Dinámica de poros transitorios en membranas modelo

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(1)Benemérita Universidad Autónoma de Puebla Facultad de Ciencias Físico-Matemáticas Posgrado en Física Aplicada. Dinámica de poros transitorios en membranas modelo TESIS QUE PARA OBTENER EL TITULO DE: Doctor en ciencias (Física Aplicada) Presenta. LUCIANO MARTÍNEZ BALBUENA. Asesor: Dr. Iván Santamaría Holek / Dr. Fernando Rojas Rodríguez UMDIJ-Facultad de Ciencias, UNAM / FCFM, BUAP. Puebla Pue., Febrero de 2016.

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(3) Benemérita Universidad Autónoma de Puebla Facultad de Ciencias Físico-Matemáticas Posgrado en Física Aplicada. Dinámica de poros transitorios en membranas modelo TESIS QUE PARA OBTENER EL TITULO DE: Doctor en ciencias (Física Aplicada) Presenta. LUCIANO MARTÍNEZ BALBUENA. Asesor: Dr. Iván Santamaría Holek / Dr. Fernando Rojas Rodríguez UMDIJ-Facultad de Ciencias, UNAM / FCFM, BUAP. Miembros del comité tutorial, Febrero de 2016. (Presidente). (Secretario). (Vocal). ....................... Dr. González Jiménez E. FCFM, BUAP. .................... Dr. Reyes Lazalde A. E. de Biología, BUAP. ........................ Dr. Hernández Zapata E. Dto. R. de la Tierra, UAM. Puebla Pue., Febrero de 2016.

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(5) Benemérita Universidad Autónoma de Puebla Facultad de Ciencias Físico-Matemáticas Posgrado en Física Aplicada. Copyright © – Todos los derechos reservados. Luciano Martínez Balbuena, 2016. La copia, almacenamiento y distribución de esta obra, en su totalidad o parte de la misma, para cualquier propósito comercial. La reproducción, el almacenamiento y la distribución para efectos no lucrativos, carácter educativo o de investigación, siempre que indique la fuente y para mantener el mensaje existente.. El contenido de este documento no refleja necesariamente las opiniones de las Facultades, de los asesores o el Comité Tutorial.. Atentamente. (Firma). ................... L. Martínez Balbuena.

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(7) A Valentina y Araceli, las dos terceras partes del todo.. También a ese conjunto de amigos que aún cuando el tiempo ha ido poco a poco dispersando en el espacio, intactos siguen en la memoria. Que estas páginas sirvan como evidencia de que su esfuerzo y confianza siempre fueron y serán valorados..

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(9) Índice general. 1. Introducción 1.1. Mambranas biológicas . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 9 9. I Antecedentes. 15. 2. Vesículas unilamelares gigantes 2.1. Membranas biológicas modelo . . . . . 2.2. Liposomas . . . . . . . . . . . . . . . . 2.3. Propiedades elásticas de las membranas 2.3.1. Medición de los parámetros . .. . . . .. 17 17 20 22 24. . . . . . .. 27 28 31 32 33 35 36. . . . .. . . . .. . . . .. . . . .. 3. Termodinámica 3.1. Primera y segunda ley de la Termodinámica . . 3.1.1. Principios extremales . . . . . . . . . . 3.2. Termodinámica Irreversible Lineal . . . . . . . 3.3. Termodinámica Mesoscópica de No Equilibrio 3.3.1. Fokker-Planck equation . . . . . . . . 3.4. Formación espontánea de liposomas . . . . . .. II. . . . .. . . . . . .. . . . .. . . . . . .. . . . .. . . . . . .. . . . .. . . . . . .. . . . .. . . . . . .. . . . .. . . . . . .. . . . .. . . . . . .. . . . .. . . . . . .. . . . .. . . . . . .. . . . .. . . . . . .. . . . .. . . . . . .. . . . .. . . . . . .. . . . .. . . . . . .. Poros transitorios. 4. Consideraciones iniciales y modelos previos 4.1. Consideraciones iniciales del sistema . . . . . . . 4.2. Modelos previos . . . . . . . . . . . . . . . . . . 4.3. Dinámica del colapso de un poro transitorio . . . 4.3.1. Resultados . . . . . . . . . . . . . . . . 4.4. Discusión sobre el cálculo de la tensión de borde. 41. . . . . .. 43 43 44 47 51 52. 5. Dinámica de poros transitorios 5.1. Termodinámica de una vesícula estirada . . . . . . . . . . . . . . . . . . 5.2. Termodinámica irreversible de Onsager y ecuaciones dinámicas . . . . .. 55 55 58. . . . . .. . . . . .. . . . . .. . . . . .. . . . . .. . . . . .. . . . . .. . . . . .. . . . . .. . . . . .. . . . . .. . . . . .. 3.

