MECANISMOS DE REGULACIÓN ENZIMÁTICA

ENZIMAS REGULADORAS ENZIMAS REGULADORAS ENZIMAS REGULADORAS Tema 13 (I) Alosterismo Alosterismo

• Enzimas que catalizan la reacción mas lenta de la ruta metabólica= etapa limitante

• Controlan toda la ruta metabólica ENZIMAS REGULADORAS ENZIMAS REGULADORAS ENZIMAS REGULADORAS

Tipo de control

a) a nivel de S b) Por retroacción (feed back)

c) Control genético

MECANISMOS DE REGULACIÓN ENZIMÁTICA

1. Control a nivel de sustrato

2. Inhibición reversible por productos (retroalimentación) 3. Control genético

4. Activación/inhibiciónalostérica(nivel celular) 5. Modificacióncovalente(supracelular):

• Reversible: fosforilación, metilación, acetilación,

ADP-ribosilación, etc.

• Irreversible: activación proteolítica

1. E alostéricas

2. E reguladas por modificación covalente Clases de enzimas reguladoras

1. Enzimas alostéricas

• Reguladas por metabolitos = “modulador” ó “efector” • Se unen al E por enlace no covalentede forma reversible • Se unen a un “sitio regulador” o centro alostérico” (distinto al centro activo)

• Etimológicamente: -”allos”= otra -”steros”= forma Enzimas alostéricas Centro alostérico Centro activo ó catalitico Centro de fijación del S

(unión del modulador)

• En ausencia de inhibidor, el sustrato se fija normalmente al centro activo

• Cuando el inhibidor ocupa el centro alostérico, tiene lugar un cambio conformacional en el centro activo que impide la fijación del sustrato

Inhibición alostérica

s

Centro activo Centro alostérico

s

i

Centro alostérico Centro activo (Jacob y Monod, 1960)

• La unión del efector ⇒cambio conformacional del E

Efector _Inhibidor:

↓_{Afinidad del E por el S} Activador:

↑Afinidad del E por el S

Enzimas Homotrópicas(modulada por el S, presentan cooperatividad de unión al S)

Enzimas Heterotrópicas(modulada por efectores y el S) Tipos de Enzimas alostéricas

HOMOALOSTERISMO

HOMOALOSTERISMO

ENZIMAS HOMOTRÓPICAS: el modulador y el sustrato

son idénticos.

HETEROALOSTERISMO

HETEROALOSTERISMO

La unión de inhibidoreso activadoresalostéricos no afecta a la Vmáx, per si altera la Km

“Bioquímica” Mathews, van Holde y Ahern. Addison Wesley 2002

+

-ENZIMAS HETEROTRÓPICAS: el modulador es distinto al sustrato. El sitio regulador es distinto del centro catalítico

Enzimas Homotrópicas

• El propio S es el modulador⇒modifica la estructura del E • Ejerce efecto positivo: >afinidad. Cooperatividad (+).

Curva sigmoidea

• Ejerce efecto negativo: <afinidad. Cooperatividad(-).

Curva hiperbólica

Tipos de Enzimas alostéricas

Rutas metabólicas controladas por retroalimentación

Glicólisis Fosfofructoquinasa ATP

Gluconeogénesis FBPasa AMP

Bios. Ács. Grasos AcetilCoA carboxilasa AcilCoA Bios. Colesterol HMGCoA reductasa Colesterol

Bios. Purinas PRPP sintetasa AMP,GMP,IMP

Ruta Enzima Inhibidor

Introducción a la regulación alostérica • Proteínas alostéricas son oligoméricas

•Eje de simetríaen la estructura espacial de los protómeros • Cada protómero posee “solamente un sitio de unión”para cada uno de los diferentes ligandos que pueden ser: S; activadores; inhibidores.

• La proteína puede existir en dos estados conformacionales R y T, siempre en equilibrio

R T

L: cte de equilibrio = [R]/[T]

• Todos los cambiosde R T son concertados. L

Un sistema alostéricoclásico es la Hemoglobina:

1. La fijación de su “sustrato”, O2, es de tipo sigmoide 2. La fijación del “sustrato” puede inhibirse por efectores

(H+_{, CO}

2, 2,3-BPG) que no actúan sobre el “Centro Ac-tivo” (grupo hemo)

3. Las subunidades, por separado, presentan cinética michaeliana en la fijación de O2

Cinéticas michaeliana y sigmoide: Mioglobina y Hemoglobina

s

0 2 4 6 8 10 12

Y

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Mioglobina Hemoglobina

Efecto del 2,3-bisfosfoglicerato (2,3-BPG) sobre la saturación de la hemoglobina

PO2, mmHg 0 20 40 60 80 100 S a tu ra c ió n d e O 2 , % 0 20 40 60 80 100 0 0.1 mM 1 mM Inhibidores y activadores alostéricos

s

0 2 4 6 8 10 12

Y

0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 (↑Inhibidor) ( ↑Activador) (sin efectores) V+ V₀ V -Aumentan la K_map Disminuyen la Kmap (+) (-) Enzimas Heterotrópicos

Tipos de Enzimas alostéricas

• El moduladoró efectorproduce un efecto + ó – sobre la afinidad del E por el S.

