Estudio microbiologico del aceite extraido a partir de la crisalida de Bombyx Mori Linn hibrido pilamo 1 para su uso como materia prima en la industria cosmética

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(1)ESTUDIO MICROBIOLÓGICO DEL ACEITE EXTRAÍDO A PARTIR DE LA CRISÁLIDA DE Bombyx mori linn HIBRIDO PILAMO 1 PARA SU USO COMO MATERIA PRIMA EN LA INDUSTRIA COSMÉTICA. Presentado por: JAIRO ALBERTO AGUIRRE GALVIS LUZ ADRIANA CABRERA PATIÑO. Director: GLORIA EDITH GUERRERO. UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA FACULTAD DE TECNOLOGÍAS ESCUELA DE QUÍMICA GRUPO DE OLEOQUIMICA Pereira, 2007.

(2) ESTUDIO MICROBIOLÓGICO DEL ACEITE EXTRAÍDO A PARTIR DE LA CRISÁLIDA DE Bombyx mori linn HIBRIDO PILAMO 1 PARA SU USO COMO MATERIA PRIMA EN LA INDUSTRIA COSMÉTICA. Presentado por: JAIRO ALBERTO AGUIRRE GALVIS LUZ ADRIANA CABRERA PATIÑO. TRABAJO DE GRADO Requisito parcial para optar al titulo de tecnólogo químico. Director: GLORIA EDITH GUERRERO. UNIVERSIDAD TECNOLÓGICA DE PEREIRA FACULTAD DE TECNOLOGÍAS ESCUELA DE QUÍMICA GRUPO DE OLEOQUIMICA Pereira, 2007.

(3) NOTA DE ACEPTACIÓN DEL TRABAJO DE GRADO. ESTUDIO MICROBIOLÓGICO DEL ACEITE EXTRAÍDO A PARTIR DE LA CRISÁLIDA DE Bombyx mori linn HIBRIDO PILAMO 1 PARA SU USO COMO MATERIA PRIMA EN LA INDUSTRIA COSMÉTICA. Presentado por: Luz Adriana Cabrera Patiño Jairo Alberto Aguirre Galvis. Los suscritos directores y jurados del presente trabajo de grado, una vez revisada la versión escrita y presenciado la sustentación oral decidimos otorgar:. La nota de: __________________________________. Con la connotación de:_________________________. Para constancia firmamos en la ciudad de Pereira hoy. El director: Nombre: Gloria Edith Guerrero A.. Jurado: Nombre: Luz Stella Ramírez. Jurado: Nombre: Carolina Marín.

(4) Dedicatoria. A mis padres, que con su paciencia, entrega y amor hacen posible que culmine satisfactoriamente este periodo de mi vida, porque la vida misma encierra dificultades que solo son posibles de sobrellevar con la comprensión de quienes verdaderamente te aman. Adriana.. A mi Mami Marlen Galvis por tantas molestias en estos años de universidad y en estos 25 años de vida, la amo con todo mi ser y le agradezco con toda mi alma; a mis hermanos Jorge Andrés y Alejandro por su paciencia y por su apoyo, han sido mi inspiración y mi modelo a seguir; a mi universidad, que como academia permitió mi crecimiento intelectual; y a todos aquellos hombres y mujeres que han permitido que la ciencia avance y que la humanidad se aleje de falsos dogmas y se concentre en la verdad: La Ciencia Como Único Camino. Jairo A..

(5) AGRADECIMIENTOS A mis padres, por crear en mí la conciencia del Ser. A jairo y familia, por su amistad, su apoyo incondicional e inigualable sentido de pertenencia, su empeño y paciencia durante este tiempo. A Adriana y sus papas, por los incontables días de trabajo y dedicación a este proyecto. A todos los profesores que contribuyeron a la formación de nuestro intelecto, por compartir sus conocimientos y su sabiduría. A Gloria Edith guerrero por sus aportes intelectuales en el campo de la Sericultura, además de su sincera colaboración y confianza. Al personal administrativo de la Escuela de Química por proporcionarnos los recursos necesarios para la ejecución de este proyecto. A todos aquellos que de una u otra manera estuvieron pendientes de nuestro bienestar, de nuestros logros y de nuestro grado, gracias! A Ana Carolina Acuña, quien me apoyo incansablemente para que terminara este trabajo y me alentó e inspiro en tantos momentos. A Tomas Rodrigo Medina S. y José Reinaldo Marín B. ya que sin sus consejos me hubiese retirado de Química y no tendría el orgullo de ser Tecnólogo Químico. A los grandes hombres que han inspirado mi vida, entre ellos Lavoiser, Dalton, Gay-Lussac, Avogadro, Erwin Schrödinger, Charles Darwin, Alfred Russell Wallace, Willi Hennig, Aristarco de Samos, Nicolás Copérnico, Galileo Galilei, Johannes Kepler, Isaac Newton, Edwin Hubble y Carl Sagan.

(6) TABLA DE CONTENIDO Página. i iii iv v vi. i ii iii iv v. Índice De Tablas Índice De Graficas Índice De Figuras Resumen Abstract. 1.. Justificación. 1. 2.. Formulación Del Problema. 3. 3.. Objetivos. 4. 3.1. 3.2.. Objetivo General Objetivos Específicos.. 4 4. 4.. Marco de referencia. 5. 4.1. 4.1.1.. La Sericultura Gusano de seda Bombyx Mori Linn. 5 6. 4.1.1.1.. Taxonomia. 6. 4.1.1.2. 4.1.2. 4.1.2.1. 4.1.2.1.1. 4.1.2.1.2. 4.1.2.1.3. 4.1.2.1.4. 4.1.2.1.5. 4.1.2.2. 4.1.2.2.1. 4.1.2.2.2. 4.1.2.2.3.. Ciclo Biológico Enfermedades Del Gusano De Seda Enfermedades Por Hongos. Muscardina Blanca Muscardina Verde Muscardina Negra Muscardina Amarilla Aspergillus. Enfermedades Por Bacterias. Desmayo Bacterial. Septicemia Bacterial. Enfermedad Intestinal Por Bacteria.. 6 7 8 8 9 9 10 10 11 11 11 11. 4.2. 4.2.1. 4.2.2.. Aplicaciones Alternativas De La Sericultura. Aplicaciones medicas Aplicaciones alimenticias. 12 12 13.

(7) 4.2.3. 4.2.3.1. 4.3.. 4.3.1.. Aplicaciones industriales Aplicaciones de las proteínas del hilo de seda.. Aceite de crisálida del gusano de seda Bombyx Mori Linn. Comparación de la cantidad relativa de aceites grasos presentes en el extracto y los estudios realizados con el aceite de crisálida fresca de la raza china (LH) y el aceite de crisálida de hibrido pilamo 1.. 13 14. 15. 15. 4.4 4.4.1.. Cosméticos: Aceites y materias primas. Normalización. 16 18. 4.5.. Análisis Microbiológico como herramienta y su importancia. 19. 4.5.1. 4.5.1.1. 4.5.1.1.1. 4.5.1.1.2. 4.5.1.1.3. 4.5.1.1.4. 4.5.2. 4.5.2.1. 4.5.2.1.1. 4.5.2.2.. Crecimiento De Microorganismos. Curva De Crecimiento. Fase de latencia Fase exponencial Fase estacionaria Fase de muerte Tipos De Microorganismos. Microorganismos Mesofilos. Microorganismos Patógenos. Hongos.. 19 20 20 21 21 22 23 23 24 24. 4.5.3.. Recuento De Células Viables. 25. 4.5.4.. Medios De Cultivo.. 26. 4.5.5.. Métodos De Siembra.. 26. 4.5.5.1.. Siembra Por El Método De Extensión En Placa.. 27. 4.5.5.2.. Siembra Por El Método De Vertido En Placa.. 27. 4.5.6.. Esterilización.. 28.

(8) 4.6. 4.6.1.. Fundamentos Fisicoquímicos. Extractor Soxhlet. Eliminación De Disolventes A Presión Reducida (Rotavapor).. 28 28. 5. 5.1. 5.2.. Metodología Muestras Sacrificio. 31 31 31. 5.3.. Conservación del capullo. 32. 5.4. 5.5. 5.6. 5.7. 5.8. 5.9.. 32 32 33 33 33 33. 5.9.2.. Secado del capullo Obtención de la crisálida Secado de la crisálida Extracción del aceite Tratamiento de control microbiológico Análisis microbiológico Determinación De Microorganismos Mesófilos Aerobios Viables. Determinación De Mohos Y Levaduras.. 5.9.3.. Determinación De Staphylococcus aureus.. 35. 5.9.4. 5.9.5.. Determinación De E. coli. Control de medio. 35 35. 6 6.1. Resultados Y Discusión Caracterización microbiológica del aceite fresco Recuento de microorganismos mesófilos aerobios viables Recuento de patógenos Contaminación por manipulación humana Contaminación por contacto con materia fecal Recuento de mohos y levaduras Caracterización microbiológica del aceite sometido a calentamiento Recuento de microorganismos mesófilos aerobios viables Recuento de patógenos Contaminación por manipulación humana Contaminación por contacto con materia fecal Recuento de mohos y levaduras. 36 37. 4.6.2.. 5.9.1.. 6.1.1. 6.1.2. 6.1.2.1. 6.1.2.2. 6.1.3. 6.2. 6.2.1. 6.2.2. 6.2.2.1. 6.2.2.2. 6.2.3.. 29. 34 34. 37 38 38 38 39 40 40 41 41 41 42.

