FACULTAD DE FARMACIA
TESIS DOCTORAL
Identificación de hongos filamentosos y levaduras de interés clínico mediante espectrometría de masas MALDI -TOF
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR
Margarita Estreya Nikolaeva Zvezdanova Directoras
Belén Rodríguez Sánchez Pilar Escribano Martos
Madrid
© Margarita Estreya Nikolaeva Zvezdanova, 2022
F ACULTAD DE F ARMACIA
T ESIS DOCTORAL
Identificación de hongos filamentosos y levaduras de interés clínico mediante espectrometría de
masas MALDI -TOF
MEMORIA PARA OPTAR AL GRADO DE DOCTOR PRESENTADA POR:
Margarita Estreya Nikolaeva Zvezdanova
DIRECTORAS:
Belén Rodríguez Sánchez y Pilar Escribano Martos
F ACULTAD DE F ARMACIA
T ESIS DOCTORAL
Identificación de hongos filamentosos y levaduras de interés clínico mediante espectrometría de masas
MALDI -TOF
Memoria para optar al grado de doctor presentada por:
Margarita Estreya Nikolaeva Zvezdanova
Servicio de Microbiología Clínica y Enfermedades Infecciosas. Hospital General Universitario Gregorio Marañón.
Madrid, 2021
DIRECTORAS:
Belén Rodríguez Sánchez y Pilar Escribano Martos
A mi padre
Agradecimientos
Tal y como había escuchado decir a mucha gente a lo largo de mi vida, la realización de una tesis doctoral es algo que conlleva mucho trabajo y esfuerzo, y aunque lo intuyes, te sorprende, aun así. Sin embargo, hoy en día puedo decir que, además, cuando aquello a lo que te dedicas te gusta de verdad, puede ser una experiencia muy gratificante que te enseña y te hace crecer en más ámbitos de la vida.
No se trata de una experiencia meramente laboral, va mucho más allá, acercándote a unos objetivos de vida.
He sido muy afortunada por tener a mi alrededor gente cercana apoyándome.
Belén, has sido muy importante a lo largo de estos años, a nivel profesional y a nivel personal. No puedo estar más agradecida de haber tenido una persona como tú, dirigiéndome e indicándome el camino. Cuando descubres el área de la investigación, un mundo muy bonito, pero también difícil a la vez, asusta. Y por eso agradezco que hayas estado presente, y me hayas brindado esta oportunidad, con esa fuerza que te caracteriza. Eres una persona muy positiva y creo que esa es tu mayor virtud.
Pilar, tengo que agradecerte haber compartido conmigo tus enormes conocimientos sobre hongos y biología molecular, y, sobre todo, tu implicación en este trabajo. Gracias por el apoyo también a nivel personal, por haber confiado en mí y haberme dado la oportunidad de aprender contigo.
Por otro lado, quería agradecer a mis queridos amigos Adrián, Lidia y Laura compañeros de laboratorio durante mucho tiempo, y actualmente muy importantes para mí a nivel personal. Espero seguir teniéndoos por mucho más y seguir pegándonos esas charlas y risas que tanto nos gustan. Sois los mejores.
Cómo no mencionar a mi hermana Alba y mi madre, que siempre habéis estado allí, sois mi familia, siempre seréis importantes para mí y agradezco mucho teneros.
Juan y Sergio, habéis sido otro cimiento muy importante para mí a nivel personal. No os puedo estar más agradecida por el apoyo constante y más en momentos difíciles. Sois realmente dos personas muy valiosas y espero poder contar siempre con vosotros.
Quiero expresar también mi gratitud al Servicio de Microbiología Clínica y Enfermedades Infecciosas del Hospital General Universitario Gregorio Marañón, donde se ha desarrollado esta tesis doctoral. Muy especialmente, a la Dra. Emilia Cercenado y al personal del laboratorio de Identificación y Sensibilidad Antibiótica, María, Carmen, Vicky, Belén y Azahara con quienes he compartido el MALDI-TOF, conocimiento y muy buenos ratos durante estos últimos años. También estoy enormemente agradecida al laboratorio de Identificación de Hongos del hospital y al Dr. Jesús Guinea por hacernos fácil el acceso a aislados fúngicos de gran interés que han permitido el desarrollo de esta tesis doctoral. También quiero agradecer al Instituto de Investigación Sanitaria Gregorio Marañón su apoyo a todas nuestras iniciativas y a Eva Carravilla y al resto del personal de la Unidad de Apoyo a la investigación por guiarnos y facilitarnos la tramitación de la protección intelectual de la base de datos.
Fuera del Hospital Gregorio Marañón, que se ha convertido en mi casa durante este tiempo, quiero agradecer la paciencia y el tiempo dedicado a la validación externa de la base de datos de hongos a Marina Oviaño y a Manuel González de Aledo del Servicio de Microbiología del Complejo Hospitalario de A Coruña, a Andrés Canut, José Israel López-Mirones, Carmen Gomez y Silvia Hernáez del Servicio de Microbiología del Hospital Universitario de Álava y a Carmen Castro, Jesús Ortega y Estrella Martín Mazuelos del Servicio de Microbiología del Hospital de Valme. Gracias por haber creído en el proyecto desde el inicio y por todo vuestro apoyo.
Por último, aunque no menos importante, gracias a Luis Mancera, Manuel Arroyo y Gema Méndez, de Clover Biosoft, por abrirnos la puerta del análisis de datos y el Machine Learning y llevarnos de la mano en esta aventura que no deja de sorprendernos y de darnos alegrías. También quiero agradecer el apoyo del Dr.
Tomoaki Uchiki y de Nittobo Ltd. y su interés en nuestros proyectos de MALDI-TOF. La colaboración con Nittobo Ltd. ha financiado gran parte de mi periodo predoctoral, algo muy difícil en los tiempos que corren. Quiero expresar, para concluir, mi gratitud al personal de Beckman/Coulter por habernos dado la oportunidad de aprender el manejo de la espectrometría de masas y darnos acceso a todos los reactivos y software que hemos necesitado; a Bruker Daltonics y Bruker España por tenernos presente y contar con nuestro grupo para proyectos y colaboraciones y a bioMérieux
internacional por creer en nuestra trayectoria con la espectrometría de masas y darnos la oportunidad de conocer su sistema desde dentro y poder desarrollar nuevos proyectos con él. Millones de gracias a todos vosotros, a todas vosotras, por haberme acompañado en este periodo de mi vida y por haberme descubierto distintos aspectos del mundo de la investigación.
