saturados e insaturados también han sido reportados en las semillas (16,43–
45).
Lu et al (2011) reporta que la concentración inhibitoria mínima (CIM) del extracto metanólico de las hojas es de 10 mg/mL contra Escherichia coli y Staphylococcus aureus bajo el método de placa de copa, mientras que Leelaprakash et al (2011) reporta CIM de 100 mg/mL contra E. coli, Pseudomonas aeruginosa, Bacillus subtilis y Klebsiella pneumonia bajo el método de discos de difusión (1,46); Guarniz et al (2019) reporta que el extracto etanólico de las hojas tiene un CIM de 125 µg/mL contra S. aureus bajo el método de microdilución (47). Leelaprakash et al (2011) reporta que el extracto acuoso de las hojas tiene un CIM de 100 mg/mL contra E. coli, P. aeruginosa, B. subtilis y K. pneumonia bajo el método de discos de difusión (1); a su vez, Bakhari et al (2019) menciona que, bajo el método de difusión en disco, el extracto acetónico de hojas tiene un CIM de 2 µg/mL contra P. aeruginosa de 3 µg/mL contra S. aureus (18).
Saengsai et al (2015), utilizando el método de difusión en disco, encontró que el extracto de tallo, obtenido por fluidos supercríticos, tiene un CIM de 250 µg/mL contra Enterococcus faecalis y de 125 µg/mL contra B. subtilis (48).
Mahmood et al (2012) encontró que, utilizando el método de difusión en disco, el extracto percolado de frutos de M. charantia, tiene un CIM de 200 µg/mL contra B. subtilis, P.
aeruginosa y Saccharomyces cerevisiae, mientras que Yaldiz et al (2015), bajo el mismo método, determino actividad antimicrobiana del extracto etanólico de frutos contra Aspergillus niger, S. aureus, y Salmonella typhi (22,49).
Lucena Filho et al (2015), bajo el método de microdilución, determinó que el extracto etanólico de las semillas de M. charantia tiene una CIM de 3 µg/mL contra Proteus mirabilis, 7 µg/mL contra Providencia rettgeri, 15 µg/mL contra Candida parapsilosis, 31 µg/mL contra S. aureus, E. coli, Candida guillermond y Candida glabata, 62 µg/mL contra P. aeruginosa, Candida tropicallis y C. albicans, y 125 µg/mL contra Candida krusi; Braca et al (2008), bajo el mismo método, determinó que el hidrodestilado de semillas, tenía un CIM de 125 µg/mL contra S. aureus y mayor a 500 µg/mL contra E. coli y C. albicans (50,51).
La amplia variedad de compuestos en diversas partes de la planta ha originado estudios comparativos de la actividad antimicrobiana, siendo las más estudias el fruto y la semilla
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(22), las hojas, con menos estudios, también han despertado gran interés, para el estudio de sus propiedades biológicas de los metabolitos presentes en esta planta medicinal es por ello que se realizará diversos extractos y particiones con solventes de diversas polaridades tanto de hojas, tallos, frutos y semillas, las cuales serán enfrentadas a varias cepas bacterias de características múltiples y variado grados de resistencia, con el fin de encontrar el extracto de la parte vegetal que presente mejor actividad antimicrobiana, sino también los metabolitos bioactivos responsables de dicha actividad, y en futuros estudios, realizar modificaciones químicamente y mejorar su actividad, ampliando de este modo la gamma de antimicrobianos utilizados actualmente.
Ante ello, se formula el siguiente problema de investigación:
¿Cuáles son los metabolitos bioactivos causantes de la actividad antimicrobiana de las partes aéreas de Momordica charantia L.?
Hipótesis Implícita.
Objetivo General
Comparar la actividad antimicrobiana de las diversas partes aéreas de Momordica charantia L.
Objetivos Específicos
1. Determinar la actividad antimicrobiana de diferentes extractos de hojas, tallos, frutos y semillas de Momordica charantia L.
2. Identificar mediante UPLC-MS/MS las estructuras químicas de metabolitos con actividad antimicrobiana de Momordica charantia L.