(9) 6.3. 6.3.1. 6.3.2. 6.3.3. 6.3.4. 6.3.4.1. 6.3.4.2. 6.3.5. 7. 8. 9. 10. 11. Evaluación de la estabilidad del aceite crudo y del aceite sometido a calentamiento, en un periodo de 8 semanas Estabilidad del aceite crudo Estabilidad del aceite sometido a calentamiento Estabilidad del aceite crudo contra estabilidad del aceite sometido a calentamiento Recuento de patógenos Contaminación por manipulación humana Contaminación por contacto con materia fecal Recuento de mohos y levaduras Conclusiones Recomendaciones Bibliografía Anexos Anexo 1 Anexo 2 Anexo 3 Anexo 4 Glosario. 43 43 44 45 47 47 48 48 51 52 53 58 58 59 60 64 66.

(10) ÍNDICE DE TABLAS. TABLA. NOMBRE DE LA TABLA. #. PAGINA. Comparación de la cantidad relativa de aceites grasos 1. presentes en el extracto y los estudios realizados con el. 16. aceite de crisálida fresca de la raza china (LH) y el aceite de crisálida de hibrido pilamo 1.. 2. 3. 4 5 6. 7. 8. 9 10 11. 12. Recuento de microorganismos mesófilos aerobios viables del aceite fresco. Recuento de microorganismos patógenos: Staphylococcus aureus del aceite fresco. Recuento de microorganismos patógenos: E. coli del aceite fresco. Recuento de mohos y levaduras del aceite fresco. del aceite sometido a calentamiento. Recuento de microorganismos patógenos: Staphylococcus aureus del aceite sometido a calentamiento. Recuento de microorganismos patógenos: E. coli del aceite sometido a calentamiento. Recuento de mohos y levaduras del aceite sometido a calentamiento. Estabilidad de mesófilos del aceite crudo de. mesófilos. del. aceite. 38. 40. 41. 41. 42 43. sometido. a. calentamiento. Estabilidad de mesófilos del aceite crudo y del aceite sometido a calentamiento.. 38. 39. Recuento de microorganismos mesófilos aerobios viables. Estabilidad. 37. 44. 45.

(11) 13. 14. 15. Estabilidad de Staphylococcus aureus del aceite crudo y del aceite sometido a calentamiento. Estabilidad de E. coli del aceite crudo y del aceite sometido a calentamiento. Estabilidad de mohos y levaduras del aceite crudo y del aceite sometido a calentamiento.. 47. 48. 48.

(12) ÍNDICE DE GRAFICAS. GRAFICA #. NOMBRE DE LA GRAFICA. PAGINA. 1. Curva de crecimiento de mesófilos del aceite crudo. 44. 2. Curva de crecimiento de mesófilos del aceite sometido. 45. a calentamiento. 3. Curva de crecimiento de mesófilos del aceite crudo vs aceite sometido a calentamiento.. 46.

(13) ÍNDICE DE FIGURAS. FIGURA #. NOMBRE DE LA FIGURA. PAGINA. 1. Curva de crecimiento microbiano. 22. 2. Siembra por el método de extensión en placa. 27. 3. Siembra por el método de vertido en placa. 28. 4. Extractor Soxhlet. 29. 5. Rotavapor. 30. 6. Muestra de los capullos. 31. 7. Proceso de secado en horno WTB-BINDER. 32. 8. Diluciones del aceite crudo. 36. 9. Diluciones del aceite sometido a calentamiento. 36. 10.. 11. 12. 13.. Recuento de mohos y levaduras del aceite fresco dilución 10-1 Recuento de mohos y levaduras del aceite fresco dilución 10 -2 Tinciones de Gram. seleccionadas Comparación de las siembras de mohos y levaduras en el seguimiento microbiológico de ocho semanas. 39. 42 47 50.

(14) RESUMEN. Se realizó el estudio microbiológico del aceite de crisálida de Bombyx mori linn Hibrido Pilamo 1. El aceite se extrajo por la técnica de Soxhlet conservando una relación muestra –solvente 1/10. El aceite obtenido se dividió en dos fracciones, a una de las cuales se le realizó un tratamiento de calentamiento y la otra se conservó a temperatura ambiente para un posterior seguimiento. A las dos fracciones se les realizó los análisis microbiológicos de rutina exigidos por la Norma Técnica Colombiana NTC 4833 para su uso como materia prima de base oleosa para productos cosméticos que incluyen Mesófilos Aerobios Viables, Hongos y levaduras, Staphylococcus aureus y Escherichia coli. Según los resultados el aceite conservado a temperatura ambiente no cumple con la normatividad vigente por superar el recuento de mesófilos y el proceso de calentamiento incrementó la multiplicación de microorganismos Mesófilos aerobios viables y de hongos..

(15) ABSTRACT. It’s been studied the oil extracted from a Bombyx mori linn chrysalides, pilamo 1 hybrid. The extraction method used was the soxhlet technique with a ratio 1/10 sample-solvent. The extracted oil was divided in two fractions, one of which was given a warming treatment while the other one was kept at environmental conditions for a posterior study. Microbiological analysis, which were obtained by the Colombian Technical Standard NTC 4833 for use as a primal probe for the oil base to cosmetical products including mesophyll, fungi and yeast, Staphylococcus aureus and Escherichia coli were given to the fractions. According to the results, the oil that was kept at environmental conditions doesn’t match the standard due to a superior account of mesophile and the warming process increment the cell multiplication of microorganism such as mesophyll and fungi..

(16) 1. JUSTIFICACIÓN. En el año de 1868 se inicia en Colombia el cultivo de la morera cuando se siembran los primeros acodos de este arbusto en la zona de Cartago. En el año de 1924 el italiano Francesco Sartori determina que las condiciones climáticas de algunas zonas de Colombia son óptimas para el cultivo de morera y la cría de gusano de seda, especialmente entre los 1000-2000 metros de altura sobre el nivel del mar por contar con temperaturas no mayores a 27 ºC, (1). De esto se deduce que Colombia tiene un potencial excelente e infinito para el desarrollo de la industria de la sericultura en el mundo, basado en las tres ventajas siguientes: Condiciones. agro-climáticas. favorables,. condiciones. socioeconómicas. y. disponibilidad de recursos genéticos superiores.. En el año de 1971 la Federación Nacional de Cafeteros observa el potencial de este cultivo y lo propone como medio alternativo para las familias cafeteras, de esta forma se aprovecharían las excelentes condiciones del suelo cafetero y se masifica el cultivo y la cría del gusano de seda,(2).. Hasta la fecha la sericultura tiene un gran impacto social en Colombia, en los últimos años se ha convertido en la herramienta de subsistencia para gran cantidad de familias campesinas y desplazados que por la crisis no han tenido ingresos con sus otros cultivos. Además Colombia coopera con los países andinos suministrando los huevos híbridos de gusano de seda que requieran estos países, esto se hace a través del banco de germoplasma que maneja y sostiene La Universidad Tecnológica de Pereira, mediante convenio con la red andina de la seda en noviembre de 2004, (3).. La sericultura en Colombia presenta dificultades ya que el costo del hilo nacional no compite con el costo del hilo internacional y en parte esto se debe a que en.

(17) Colombia no se aprovecha ningún subproducto de este proceso tal como lo hacen en países como China, Italia y Argentina donde se produce la sericina con fines cosméticos, por lo cual se debe buscar el aprovechamiento integral con el fin de aumentar la competitividad del producto nacional en el mercado internacional, (2).. En el grupo de Oleoquímica de la Universidad Tecnológica de Pereira se han realizado estudios para aprovechar las proteínas (9) y el aceite de la crisálida del gusano de seda (4), (5), (6), (8); pero se ha encontrado que el aceite no tiene una buena estabilidad por posibles causas microbiológicas (6), (7). Es por esto que se requiere hacer un control permanente de la calidad del aceite tanto en sus propiedades físico-químicos como microbiológicos para establecer si cumple con la normatividad vigente para insumos cosméticos. Por esta razón se plantea el presente estudio con la finalidad de implementar el análisis microbiológico exigido a aceites de uso cosmético según la norma NTC 4833, (32). Y evaluar el proceso de calentamiento como alternativa para mantener una mejor calidad del aceite..

(18) 2. FORMULACION DEL PROBLEMA. ¿Cumple el aceite de la crisálida de gusano de seda obtenido como producto primario con la Norma Técnica Colombiana NTC 4833, para su uso como materia prima en la industria cosmética?.