(10) Índice general. 5.2.1. Ecuaciones dinámicas y coeficientes de Onsager . . . . . . . . . 5.3. Discusión de los resultados . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. III. Conclusiones y perspectivas. 60 63. 67. 6. Conclusiones. 69. 7. Perspectivas 7.1. Cinética de poros con solubilización de la membrana . . . . . . . . . . . 7.2. Motores moleculares . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 7.2.1. Movimiento autónomo de liposomas . . . . . . . . . . . . . . . .. 71 71 71 72. Anexos. 75. A. Conceptos de Geometría Diferencial. 77. B. Flujo de masa a través de una superficie con poro. 79. 4.

(11) Índice de figuras. 1.1. 1.2. 1.3. 1.4.. Porción de una doble capa lipídica. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 2.1. 2.2. 2.3. 2.4. 2.5.. Estructura de mosaico para las membranas biológicas . . . . . . . . . . . . .. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Radios de curvatura de una superficie bidimensional . . . . . . . . . . . . .. 18 18 19 20 22. 3.1. 3.2. 3.3.. Formación de una vesícula a partir de un brote . . . . . . . . . . . . . . Formación espontánea de una vesícula . . . . . . . . . . . . . . . . . . Energía libre de una vesícula en formación. . . . . . . . . . . . . . . . .. 36 37 39. 4.1. 4.2. 4.3. 4.4. 4.5. 4.6. 4.7.. Formación de un poro en una VUG . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 43 45 46 48 49 50 52. 5.1. 5.2.. Auto-ensamblaje de lípidos. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Fusión y ruptura de la membrana celular. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Esquema de un liposoma auto-propulsado. . . . . . . . . . . . . . . . . . .. Secuencia stomatocyte-discocyte-echinocyte . . . . . . . . . . . . . . . . . Estructuras formadas con moléculas anfifílicas . . . . . . . . . . . . . . . . Rigidez de curvatura. Membrana lipídica con un poro transitorio de radio r . . . . . . . . . . . . . Dinamica de un poro transitorio . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. Colapso de un poro transitorio . . . . . . . . . . Relación entre el ángulo θ y los radios . . . . . Energía libre adimensional F̃(θ) en función de θ Crecimiento y colapso de un poro transitorio . .. . . . .. . . . .. . . . .. . . . .. . . . .. . . . .. . . . .. . . . .. . . . .. . . . .. . . . .. . . . .. . . . .. 10 11 12 13. Secuencia de una vesícula durante el crecimiento y colapso de un poro. . Soluciones numéricas de las ecuaciones dinámicas con los datos experimentales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Soluciones numéricas de las ecuaciones dinámicas con los datos experimentales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Soluciones numéricas de las ecuaciones dinámicas con los datos experimentales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 56. 7.1.. Ilustración del mecanismo de auto-propulsión de una vesícula . . . . . .. 73. A.1.. Curvaturas normales . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .. 78. 5.3. 5.4.. 60 61 62. 5.

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(13) Índice de cuadros. 5.1. 5.2.. Cantidades físicas usadas en los ajustes de los datos experimentales reportados en [?, ?, ?]. . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . Tensión de borde, γ, en poros transitorios . . . . . . . . . . . . . . . . .. 63 65. 7.