3. Explicar el mecanismo de la actividad antimicrobiana por técnicas in silico.
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II. MATERIALES Y MÉTODOS Materiales
a. Material Biológico
Partes aéreas de la planta de Momordica charantia L. procedente del departamento de La Libertad; recolectadas en el mes de julio de 2019.
b. Medios de cultivo
• Agar Mueller-Hinton
• Caldo BHI
• Agar Sabouraud -Dextrosa c. Microorganismos
• Staphylococcus aureus (ATCC 6538)
• Pseudomonas aeruginosa (ATCC 9027)
• Candida albicans (ATCC 24433) d. Fármacos de referencia (Estándares)
• Ampicilina ER
• Doxiciclina ER
• Ciprofloxacino ER
• Fluconazol ER e. Reactivos
• Dimetilsulfóxido 1% en agua estéril
• Resazurina 0,01% en agua estéril f. Solventes
• Acetona, diclorometano, cloroformo, hexano, butanol, metanol y etanol g. Equipos
• Agitador magnético con calentador Nuova II.
• Balanza analítica Sartorius BP301S.
• Baño con ultrasonido Branson.
• Cámara de manchado con yodo
• Plancha de calentamiento CAT H3.1
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• Lámpara de luz ultravioleta de 254 y 366 nm.
• Sistema de purificación PLC Gilson 2250.
• Campana extractora de gases Esco Frontirer Duo™, Model EFD-4B_.
• Cabina de bioseguridad C4.
• Incubadora.
Métodos y técnicas
a. Recolección de la especie vegetal
Se realizó extractos de hojas, tallos, frutos y semillas de Momordica charantia L.
fueron recolectadas en el mes de julio 2019 en los sectores ribereños de Menocucho – La Libertad, a 310 m.s.n.m, a 8°1’25’’S, 78°50’16’’O. Luego lavadas, secadas, pulverizadas y almacenadas en frascos contenedores esmerilados ámbar para su posterior estudio.
b. Identificación botánica
Se llevó un ejemplar de la planta al Herbarium Truxillense (HUT) de la Universidad Nacional de Trujillo, para su identificación y verificación taxonómica, siendo registrada con el número HUT 59572 (Anexo 1) .
c. Procesos de extracción
Los extractos secos de las cuatro partes fueron obtenidos individualmente por el método de maceración, previamente desengrazados con hexano (52). Para las extracciones se utilizó cuatro solventes individualmente, cloroformo, acetona, metanol, etanol. A 100 gramos de polvo de droga vegetal se adicionó 500 mL de solvente manteniendo en agitación durante 72 horas, concluido el tiempo se filtró la muestra separando el solvente del sólido, adicionando a este último, nuevamente 500 mL de solvente manteniendo en agitación durante la misma cantidad de tiempo.
Posteriormente se combinó los extractos y concentró en evaporador rotativo a temperatura no superior a los 50 °C, hasta la obtención de un extracto blando, evaporando a sequedad el disolvente en estufa (53).
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d. Actividad antimicrobiana
Se utilizó el método de la microdilución en pocillo, en el que 20 µL del extracto de planta, previamente redisuelto en dimetilsulfóxido 1%, fue mezclada con 100 µL medio de cultivo líquido (caldo BHI), permitiendo concentraciones a 2048, 1024, 512, 256, 128, 64 y 32 μg/mL (ensayo por triplicado). Para este método, la CIM se define como la menor concentración capaz de inhibir el crecimiento bacteriano a una concentración de 106 UFC/mL. Las temperaturas de incubación fueron de 35 °C para bacterias y de 30 °C para hongos. El tiempo de incubación fue de 24 horas para bacterias y de 48 horas para hongos (17,54).
Para la interpretación de resultados, se utilizó el indicador de óxido reducción (REDOX) resazurina, el cual se fundamenta en la reducción de la resazurina en resorufina por las células metabólicamente activas, produciendo un color rosa directamente proporcional a las células viables. La resazurina fue preparada al 0,01%
en agua estéril y se esterilizó por filtración en filtro jeringa de 0,2 µm x 25 mm.
Después del tiempo de incubación se agregó una alícuota (10% v/v) de la resazurina preparada y se dejó incubar por 30 minutos para observar el cambio de color. La CIM se consideró aquella concentración en la que no haya viabilidad, por lo tanto, no hay cambio de color (54,55).
e. Procesos de partición y cromatografía en capa fina (CCF)
Con cada uno de los extractos secos redisuelto en metanol, se analizaron por TLC para selección de fase móvil y realizando un proceso de separación mediante cromatografía en columna con una columna cromatográfica de 45 cm, con un diámetro de 2,5 cm, que contiene silicagel G-60, de 70-230 Mesh (Sigma-Aldrich®), usando una fase móvil de diclorometano:metanol (9:1).