(19) 3. OBJETIVOS 3.1. OBJETIVO GENERAL. Evaluar la carga microbiológica del aceite fresco y del aceite sometido a calentamiento, extraído de crisálidas de Bombyx mori linn Híbrido Pilamo 1, con el fin de determinar si se encuentra dentro de los parámetros máximos permitidos por la normatividad vigente y la industria cosmética Nacional.. 3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS. 3.2.1. Obtener y caracterizar microbiológicamente el aceite de las crisálidas recién sacrificadas de Bombyx mori linn, hibrido Pilamo 1,. 3.2.2. Evaluar la estabilidad del aceite fresco y el aceite sometido a calentamiento mediante el trazo de la curva de crecimiento microbiano, realizando un seguimiento por un periodo de 2 meses, evaluando cada 15 días,. 3.2.3. Comparar los datos experimentales con la norma técnica colombiana NTC 4833 y determinar si el aceite crudo y el aceite sometido a calentamiento, cumple los parámetros microbiológicos máximos requeridos para su uso como base oleosa de productos cosméticos..

(20) 4. MARCO DE REFERENCIA 4.1. LA SERICULTURA. La sericultura es la combinación de los cuidados del hombre y el trabajo de un gusano poseedor de la invaluable capacidad para producir, con sus glándulas salivosas, miles de metros del finísimo hilo, (3). El insecto se caracteriza por elaborar una hebra única, muy requerida por la industria textil, (10) El ciclo productivo de la sericultura comienza con la producción de la seda cruda a través de la crianza de gusanos de seda, conocida en China desde hace más de 5.000 años, se extendió por Asia, y durante el siglo XI a Europa. Allí llevaron algunos huevos y semillas de la planta de mora y comenzaron a criar gusanos de seda. Así llegó más tarde al sur de los Estado Unidos en los tiempos coloniales, (10). Actualmente, China es el principal productor de seda natural. En América, Brasil ocupa un lugar preponderante como productor mundial. Como cadena productiva abarca: cultivo de morera, cría del gusano de seda, producción y transformación del capullo en hilos y tejidos para su posterior comercialización. Los Capullos de seda, se pueden comercializar a valores que oscilan de acuerdo con su calidad, cotizándose en dólares por kilogramo. Lo óptimo es producir hilo de seda a partir del capullo, que se puede vender por lo menos a tres veces el valor del capullo por kilogramo. Para ello es necesario contar con una hiladora, máquina para hilar a pequeña escala, que se puede fabricar a un costo relativamente bajo..

(21) Como la demanda mundial es muy superior a la oferta global, la cría de los gusanos de seda y la comercialización de capullos o hilos de seda natural, se perfila como una actividad promisoria para pequeños cultivadores en el mundo. El secreto es lograr un producto de alta calidad y competitivo con los grandes productores, (10). 4.1.1. Gusano de Seda Bombyx mori linn 4.1.1.1 Taxonomia El gusano de seda tiene por nombre científico Bombyx mori linn, es un insecto perteneciente al orden de los Lepidopteros (Mariposas) y de la familia Bombicidae, en la cual todos sus integrantes se caracterizan por formar un capullo de seda (7). El género que agrupa a las diferentes mariposas de Seda es Bombyx, y la especie comúnmente domesticada en todo el mundo es la mori linn. Existen 4 subespecies y en el caso de este estudio se usa un hibrido, denominado “hibrido pilamo 1”, (11). 4.1.1.2 Ciclo biológico Es un insecto monófago, ya que se alimenta exclusivamente de la hoja de la morera durante su etapa larval, es holometábolo y presenta una metamorfosis completa desde huevo hasta la etapa de adulto, (10). El ciclo evolutivo del gusano de seda se cumple en aproximadamente dos meses, (12). Como su alimentación es con hojas de la morera, el cultivo y disponibilidad o producción de esta planta está estrechamente vinculada a la actividad, (10). Durante los 50 a 55 días del ciclo de su vida se presentan cuatro etapas bien definidas: Huevo, larva, pupa o crisálida y polilla (mariposa), (12). Huevo: esta cubierto por un Corion, el cual determina su forma, su color se establece por los colores tanto del Corion como las de las membranas vitelinas.

(22) que se transmite de la polilla hembra y el color de la serosa la cual se forma después de la fecundación, (10). Larva: esta formada por una cabeza relativamente grande, cubierta por quitina, la cual es un protector duro de color negro, también posee tórax y abdomen, que esta cubierta por una cutícula, la cual es mas flexible y tiene en su cuerpo setas o pelos, los que le dan una apariencia de oruga peluda, (10). Pupa o Crisálida: este estado comienza con la formación del capullo caracterizado por estar constituido por un hilo continuo, el gusano realiza su metamorfosis pasando del estado de larva al de crisálida de forma oval, un poco alargada y de color primeramente amarillo claro, cuando avanza su edad tiende a tomar un color oscuro. Exteriormente deja entrever los ojos, así como las alas de la futura mariposa, la pupa es incapaz de comer alimento y aparece en estado inquieto o inmóvil, sin embargo, esta etapa es muy importante fisiológicamente, porque es una etapa transitoria durante la cual se definen cambios en la forma del insecto. Durante este periodo de actividad biológica el cuerpo larval y sus órganos internos experimentan un completo cambio y asumen una nueva forma de estado adulto o polilla, (10). Polilla: Es el estado de mariposa, es incapaz de volar como consecuencia de la domesticación, la duración de la polilla es de 3 a 5 días a temperatura ambiente y solamente se dedica a copular para producir huevos, (12). 4.1.2. Enfermedades del Gusano de Seda Es importante conocer las enfermedades que atacan al gusano de Seda para tomar medidas preventivas antes, durante y después de las crías, el control, de plagas y enfermedades de gusano de seda juega un papel importante en el resultado de la cría tanto en calidad como en cantidad de capullos, por lo tanto es necesario hacer énfasis en ellas, (12)..

(23) Entre los patógenos que causan las enfermedades infecciosas en el gusano se encuentran: hongos, bacterias, virus, y protozoarios. Las enfermedades causadas por hongos son: Muscardina blanca, Muscardina amarilla, Muscardina verde, Muscardina negra, Muscardina roja, Aspergillus, por bacterias: Desmayo bacterial, Septicemia, Bacteria del órgano digestivo y por virus: Virus Poliedrosis Nuclear (VPN), Virus poliedrosis citoplasmática (VPC) y Virus de flacherie. Además presenta una enfermedad causada por protozoarios conocida como pebrina, (13).. 4.1.2.1. Enfermedades causadas por hongos 4.1.2.1.1. Muscardina blanca. El agente causal es el hongo Beuveria bassiana (Bals) el cual forma conidias que aparecen de un color yeso en toda la población, pero con variaciones de color de individuo a individuo. El ciclo de vida de espora a espora dura 10 días cuando el tiempo esta frío, y cerca de 4 días en verano. La transmisión de una generación a otra puede ocurrir cuando la conidia contamina la superficie externa de los huevos e infectan la larva que sale de estos huevos. La infección, tiene lugar a través de la piel, aunque también puede ocurrir a través de la abertura traqueal. Usualmente la infección ocurre por una penetración directa del integumento por la infección del tubo germinativo de la conidia del hongo. Los hongos continúan su desarrollo una vez han entrado en la cavidad del cuerpo. La sangre comienza a escasearse, las células son destruidas y la acidez de ellas comienza a neutralizarse. Finalmente la circulación se detiene y el insecto muere, (13)..

(24) 4.1.2.1.2. Muscardina Verde. Lo que es llamado como Muscardina verde en Europa es conocida como Muscardina negra en Japón. El agente causal es el hongo: Metarrhizium anisopliae (Match), es llamada verde debido al color verde oscuro de las esporas. La infección tiene lugar en la cobertura por la germinación de las hifas y esporas. Después de que el hongo entra en la cavidad del cuerpo se desarrolla en la sangre y no penetra el tejido después de que el gusano de seda no ha muerto. Esta enfermedad tiene un largo periodo (11-13 días) de incubación, que comprende el periodo entre la infección y aparición de los síntomas inducidos por patógenos. Afecta el tercer instar, especialmente en la tercera muda, considerando un largo periodo de incubación, la infección de la enfermedad se supone que tiene lugar durante la primera edad, (13).. 4.1.2.1.3. Muscardina negra. Esta enfermedad prevalece en el Japón; es causada por el hongo: Spicaria prasina (MAUBL). Las conidias son verde brillante, células simples y ovales. Germinan en 15 a 20 horas por medio de un tubo germinativo, en temperaturas óptimas de 22º-23º C. Las hifas germinativas forman el micelio e invaden el cuerpo líquido de los gusanos de seda y forman esporas cilíndricas. Las larvas jóvenes son más susceptibles a la Muscardina negra, que las larvas maduras. Las esporas de este hongo tienen un largo periodo de incubación, que comprende el periodo entre la adherencia de las conidias, su germinación y la baja formación de esporas cilíndricas después de la entrada del micelio a la hemolinfa. Esta enfermedad afecta especialmente al tercer instar larval, particularmente en la tercera muda, (13)..