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Índice
Resumen/Abstract ... 1
Introducción ... 9
1. Generalidades de los hongos ... 11
1.1. Origen e importancia... 11
1.2. Características de los hongos: estructura y morfología celular ... 12
1.2.1. Levaduras ... 15
1.2.2. Hongos filamentosos ... 16
2. Infección fúngica y epidemiología ... 17
2.1. Candida ... 21
2.2. Cryptococcus ... 22
2.3. Aspergillus ... 24
2.4. Fusarium ... 27
2.5. Scedosporium ... 28
2.6. Mucorales ... 30
2.7. Dermatofitos ... 32
2.8. Hongos dimorfos ... 34
3. Métodos de diagnóstico ... 35
3.1. Métodos convencionales ... 36
3.1.1. Diagnóstico histopatológico ... 36
3.1.2. Cultivo ... 37
3.1.3. Otras técnicas de diagnóstico no dependientes de cultivo ... 39
3.2. Métodos moleculares... 41
3.2.1. Identificación molecular a partir de cultivo ... 41
3.2.2. Detección directa de los hongos en muestras clínicas ... 47
3.3. Métodos proteómicos: espectrometría de masas ... 50
3.3.1. Componentes de un espectrómetro de masas ... 51
3.3.2. Análisis de espectros e identificación de microorganismos ... 56
3.3.3. Espectrómetro de masas MALDI-TOF ... 57
3.3.3.1. Plataformas comerciales ... 58
3.3.3.2. Preparación de las muestras ... 60
3.3.3.3. Otras aplicaciones del espectrómetro de masas MALDI-TOF ... 64
3.3.3.4. Limitaciones de la espectrometría de masas MALDI-TOF ... 66
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Justificación y Objetivos ... 69
1. Justificación ... 71
2. Objetivos ... 72
Material y Métodos ... 75
1. Aislados incluidos ... 77
1.1. Selección de aislados del Hospital Gregorio Marañón ... 77
1.2. Selección de aislados clínicos de otros centros... 77
1.3. Condiciones de crecimiento ... 78
2. Identificación molecular de los aislados ... 79
3. Análisis proteómico ... 82
3.1. Espectrómetro de masas MALDI-TOF Biotyper de Bruker Daltonics ... 82
3.1.1. Identificación ... 82
3.1.2. Creación de la base de datos del Hospital Gregorio Marañón (HGM) ... 86
3.1.3. Validación de la base de datos ... 87
3.1.3.1. Validación interna ... 87
3.1.3.2. Validación externa ... 88
3.1.4. Análisis de espectros proteicos ... 89
4. Espectrómetro de masas MALDI-TOF Vitek MS de bioMérieux ... 90
5. Estadística ... 92
Resultados ... 95
1. Identificación molecular de los aislados ... 97
2. Espectrómetro de masas MALDI-TOF Biotyper de Bruker Daltonics ... 101
2.1. Procesamiento de los aislados ... 101
2.2. Creación de la primera versión de la base HGM ... 101
2.2.1. Validación de la librería inicial HGM ... 102
2.3. Versión final de la base HGM ... 112
2.3.1. Identificación de Aspergillus ... 115
2.4. Evaluación externa de la base HGM por otros centros ... 119
2.4.1. Identificaciones obtenidas por el Centro 1 ... 120
2.4.2. Identificaciones obtenidas por el Centro 2 ... 121
2.4.3. Identificaciones obtenidas por el Centro 3 ... 123
2.5. Análisis de espectros proteicos ... 125
2.5.1. Cryptococcus... 125
2.5.2. Aspergillus ... 130
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3. Espectrómetro de masas MALDI-TOF Vitek MS de bioMérieux ... 137
Discusión ... 141
1. Identificación con el espectrómetro de masas MALDI-TOF de Bruker Daltonics ... 143
1.1. Identificación de Cryptococcus ... 151
1.2. Identificación de Fusarium ... 153
1.3. Identificación de Scedosporium/Lomentospora... 154
1.4. Identificación de Mucorales ... 155
1.5. Identificación de Dermatofitos ... 156
1.6. Identificación de Aspergillus ... 159
2. Validación de la base de datos HGM por otros centros ... 163
3. Identificación con el espectrómetro de masas MALDI-TOF Vitek ... 166
Conclusiones ... 171
Bibliografía ... 175 Anexos
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Resumen/Abstract
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Resumen
Los hongos con relevancia clínica suponen aproximadamente el 0,04% de las especies fúngicas conocidas. Sin embargo, las infecciones fúngicas, que están asociadas a una elevada morbilidad y mortalidad, se han incrementado en las últimas décadas. Esto se ha debido principalmente a los avances en la medicina y las nuevas terapias, que permiten una mayor supervivencia de pacientes inmunodeprimidos especialmente susceptibles a las infecciones causadas por estos microorganismos. A esto se suma la aparición de especies emergentes que muestran susceptibilidad reducida a los tratamientos de elección, lo que pone de manifiesto la importancia del empleo de herramientas rápidas, precisas y fiables para la identificación de los hongos.
La identificación de los agentes causales de estas infecciones se suele realizar mediante métodos tradicionales (macroscópicos y microscópicos) para los que se necesita personal cualificado, o técnicas moleculares (PCR y secuenciación) que son costosas y demoran días los resultados. Por lo tanto, es necesaria la implementación en el laboratorio de Microbiología de técnicas rápidas que adelanten el diagnóstico y que permitan establecer un tratamiento adecuado y rápido de los pacientes.
La espectrometría de masas MALDI-TOF, ha emergido en la pasada década como una herramienta de identificación rápida para un gran número de bacterias y levaduras. Sin embargo, su aplicación es más limitada en el caso de microorganismos más complejos como los hongos filamentosos debido principalmente a dos factores: la falta de protocolos estandarizados de procesamiento de muestras y las limitadas bases de datos específicas. Estas razones fueron el motor para el desarrollo de esta tesis doctoral, en la que se evaluaron dos sistemas de espectrometría de masas -MALDI Biotyper (Bruker Daltonics, Alemania) y Vitek MS (bioMérieux, Francia)- para la identificación de diferentes hongos filamentosos con relevancia clínica pertenecientes a los géneros Aspergillus, Fusarium, Scedosporium/Lomentospora, el orden Mucorales, hongos dermatofitos, y levaduras del complejo Cryptococcus neoformans.
En estudios previos se han planteado diferentes condiciones de preparación de los hongos filamentosos para su análisis mediante MALDI-TOF. En esta tesis doctoral se
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aplicó un método sencillo que emplea etanol - ácido fórmico -acetonitrilo y que ha demostrado ser efectivo para la obtención de espectros de proteínas de alta calidad.
Este método de preparación de muestras permitió identificar más del 90,0% de los aislados analizados con elevada fiabilidad y crear una base de datos propia.
Las bases de datos comerciales para la identificación de hongos filamentosos cuentan con un número muy limitado de espectros de referencia para las especies fúngicas más importantes. Debido a los constantes cambios taxonómicos que caracterizan este grupo, así como la existencia de especies “crípticas”, indistinguibles mediante la observación morfológica, es necesaria una actualización más frecuente de las bases de datos de hongos filamentosos y una mejor representación de las especies con relevancia clínica. Estudios recientes demuestran que la capacidad de identificación de MALDI-TOF es mucho mayor cuando se cuenta con bases de datos ampliadas y actualizadas. Esa es la razón por la que se creó y evaluó una base de datos interna en la que se incluyeron las principales especies de hongos con interés clínico (Hongos filamentosos y Levaduras HGM). La validación interna de esta base de datos permitió la identificación a nivel de especie de la práctica totalidad de los aislados analizados (96,6% - 99,0%). También se realizó una validación externa de la base de datos en tres hospitales nacionales, que lograron una identificación precisa de > 84,0%
de los aislados analizados. Estos resultados demuestran que la base de datos creada es una herramienta eficaz y universal para la identificación rápida de hongos filamentosos.
En este trabajo se exploraron también herramientas de análisis basadas en Machine Learning para clasificar espectros proteicos obtenidos mediante MALDI-TOF con el objetivo de lograr una mayor discriminación de grupos de microorganismos estrechamente relacionados e indistinguibles. Esta metodología se empleó para la discriminación de las especies Cryptococcus neoformas, C. deneoformans y la especie híbrida que forman entre ellas, obteniendo la correcta discriminación en el 100% de los casos con el algoritmo de análisis PLS-DA. También se empleó esta aproximación para la discriminación de las especies del complejo Fumigati y para diferenciar entre
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aislados de A. fumigatus sensu stricto sensibles y resistentes a azoles, obteniéndose un 100% y un 98,5% de clasificaciones correctas, respectivamente.