De cada fracción obtenida fue analizada su actividad antimicrobiana. Las fracciones con menor CIM se analizaron por UHPLC-MS/MS.
f. Identificación de Compuestos con Actividad Antimicrobiana
Las fracciones que mejor actividad antimicrobiana presente, fueron analizadas bajo técnicas de UHPLC-MS/MS (Anexo 2).
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El análisis se realizó en un sistema Acquity UPLC, acoplado a un sistema de Quadrupolo QToF, usando una columna Waters Acquity UPLC BEH (150 x 2,1 mm, 1,7 µm), temperatura fija de 40 °C, fases móviles de agua con ácido fórmico al 0,1%
(A) y acetonitrilo con ácido fórmico al 0,1% (B), gradiente de 2% a 95% (15 min), velocidad de flujo de 0,4 mL/min y volumen de inyección de 5 μL. Condiciones de masa de alta resolución – XEVO – QToF. El modo de ionización por electropulverización (ESI) se realizó en el rango de 110-1180 Da, temperatura de fuente fija a 120 °C, temperatura de desolvatación 350 °C, flujo de gas de extracción de 500 L/h, cono de extracción de 0,5 V, voltaje capilar de 2,6 kV. El modo ESI+ se realizó en el rango de 110-1180 Da, temperatura de la fuente fija a 120 °C, temperatura de desolvatación 350 °C, flujo de gas de desolvatación 500 L/h y el voltaje capilar de 3,2 kV. La encefalina leucina se utilizó como masa de bloqueo. El instrumento fue controlado por el software Masslynx 4.1 (Waters Corporation) (47).
g. Determinación del mecanismo de la actividad antimicrobiana in silico Las moléculas aisladas de las fracciones activas fueron buscadas en la base de datos PUBCHEM y, las que no se encontraron, fueron dibujadas con el software MarvinSketch 21.18 (56), en ambos casos guardando los archivos en formato MDL SDfile. A cada una de las moléculas se le agregó los hidrógenos polares a pH fisiológico a 7.4 y se construyó la estructura 3D minimizando y optimizando la energía bajo un forcefield MMFF94, y mediante el uso del software OBABEL 3.1.1 (57), guardando cada archivo en formato MDL mol2.
Las moléculas fueron comparadas con compuestos similares que han declarado actividad antimicrobiana bajo estudios in vitro o in vivo (Anexo 3).
1. Cuantificación de Similitud estructural. La medida en que los dos compuestos comparten la misma propiedad se anota de acuerdo con la frecuencia que ambas moléculas presentan un mismo descriptor dado (58). El coeficiente T de Tanimoto (59) es un índice de uso frecuente para cuantificar la similitud y se define como:
T = [N11] / [n – N00]
donde N11 es el número de descriptores para los que ambos valores son 1 (presencia del mismo descriptor), N00 es el número de descriptores para los que ambos valores son 0 (descriptores distintos) y n es el número total de
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descriptores utilizados (60). Una computadora puede determinar rápidamente huellas digitales 2D, es por ello que, para el análisis, fue utilizado el software LiSiCA (61).
2. Preparación de ligando. Los ligandos bajo el uso del programa AutoDock Tools fueron parametrizaron (62) y guardando la estructura resultante en el formato requerido, pdbqt, para su uso con AutoDock Vina (63).
Ascosteroside y Enfumafungin sustancias con actividad sobre la Exo-beta- 1,3-glucanasa de candida albicans, fueron utilizadas como controles positivos y, por lo tanto, trabajadas bajo las mismas condiciones que los ligandos aislados.
3. Preparación de enzima target. La estructura cristalina de la Exo-beta-1,3- glucanasa de candida albicans fue obtenida de la base de datos Protein Data Bank (PDB 3N9K) (64); la molécula fue limpiada de toda molécula de agua, iones y/o ligandos con la ayuda del software PyMOL Molecular Graphics System 2.5 programs (65).
Para el correcto desarrollo del Docking molecular, la estructura proteica de la enzima seleccionada se parametrizó bajo el uso del software AutoDock Tools (62), agregando y retirando los hidrógenos polares y no polares respectivamente, y agregando las cargas de Kollman.
4. Acoplamiento molecular (Docking). El acoplamiento molecular se realizó bajo el uso del algoritmo Vina (63) basado en el algoritmo genético de Lamarkian, bajo el diseño de acoplamiento molecular dirigido y rígido.