(25) 4.1.2.1.4. Muscardina amarilla. El agente causal es el hongo: Isaria Farinosa. Las conidias tienen forma esférica de color amarillo. La germinación se hace por medio de un tubo germinativo, en los gusanos muertos el micelio produce muchos conidioforos, los cuales se reúnen en manojos llamados sinemas. La humedad óptima para la germinación de la espora es mayor a 93% y no germina bien con menos de 81% de humedad. El periodo de incubación en gusanos jóvenes es de 5 a 7 días y de 7 a 10 días en los gusanos adultos, (13).. 4.1.2.1.5. Aspergillus. Diferentes especies de hongos del genero Aspergillus causan esta enfermedad, de las cuales las siguientes especies son las mas importantes: Aspergillus flavae Link, Aspergillus oryzae Wehmer y Aspergillus ochraceus Wilm. El ciclo de vida de Aspergillus tiene tres etapas de desarrollo; conidia, hifa vegetativa e hifa aérea. Las conidias son esféricas. Para la germinación de las conidias se requiere una temperatura alta de 30-35ºC. Entre todos los hongos estas conidias son las más resistentes a factores ambientales, sobreviviendo hasta un año o más. El hongo ataca principalmente los gusanos jóvenes, pero son lo suficientemente patogénicos en larvas adultas. Las larvas jóvenes afectadas exhiben un cuerpo tenso y lustroso y finalmente mueren. Algunos presentan manchas pero generalmente no las desarrollan. Las especies de Aspergillus no forman esporas cilíndricas en la hemolinfa, la propagación de los patógenos esta limitada al área de penetración. Si el gusano muere, presenta endurecimiento solo en el área por donde el hongo penetró, (13)..

(26) 4.1.2.2. Enfermedades por Bacterias 4.1.2.2.1. Desmayo Bacterial. El agente causal es la bacteria Bacillus thuringiensis, la cual produce una sustancia toxica que infecta varios insectos del campo causando desmayo y parálisis en muy corto tiempo, por esto, se utiliza para el control microbiológico de otros insectos. La infección de esta enfermedad ocurre por vía oral. Cuando el cristal toxico es ingerido por el gusano, este se disuelve en la parte alcalina del líquido digestivo y se absorbe a través de la pared del intestino. El efecto es en el sistema nervioso, causando desmayo y parálisis, (13). 4.1.2.2.2. Septicemia Bacterial. Es causada por la penetración y multiplicación de bacterias corrosivas en la hemolinfa del gusano de seda. Las principales bacterias patogénicas son: Seratia spp, Pseudomonas spp, Aeromonas spp y Streptococcus spp. La infección principal de Septicemia se hace a través de heridas o espiráculos en la piel del gusano y se multiplican en la hemolinfa del insecto. Además, cuando el tejido del intestino medio esta herido por otras enfermedades, las bacterias pueden penetrar a la hemolinfa causando la septicemia, (13). 4.1.2.2.3. Enfermedad intestinal por bacteria. La causa de esta enfermedad no es solamente por bacterias, sino por otros factores que hacen los gusanos no saludables. Las bacterias que han sido identificadas son algunas de Enterococcus spp. Estas bacterias son resistentes al jugo digestivo del gusano, y se multiplican en el intestino medio cuando el gusano no ha tenido buenas condiciones nutricionales y ambientales, (14)..

(27) 4.2. APLICACIONES ALTERNATIVAS DE LA SERICULTURA 4.2.1. Aplicaciones médicas. El gusano de seda es una excelente alternativa para el control de enfermedades como el control de la diabetes, el medico Kang Sun Ryu del Instituto Nacional de Investigación en Sericultura y Entomología (NSERI) de Corea, desarrollo en 1995 una medicina para el control de dicha enfermedad. Este tipo de medicina se podría denominar natural realizada a partir del proceso de liofilización del gusano mostrando ser el mas efectivo en el control de la acidez (sustancia producida normalmente por el gusano) ya que con el uso de sustancias químicas para este proceso se dificulta su consumo final en humanos, (15). Los primeros experimentos fueron hechos en ratones, a algunos se les dio a comer muchos carbohidratos desarrollando así alto contenido de azúcar en su sangre, usando para su tratamiento gusano de seda en polvo, a partir de la cuarta semana, el contenido de azúcar en la sangre comenzó a caer agudamente, en diez semanas llegaron al nivel normal de los ratones que no les dieron carbohidratos desde el comienzo. Posteriormente se hicieron pruebas en los pacientes de diabetes en el hospital de la universidad de Kunai en Corea, estas pruebas fueron un éxito, (15). Todo esto muestra que el gusano de seda en polvo tiene una tendencia para reducir rápidamente los niveles de glucosa en la sangre por su alto contenido de la molécula. 1-deoxinajirimicina. siendo. desde. entonces. reconocido. como. medicamento, (15). Así mismo, el gusano de seda a partir de una enzima que produce en su intestino y posteriormente procesado a través de la fermentación es usado para pacientes con arterias coronarias obstruidas previniendo los ataques al corazón y también.

(28) para remover las placas que se encuentran en las arterias ya que reduce los coágulos formados, (16). También se investiga en este campo, para producir vacunas, hormonas y otras moléculas útiles.. 4.2.2. Aplicaciones alimenticias Además de la morera, la pupa del gusano seco es consumida normalmente en países como alimento para humanos y es vendida en los supermercados en forma enlatada como cualquier otro producto. La pupa contiene buenas cantidades de humedad, quitina, proteína soluble en agua, carbohidratos, aminoácidos, minerales (potasio, sodio, calcio, fósforo) y vitamina C. Los antiguos griegos y romanos también usaron la pupa seca y pulverizada en la preparación de pan y tortas. En China los niños prefieren la pupa como alimento a la chocolatina. Los indios nativos de América, usan las pupas deshidratantes en harinas y gomas de mascar, todo lo anterior basado en los excelentes contenidos nutricionales de la pupa, (11). 4.2.3. Aplicaciones industriales La madera producida por los frondosos árboles de morera es utilizada en algunos países en labores normales de carpintería, mientras que en otros son famosas las raquetas de tenis hechas con madera de morera. Otro uso importante que se le puede dar a las ramas de morera en las áreas rurales es para el consumo de éstas como leña, dado el importante volumen que de ésta se puede obtener por hectárea, ayudando así a la conservación del medio ambiente, (11)..

(29) En la industria, la seda es utilizada para los tejidos artesanales, tejidos industriales, cintas para maquinas de escribir y computadores, y hasta para sutura de alta cirugía, (11). 4.2.3.1. Aplicaciones de las proteínas del hilo de seda. El uso de la seda en cosmetología fue reportado por primera vez en 1935, cuando una seda atomizada fue introducida en Inglaterra. Esta seda pulverizada fue recomendada para ser usada en todas las cremas de cosmetología, lociones, maquillajes, polvos, preparaciones para baños y preparaciones farmacéuticas. Posteriormente muchas patentes fueron registradas para relacionar la fabricación de productos útiles, utilizando la seda en cosmetología, el primero de estos productos fue producido por Lawson & Verdiere quien manufacturo un polvo impalpable de seda que fue incorporado en sus cosméticos, (17). La seda en polvo también ha sido usada en la producción de champú para dispersar los surfactantes. Tiene también propiedades importantes como un aditivo natural así como proteínas solubles de seda que ofrecen grandes beneficios, (17). Los aminoácidos de seda son obtenidos por medio de un proceso de hidrolización de la fibroína, mezclándolos con aminoácidos libres dipéptidos y tripéptidos. Los aminoácidos de seda son solubles en agua y forman soluciones claras. Ello demuestra la buena compatibilidad con las soluciones alcohólicas y son compatibles con anfótericos aniónicos y catiónicos lo cual hace que se pueda incorporar fácilmente en todos los tipos de formulaciones cosméticas y de aseo personal. Los aminoácidos de seda tienen unas excelentes condiciones humectantes comparadas con los humectantes convencionales como la glicerina. Esta es una propiedad valiosa para usar en productos para el cabello donde se necesita flexibilidad y suavidad al tacto. El bajo peso molecular que poseen los.

(30) aminoácidos de seda permiten que estos penetren en las delgadas fibras de los cabellos suplementando los aminoácidos libres dentro de la corteza, (17). Además, de los beneficios socio-económicos que ofrece a los sericultores, en su mayoría campesinos, el gusano de seda incrementa la investigación en el campo farmacéutico y en la industria cosmética. 4.3. ACEITE DE CRISALIDA DEL GUSANO DE SEDA Bombyx Mori Linn Es una fuente de ácidos grasos esenciales y esteroles; sustancias que tienen aplicación cosmética y dermatológica. También es una fuente potencial de ácido linoleico, el cual se destaca por formar bloques de construcción básicos de los cuerpos grasos, membranas biológicas y prostaglandinas, (7). La vida útil del aceite de crisálida del gusano de seda esta estrechamente relacionada con la sanidad de la pupa, es decir con el buen estado que ella presente al momento de su recolección. Algunos de los factores que se deben controlar antes y durante la obtención del aceite son: microorganismos, oxigeno que penetra en la muestra, la luz solar, la humedad y otros factores ambientales, (7). 4.3.1. ÁCIDOS GRASOS PRESENTES EN EL ACEITE DE CRISÁLIDA DE Bombyx mori linn. El aceite de crisálida es rico en ácidos grasos saturados como el palmítico y el esteárico, y ácidos grasos insaturados como el oleico y poliinsaturados como el linoléico el linolénico y araquídico. Estos tres ácidos poliinsaturados no pueden ser sintetizados por los animales superiores (incluido el hombre), y como su función biológica es fundamental, deben ser suministrados en la dieta. De ahí que estos ácidos sean llamados ácidos grasos esenciales, (18)..