Por último, se evaluó también el sistema de espectrometría de masas Vitek MS (bioMérieux) para la identificación de hongos filamentosos. Esta herramienta permitió la identificación del 88,5% de los aislados, siendo la gran mayoría identificados a nivel de complejo. Estos resultados sugieren la necesidad de una mejora de la base de datos para el Vitek tal y como recomiendan otros autores.
Abstract
Clinically relevant fungi account for approximately 0,04% of the fungal species described so far. However, fungal infections –associated with high morbidity and mortality– have increased in recent decades mainly due to advances in medicine and new therapies, that improve the survival of immunosuppressed patients, who are particularly prone to infections by these microorganisms. Moreover, the emergence of newspecies with reduced susceptibility to the treatments of choice has highlighted the importance of using fast, precise, and reliable tools for the identification of fungi. The identification of the causative agents of these infections is usually carried out using conventional methods (macroscopic and microscopic) for which qualified personnel is needed, or molecular techniques (PCR and sequencing) that are expensive and delay the final results. Therefore, it is necessary to implement rapid techniques in the Microbiology laboratory to advance in the diagnosis and to initiate an optimal treatment promptly.
MALDI-TOF mass spectrometry has emerged in the past decade as a rapid identification tool for large numbers of bacteria and yeasts. However, its application is more limited in the case of complex microorganisms such as filamentous fungi, mainly due to the following factors: the lack of standardized sample processing protocols and a limited number of specific databases. These reasons constituted the goal of the present study, in which two mass spectrometry systems –MALDI Biotyper (Bruker
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Daltonics, Germany) and Vitek MS (bioMérieux, France)– were evaluated for the identification of different filamentous fungi with clinical relevance, belonging to the genera Aspergillus, Fusarium, Scedosporium/Lomentospora, the order Mucorales, dermatophyte fungi, and yeasts of the Cryptococcus neoformans complex.
In previous studies, different preparation conditions for filamentous fungi have been proposed for their analysis using MALDI-TOF. In this doctoral thesis, a simple method that uses ethanol-formic acid-acetonitrile was applied, which has proven to be effective in obtaining high-quality protein spectra. This sample preparation method made it possible to identify over 90,0% of the isolates analyzed with high reliability and to create our own database.
Commercial databases for the identification of filamentous fungi have a very limited number of reference spectra for the most important fungal species. Due to the constant taxonomic changes that characterize this group, as well as the existence of
“cryptic” species, indistinguishable by morphological observation, a more frequent update of the filamentous fungi databases and a better representation of the clinically relevant species are required. Recent studies show that the identification capacity of MALDI-TOF is much greater when there are expanded and updated databases. That is the reason why an in-house database, in which the main species of fungi of clinical interest (filamentous fungi and HGM yeasts) were included, was created and evaluated. The internal validation of this database allowed the identification at the species level of practically all the isolates analyzed (96,6% - 99,0%). An external validation of the database was also carried out in three national hospitals, which achieved an accurate identification of > 84,0% of the isolates analyzed. These results demonstrated that the database created is an effective and universal tool for the rapid identification of filamentous fungi.
In this study, analysis tools based on Machine Learning were also explored to classify protein spectra obtained by MALDI-TOF in order to achieve greater discrimination of groups of closely related and indistinguishable microorganisms. This
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methodology was used for the discrimination of the Cryptococcus neoformans species, C. deneoformans, and the hybrid isolates from the previous species, obtaining the correct discrimination in 100% of the cases with PLS-DA. This approach was also used for the discrimination of the species of the Fumigati complex and to differentiate between isolates of A. fumigatus sensu stricto sensitive and resistant to azoles, obtaining 100% and 98,5% correct classifications, respectively.
Finally, the Vitek MS (bioMérieux) mass spectrometry system was also evaluated for the identification of filamentous fungi. This tool allowed the identification of 88,5% of the isolates, the vast majority being identified at the complex level. These results suggest the need for a database improvement for Vitek as recommended by other authors.
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Introducción
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1. Generalidades de los hongos
1.1. Origen e importanciaLos hongos son un amplio grupo de organismos cuyo origen se estima hace aproximadamente mil quinientos millones de años. Aunque a día de hoy se considera que pertenecen al Reino Fungi o Eumycota, su actual posición taxonómica ha sido muy discutida a lo largo de los años (Hibbett et al 2007, James et al 2006). Durante mucho tiempo fueron clasificados erróneamente en el Reino Plantae, al tratarse de seres vivos inmóviles con estructuras asentadas en el sustrato sobre el que crecen y posteriormente fueron colocados por Haeckel en el Reino Protista (Romero 2007). La última propuesta de clasificación del reino de los hongos se realizó en el año 2007 (Hibbett et al 2007), clasificándolos más cerca del Reino Animalia (Hawksworth 2006).
Actualmente, se calculan alrededor de 500 mil especies, aunque se estima que el número real podría rondar el millón y medio (Quindós 2015).
La gran mayoría de estos organismos se comporta como saprofitos, simbiontes y comensales. Su importancia en la naturaleza se debe a su capacidad de desintegrar o reciclar casi todos los restos orgánicos permitiendo completar de esta manera el ciclo de la materia y energía. Además, debido a su capacidad de producir metabolitos secundarios presentan interés biotecnológico y biosanitario, tienen gran implicación en programas de control biológico de plagas, son modelos de estudio en áreas como la biología molecular, genética, bioquímica, patogenia, etc. y se emplean como probióticos para el restablecimiento de la flora microbiana intestinal en el ser humano (S. cerevisiae y S. boulardii). Destaca también la producción de fármacos de gran importancia como anidulafungina (Aspergillus nidulans), fumagilina (Aspergillus niger), lovastatina (Aspergillus terreus), micafungina (Coleophoma empetri), penicilinas (Penicillium notatum y P. chrysogenum), cefalosporinas (Acremonium - Cephalosporium), griseofulvina (P. griseofulvum), ácido fusídico (Fusarium spp., Mucor spp.), así como hormonas y enzimas (amilasas, lipasas, proteasas, etc.) entre otros (Arenas & Torres 2019, Bonifaz 2015).
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En la actualidad, el ser humano emplea los hongos, como alimento o para la elaboración de productos como el pan, el vino y cerveza (Saccharomyces cerevisiae) entre muchos otros (Arenas & Torres 2019). Existen también ciertos hongos tóxicos, que son capaces de producir alteraciones de la consciencia debido a su elevado contenido en productos psicotrópicos (Psilocybe zapotecorum y Psilocybe barrerae) (Quindós 2015). De esta manera, es común el envenenamiento ocasionado por la ingestión de hongos macromicetos, conocidos como setas tóxicas (Amanita phalloides, A. muscaria, A. virosa, Lepiota helveola, Psilocybe mexicana) o la ingestión de alimentos contaminados con metabolitos o sustancias precursoras de toxinas fúngicas (aflatoxinas y fusarinas), que cursan con síntomas variables desde alteraciones gastrointestinales a otras de tipo neurológico, pudiendo llegar a producir incluso la muerte (Arenas & Torres 2019, Cepero de García et al 2012).
Sin embargo, existe otro grupo de hongos, constituido por hongos parásitos que viven a costa de otros seres vivos u hospedadores. Pueden comportarse como patógenos primarios o bien como patógenos oportunistas del ser humano, animales, vegetales, insectos u otros hongos. Por lo general, los hongos patógenos suelen afectar a hospedadores con un sistema inmunológico alterado o con enfermedades graves subyacentes (Arenas & Torres 2019, Quindós 2015).