• Se produce cambio conformacionaldel E

inhibición [S] activación V ↓Kmap Vmáxigual Curva se transforma en hipérbola Efectores + ↑Km ap Vmáxigual Curva se transforma en sigmoidea Efectores

-+ • El moduladores distinto al S

Enzimas Heterotrópicos

Tipos de Enzimas alostéricos

• Unión del S y modulador (+)

Sitio de fijación del S

Sitio de fijación del modulador

C R

Sitio catalítico Sitio regulador

Diferentes subunidades Enzima inactivo

C R

S _M

Enzima –Sustrato activo M+ M+ V [S] K´ v Vmáx[S] n K´+ [S]n =

n= coef. de Hill. Parámetro empírico nº se sitios de unión que presenta el E para el S

K1/2 = K0,5= K´

Corresponde a la [S] que produce una

v =1/2 Vmáx

Se representa como [S0,5]nó [S1/2]n

Cinética de los Enzimas alostéricos. Ecuación de Hill E + nS E (S)n E + nP cinéticasigmoidea Reordenando la ecuación V(K´+ [S]n_{) = [S]}n_{. V} máx V Vmáx[S] n K´+ [S]n = VK´+ V[S]n_{= [S]}n_{. V} máx VK´= [S]n_{. V} máx- V [S]n VK´= [S]n_{( V} máx– V) [S]n = K´ V V_máx– V Aplicando logaritmos log V V_máx– V = n log [S] – log K´ y = bx - a

Ecuación de una recta n=pendiente - log K´ su ordenada en el origen log V Vmax – V 0 -1 +1 log[S] log[S_1/2] +1 +2 +3 -1 -2 -3 0

log[S1/2] = 0 _{n log[S]= log K´} log[S] logK´ n = = logK´1/n log[S] = log[S1/2] Pendiente= n log V Vmax– V = 0

n=1 Ec.Hill se transforma en Ec.M-M No cooperatividad V Vmax[S] K´+ [S] = Vmax[S] [S1/2]+ [S] = Vmax[S] Km+ [S] = n>1 cooperatividad + Curva sigmoidea n > 1 cooperatividad

Cinética de los Enzimas alostéricos

Enzimas Homotrópicos

-El S actúa < la afinidad del E por el S
Ec. de Hill representa cinética n<1

Existe cooperatividad pero no se obtienen curvas sigmoideas v [S] n<1 n=1 n>1 _n<1 n=1 n>1 1/v 1/[S]

Cinética de los Enzimas alostéricos Enzimas Heterotrópicos

Como el modulador es distinto al S es difícil generalizar la curva de saturación con el S Tipos de Enzimas Heterotrópicos a) Clase K

b) Clase V

• Los mas abundantes • Activador (+) hace que la curva sigmoidea se vaya aproximando a una

hipérbola(↑v de reacción para la misma [S]) • K 0,5desciende • Vmáx no se altera Enzimas Heterotrópicos Clase K Activador positivo(+) Activador negativo(+)

• Activador (-) hace que la curva sea sigmoidea pronunciada • K 0,5mayor • Vmáx no se altera Vmáx v [S] Presencia de activador(-) Presencia de activador(+) Sin modulador K0,5(+) K0,5 K0,5(-) Enzimas Heterotrópicos Clase K

Enzimas Heterotrópicos

Clase V • Menos numerosas

• Activador (+) > la Vmáx • Activador (-) < la Vmáx • K 0,5constante • Vmáx varia Presencia de activador(+) Sin modulador Presencia de activador(-) K 0,5 Vmax

Efectos alostéricos de moduladores positivo y negativo (al no ser cinética michaeliana no se puede usar el término Km, sino el K0,5)

Modulador alostérico Positivo (+): favorece la forma R

El sustrato es modulador positivo Modulador alostérico Negativo(-): favorece la forma T

( ”Lehninger Principles of Biochemistry” 3th.ed.

Nelson, DL and Cox, M.M. Worth Publishers, 2000.)

a) Modelo simétrico ó concertado

T T inactiva activa + S R R + S R R Estado T Estabilizado por Inhibidor (I) I I Estado R Estabilizado por activador (A) A A ↑ La unión de S al E ↓ La unión de S al E

Modelos que explican el comportamiento cinético de los enzimas

i

s

s

s

s

s

s

s

s

s

s

Forma R

Modelo MWC

(Monod, Wyman y Changeux)

L

i

i

i

i

i

i

i

i

i

Forma T

(Cte. de equilibrio) Enzima tetramérica a) Modelo simétrico ó concertado

b) Modelo secuencial simple = Modelo de encaje inducido T T + S R R I I Induce la fijación del S R r A

Se contemplan estados híbridos para la conformación enzimática

Modulador positivo

Modulador negativo Induce una