Los residuos de aminoácidos fenilalanina 144 y fenilalanina 258 son de gran importancia para el potencial de unión al sitio activo (64); procediéndose a crear un GridBox (caja de rejilla) en el sitio catalítico identificado, cuyas coordenadas fueron: Centro de x = -3,804, Centro de y = -10,159, Centro de z = 8,856, Lado x = 12,75, Lado y = 15,0 y Lado z = 18,75; cada compuesto bioactivo identificado en Momordica charantia fue exhaustivamente analizada bajo estas condiciones y analizando 100 posibles posiciones de interacción ligando-receptor. Las posiciones de posible de acoplamiento de unión se inspeccionaron gráficamente para comprobar las interacciones
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utilizando los programas PyMOL Molecular Graphics System 2.5 programs y BIOVIA Discovery Studio (65,66).
5. Selección de actividad y conformación activa. La determinación de la conformación activa y posible actividad fue bajo los parámetros de mayor cantidad de formación de puentes de hidrógeno, interacciones totales, menor energía de afinidad e interacción con aminoácidos de interés (F144 y F258).
6. Análisis de datos.
1. Energía libre de Gibbs (ΔG°): Las reacciones energéticamente favorables demandan una ΔG° < 0, por lo tanto, proceden de manera espontánea. (67). El valor de la energía libre de Gibbs se obtuvo a través del algoritmo de Vina.
2. Constante de inhibición (Ki): Concentración necesaria de la sustancia bioactiva, en el sitio activo del receptor, capaz de inhibir o inactivar la enzima (60).
∆𝐺° = −2,303 𝑥 𝑅 𝑥 𝑇 𝑥 log (1 𝐾𝑖⁄ ) Donde:
R = Constante de los gases expresada en términos de energía T = Temperatura en grados Kelvin
Ki = Constante de inhibición
3. Eficiencia de enlace (LE): Es la cantidad de energía de enlace por átomo distinto al de hidrógeno (60).
𝐿𝐸 = ∆𝐺°/𝑛 Donde:
n = número de átomos distintos a hidrógeno.
4. Número de interacciones: Cantidad de fuerzas que se atraen o repelen entre moléculas y entre átomos (68).
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III. RESULTADOS
Del análisis antimicrobiano de las partes aéreas de M. charantia solo el extracto acetónico de las hojas secas presentó resultados positivos contra Staphylococcus aureus (ATCC 6538) y Candida albicans (ATCC 24433), dando una CIM de 2 mg/mL para hojas secas del extracto acetónico. Además, se obtuvo una CIM similar contra Staphylococcus aureus (ATCC 6538) en los extractos clorofórmicos de hojas frescas, flores y frutos verdes. Es de gran relevancia el hallazgo de la actividad contra Candida albicans (ATCC 24433) del extracto acetónico, puesto que la actividad contra S. aureus ya ha sido previamente identificada (47).
Figura 1. Cromatograma de Cromatografía líquida de ultra alta definición acoplado a ultravioleta y espectrómetro de masas (MS/MS) de las fracciones F1 y F2 de extracto acetónico de hojas de M. charantia.
230225_F1_MS_Neg
Time
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00
%
0 100
230225_F1_MS_Neg 1: ScanWave MS ES-
TIC 3.18e9 26.00
24.14
23.19 22.76
1.10
21.02
24.88
27.11
230225_F2_MS_Neg
Time
2.00 4.00 6.00 8.00 10.00 12.00 14.00 16.00 18.00 20.00 22.00 24.00 26.00 28.00
%
0 100
230225_F2_MS_Neg 1: ScanWave MS ES-
TIC 2.46e9 25.94
24.14
23.98
23.50 23.23
22.23
1.10
24.35
26.31
27.10
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Ante estos hallazgos, se realizó el fraccionamiento en columna cromatográfica del extracto acetónico de las hojas secas de M. charantia, obteniéndose 22 fracciones (Anexo 4), y a las que se determinó su actividad antifúngica contra Candida albicans (ATCC 24433) resultando activas las fracciones F1 y F2 con un CIM de 0,25 mg/mL en cada una de ellas, y encontrando picos muy similares en ellas en los espectros cromatográficos en UPLC-MS/MS tal y como se observa en la Figura 01, encontrando en ellas las estructuras Charantoside V, Charantoside VI, Chlorogenic acid, Cucurbitadienol, Kuguacin M, Momordicoside F1, Momordicoside G y Vicine mostrando los espectros de masas en las Figuras 02, 03, 04, 05 y 06.
Figura 2. Espectro de masas obteniendo m/z 305 de Vicine en fracción F1 de extracto acetónico de hojas de M. charantia.