(31) Aceite de crisálida fresca. Aceite de crisálida. Aceite de crisálida. de Bombyx mori linn. fresca de Bombyx. (subproducto) de. raza japonesa (k05 x. mori linn raza. Bombyx mori linn. k30), (4).. china(LH), (8). híbrido Pilamo 1, (8). Palmitoléico. 0.84. 0.78. ____. Palmítico. 22.35. 19.97. 23.7. Linoléico. 9.66. 9.66. 7.0. Linolénico. 56.24. 56.70. 28. Esteárico. 9.18. 9.93. 7.8. Araquídico. 0.83. 1.23. ____. Béhenico. 0.44. 0.52. ____. Oleico. _____. _____. 31.6. Aceites grasos. Tabla 1. Comparación de la cantidad relativa de aceites grasos presentes en el extracto y los estudios realizados con el aceite de crisálida fresca de la raza japonesa (k05 x k30), (4) raza china (LH), (8) y el aceite de crisálida del híbrido Pilamo 1, (8).. 4.4. COSMÉTICOS: ACEITES Y MATERIAS PRIMAS Las cremas o leches cosméticas se componen principalmente de agua y grasa, además de otros aditivos que proporcionan a la crema la textura, color u olor que interesan desde el punto de vista comercial, así como estabilizantes, antioxidantes, conservantes, perfumes y los principios activos que determinan la finalidad de la crema.. Emulgentes: para unir grasa y líquidos Antioxidantes: impiden el deterioro en contacto con el aire Gelificantes: dan textura y cremosidad Conservantes: impiden el deterioro temporal Bactericidas: desinfectan el medio para que no se formen hongos, etc, (19)..

(32) Existen en la naturaleza diversas fuentes vegetales y animales de aceites enriquecidos en ácido oleico, linoleico y linolénico de gran importancia en cosmética, tal es el caso del aceite de oliva, de maíz, de palmiste, de castor y de germen de trigo. (20).. Estos aceites son vehículos portadores de gran variedad de antioxidantes, los antioxidantes son compuestos importantes porque poseen la capacidad de proteger a las células contra el daño oxidativo, el cual provoca el envejecimiento y las enfermedades crónico-degenerativas, tales como el cáncer, enfermedades cardiovasculares y diabetes, su efecto consiste en oxidarse antes que otros compuestos, además permiten la conservación de los cosméticos, debido a que son utilizados como aditivos. Existen un gran número de compuestos antioxidantes de origen tanto sintético como natural, pero son estos últimos los que se prefieren. Ejemplo de dichos antioxidantes son las vitaminas C y E que están siendo utilizadas desde hace años para combatir los efectos de los radicales libres que agreden la piel, (21). Cuando se somete a la epidermis a exposiciones repetidas a estos y otros aditivos se pueden producir alteraciones de los procesos y funciones biológicas de la piel. Es tan importante conocer las propiedades de las sustancias activas como las características del vehículo o sustancias excipientes que les acompañan en la composición del producto. Debido a esto las materias primas para la elaboración de cosméticos deben ser cuidadosamente estudiadas y caracterizadas en todos sus diversos componentes, también ya que todo producto de manufactura cosmética debe cumplir con la INCI (Nomenclatura Internacional de Ingredientes en la Cosmética). Esta declaración de ingredientes debe ser completa y exhaustiva de tal forma que en ella estén incluidos todos los componentes específicos hasta de las materias primas. Se.

(33) pretende con ello que el consumidor tenga así una mínima orientación ya que cuantas más sustancias naturales estén enumeradas en los primeros lugares, más natural será el producto, (19). La alteración que se presenta más comúnmente en los aceites y grasas es la llamada rancidez, la cual estropea el olor y el color natural del aceite. Algunas causas químicas y biológicas que causan la rancidez son: el efecto del aire y la luz, principalmente la humedad que en presencia de oxigeno actúa sobre los ácidos grasos insaturados de la molécula produciendo un olor desagradable debido a la formación de peróxidos. La presencia de metales también acelera este proceso, se recomienda envasar el aceite en frascos ámbares previamente esterilizados. Los peróxidos se descomponen formando ácidos libres de menor peso molecular, razón por la cual las sustancias en descomposición son ácidas. Por oxidación de los ácidos grasos saturados se forman metilcetonas y por oxidación de los ácidos grasos no saturados se obtienen aldehídos, (7). La calidad del aceite se ve cuantificado por la cantidad de ácidos grasos liberados. 4.4.1. NORMALIZACIÓN En Colombia los aceites son normalizados por el Instituto Técnico Colombiano (ICONTEC) e instituciones legisladoras como el INVIMA, encargadas de garantizar el buen funcionamiento, la calidad de medicamentos y alimentos, a través del ministerio de salud se preocupan por la reglamentación de los regimenes sanitarios de control de calidad y de vigilancia de los productos cosméticos. Entre algunos de los aceites de uso cosmético que se utilizan por su alto contenido de antioxidantes y que se encuentran normalizados en Colombia encontramos:.

(34) Aceite de Castor (NTC 1529), (22), Aceite de Germen de Trigo (NTC 3758), (23), Aceite de Oliva (NTC 258), (24), Aceite de Coco (NTC 252), (25), Aceite de Babasu (NTC 263), (26), Aceite crudo de algodón (NTC 257), (27), Aceite de Ajonjolí (NTC 256), (28) y Aceite de Palma (NTC 262), (29), entre otros. 4.5.. ANÁLISIS. MICROBIOLÓGICO. COMO. HERRAMIENTA. Y. SU. IMPORTANCIA. La microbiología trata de las células vivas y su funcionamiento. Estudia los microorganismos, especialmente las bacterias, un amplio grupo de células con una enorme importancia básica y aplicada. Trata de la diversidad microbiana y de la evolución, de cómo surgieron las diferentes clases de microorganismos y por qué. Analiza lo que los microorganismos hacen en el mundo en general, en la sociedad humana, en el cuerpo humano, y en los cuerpos de animales y plantas, (30) Uno de los objetivos de los microbiólogos es comprender como trabajan los microorganismos y, a través de ese conocimiento, diseñar modos mediante los cuales su efecto beneficioso pueda ser aumentado y el perjudicial reducido, (30). 4.5.1. CRECIMIENTO DE LOS MICROORGANISMOS. El crecimiento es un componente esencial de la función microbiana, ya que en la naturaleza cualquier célula tiene un periodo de vida finito y la especie se mantiene como resultado del crecimiento continuo de la población y es necesario controlarlo, (30).. Durante el ciclo de división celular, todos los componentes estructurales de la célula se duplican. El tiempo de generación de un microorganismo determinado también es función del medio de cultivo utilizado y de las condiciones de incubación empleadas..

(35) El crecimiento de poblaciones, puede ser exponencial, este crecimiento se caracteriza porque la velocidad del aumento de número de células es inicialmente lenta, pero incrementa cada vez más con el tiempo. Esto determina que en las últimas etapas el aumento de número de células sea realmente explosivo.. Una consecuencia practica del crecimiento exponencial es que cuando un producto no estéril, como la leche, se deja en condiciones que permiten el crecimiento microbiano unas cuantas horas, durante las primeras fases del crecimiento exponencial el efecto no es muy relevante, mientras que si se deja durante el mismo tiempo en fase exponencial tardía, el resultado es desastroso para el producto, (30).. 4.5.1.1. CURVA DE CRECIMIENTO. Para representar este crecimiento se realiza una curva de crecimiento que se divide en varias fases: fase de latencia, fase exponencial, fase estacionaria y fase de muerte, (Ver figura 1). 4.5.1.1.1. FASE DE LATENCIA. Cuando se inocula una población microbiana en un medio fresco, por lo general el crecimiento no comienza inmediatamente sino tan solo tras un periodo de tiempo que constituye la fase de latencia, la cual puede ser breve o larga dependiendo de la procedencia del cultivo y de las condiciones de crecimiento. Si un cultivo exponencial se inocula en el mismo medio y en las mismas condiciones de cultivo, no se observa un retraso y el crecimiento exponencial se inicia inmediatamente. Sin embargo, si el inoculo se toma de un cultivo viejo (fase estacionaria) y se inocula en el mismo medio, se observa normalmente un retraso aunque todas las células del inoculo sean viables, es decir, sean capaces de reproducirse. Esto se.