1.2. Características de los hongos: estructura y morfología celular Los hongos son organismos eucariotas que presentan la capacidad de vivir en una gran variedad de hábitats con amplios rangos de temperatura (10-40ºC) y pH (2-9) donde no sobreviven otros seres vivos. Carecen de clorofila, lo que les imposibilita la realización de la fotosíntesis, y por ello deben nutrirse de materia orgánica ya elaborada (heterótrofos) (Quindós 2015).
Todos estos organismos presentan una pared celular rígida, razón por la que se alimentan por absorción de nutrientes, que descomponen previamente gracias a la excreción de enzimas (Arenas & Torres 2019, Quindós 2015). La pared celular da forma a la célula fúngica, controla la permeabilidad celular, protege frente a factores
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ambientales (estrés, lisis osmótica, daños por acción de la luz ultravioleta y productos químicos) y actúa como barrera física contra la acción de otros organismos (Cepero de García et al 2012). Esta estructura es rica en polisacáridos como quitina (polímeros de N-acetilglucosamina), manano (polímeros de manosa), glucano (polímeros de glucosa), una minoría de proteínas glicosiladas y lípidos que suponen el 80-90% del peso celular seco (Figura 1) (Arenas & Torres 2019). Los β-glucanos y la quitina se encuentran en las capas interiores de la pared celular, cuya función principal es estructural, mientras que los mananos se encuentran en las capas exteriores, donde desempeñan una función estructural y están implicados en los procesos de adhesión durante la patogenia. Los mananos constituyen importantes patrones moleculares asociados a patógenos reconocidos por los mecanismos innatos del sistema inmunológico (Quindós 2015).
Además de todos estos componentes presentes en la pared, los pigmentos melanina y esporopolenina también forman parte de esta estructura (Cepero de García et al 2012). El primero es un polímero aromático que confiere color oscuro a las paredes fúngicas de micelio y esporas y es responsable de la resistencia a la lisis enzimática, siendo un factor de virulencia en hongos patógenos (Brakhage et al 1999, Plonka &
Grabacka 2006). Los hongos que presentan melanina en las paredes de sus hifas y esporas se conocen como hongos pigmentados o dematiáceos y las infecciones que causan se conocen como feohifomicosis, mientras que los que carecen de este pigmento en sus paredes son hongos hialinos y causan las hialohifomicosis (Quindós 2015). La esporopolenina, característica de hongos ambientales como Mucor mucedo y Neurospora crassa, es muy resistente a los ataques de agentes químicos y físicos, protegiendo a los hongos de los mismos (Cepero de García et al 2012).
Debajo de la pared celular se encuentra la membrana celular rodeando al citoplasma. La membrana celular de los hongos se encarga principalmente de la protección celular, regulación de la entrada y salida de moléculas e interviene en la síntesis de la pared y cápsula cuando existe (Cepero de García et al 2012). Es una bicapa fosfolipídica en la que se insertan proteínas y esteroles, entre ellos el ergosterol, diferencia fundamental con los animales (colesterol) y plantas
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(fitoesteroles) (Bonifaz 2015). Las principales funciones del ergosterol son el control de la permeabilidad celular y la síntesis de la pared celular. Tanto el ergosterol como la pared fúngica son dianas muy empleadas para la acción de los principales antifúngicos de interés.
Figura 1. Pared celular de los hongos (fuente:
https://hongosmasquecallampas.wordpress.com/tag/que-son-los-hongos/)
De manera general, los hongos se clasifican como macroscópicos y/o microscópicos, en función de su apreciación a simple vista o con la ayuda de un microscopio. Los hongos macroscópicos pueden llegar a medir algunas decenas de centímetros y son las comúnmente denominadas setas (Arenas & Torres 2019). Sin embargo, esta tesis se centra en los hongos microscópicos, que son las que presentan interés clínico.
Los hongos microscópicos presentan dos tipos de morfologías: unicelular, característica de las levaduras y pluricelular, desarrollada por los hongos filamentosos o micelares. Aquellos microorganismos capaces de expresar las dos morfologías son conocidos como hongos dimorfos (Quindós 2015).
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1.2.1. Levaduras
También conocidas como blastoconidios, son hongos unicelulares que poseen una morfología esférica o elíptica. Desarrollan colonias lisas en los medios de cultivo sólidos, mientras que en los medios líquidos producen una turbidez homogénea que sedimenta con el tiempo. En ambos casos se asemejan mucho a las colonias bacterianas con la diferencia de que el tamaño levaduriforme es algo mayor (3-10 µm de ancho y 5-30 µm de largo) (Quindós 2015).
Se reproducen mediante gemación o fisión binaria. En una gemación clásica aparecen uno o más brotes o yemas en la superficie de la célula madre y a medida que se produce la división se reparten el nuevo citoplasma con los orgánulos y núcleo a partir de la célula madre. En ocasiones esta división no termina por completarse, formándose de esta manera cadenas cortas de blastoconidios alargados que simulan hifas y por ello se conocen con el nombre de pseudohifas o pseudomicelio (Quindós 2015). Estas estructuras se han observado en la levadura C. albicans cuando crece en medios de crecimiento pobres en nutrientes (Bonifaz 2015).
Algunos hongos levaduriformes como Cryptococcus neoformans poseen además otra estructura, exterior a la membrana y pared que se conoce como cápsula (Figura 2). Se trata de una capa polisacarídica constituida por los polisacáridos glucoronoxilmanano y galactoxilomanano, que representan el 90% y 8% del peso celular seco, respectivamente, y manoproteínas. La cápsula constituye un importante factor de virulencia y se ha relacionado con la inhibición de la fagocitosis y de la inflamación, así como con la supresión de la inmunidad celular y humoral. De manera particular, los polisacáridos de la cápsula interfieren en la presentación de antígenos, limitan la producción de óxido nítrico que inhibe el crecimiento y daña las células fúngicas e impiden la opsonización de Cryptococcus por el sistema del complemento y anticuerpos. Además, la cápsula se encuentra cargada de forma negativa, generando la repulsión eléctrica de fagocitos y linfocitos efectores (Quindós 2015).
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Figura 2. Cápsula de Cryptococcus neoformans (Castella et al 2008).
1.2.2. Hongos filamentosos
Son estructuras constituidas por un complejo denominado talo o micelio. Éste se encuentra conformado por un conjunto de filamentos o hifas – de diámetro entre 1 y 30 µm-, que consisten en una sucesión de células intercomunicadas entre sí cuyo origen se produce a partir de esporas o fragmentos de otras hifas (Arenas & Torres 2019). En la mayoría de los casos entre célula y célula suelen existir septos (poros centrales) que delimitan parcialmente las diferentes células, conformando de esta manera las denominadas hifas tabicadas (diámetro 2-5 µm). Sin embargo, los hongos menos evolucionados como los Mucorales, carecen de estos septos, caracterizándose por la presencia de las hifas cenocíticas o sifonadas (diámetro 10-15 µm) (Quindós 2015).
Los hongos filamentosos se caracterizan por el desarrollo de típicas colonias algodonosas, vellosas, lanosas o pulverolentas cuando el sustrato sobre el que crecen es sólido. Por el contrario, cuando el medio de crecimiento es líquido estos microorganismos crecen formando agregados que se depositan en el fondo (Quindós 2015).
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En todos los hongos filamentosos que crecen en la superficie de un medio de cultivo se pueden diferenciar dos partes: el micelio vegetativo y el micelio reproductor.