Figura 3. Espectro de masas obteniendo m/z 425 de Cucurbitadienol en fracción F1 de extracto acetónico de hojas de M. charantia.
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Vicine y Cucurbitadienol, fueron identificados en la fracción F1 del extracto acetónico de hojas secas de M. charantia, Chlorogenic acid fue identificado en ambas fracciones, tanto en F1 como en F2, y Kuguacin M, Momordicoside F1 fueron identificados en la fracción F2. La base de datos KNApSAcK fue utilizada para la identificación de las estructuras, en esta base se puede observar que Momordicoside F1, Charantoside V, Charantoside VI y Momordicoside G, todas identificadas en M.
charantia tienen el mismo peso molecular (MW = 630g/mol) por lo que todas ellas fueron incluidas para los estudios posteriores.
Figura 4. Espectro de masas obteniendo m/z 353 de Chlorogenic acid en fracción F1 de extracto acetónico de hojas de M. charantia.
Figura 5. Espectro de masas obteniendo m/z 631 de Momordicoside F1 en fracción F2 de extracto acetónico de hojas de M. charantia.
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Figura 6. Espectro de masas obteniendo m/z 355 de Kuguacin M en Fracción F2 de extracto acetónico de hojas de M. charantia.
Debido a que las sustancias aisladas tuvieron estructura esteroidal en su mayoría, se les buscó similitud estructural contra sustancias que demostraron actividad contra Candida albicans y que estructuralmente son similares al Ergosterol tal como se observa en la Tabla 1, realizando el acoplamiento molecular en el sitio activo declarado por estas sustancias de actividad ya conocida, la Exo-beta-1,3-glucanasa de Candida albicans, encontrado los resultados que se observa en la Figura 7 y Tabla 2.
Tabla 1. Similitud estructural de los compuestos triterpénicos de M. charantia, frente a sustancias similares a Ergosterol con actividad frente a Exo-beta-1,3-glucanasa de Candida albicans. Datos obtenidos a través de software LiSiCA
Molécula Ergosterol Enfumafungin Ascosteroside Arundifungin Ergokonin A Ibrexafungerp Charantoside V 0,423077 0,610169 0,596491 0,526316 0,400000 0,441176 Charantoside VI 0,423077 0,610169 0,596491 0,526316 0,400000 0,441176 Chlorogenic acid 0,255814 0,209677 0,224138 0,175439 0,163934 0,200000 Cucurbitadienol 0,621622 0,446429 0,452830 0,553191 0,400000 0,423729 Kuguacin M 0,447368 0,333333 0,309091 0,333333 0,309091 0,316667 Momordicoside F1 0,541667 0,557377 0,654545 0,526316 0,491803 0,400000 Momordicoside G 0,541667 0,557377 0,654545 0,526316 0,491803 0,400000
Vicine 0,162791 0,203390 0,218182 0,166667 0,155172 0,193548
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Tabla 2. Energía de afinidad y número de interacciones de los compuestos de M. charantia frente a Exo-beta-1,3-glucanasa de Candida albicans. Datos obtenidos mediante la base de datos Pubchem y el programa BIOVIA Discovery Studio.
Molécula Fórmula
Energía de Afinidad
(ΔG) kcal/mol
Ki (M) LE kcal/mol/átomos (no hidrógeno)
Número de Interacciones
Totales
Aminoácidos Enlazantes Totales
Número de Puentes de Hidrógeno
Aminoácidos Enlazantes con Puentes de Hidrógeno Charantoside V C37H60O8 -9,0 2,5x10-7 -0,200 9 ASP227, TYR255, ALA229, ASN146,
ASP145, LEU304, PHE258 4 ASN146, ASP145,
LEU304 Charantoside VI C37H60O8 -9,0 2,5x10-7 -0,200 9 ASP227, ALA229, ASN305, ASP145,
LEU304, ASN146, PHE258, TYR255 4 ASN305, ASP145, LEU304, ASN146 Chlorogenic acid C16H18O9 -8,9 2,96x10-7 -0,356 12 GLU192, PHE258, PHE144, ASP145,
ASN305, ARG312, TYR153, ARG309 9
GLU192, ASP145, ASN305, ARG312, TYR153, ARG309 Cucurbitadienol C30H50O -9,2 1,78x10-7 -0,297 11 PHE258, LEU194, GLU262, TYR255,
PHE144 2 TYR255, GLU262
Kuguacin M C22H28O4 -9,2 1,78x10-7 -0,354 4 PHE144, PHE258, ARG312, TYR317 2 TYR317, ARG312
Momordicoside F1 C37H60O8 -9,4 1,27x10-7 -0,209 9 PHE258, PHE144, LEU304, ASN146,
GLU27, GLU192, TYR255, HIS254, TRP277 5
LEU304, ASN146, GLU27, GLU192,
TYR255 Momordicoside G C37H60O8 -9,4 1,27x10-7 -0,209 11 PHE258, PHE144, GLU192, GLU27,
ASN146, TYR255, HIS254, TRP277 6 GLU192, GLU27, ASN146, TYR255
Vicine C10H16N4O7 -8,5 5,82x10-7 -0,405 13 SER292, GLU192, ASN305, ASP145,
ASN146, GLU27, TYR29, TRP363 9
TYR29, GLU27, ASP145, ASN305,
GLU192
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Figura 7. Interacción de los compuestos triterpénicos de M. charantia frente a Exo-beta-1,3-glucanasa de Candida albicans en formato 2D. Notas: A). Charantoside V; B). Charantoside VI; C). Chlorogenic acid; D). Cucurbitadienol; E). Kuguacin M; F). Momordicoside F1;
G). Momordicoside G; H). Vicine. Fuente: Programa BIOVIA Discovery Studio.