(36) debe con frecuencia a que las células carecen de varios componentes esenciales para dividirse y se requiere tiempo para su síntesis. También se observa un retraso cuando las células del inoculo han sido dañadas parcialmente con calor, radiaciones o compuestos tóxicos, debido al tiempo requerido para recuperarse y reparar los daños. La fase de latencia también ocurre cuando se transfiere una población de un medio rico a otro medio mas pobre. Para que ocurra crecimiento en un medio de cultivo particular, las células deben tener un equipo enzimático completo que permita la síntesis de los metabolitos esenciales ausentes en el medio. Al pasar a otro medio, se necesita tiempo para la síntesis de las nuevas enzimas, (30). 4.5.1.1.2. FASE EXPONENCIAL. Es una consecuencia del hecho de que cada célula se divide para formar dos, cada una de las cuales va a formar otras dos y así sucesivamente. La mayoría de los microorganismos unicelulares crecen exponencialmente pero las velocidades del crecimiento exponencial son muy variables. La velocidad de crecimiento esta influenciada por las condiciones ambientales (temperatura, composición del medio de cultivo. etc.). Así como por las características genéticas del organismo. Por lo general, los microorganismos procarióticos crecen más rápido que los eucarióticos, y los eucariotas de pequeño tamaño lo hacen más rápido que los de mayor tamaño, (30).. 4.5.1.1.3. FASE ESTACIONARIA. En un sistema de cultivo cerrado, el crecimiento exponencial no se puede prolongar de modo indefinido. Se puede calcular que una sola bacteria con un tiempo de generación de 20 minutos produciría en tan solo 48 horas de crecimiento exponencial continuado una población que pesaría unas 4000 veces el peso de la Tierra, porque una sola célula bacteriana pesa alrededor de 10ֿ¹².

(37) gramos. Por lo tanto algo debe pasar mucho antes de ese tiempo, que limite el crecimiento de la población. Generalmente sucede que un nutriente esencial del medio de cultivo se usa y llega a ser un factor limitante del crecimiento; o se acumulan en el medio algunos productos de desecho hasta niveles inhibitorios que hacen que cese el crecimiento exponencial. Frecuentemente, ocurren ambas cosas. Al producirse esto, la población alcanza la fase estacionaria. En esta fase no hay aumento ni descenso neto en el número de células. Aunque no suele haber crecimiento en la fase estacionaria muchas funciones celulares continúan, como el metabolismo energético y algunos procesos biosintetico. En algunos casos puede ocurrir un lento crecimiento durante la fase estacionaria; algunas células de la población crecen, pero otras mueren y los dos procesos se equilibran de modo que no hay aumento ni disminución en el numero de células (este fenómeno se conoce como crecimiento críptico).. 4.5.1.1.4. FASE DE MUERTE. Si la incubación continúa después de que la población haya alcanzado la fase estacionaria, las células pueden continuar vivas y metabolitamente activas, pero también pueden morir. Si ocurre esto ultimo, se dice que la población esta en fase de muerte, (30).. Figura .1 Curva de Crecimiento Microbiano, (30)..

(38) 4.5.2. TIPOS DE MICROORGANISMOS Los microorganismos procarióticos tienen la particularidad de reproducirse a diferentes temperaturas, de acuerdo a la temperatura a la cual se desarrollen los podemos clasificar en: Mesófilos: son los microorganismos que crecen a temperatura ambiente entre 3037 ˚C, Psicrófilos: son los que crecen a temperaturas bajas entre 0-5 ˚C, y Termófilos: son los que se desarrollan y reproducen a temperaturas mayores de 50 ˚C. Los microorganismos patógenos como E. coli y S. aureus, se encuentran dentro de los microorganismos Mesófilos que crecen a temperaturas entre 30-37 ˚C. 4.5.2.1. MICROORGANISMOS MESOFILOS Se encuentran en casi todos los productos, además son los microorganismos que se encuentran ampliamente difundidos en el medio ambiente. Un recuento total de aerobios Mesófilos bajo, no asegura que un producto este exento de patógenos o de sus toxinas; tampoco un recuento total alto significa, inevitablemente, presencia de microbiota patógena. La determinación de mesófilos se utiliza para: •. Verificar la eficacia de los sistemas de limpieza y desinfección y averiguar la temperatura a que fue preservada la materia prima durante los procesos de tratamiento industrial, transporte y almacenamiento, (31)..

(39) •. Hacer una comparación con la norma establecida y decidir si el producto es apto para uso humano o si la industria de donde proviene el producto cumple con los requerimientos de calidad, (31).. 4.5.2.1.1. MICROORGANISMOS PATÓGENOS Dentro de las bacterias parasitas se distingue a los patógenos, que son aquellos que producen enfermedad, morfológicamente los microorganismos tienen ocurrencia muy variable sin embargo, es muy común encontrar en bacterias las formas cilíndrica, esférica y espirales. A las formas esféricas se les denomina cocos, cuando constituyen una especie de racimos, estafilococos, y cuando adoptan la forma de una cadena, estreptococos; cuando los cocos adoptan una forma ovalada se les llama cocobacilos. Las bacterias de conformación cilíndrica reciben el nombre de bacilos, cuando ocurren en cadena estreptobacilos. Entre los microorganismos patógenos que se buscan en bases oleosas de cosméticos. se. encuentran:. Staphylococcus. aureus,. Escherichia. coli,. Pseudomonas aeruginosa y Clostridium Anaerobios Esporoformadores, (32). 4.5.2.2. HONGOS Los hongos constituyen un grupo diverso de organismos unicelulares o pluricelulares que se alimentan mediante la absorción directa de nutrientes. Los alimentos se disuelven mediante enzimas que secretan los hongos; después se absorben a través de la fina pared de la célula y se distribuyen por difusión simple en el protoplasma. Junto con las bacterias, los hongos son los causantes de la putrefacción y descomposición de toda la materia orgánica. Algunos son parásitos de organismos vivos y producen graves enfermedades en plantas y animales. Otros han sido benefactores de la humanidad y han sido.

(40) cultivados en forma controlada por los humanos, como las levaduras que se usan ampliamente para producir desde pan hasta biocombustibles; o mohos como el productor de la penicilina, que fue descubierta por Fleming en 1928 cuando estaba estudiando cultivos bacterianos de Staphylococcus aureus, él observó que cuando se contaminaban las placas de cultivo con un hongo microscópico del género Penicillium (Penicillium notatum) éste inhibía el crecimiento de las bacterias debido a la producción de una micotoxina por parte del Penicillium, esto se debe a que este moho forma metabolitos secundarios que actúan como antibióticos favoreciendo la prevalencia del moho frente a otros microorganismos causando en estos micotoxicosis, (33). 4.5.3. Recuento de células Viables En el recuento microscópico directo se cuentan tanto células vivas como muertas. En muchos casos interesa contar solo las células vivas, con este fin se han desarrollado métodos de recuento de células viables. Una célula viable se define como aquella que es capaz de dividirse y dar lugar a una descendencia; y el método usual para realizar una determinación de células viables se basa en contar el número de células de la muestra que es capaz de formar colonias sobre un medio sólido adecuado, (30). Para realizar el recuento es necesario realizar la dilución de las suspensiones celulares antes de la siembra en placa, con el fin de obtener el numero apropiado de colonias, cuando se desconoce el numero de células viables, normalmente se realiza mas de una dilución. Lo mas frecuente es realizar diluciones decimales de la muestra. Para hacer una dilución de 10ֿ¹ se mezclan 1 mL de la muestra con 9 mL del diluyente, una dilución de 10ֿ² se puede hacer de modo seriado haciendo sucesivamente dos diluciones de tipo 10ֿ¹. El numero de colonias que se obtiene en una determinación de viables no sólo depende del tamaño del inoculo sino también de lo adecuado que sea el medio de cultivo y de las condiciones de incubación. Las células depositadas en la placa no se desarrollaran todas en colonias a la misma velocidad y si se emplea un corto.

(41) tiempo de incubación, se obtendrán menos colonias de las posibles. La determinación de viables puede estar sujeta a grandes errores y, si se desean recuentos precisos, han de hacerse con cuidado y hacer las placas de las diluciones por duplicado o triplicado según se dé el caso. El recuento de viables se expresa a menudo como unidades formadoras de colonias (UFC) obtenidas, más que como numero de células viables (ya que una unidad formadora de colonia pudo originarse a partir de una o mas células iniciales), (30).. Existen varios factores que afectan el recuento en los productos a analizar, entre estos se tienen: el tratamiento de la muestra, el método de la dilución, la naturaleza del diluyente, medios de cultivo utilizados, temperatura de los medios, antagonistas presentes en la muestra, técnica de siembra utilizada, temperatura de incubación, tiempo de incubación, colonias que difunden, numero de colonias y el método de lectura, (31). 4.5.4. MEDIOS DE CULTIVO. Los medios de cultivo son la base fundamental de todo el trabajo experimental. Son los medios de cultivo los encargados de proporcionar los nutrientes y la fuente de energía, es decir, son el alimento para los microorganismos a estudiar, de esta manera contribuyen al crecimiento bacteriano. Están constituidos por una mezcla compleja de nutrientes como: Carbono, Vitaminas, minerales, iones.. Los medios de cultivo sólidos son los medios para verter en cajas de petri, con un contenido de agar del 1% o más. Los microorganismos se agrupan y forman colonias, en cultivos puros para ser identificables, (30), (VER ANEXO 4). 4.5.5. MÉTODOS DE SIEMBRA. Existen varios métodos de cultivo; entre los que se destacan en este estudio:.