El primero es el que se encuentra sumergido proporcionando la fijación al sustrato de crecimiento y el que asegura el desarrollo, la nutrición y la edificación de la parte reproductora. El segundo es aéreo, encargado de la reproducción y por tanto el portador de las estructuras necesarias para ello (Arenas & Torres 2019).
2. Infección fúngica y epidemiología
Los hongos presentan la capacidad de ocasionar infección en el ser humano (Bongomin et al 2017, Brown et al 2012). La patogenia depende del equilibrio existente entre los factores de virulencia del hongo y el estado general del hospedador (Brown et al 2012). Por lo general, el sistema inmunitario humano es muy eficaz a la hora de eliminar esporas y células fúngicas (Quindós 2015). Sin embargo, bajo determinadas circunstancias este sistema falla y permite que los hongos entren en la célula hospedadora y produzcan infección.
Las principales vías de entrada de los hongos en el hospedador son: i) inhalación de conidios presentes en el aire, ii) contacto con propágulos fúngicos del suelo o de animales, iii) implantación del hongo por traumatismo o por pinchazos con espinas y astillas, iv) ingestión y colonización del aparato digestivo, v) inoculación mediante agujas o catéteres empleados en la administración intravenosa de fármacos, nutrición parenteral, cirugía, o presencia de catéteres, prótesis u otros dispositivos biomédicos (Quindós 2015).
Las infecciones se pueden clasificar en tres grandes grupos en función del tejido que invaden los hongos: superficiales (cutáneas y mucosas), subcutáneas y micosis invasoras o profundas. Estas categorías se pueden solapar, puesto que hay hongos capaces de infectar tejidos superficiales, pero también profundos (Quindós 2015) (Tabla 1).
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Tabla 1. Tipos de infección y agentes etiológicos implicados (Quindós 2015).
Tipo de infección y
tejidos afectados Gravedad Principales agentes etiológicos
Superficial:
capas más externas de piel y cabello. Mucosas
oral y genital.
Leve:
• Sin destrucción celular.
Suponen un mero problema estético.
• Con respuesta inflamatoria que se manifiesta con prurito, descamación, lesiones cutáneas
o alteraciones de las uñas y pelo.
• Malassezia (pitriasis versicolor), Hortaea werneckii (la tiña negra),
Piedraia hortae (piedra negra) y Trichosporon (piedra blanca).
• Dermatofitos (tiñas):
Epidermophyton, Trichophyton y Microsporum; Candida, Aspergillus,
Geotrichum y Trichosporon.
Subcutánea:
capas profundas de la piel, tejido subcutáneo
y músculo.
Moderada a grave:
• Destrucción variable del tejido como consecuencia de la
respuesta inmunitaria del hospedador (micetoma o
eumicetoma).
• Sporothrix (sporotricosis), Pseudallescheria boydii, Madurella mycetomatis, Phialophora verrucosa,
Fonsaeca pedrosoi
(cromoblastomicosis), Mucorales y Entomoftorales.
Profunda o invasiva:
tejidos y órganos.
Grave:
• Las manisfestaciones clínicas dependen del lugar de entrada
del microorganismo y la enfermedad de base
subyacente.
• Hongos primarios o endémicos:
hongos dimorfos.
• Hongos oportunistas: Candida, Cryptococcus, Trichosporon, Rhodotorula, Aspergillus, Fusarium,
Scedosporium y Mucorales entre otros.
Aunque por lo general los hongos han sido relacionados con infecciones superficiales de la piel y las mucosas, las micosis invasivas han ido cobrando cada vez mayor importancia en los hospitales debido a que son difíciles de diagnosticar y causan una elevada morbilidad y mortalidad a pesar del tratamiento antifúngico empleado (Richardson & Lass-Florl 2008). Las micosis invasivas no son consideradas enfermedades de declaración obligatoria, razón por la que las cifras reales de afectados no se conocen con exactitud, lo que dificulta el esclarecimiento de muchos de los factores y variables que influyen en su prevalencia (Bongomin et al 2017). Se estima que entre 1 y 3 % de la población mundial las padece, existiendo una gran variación entre países y dentro de los mismos en función de las condiciones socio -
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sanitarias, las enfermedades y factores de riesgo subyacentes, así como la praxis médica (Quindós 2018).
Los avances en la medicina y las nuevas terapias antifúngicas, tanto en profilaxis como en la terapia dirigida, han aumentado la supervivencia de los pacientes.
Sin embargo, estos avances han favorecido el incremento de individuos inmunodeprimidos que son los especialmente susceptibles a las principales micosis invasivas (Richardson & Lass-Florl 2008). Entre los factores de riesgo más destacables para adquirir una infección fúngica invasiva se encuentran un mayor uso de la quimioterapia, y el aumento de trasplantes como el de progenitores hematopoyéticos o de órganos sólidos que requieren el empleo de inmunosupresores (esteroides, anticuerpos monoclonales, etc.). Los pacientes con quemaduras graves, tratamientos con corticoterapia de al menos 7 días, estancia en UCI de más de 21 días, malnutrición (Meersseman et al 2004, Richardson & Lass-Florl 2008, Ruiz-Camps et al 2011), pacientes con enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC) (Bulpa et al 2007), cirrosis (Dimopoulos et al 2003) o pacientes que se han sometido a una cirugía mayor son también susceptibles (El-Hamamsy et al 2005, Pasqualotto & Denning 2006).
Todos estos factores alteran el sistema inmunitario provocando neutropenia, deficiencias en la fagocitosis y alteraciones en la inmunidad celular, de manera que el desarrollo de las infecciones fúngicas depende del tipo de enfermedad y el perfil del huésped (Pahissa 2010, Segal & Walsh 2006). Por ello, un mayor control sobre las enfermedades de base subyacentes y las terapias antimicrobianas empleadas producen una mejora en el pronóstico del paciente incrementando su supervivencia (Richardson & Lass-Florl 2008).
Actualmente, los hongos con relevancia en el ámbito clínico se agrupan en aproximadamente 200 especies (0,04% de las especies fúngicas conocidas). Entre las levaduras capaces de generar infección destacan los géneros Candida, Cryptococcus, Malassezia, Pneumocystis, Magnusiomyces (Saprochaete), Geotrichum, Rhodotorula, Saccharomyces y Trichosporon. Entre los hongos filamentosos son clínicamente
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importantes los géneros Aspergillus, Fusarium, Scedosporium, Microsporum, Epidermophyton, Trichophyton y el orden Mucorales (Quindós 2015).
Existe un número reducido de hongos que se comporta como patógenos primarios, muy adaptados para la supervivencia en los tejidos que infectan y son capaces de generar infecciones en seres humanos inmunocompetentes, pero también a los que presentan un sistema inmunológico alterado con infecciones más graves.
Este grupo se encuentra conformado en gran parte por los denominados hongos dimorfos, causantes de micosis endémicas geográficamente localizadas. Por otro lado, también existen los parásitos obligatorios entre los hongos, destacando los comúnmente conocidos hongos dermatofitos, capaces de generar infecciones que, aunque son leves, afectan a una gran parte de la población mundial (Arenas & Torres 2019).