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IV. DISCUSIÓN
La actividad antimicrobiana de M. charantia es cada vez más investigada (69), sin embargo, no se ha determinado los metabolitos responsables de esa actividad antimicrobiana y/o antifúngica. Aunque la actividad antibacteriana frente a S. aureus ya ha sido reportada (47), la actividad antifúngica aún sigue en estudio. En las fracciones identificadas como activas contra C. albicans se logró identificas 8 posibles compuestos entre ambas (Figura 1). Los espectros de masas fueron comparados con compuestos previamente identificados usando la base de datos KNApSAcK, base de datos cuya última actualización a la fecha de uso es de febrero 2022.
Vicine, compuesto identificado en la fracción F1 (Figura 2), es un compuesto previamente aislado de frutos y tallos de M. charantia (69), es un compuesto que ha sido relacionado con la actividad antidiabética de M. charantia (70), muy probablemente por su similitud estructural a los carbohidratos, puesto que su actividad está relacionada a la inhibición de la α- glucosidasa (71).
Cucurbitadienol, compuesto identificado en la fracción F1 (Figura 3), es un compuesto previamente aislado de hojas de M. charantia (72), y actualmente ha sido relacionado con actividad sobre SARS-CoV-2 en modelos in silico (73).
Ácido clorogénico, compuesto identificado en ambas fracciones (Figura 4), es un compuesto fenólico previamente identificado en hojas de M. charantia (74).
Charantoside V, Charantoside VI, Momordicoside F1 y Momordicoside G, compuestos con un mismo peso molecular identificado en la fracción F2 (Figura 5), son compuestos previamente identificados en hojas y frutas de M. charantia (30,75), siendo relacionados con actividades antidiabéticas.
Kuguacin M, compuesto identificado en la fracción F2 (Figura 6), es un compuesto previamente identificado en hojas de M. charantia (76), y ha sido relacionado con actividades antidiabéticas, antivirales y anticancerígenas (77).
Diversos compuestos, como la Kuguacin J, han sido reportados como inhibidores de la glicoproteína P, aumentado la actividad de aminoglucósidos (17), y aunque no ha sido identificada esta sustancia, se ha logrado identificar Kuguacin M en la fracción F2 de extracto acetónico (activo), el cual guarda una relación estructural a Kuguacin J, y que análisis quimioinformáticos en pkCSM, indican inhibición de glicoproteína
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P de tipo I (78), lo que demuestra un sinergismo o incremento de la potencia antimicrobiana de los aminoglucósidos.
Las fracciones activas frente a C. albicans encontradas en el presente estudio contienen diversos compuestos triterpenoides con estructura similar al Ergosterol, encontrando que los Momordicoside F1 y G son los compuestos con mayor similitud (Tabla 1) con un 54,1667%, el resto de las moléculas tienen un nivel de similitud importante, a excepción del ácido clorogénico y la vicina. La semejanza estructural al ergosterol explica la facilidad de la estructura para atravesar las membranas e inhibir a la glicoproteína P, gracias a la alta lipofilicidad de las estructuras que varía entre 3 a 7, permitiría mayor paso a través de membranas (79,80). Esta alta lipofilicidad de la sustancia hace que Cucurbitadienol incumpla con una de las reglas de Lipinski (LogP < 5), por lo que la Cucurbitadienol podría mantener una absorción oral (81), a diferencia de Vicina (Figura 2 y 3), que es una molécula altamente hidrófila, con gran cantidad de aceptores y donadores de puentes de hidrógeno, incumpliendo dos de las reglas de lipinski, además de tener un LogP por debajo de - 1, impidiendo su absorción oral (81).