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(15) Capítulo. 1. Introducción. D. esde un punto macroscópico se define a una membrana como una placa o lámina flexible cuyo grosor no se compara con su extensión. Otra característica importante es la permeabilidad. En la industria, por ejemplo, la utilidad de las membranas se debe a su capacidad para separar extractos específicos. Las membranas se definen entonces como barreras semi-permeables y su aplicación permite separar sustancias. Particularmente, en procesos de deshidratación, concentración y separación de sustancias, la filtración por membranas ayuda a concentrar sólidos disueltos o en suspensión. Por otro lado, tales estructuras también suelen definirse como una piel delgada. Sin embargo, definir de este modo a las membranas hace pensar que éstas son algo mas complicado que una placa (por el simple hecho de escribir la palabra piel). Esta última definición, con ciertas simplificaciones, es la que se mantendrá a lo largo del presente trabajo. Para darse una idea de la complejidad que encierra la definción de membrana como piel, piense en la tarea de crear una barrera selectiva que haga alguna de las funciones de la piel humana. Siguiendo esta línea biológica y analizando a las membranas desde un punto de vista microscópico se puede dar otra definición: Las membranas, incluyendo a la membrana celular y a las membranas citoplasmáticas, sirven para mantener el contenido de las células y sus organelos. Se componen de lípidos y proteínas; los lípidos (que incluyen fosfolípidos, glicolípidos y esteroles) forman una bicapa en la que las colas hidrófobas se unen a fosfolípidos extremo a extremo, dejando las cabezas hidrófilas expuestas al exterior. (ver Fig. 1.1). 1.1.. Mambranas biológicas. La existencia de membranas biológicas es una característica esencial del mundo biológico. Su importancia se debe a que participan en diversos procesos de forma tal que los seres vivos dependen de alguna manera de ellas. La capacidad de rodear a la célula, separar su contenido celular del medio exterior y formar espacios específicos dentro del citoplasma son funciones conocidas ampliamente. Sin embargo, la función que desempeñan en 9.

(16) Capítulo 1. Introducción. Figura 1.1: Porción de una doble capa lipídica. Los lípidos que forman a la bicapa unen sus extremos hidrófobicos dejando las cabezas hidrófilas expuestas al exterior. diferentes procesos biológicos, así como en la solución de problemas fundamentales como el origen de la vida o su aplicación en innovaciones tenológicas sigue en discusión. La hipótesis del desarrollo de la vida como un organismo heterótrofo sugiere que los nutrientes de las células primitivas fueron incorporados del medio ambiente [?, ?]. Con el fin crear estructuras que reproduzcan el funcionamiento de las células primitivas se utilizan estructuras auto-ensambladas formadas por bicapas lipídicas (liposomas), donde el crecimiento de la estructura y la evolución en su interior usando los recursos del ambiente marca el origen de la vida (vea Fig. 1.2). La incorporación de los nutrientes a través de la membrana es plausible debido a su naturaleza permeable. La selectividad de las moléculas que atraviesan la barrera lipídica se regula con mezclas óptimas de ácidos grasos. Actualmente es posible optimizar la mezcla de moléculas en la membrana de la vesícula para maximizar la permeabilidad del ribosoma, pero minimizar el transporte de polímeros como el ADN. El uso de éstas vesículas ha permitido observar una elongación notable en el ADN atrapado y por lo tanto, simular una célula prebiótica capaz de trabajar con una fuente externa de reactivos [?, ?]. Un proceso celular donde la importancia de la membrana es crucial es la ruptura de la membrana plasmática. Éste es un evento frecuente en distintas células y el mecanismo de reparación es la clave para no morir. La frecuencia de la ruptura, en células musculares esqueléticas y cardíacas de mamíferos, depende directamente del nivel de actividad física y experimentalmente se sabe que las membranas plasmáticas son incapaces de repararse sin ayuda bajo condiciones fisiológicas [?]. Se sabe que sin importar la causa de la ruptura, la membrana plasmática se repara por la fusión de lisosomas que viajan desde el interior de la célula hasta el sitio de la ruptura (ver Fig. 1.3 a). Otros eventos como la fusión célular en la etapa de fertilización, el desarrollo y carcinogénosis [?], la fusión de la membrana en la etapa del desarrollo de virus y las reaccio10.