Candida y Aspergillus son los agentes etiológicos más frecuentemente implicados en las infecciones por hongos (Bongomin et al 2017, Quindós 2015); sin embargo, en las últimas décadas, se ha producido un aumento significativo del número de infecciones fúngicas oportunistas causadas por hongos menos frecuentes en pacientes inmunodeprimidos, con morbilidad y mortalidad aún más elevada, aunque afortunadamente con menores incidencias globales (Groll et al 1996, Malani &
Kauffman 2007, Pahissa 2010, Peman & Salavert 2014, Ruping et al 2008, Simonsen et al 1998). Entre los hongos patógenos emergentes sobresalen nuevas especies de los géneros Candida, Aspergillus, Scedosporium, Fusarium y Mucorales (Miceli & Lee 2011, Pahissa 2010, Richardson & Lass-Florl 2008), y otras pertenecientes a Acremonium spp., Phialemonium spp., Phaeoacremonium spp, y las levaduras negras, Exophiala, Cladophialophora y Fonsecaea (Guarro 2012). Estos patógenos causan infecciones en la piel, tejidos blandos, huesos, articulaciones, senos nasales y también infecciones generalizadas o localizadas muy graves como peritonitis, neumonías, lesiones cerebrales o incluso fungemia sistémica, en función de las condiciones previas de los pacientes y de las características del hongo (Peman & Salavert 2014). El principal inconveniente de las infecciones fúngicas, y especialmente las causadas por hongos
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menos frecuentes, radica en la dificultad de su diagnóstico y tratamiento, puesto que muchos de estos hongos son resistentes a los antifúngicos convencionales empleados (Ostrosky-Zeichner 2012), lo que lleva asociado una mayor mortalidad (Shao et al 2007).
2.1. Candida
Las especies del género Candida producen infecciones que van desde trastornos muocutáneos a enfermedades invasivas que pueden afectar a cualquier órgano, y son la causa más común de infecciones fúngicas invasivas en los seres humanos (Pappas et al 2016, Pfaller & Diekema 2007). La candidemia es la principal infección producida por Candida, y su incidencia ha aumentado aún con las mejoras introducidas durante los últimos 20 años en los procedimientos de diagnóstico, el desarrollo y comercialización de nuevos antifúngicos y la implementación de estrategias de prevención (Pfaller & Diekema 2007). Una desventaja destacable de estas infecciones es la dificultad de diagnóstico, lo que hace que los verdaderos valores de incidencia y epidemiología sean imprecisos. Se estima que la incidencia por cada 100.000 habitantes oscila entre 1 y 8 casos, aunque en determinados países, puede ser incluso mayor (Guinea 2014). En España ésta se encuentra en torno a 8,1 por 100.000 habitantes. Por otro lado, la mortalidad asociada a la candidemia se encuentra entre 15 a 35% para adultos y 10-15% para recién nacidos (Guinea 2014).
Los pacientes con mayor riesgo de padecer estas infecciones son los ingresados en una Unidad de Cuidados Intensivos, los pacientes neutropénicos con cáncer, aquellos sometidos a procedimientos quirúrgicos y los neonatos prematuros entre otros (Pfaller & Diekema 2007). Además, muchos de los pacientes portan comúnmente catéteres venosos centrales y/o han recibido antibióticos de amplio espectro (Almirante et al 2005).
Al menos 17 especies de Candida son capaces de originar candidiasis sistémica, generando una duración excesiva de la estancia hospitalaria y en consecuencia un
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enorme coste (Morgan et al 2005). Aunque C. albicans es el patógeno fúngico con mayor relevancia en humanos (ocasiona entre 40-75% de las candidiasis), es importante resaltar la incidencia creciente de levaduras como C. glabrata, C.
parapsilosis, C. tropicalis y C. krusei entre otras (Arendrup 2010, Chen et al 2009, Guarro 2012, Pappas et al 2016). Aproximadamente el 95% de las candidiasis se deben a estas cinco especies (Pfaller et al 2004), mientras el porcentaje restante es debido a especies emergentes como C. dubliniensis, C. metapsilosis y C. orthopsilosis (especies crípticas de complejo C. parapsilosis), así como C. nivariensis y C. bracariensis (especies crípticas del complejo de C. glabrata). C. auris es una nueva especie que ha aparecido en los últimos años, muy propensa a formar brotes y cuya mortalidad asociada puede llegar a superar el 40%. Esta levadura se caracteriza por la multirresistencia que presenta a los antifúngicos convencionales empleados (Clancy & Nguyen 2017, Friedman & Schwartz 2019).
El retraso en el diagnóstico y por ende en la instauración del tratamiento dirigido son los principales inconvenientes de estas infecciones (Guinea 2014). Por esta razón es tan importante el empleo de técnicas de diagnóstico rápidas y precisas.
2.2. Cryptococcus
Las levaduras del género Cryptococcus son la segunda causa de enfermedad fúngica invasora causadas por levaduras (Quindós 2018). La infección se adquiere, normalmente, por vía respiratoria y una vez alcanzados los pulmones, puede diseminarse al sistema nervioso central ocasionando la meningitis criptocócica, asociada en pacientes inmunocomprometidos a una mortalidad entre el 20 y el 50%
(Chayakulkeeree & Perfect 2006, Idnurm et al 2005, Speed & Dunt 1995, Zaragoza 2019). Esta especie tuvo especial relevancia con el inicio de la pandemia del VIH por las complicaciones que es capaz de originar (Chayakulkeeree & Perfect 2006, Park et al 2009, Speed & Dunt 1995). Actualmente, gracias a la terapia antirretroviral, la incidencia de la criptococosis se controla de manera eficaz en los países desarrollados, no siendo así en las áreas en desarrollo donde continúa siendo un problema. Se estima
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que causa alrededor de 180.000 muertes en África subsahariana (Zaragoza 2019). En países desarrollados, los pacientes más afectados son los tratados con corticosteroides o con linfoma (Khawcharoenporn et al 2007), así como los receptores de órganos sólidos, en los que la criptococosis es la tercera infección fúngica más común (Baddley et al 2019).
Por lo general, las infecciones criptocócicas se deben a las especies Cryptococcus neoformans y Cryptococcus gatti (Kwon-Chung et al 2014). La primera se encuentra en altas concentraciones en excrementos de aves, y también en productos alimenticios, como la leche de cabras y vacas con mastitis criptocócica, donde se mantiene activa (Quindós 2018). En este caso, la infección se encuentra asociada a una elevada mortalidad en pacientes inmunocomprometidos. C. gattii, por el contrario, se localiza en áreas de clima tropical y subtropical y se asocia con la corteza de eucaliptos (Eucalyptus camaldulensis y Eucalyptus tereticornis) (Speed & Dunt 1995). La principal diferencia respecto a C. neoformans es que C. gattii puede afectar también a individuos inmunocompetentes y se relaciona con una mortalidad más baja, aunque puede ocasionar secuelas neurológicas graves (granulomas cerebrales) (Idnurm et al 2005, Kwon-Chung et al 2014, Quindós 2015, Speed & Dunt 1995). Las especies de los complejos C. neoformans y C. gattii difieren también en su forma de apareamiento, factores de virulencia, características de la enfermedad que producen, distribución, epidemiología y nicho ecológico (Firacative et al 2012).
Hasta hace pocos años la especie Cryptococcus neoformans estaba compuesta por dos variedades, C. var. grubii y C. var. neoformans (Chayakulkeeree & Perfect 2006, Idnurm et al 2005, Kwon-Chung et al 2014). En la actualidad estas dos variedades han adquirido el estatus de especies dentro del complejo C. neoformans (Hagen et al 2017). Mientras C. neoformans sensu stricto (antigua C. neoformans var. grubii) – con tipo molecular VNI/AFLP1 y VNII/AFLP1A y serotipo A- causa la mayoría de las infecciones clínicas en todo el mundo, las infecciones por C. deneoformans (antigua C.
neoformans var. neoformans) - con tipo molecular VNIV/AFLP2 y serotipo D - son más frecuentes en India y ciertas áreas de Europa (Lin & Heitman 2006, McTaggart et al
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2011). Es de desatacar la existencia de híbridos originados por apareamiento entre estas dos especies (VNIII/AFLP3 y serotipo AD) (Lin & Heitman 2006).