(42) •. El método de extensión en placa, (por superficie).. •. El método de vertido en placa, (por profundidad).. 4.5.5.1. Siembra por el método de extensión en placa. Un cierto volumen de cultivo diluido, que no suele ser superior a 0.1 mL, se extiende sobre la superficie de una placa con medio sólido utilizando un asa estéril de extensión. La placa se incuba después hasta que aparecen las colonias y se cuenta su número, (30). (VER ANEXO 3). Figura 2. Siembra por el método de extensión en placa, (38).. 4.5.5.2. Siembra por el método de vertido en placa. Se toma un volumen conocido (normalmente 0.1-1.0 mL) de cultivo en una placa petri estéril, sobre la que se añade el medio con agar fundido y se mezcla con suaves movimientos de la placa sobre la superficie de la mesa antes de que solidifique, (30)..

(43) Figura 3. Siembra por el método de vertido en placa, (38). 4.5.6. ESTERILIZACIÓN. Para la ejecución del análisis microbiológico se tiene en cuenta la esterilización de todos los materiales, permitiendo de esta manera el trabajo exclusivo con los microorganismos deseados, por esto se hace referencia a la esterilización.. 4.6. FUNDAMENTOS FÍSICO-QUÍMICOS. 4.6.1. EXTRACTOR SOXHLET El extractor Soxhlet o simplemente Soxhlet es utilizado para la extracción de compuestos, generalmente de naturaleza lipídica, contenidos en un sólido, a través de un solvente afín. Fue inventado en 1879 por Franz von Soxhlet, y fue diseñado originalmente para extraer un lípido de una muestra de un material sólido. Este equipo está diseñado para aplicaciones a nivel micro durante el análisis y experimentación en procesos de extracción de grasas. Integrado por un extractor, un condensador especial de tipo bulbo y un matraz, (36)..

(44) 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11.. buzo / agitador / granallas o esferas balón brazo para ascenso del vapor cartucho de extracción o cartucho Soxhlet muestra (residuo) entrada del sifón descarga del sifón adaptador refrigerante (condensador) entrada de agua de refrigeración salida de agua de refrigeración. Figura 4. Extractor SOXHLET.. 4.6.2.. ELIMINACIÓN. DE. DISOLVENTES. A. PRESIÓN. REDUCIDA. (ROTAEVAPORACION) Una operación frecuente en un laboratorio es la eliminación de un disolvente orgánico volátil de una mezcla de reacción. Esto se puede realizar por destilación simple, sin embargo el procedimiento más rápido y cómodo es el empleo de un rotaevapor..

(45) Figura 5. Rotaevaporador.. Básicamente consiste en un motor eléctrico que produce el giro de un tubo con un ajuste esmerilado al que se acopla un matraz de fondo redondo que contiene la disolución. Dicho matraz se sumerge parcialmente en un baño de agua, manteniendo el giro.. La temperatura del baño no debe exceder de 35-40º para la manipulación de los disolventes orgánicos más comunes. Acoplado al sistema, se encuentra un condensador por el que circula un líquido, por lo general agua, que produce la condensación del disolvente que se recoge en un colector, (37)..

(46) 5 METODOLOGÍA 5.1. MUESTRAS Se seleccionaron capullos de gusano de seda Bombyx mori linn, de un lote suministrado por los sericultores del municipio de Buga en el Valle del Cauca, se escogieron los capullos mas grandes.. Figura 6. Muestra de los Capullos de bómbix mori linn. 5.2. SACRIFICIO. Se realizó inicialmente un tratamiento con CO2 sometiendo las crisálidas contenidas en el capullo a una atmósfera de CO2 producido a partir de Bicarbonato de Sodio (NaHCO3)) y ácido acético (CH3COOH), posteriormente para garantizar la mortalidad se llevó a cabo a una temperatura de 80º C durante 14 horas en un horno marca WTB-BINDER (ver figura 7). La reacción química que tuvo lugar fue la siguiente: NaHCO3 + CH3COOH ----> CH3COONa + CO2 + H2O.

(47) En el sacrificio se produce una muerte de las crisálidas por asfixia. Se. implemento. este. método. buscando aminorar el estrés que se produce en el momento de la muerte. para. degradación. evitar del. la. posible. aceite. por. reacciones químicas. .. Figura 7. Proceso de secado en horno WTB-BINDER. 5.3. CONSERVACION DEL CAPULLO. El capullo se conservo en bolsas Ziploc ®, y se llevaron a un refrigerador marca Selecta, modelo Templow a -20ºC durante dos meses. 5.4. SECADO DEL CAPULLO. Se sacaron los capullos y se secaron en un horno de fabricación manual en madera con flujo de aire caliente a una temperatura de 55-65ºC durante 96 horas en el laboratorio de Oleoquímica de la Universidad Tecnológica de Pereira, para eliminar la humedad adquirida en este periodo de tiempo, verificando un peso constante, pesando en balanza triple brazo marca OHAUS. 5.5. OBTENCION DE LA CRISALIDA. Se cortaron los capullos para obtener la crisálida que se encuentra dentro de ellos y se preservaron en bolsa Ziploc ® a temperatura ambiente libre de humedad en un desecador durante 24 horas para la posterior extracción del aceite..

(48) 5.6. SECADO DE LA CRISALIDA.. Las crisálidas se sometieron a secado en el horno de fabricación manual en madera hasta obtener un peso constante y garantizar la eliminación de humedad que haya podido adquirir en el proceso de corte y preservación en desecador.. 5.7. EXTRACCION DEL ACEITE. Se realizó mediante extracción por el método soxhlet partiendo de crisálida fresca y n-hexano como solvente, conservando una relación 1/10 y utilizando los tiempos y técnicas propuestos en estudios previos, (4). El extracto se concentró en rotaevaporador marca: Rotavac, modelo: Heidolph y el aceite obtenido se guardó en frascos de vidrio previamente esterilizados para evitar la contaminación de la muestra; protegidos de la luz y envueltos en papel aluminio a temperatura ambiente para su posterior análisis, (5). El aceite extraído se dividió en dos porciones, uno se sometió a tratamiento de calentamiento y la otra porción para análisis directo. Se conservó a temperatura ambiente y posteriormente se sometieron a los diferentes análisis microbiológicos. 5.8. TRATAMIENTO DE CONTROL MICROBIOLÓGICO. El aceite de crisálidas fresco se sometió a un calentamiento a 60ºC durante 6 horas en un baño termostatico marca Memmert WB-10 en el laboratorio de Oleoquímica. 5.9. ANÁLISIS MICROBIOLÓGICO. Tanto al aceite sometido a calentamiento como al aceite conservado a temperatura ambiente se les realizo el análisis microbiológico de rutina según la norma NTC 4833, (32), se le realizó por duplicado las diluciones 10-1 ,10-2 y por.

(49) triplicado las diluciones 10-3 para las pruebas de mesófilos aerobios viables y mohos y levaduras, para Escherichia coli y Staphylococcus aureus se realizo por triplicado las diluciones 10-1 y 10-2 adaptándola a los recursos disponibles en el laboratorio de microbiología de La Escuela de Química de La Universidad Tecnológica de Pereira. ANEXO 3.. Para la ejecución del análisis microbiológico del aceite se tuvo en cuenta la esterilización de todos los materiales que se emplearon para las pruebas en el laboratorio de microbiología de La Universidad Tecnológica de Pereira, permitiendo de esta manera el trabajo exclusivo con los microorganismos deseados: Mesófilos aerobios viables, mohos y levaduras, Escherichia coli y Staphylococcus aureus.. La incubación de los diferentes microorganismos se llevó a cabo en una Incubadora Marca: Selecta, Modelo: Incudigit.. El análisis microbiológico incluyo las siguientes pruebas:. 5.9.1. DETERMINACION DE MICROORGANISMOS MESOFILOS AEROBIOS VIABLES. Para esta identificación, el medio de cultivo utilizado fue el Agar Tripticasa de Soya Se realizaron las respectivas diluciones con agua peptonada y la muestra. Se continuó con la siembra por el método de vertido en placa y se incuban de 35 ±2˚C, por 48 horas. Realizando un seguimiento de quince días durante dos meses.. 5.9.2. DETERMINACION DE MOHOS Y LEVADURAS. Para esta identificación, el medio de cultivo utilizado fue Agar Saboraud se realizaron las respectivas diluciones con agua peptonada y la muestra. Se.

(50) continuó con la siembra por el método de vertido en placa y se incubó de 25 ±2˚C durante 8 días. ANEXO 1: Marcha analítica para conteo de mesofilos, mohos y levaduras Realizando un seguimiento de quince días, durante dos meses. 5.9.3. DETERMINACION DE Staphylococcus aureus. Para esta identificación, el medio de cultivo utilizado fue Baird Parker. Se realizaron las respectivas diluciones con agua peptonada y la muestra, efectuando una preparación preliminar de la muestra se incubó de 35-37 ˚C durante 48 horas, para continuar a realizar la siembra por el método de extensión en placa e incubando a temperatura de 35-37˚C durante 48 horas. Por quince días durante dos meses.. 5.9.4. DETERMINACION DE Escherichia coli. Para esta identificación se realizaron las respectivas diluciones con agua peptonada y la muestra. Se incubaron las diluciones a 35-37ºC por 24 horas, se continúo con la siembra por extensión en placa utilizando el medio EMB se incubó a una temperatura de 35-37ºC durante 24 horas. ANEXO 2: Marcha analítica para S. aureus y E. coli. Por quince días durante dos meses. 5.9.5. CONTROL DE MEDIO. A cada una de las anteriores pruebas se les realiza control del medio que es una placa llevada en las mismas condiciones que las placas que contienen el microorganismo, con la única diferencia que en ella no se inocula muestra, se usa normalmente para verificar el estado de la siembra y de los conteos..