La similitud estructural ha sido desarrollada bajo el coeficiente de Tanimoto (60), este coeficiente es una relación entre las porciones o grupos funcionales de las estructuras que son similares con las que no lo son, siendo este coeficiente altamente utilizado en las determinaciones quimioinformáticas (58). Tras la determinación de este coeficiente bajo el software LiSiCA (61), se puede observar que los charantosidos y momordicosidos son los que presentan la mayor similitud a las estructuras que presentan actividad contra C. albicans (Tabla 1).
Las estructuras seleccionadas para el desarrollo del coeficiente de Tanimoto, son sustancias que presentan estructura esteroidal y han declarado actividad antifúngica (82,83), las sustancias Emfumagungin, Ascosteroside, Arundigungin y Ergokonin A han demostrado actividad, mientras que Ibrexafungerp es una estructura novedosa con actividad frente a C. albicans. Todas las sustancias son activas frente a Exo-beta- 1,3-glucanasa de C. albicans, una glucanasa importante para el desarrollo de las secuencias de carbohidratos que conforman la membrana de C albicans (64).
Exo-beta-1,3-glucanasa es una enzima que ha sufrido mutación en C. albicans resistente, es por ello, que se ha emulado la enzima a partir de la estructura cristalográfica en Protein Data Bank con el código 3N9K (Anexo 4), una enzima con doble mutación (F229A/E292S) y que tiene una resolución de 1,7Å, una alta
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resolución y la más alta con la que se cuenta en PDB a la fecha (07/2022). Se ha demostrado que la entrada al sitio activo está compuesta por dos residuos de fenilalanina (F144 y F258), por lo que una interacción importante en este sitio actuaría como una inhibición total a la enzima, evitando su disposición para el cumplimiento de su actividad natural (64). Moléculas con alta afinidad y paso a través de membrana (lipofilicidad alta), como los triterpenoides de la M. charantia, son de gran probabilidad de acción en esta enzima, siendo esta, un potencial sitio de acción, tomando como base los triterpenoides de actividad demostrada (83). Por esta razón el acoplamiento molecular se realizó con esta enzima y tomando la entrada de las fenilalaninas F144 y F258 como sitio activo.
El acoplamiento molecular realizado fue determinado bajo la premisa de la energía de afinidad (Tabla 2), que es la fuerza de interacción entre un ligando y una macromolécula (receptor), que se unen de forma reversible (68). Se determinó que todos los triterpenoides de M. charantia identificados tienen las energías de afinidad más elevadas, siendo los Momordicosidos F1 y G las que presenta mayor energía de afinidad. Aunque ácido clorogénico y vicina no son moléculas lipófilas, se realizó el acoplamiento molecular, y estas tuvieron la energía de afinidad más baja (-8,9 y -8,5 respectivamente).
Sin embargo, para el acoplamiento molecular en fármacos, más que una energía de afinidad baja es importante el número de interacciones y la formación de puentes de hidrógeno (Figura 7), esto debido a que el ligando debe de permanecer el mayor tiempo posible dentro del sitio activo, por lo que una alta energía de afinidad debe de estar ligada también a un alto número de interacciones y en ácido clorogénico y vicina se observa la mayor cantidad de interacciones y puentes de hidrógeno, observando la formación de 9 puentes de hidrógeno en ambas interacciones.
Adicionalmente, observamos que los Momordicosidos F1 y G son capaces de formar 5 y 6 puentes de hidrógeno respectivamente, la cual no es tanta como en las moléculas hidrófilas pero sus energías de afinidad son de -9,4, que es bastante alta.
El docking molecular considera dos aspectos de gran relevancia adicionales, la constante de inhibición (Ki) y la eficiencia de enlace (LE). Los resultados obtenidos expresan estos valores en la tabla 2, donde observamos que la Ki de las moléculas es bastante baja, lo que es de gran importancia, ya que implica no solo que la Exo-beta- 1,3-glucanasa puede ser inhibida a baja concentración por las sustancias, sino que la
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ligando para lograr la respuesta biológica está dada por la LE, una magnitud cuantitativa que cuando es mayor a -0,4 se clasifica como buena o excelente de la respuesta, marcando los Hits y compuestos líderes valores de LE por encima de -0,41 y -0,39 respectivamente y por encima de -0,42 para compuestos en Fase II (84).