2.3. Aspergillus
Los hongos del género Aspergillus pueden colonizar el ser humano y causar: I) alergias que se manifiestan mediante cuadros como la sinusitis alérgica y la aspergilosis broncopulmonar alérgica; II) infecciones locales que cursan como aspergiloma (o bola fúngica) y aspergilosis pulmonar; III) aspergilosis invasora. Se ha notificado también la aspergilosis cutánea primaria en pacientes con quemaduras y en recién nacidos (Papouli et al 1996, Patterson et al 2016), así como otras manifestaciones en forma de onicomicosis u otitis externa (Arastehfar et al 2021).
La aspergilosis es la micosis con mayor relevancia clínica (Ullmann et al 2018).
La incidencia de la aspergilosis invasiva podría ser superior a los 300.000 casos al año (Bongomin et al 2017), mientras las infecciones pulmonares se estiman en unos 16 millones al año (Arastehfar et al 2021). La mortalidad se encuentra alrededor del 30%
(Arastehfar et al 2021), un número elevado, aunque se cree que podría serlo aún más ya que no se suelen realizar autopsias rutinariamente que podrían pasar por alto este tipo de infecciones (Meersseman et al 2004).
Los pacientes de riesgo de aspergilosis son los neutropénicos, los receptores de trasplantes de órganos sólidos o médula ósea, los que están bajo tratamiento con corticosteroides y aquellos que presentan enfermedad granulomatosa crónica entre otros (Dimopoulos et al 2003, Meersseman et al 2004, Patterson et al 2016). Por esta razón, las guías clínicas recomiendan que este tipo de pacientes se sitúen en ambientes protegidos, evitando la exposición, en la medida de lo posible, a las esporas fúngicas del género (Patterson et al 2016).
La taxonomía del género Aspergillus se ha transformado en los últimos años con la introducción de las herramientas moleculares, lo que hace que la identificación a nivel de especie sea un desafío para el micólogo (Samson et al 2014). Se han descrito
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unas 379 especies pertenecientes a 27 secciones o complejos (Houbraken et al 2020).
Entre las especies con mayor relevancia clínica destacan: A. fumigatus, A. flavus, A.
niger, A. terreus, A. versicolor, A. nidulans y A. calidoustus (Steinbach et al 2012), distribuidas en diferentes complejos de especies como Fumigati, Flavi, Terrei, Nigri, Usti, etc. (Houbraken et al 2020) (Figura 3). Se han descrito numerosas especies crípticas en cada uno de los complejos, especialmente en el complejo Fumigati, y se calcula que estas especies crípticas conforman entre el 10% (Balajee et al 2009b), 12%
(Alastruey-Izquierdo et al 2013) y 15,7% (Vidal-Acuna et al 2018) del número total de especies con relevancia clínica del género Aspergillus. El interés en la identificación de estas especies crípticas reside en los factores de virulencia que expresan, así como en los patrones de sensibilidad a antifúngicos disminuidos (Alastruey-Izquierdo et al 2014, Van Der Linden et al 2011).
Figura 3. Fotografías de A. fumigatus (A), A. lentulus (B), A. flavus (C), A. niger (D), A. nidulans (E), A. terreus (F), A. calidoustus (G) y A. sydowii (H) en agar Sabouraud Dextrosa.
La especie A. fumigatus sensu stricto es el hongo filamentoso patógeno más frecuente del género Aspergillus (Lamoth 2016, Yaguchi et al 2007), aunque en los últimos años han ido cobrando mayor relevancia el resto de las especies de la sección
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Fumigati, entre las que se encuentran A. lentulus, A. udagawae, A. viridinutans, A.
thermomutatus (Neosartorya pseudofischeri), A. novofumigatus y A. hiratsukae (Houbraken et al 2020). Estas especies crípticas, además de presentar resistencias antifúngicas producen entre 3 - 6% de los casos de aspergilosis invasiva (Alastruey- Izquierdo et al 2014, Escribano et al 2013, Lamoth 2016, Van Der Linden et al 2011, Yaguchi et al 2007).
Los triazoles son los antifúngicos de primera línea que se utilizan para tratar a los pacientes con aspergilosis invasiva reduciendo las tasas de mortalidad al 30% o menos (Neofytos et al 2009). Estos compuestos inhiben la enzima citocromo P450 lanosterol 14-α-desmetilasa fúngica, que es necesaria para la síntesis del ergosterol, componente principal de membranas celulares de los hongos. Como consecuencia de ello se acumulan en la célula 14 - metil esteroles que son tóxicos para la célula y se ven alteradas las funciones de la membrana celular, lo cual conduce a la detención del crecimiento celular (Arastehfar et al 2021). La enzima lanosterol 14-α-desmetilasa está codificada por los genes cyp51, y cambios en estos genes, especialmente en el gen cyp51A, se traducen en resistencias a azoles. Se ha observado que el amplio uso de los azoles en sectores como la agricultura, la industria y la clínica, promueve una presión selectiva que favorece la aparición de aislados de A. fumigatus sensu stricto resistentes a estos antifúngicos en numerosos nichos (Verweij et al 2015).
Actualmente, se conocen dos rutas de adquisición de la resistencia en A.
fumigatus sensu stricto: 1) ruta clínica o médica, característica en pacientes con tratamientos prolongados con azoles en los que A. fumigatus desarrolla in vivo una resistencia adquirida de novo, 2) ruta ambiental, originada tras la exposición de los aislados a fungicidas azólicos de amplio espectro conocidos como inhibidores de la demetilación (demethylation inhibitors, DMIs) y que tienen resistencia cruzada con los azoles clínicos. De este modo, cuando las esporas de aislados resistentes llegan a los pulmones de pacientes inmunodeprimidos, pueden causar aspergilosis invasiva resistente a azoles, en pacientes que nunca han sido tratados con estos antifúngucos, complicando aún más el tratamiento (Arastehfar et al 2021).
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El gen cyp51A presenta diferentes cambios en función de la ruta de adquisión de la resistencia. Así, los aislados resistentes asociados a la ruta clínica se caracterizan por la presencia de mutaciones puntuales (G54, G138, P216, M220 y G448)(Snelders et al 2008), mientras que la resistencia generada mediante la ruta ambiental suele deberse a repeticiones en tándem (Tandem Repeat - TR) en el promotor de gen, asociadas o no con alguna mutación puntual. Las repticiones en tándem más características suelen ser TR34/L98H, TR46/Y121F/T289A y TR53 (Snelders et al 2008).
2.4. Fusarium
Después de la aspergilosis, los hongos del género Fusarium son la segunda causa de infección por hongos filamentosos, presentando una mortalidad superior al 50% (Fernandez-Cruz et al 2020, Peman & Salavert 2014). La incidencia media de la fusariosis depende de la zona geográfica y la enfermedad de base del paciente (Hoenigl et al 2021). En España se ha estimado en 0,074 episodios por cada 10.000 pacientes hematológicos (Fernandez-Cruz et al 2020).