(51) 6 RESULTADOS Y DISCUSIÓN. El aceite crudo obtenido presentó una coloración amarilla como se aprecia en la figura 8. El aceite sometido a calentamiento no presentó cambio de color con relación al aceite sin tratamiento, ver figura 9. Los análisis microbiológicos se llevaron a cabo a los cinco días después de obtenido el aceite.. Figura 8. Diluciones Aceite crudo.. Figura 9. Diluciones del Aceite sometido a calentamiento.. A. continuación. se. presentan los. resultados. obtenidos. de los. análisis. microbiológicos del aceite fresco así como del aceite sometido a calentamiento..

(52) 6.1. CARACTERIZACIÓN MICROBIOLÓGICA DEL ACEITE FRESCO. 6.1.1. Recuento de Microorganismos Mesófilos Aerobios Viables. Mesófilos Aerobios Viables Fecha del recuento. 27-Jul-06. Aceite Crudo (UFC/mL). NTC 4833 Cosméticos en general (UFC/mL). NTC 4833 Cosméticos para bebé y área de los ojos (UFC/mL). 60000. <1000. <100. Tabla 2.Recuento de microorganismos mesófilos aerobios viables del aceite fresco. Se observó al extraer el aceite, que la carga de microorganismos mesófilos es muy alta y no cumple con los parámetros exigidos por la norma NTC 4833, ni para cosméticos en general, ni para cosméticos para bebe y área de los ojos, lo cual puede atribuirse a que el aceite contiene suficientes sustancias nutritivas para permitir el desarrollo de diferentes microorganismos, muchas de las bacterias provienen del contacto del gusano con el aire, el suelo, animales, plantas vivas o en descomposición y fuentes minerales, (35), además existe un factor externo que es el tratamiento de la muestra (no existe control en el proceso de recolección y transporte, los equipos para sacrificio y secado no eran desinfectables) el cual influye considerablemente en el análisis de los resultados..

(53) 6.1.2. Recuento de Patógenos. 6.1.2.1. Contaminación por manipulación humana. Staphylococcus aureus Fecha del recuento. 27-Jul-06. Aceite Crudo (UFC/mL). NTC 4833 Cosméticos en general (UFC/mL). NTC 4833 Cosméticos para bebé y área de los ojos (UFC/mL). 0. Ausencia Total. Ausencia Total. Tabla 3 Recuento de microorganismos Patógenos: Staphylococcus aureus del aceite fresco.. Se observa que no presenta crecimiento de S. aureus por lo tanto esta dentro de la normatividad.. 6.1.2.2. Contaminación por contacto con materia fecal. Escherichia coli Fecha del recuento. 8-Ago-06. Aceite Crudo (UFC/mL). NTC 4833 Cosméticos en general (UFC/mL). NTC 4833 Cosméticos para bebé y área de los ojos (UFC/mL). 0. Ausencia Total. Ausencia Total. Tabla 4.Recuento de microorganismos Patógenos: E.Coli del aceite fresco.. Se observa que no presenta crecimiento de E. coli, por lo tanto esta dentro de la normatividad..

(54) 6.1.3. Recuento de mohos y levaduras.. Mohos y levaduras Fecha del recuento. 01-ago-06. Aceite Crudo (UFC/mL). 980. NTC 4833 NTC 4833 Cosméticos Cosméticos para bebé y en área de los ojos general (UFC/mL) (UFC/mL). <1000. <100. Tabla 5.Recuento de mohos y levaduras del aceite fresco.. Figura 10. Recuento de mohos y levaduras del aceite fresco Dilución 10-1. Se observó que el aceite fresco presenta una baja carga de levaduras y mohos de 980 UFC/ml como se aprecia en la tabla 8. El recuento se realizo en la caja con dilución de 10-1 (figura 10). Se cumple con un recuento < 1000 como lo exige la norma NTC 4833, aunque sigue siendo elevada cumple para cosméticos en general mas no para cosméticos para bebe y área de los ojos. Se puede atribuir la presencia de mohos y levaduras a la exposición del aceite y la crisálida al ambiente, a la humedad y a las condiciones naturales de manipulación, en laboratorio por causa del secado en el horno de madera o en el campo en los cultivos de la morera, como en la recolección del capullo y el almacenamiento, en el cual pudo adquirir los mohos. Normalmente la presencia de mohos y levaduras, así como de mesófilos aerobios no necesariamente indica la contaminación del producto con microorganismos patógenos, sin embargo; los hongos pueden.

(55) generar toxinas que ocasionan daños en la piel, se recomienda realizar un estudio micotoxicológico para evaluar la presencia o ausencia de éstas en el aceite.. 6.2. CARACTERIZACIÓN MICROBIOLÓGICA DEL ACEITE SOMETIDO A CALENTAMIENTO. 6.2.1. Recuento de Microorganismos Mesófilos Aerobios Viables. Mesófilos Aerobios Viables Fecha del recuento. 27-Jul-06. Aceite sometido a calentamiento (UFC/mL). NTC 4833 Cosméticos en general (UFC/mL). NTC 4833 Cosméticos para bebé y área de los ojos (UFC/mL). 360. <1000. <100. Tabla 6. .Recuento de microorganismos mesófilos Aerobios Viables del aceite sometido a calentamiento. Se observa que al calentar el aceite fresco la carga de microorganismos mesófilos disminuye y cumple con los parámetros exigidos por la norma NTC 4833, para cosméticos en general, pero aun así no alcanza las exigencias para cosméticos para bebe y área de los ojos. Esto indicaría que el tratamiento de calentamiento es efectivo pero no con los resultados esperados, hay que recordar que el calentamiento no es una esterilización (30). En el calentamiento se busca que la carga microbiológica disminuya y que cumpla los criterios de la Norma Técnica Colombiana 4833 que es la que garantiza si puede ser utilizado en la industria de los cosméticos, al no ser así se recomienda buscar otras formas de control microbiológico hasta encontrar la indicada..

(56) 6.2.2. Recuento de Patógenos. 6.2.2.1. Contaminación por manipulación humana. Staphylococcus aureus Fecha del recuento. 27-Jul-06. Aceite sometido a calentamiento (UFC/mL). NTC 4833 Cosméticos en general (UFC/mL). NTC 4833 Cosméticos para bebé y área de los ojos (UFC/mL). 0. Ausencia Total. Ausencia Total. Tabla 7 Recuento de microorganismos Patógenos: Staphylococcus aureus del aceite sometido a calentamiento. Se observa que no presenta crecimiento de S. aureus, por lo tanto cumple los parámetros exigidos en la NTC.. 6.2.2.2. Contaminación por contacto con materia fecal. Escherichia coli Fecha del recuento. 08-ago-06. (UFC/mL). NTC 4833 Cosméticos en general (UFC/mL). NTC 4833 Cosméticos para bebé y área de los ojos (UFC/mL). 0. Ausencia Total. Ausencia Total. Aceite sometido a calentamiento. Tabla 8. Recuento de microorganismos Patógenos: E.coli del aceite sometido a calentamiento. Se observa que no presenta crecimiento de E. coli, por lo tanto cumple los parámetros exigidos en la NTC..

(57) 6.2.3. Recuento de mohos y levaduras. Mohos y levaduras Fecha del recuento. 01-ago-06. (UFC/mL). NTC 4833 Cosméticos en general (UFC/mL). NTC 4833 Cosméticos para bebé y área de los ojos (UFC/mL). 19200. <1000. <100. Aceite sometido a calentamiento. Tabla 9.Recuento de mohos y levaduras del aceite sometido a calentamiento. Figura 11. Recuento de mohos y levaduras del aceite sometido a calentamiento Dilución 10-2. Como se observa en la tabla 13 y en la figura 11, el aceite sometido a calentamiento presenta una elevadísima carga microbiológica de levaduras. Existe un crecimiento menor de mohos. Esto no necesariamente indica que no haya mohos en la muestra, sino que las levaduras se desarrollan mas rápido en el medio de cultivo que los mohos (aprox. 72h) (38) esto produce una competencia interespecífica y la respuesta a esta condición de estrés en la muestra es mas demorada por parte del hongo, que se demora mucho mas tiempo en sintetizar micotoxinas para eliminar a especies competidoras por los nutrientes (bacterias y levaduras) (33) y poder crecer y marcar correctamente su contenido en la caja de petri. Este interferente se podría eliminar usando productos como el Actidione© (ciclohexamida), que inhibe el crecimiento de levaduras y permite el conteo adecuado de mohos, (38). Sin embargo, este producto es controlado.