La LE es una relación de la energía de afinidad con los átomos distintos a hidrógenos que conforma la estructura química, mientras más compleja es la sustancia, menor será la LE (60). Los momordicosidos F1 y G aislados no sobrepasan de -0,25 la LE, esto impide que estos triterpenoides aislados sean tomadas como compuestos líderes, pero un análisis y simplificación estructural, puede ayudar a la búsqueda de fragmentos que mantengan la actividad y búsqueda de nuevos compuestos con actividad antifúngica. Hay que recordar que los fragmentos activos, deben de mantener un LE entre -0,1 a -0,3; y estos deben de aumentar conforme se trabajan hacia Hits y compuestos líderes (84).
Si bien es cierto que la ΔG y Ki de los compuestos fueron bastante prometedores, sobre todo en momordicosidos F1 y G, estas tienen un LE de -0,209, por lo que no podrían ser considerados compuestos candidatos a fármaco antifúngico, sin embargo, nos permite identificar a las estructuras triterpénicas como posibles nuevos compuestos antimicrobianos activos contra C. albicans. La modificación estructural de estos compuestos es de gran importancia, en primera instancia debido a que son sustancias glicosiladas y es a nivel de este grupo donde se forma la mayor cantidad de puentes de hidrógeno (Figura 7), sin embargo, el puente de oxígeno (enlace glucosídico) es altamente degradable a nivel sistémico (85) por lo que su modificación es fundamental para aumentar su tiempo de vida media. La modificación estructural de este punto puede ser similar a la modificación en las sustancias antidiabéticas inhibidores de SGLT2, donde el puente de oxígeno fue modificado por un carbono (86), más aún cuando en el docking se observa que el puente de oxígeno no mantiene interacción alguna con ningún resto aminoacídico.
Por otro lado, la vicina a pesar de ser una sustancia altamente hidrófila tiene un LE de -0,405, por lo que la modificación y aumento de lipofilia puede mejorar la actividad antifúngica de esta estructura química. Los cambios en esta molécula, como el mismo puente de oxígeno del glucósido por un carbono, aumentaría la lipofilia además del tiempo de vida de la sustancia, además del cambio del nitrógeno con hibridación sp2, lo que aumentaría la lipofilia a -1,9 y reduce las violaciones a las reglas de Lipinski a solo una.
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El tener ahora 8 compuestos identificados en M. charantia con potencial actividad antifúngica, ayuda a la determinación de fragmentos activos y la elucidación del farmacóforo triterpenoide inhibidor de Exo-beta-1,3-glucanasa, un nuevo sitio activo para fármacos antimicrobianos (82), característica que es importante para la búsqueda de cabezas de serie con actividad antimicrobiana, para su posterior optimización estructural.
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V. CONCLUSIONES
1. Se determinó que el extracto acetónico de hojas secas de Momordica charantia es activo contra Staphylococcus aureus y Candida albicans con un CIM de 2 mg/mL, los extractos clorofórmicos de frutos verdes, flores, hojas secas y de hojas frescas de Momordica charantia solo fueron activos contra Staphylococcus aureus. Las fracciones F1 y F2 del extracto acetónico de hojas secas de Momordica charantia tienen actividad potente contra Candida albicans con un CIM de 0,25 mg/mL.
2. Fueron identificadas los siguientes metabolitos en las fracciones activas F1 y F2:
Charantoside V, Charantoside VI, Chlorogenic acid, Cucurbitadienol, Kuguacin M, Momordicoside F1, Momordicoside G y Vicine, mediante UHPLC-MS/MS.
3. Del análisis in silico se infiere que la actividad antifúngica de los compuestos aislados probablemente se deba a la inhibición reversible de Exo-beta-1,3- glucanasa, siendo las moléculas Momordicosidos F1 y G las sustancias más activas de todas las aisladas, al poseer un ΔG de -9,4 y un Ki de 1,27x10-7. Sin embargo, al poseer un LE por debajo de -0,4 limita su uso como compuesto líder.
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VI. RECOMENDACIONES
Se recomienda realizar simplificaciones estructurales con la finalidad de determinar un fragmento activo a partir del cual se pueda encontrar moléculas nuevas y mucho más activas de las que se ha podido aislar de M. charantia, contra Candida albicans.
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VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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