Este género está constituido por un gran número de especies saprobias o parásitas de plantas que se comportan como oportunistas (Nucci & Anaissie 2007). En pacientes inmunocompetentes puede causar queratitis postraumática y onicomicois, mientras que, en individuos inmunodeprimidos puede llegar a extenderse y generar una infección diseminada. En estos últimos puede afectar múltiples órganos (pulmón, piel, tubo digestivo, hígado, bazo, corazón, riñón y sistema nervioso central) y las infecciones suelen cursar con fiebre persistente y lesiones metastásicas cutáneas (nódulos, úlceras) que pueden evolucionar hacia una necrosis central (Peman &
Salavert 2014).
Se ha demostrado que las especies con mayor relevancia clínica son también complejos de especies entre los que destacan los complejos Solani, Oxysporum y Verticillioides (Guarro 2012, Guarro 2013) (Figura 4). Se han podido diferenciar al menos 70 especies involucradas en infecciones humanas (Guarro 2012), entre ellas F.
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solani, F. oxysporum, F. dimerum, F. chlamydosporum, F. incarnatum, F. proliferatum, F. sambucinum, F. tricinctum y F. fujikuroi (Peman & Salavert 2014). El complejo Solani es responsable de más del 50% de fusariosis severas, seguido por el 20% originado por las especies del complejo Oxysporum (Guarro 2013).
Debido al mal pronóstico asociado a la fusariosis, la prevención resulta fundamental en pacientes inmunodeprimidos con alto riesgo de infección. Por esta razón se recomienda el uso de habitaciones con filtros HEPA y presión positiva, así como la limpieza exhaustiva de duchas y baños (Peman & Salavert 2014).
Figura 4. Fotografías de F. solani (A), F. oxysporum (B), F. verticillioides (C), F. proliferatum (D), F. antophilium (E) y F. dimerum (F) en agar Sabouraud Dextrosa.
2.5. Scedosporium
Las especies del género Scedosporium tienen la capacidad de originar dos tipos de afecciones en el ser humano conocidas como micetoma y escedosporiosis. La primera es característica de pacientes inmunocompetentes como una infección local.
Sin embargo, en pacientes con un sistema inmunitario alterado este hongo es capaz de
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colonizar superficies y cavidades corporales originando infecciones diseminadas con tendencia a invadir el sistema nervioso central (Hoenigl et al 2021, Peman & Salavert 2014). Las infecciones sistémicas por estos hongos se diagnostican, sobre todo, en pacientes inmunodeprimidos, mayoritariamente oncohematológicos, con fibrosis quística, pacientes tratados con corticoides, receptores de trasplante de progenitores hematopoyéticos y de órganos sólidos (Peman & Salavert 2014). La prevalencia e incidencia de la scedosporidiasis en la actualidad es, en gran parte, desconocida (Hoenigl et al 2021), presenta una distribución geográfica variable, y está asociada a unas tasas de mortalidad elevadas (Alvarez-Uria et al 2020). No existen muchos trabajos que aclaren los datos de incidencia y epidemiología de la escedosporiosis, sin embargo, en un estudio reciente se observó una media de 0,15 episodios /10.000 admisiones de escedosporiosis y lomentosporiosis, siendo, además, la tercera infección por hongos filamentosos más común después de la aspergilosis y la mucormicosis (Alvarez-Uria et al 2020).
La taxonomía del género ha sido una de las más controvertidas dentro de los hongos con la continua modificación de las especies implicadas (Gilgado et al 2005, Ramirez-Garcia et al 2018). Actualmente, este género se caracteriza por la presencia de las especies S. aurantiacum, S. minutisporum, S. desertorum, S. cereisporum, S.
dehoogii y el complejo de especies Apiospermum que integra las especies S. angustum, S. apiospermum, S. boydii (antes conocida como Pseudallescheria boydii), S.
ellipsoideum y S. fusarium (Ramirez-Garcia et al 2018) (Figura 5). La especie antes conocida como S. prolificans fue separada de este género y se encuentra hoy en día formando parte del género Lomentospora, con el nombre de L. prolificans. De todas estas especies, las que presentan una importancia especial son S. apiospermum y L.
prolificans. La primera presenta una distribución mundial, mientras la segunda es un patógeno emergente, predominantemente en España, Australia y regiones del sur de EEUU, capaz de ocasionar infecciones diseminadas con una elevada mortalidad y es resistente prácticamente a todos los antifúngicos disponibles (Alvarez-Uria et al 2020, Rodriguez-Tudela et al 2009).
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Figura 5. Fotografías de L. prolificans (A), S. boydii (B) y S. apiospermum (C) en agar Sabouraud Dextrosa.
2.6. Mucorales
Son hongos cenocíticos cosmopolitas capaces de invadir vasos sanguíneos y diseminarse a otros órganos y estructuras adyacentes. Según datos recientes, la incidencia de la mucormicosis podría ser superior a los 10.000 casos al año (Bongomin et al 2017). En España, se han realizado estudios donde la incidencia se ha estimado en 3,3 casos/100.000 ingresos hospitalarios con una mortalidad aproximada del 47,4%
(Guinea et al 2017).
La rapidez en la invasión, gracias a la producción masiva de esporas que producen y su rápido desarrollo, es la principal causa de la elevada mortalidad que generan, entre el 40 y el 80% (Cornely et al 2019). Los Mucorales suelen afectar a pacientes con diabetes mal controlada, insuficiencia renal crónica, neutropenia o inmunodeprimidos, así como aquellos que presentan estados de sobrecarga de hierro y acidosis metabólica (Cornely et al 2019, Peman & Salavert 2014). La mucormicosis cutánea y de tejidos blandos son las formas más comunes de infecciones en pacientes inmunocompetentes y se suelen producir tras la rotura de la piel debido a lesiones producidas en desastres naturales, accidentes de vehículos de motor, bombas explosivas en zonas de guerra, cirugía o quemaduras y se caracterizan por la presencia de abscesos, hinchazón de la piel, necrosis y úlceras secas (Cornely et al 2019). En inmunocomprometidos la mucormicosis se adquiere, generalmente, tras la inhalación
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de esporas originando infecciones pulmonares que se diseminan (Cornely et al 2019).
En pacientes con diabetes mal controlada es común el desarrollo de infecciones orbitorrinocerebrales, en las que el origen son los senos paranasales, con posterior destrucción ósea e invasión del ojo y el cerebro (Bhansali et al 2004). En recién nacidos la mucormicosis suele ser gastrointestinal y está asociada también a una mortalidad elevada (Roilides et al 2009).
Los géneros con importancia clínica en este grupo son Rhizopus, Lichtheimia, Mucor, Cunninghamella y Rhizomucor (Cornely et al 2019) (Figura 6). De todos estos, el género Rhizopus, es el más frecuente generando alrededor del 70% de las micormicosis en Europa (Dolatabadi et al 2015), con R. arrhizus (antigua denominación: R. oryzae) y R. microsporus como especies más relevantes. El género Lichtheimia está compuesto por las especies L. corymbifera, L. ramosa y L. ornata, todas ellas termotolerantes. En cuanto al género Mucor, M. circinelloides es la especie más común, aunque recientemente se han reportado casos relacionados con la especie M. velotinosus. Por otro lado, de los géneros Cunninghamella y Rhizomucor destacan las especies C. bertholletiae y R. pusillus (Guarro 2012, Quindós 2015).
Además de las anteriores, las especies de los géneros Apophysomyces y Saksenaea, auténticos complejos de especies son capaces de ocasionar infecciones muy agresivas y devastadoras que con frecuencia acaban con la vida del paciente en pocos días (Guarro 2012).
Debido a la gran velocidad de crecimiento, capacidad invasora y sensibilidad reducida a los antifúngicos convencionales, el diagnóstico precoz de la mucormicosis es clave para un pronóstico favorable (Peman & Salavert 2014).