(17) 1.1 Mambranas biológicas. Figura 1.2: Auto-ensamblaje de lípidos. Ejemplo del proceso de formación espontáneo de una estructura tipo célula.. nes de fusión intracelular en la exo/endocitosis, involucran la fusión de la membrana [?]. Cierto es que las reacciones de fusión en cada caso dependen de interacciones específicas entre proteínas y lípidos; Sin embargo, ciertas características mecánicas importantes son comunes entre ellas. Experimentalmente, por ejemplo, se sabe que las membranas libres de proteínas cuya composición imita a las membranas biológicas no se fusionan incluso estando en contacto durante mucho tiempo [?]. Es válido, por lo tanto, preguntarse sobre las condiciones bajo las cuales las membranas libres de proteínas se fusionan. Para modelar las condiciones de fusión y caracterizar tanto las secuencias como las estructuras intermedias que se forman, usualmente se utilizan arreglos de doble capa como los liposomas. Con estas aproximaciones se han caracterizado dos tipos importantes: la hemifusión y los poros de fusión (un esquema se muestra en la Fig. 1.3b). La hemifusión es una estructura transitoria que representa la conexión entre las hojas externas de las membranas yuxtapuestas. La fusión de las membranas permite el intercambio de lípidos entre ellas y el resultado de la fusión puede conducir a la separación de las membranas o dar lugar a un poro de fusión [?]. Desde el punto de vista físico-químico la fusión de las membranas se puede analizar teóricamente aproximándolas como películas contínuas macroscópicas y permitiendo usar en la descripción la física clásica. Consecuentemente es posible hallar las condiciones que garantizan el estado energético más favorable, la secuencia de las transformaciones estructurales, el costo de energía durante el proceso de fusión y las condiciones bajo las cuales los estados intermedios no presentan barreras de energía que son restricciones cinéticas en el proceso de fusión. Finalmente, el uso de liposomas como posibles vehículos moleculares es una idea aún no desarrollada. Sin embargo, el amplio entendimiento de las características físicas y químicas de tales estructuras (ver capítulo 2) la convierten en una idea atractiva [?]. Actualmente se sabe que su exposición a diferentes esfuerzos mecánicos incrementa la tensión 11.

(18) Capítulo 1. Introducción. a). Ca2+ Membrana plasmática. Membrana plasmática. Figura 1.3: Fusión y Vesícula. Vesículas fusionadas. Poro transitorio Parche. b). Hemifusión. Poro de fusión. ruptura de la membrana celular. a) Dos posibles mecanismos de reparación; la hidrofobicidad de los lípidos favorece la reparación, a la izquierda; la reparación a consecuencia de la fusión entre un parche de vesículas y la membrana plasmática, a la derecha. b) Etapas intermedias en la fusión de una membrana: hemifusión y poros de fusión. Lípidos distintos espontáneamente forman monocapas con curvaturas diferentes según su forma molecular efectiva, extrema derecha.. superficial de la bicapa lipídica, provocando la formación de poros transitorios que colapsan después de expulsar parte del fluido interno [?]. La expulsión de fluido además de disminuir la tensión superficial y la diferencia de presión entre el interior y el exterior del liposoma, provoca un cambio en el momento lineal. Por lo tanto, la formación y colapso de poros induce una fuerza motora en la dirección opuesta a la ruptura, capaz de mover al liposoma una cierta distancia (una ilustración de una vesícula auto-propulsada se muestra en la Fig. 1.4). Es claro que la apertura de un solo poro no permitirá el movimiento dirigido. Sin embargo, es posible provocar la apertura de varios poros en una región específica, permitiendo que la fuerza motora sea casi continua y con dirección determinada. La creación de la cascada de poros puede inducirse por presión osmótica. Para tal propósito los liposomas se pueden preparar en una solución que contenga pequeñas moléculas impermeables a la membrana lipídica y luego colocarlos en una solución acuosa purificada. El desequilibrio en la concentración de soluto dentro y fuera de los liposomas conducirá un flujo osmótico de disolvente a través de la membrana semi-permeable, provocando la hinchazón de la vesícula y el estiramiento de su membrana [?]. Consecuentemente, la tensión superficial aumentará, permitiendo la creación de un poro. Si hay suficiente soluto dentro del liposoma, el proceso podría repetirse hasta agotar al soluto. Como puede notarse, de los procesos mencionados, los poros biológicos son entidades importantes en las células y desempeñan un papel crucial en el control espacial y temporal de los flujos de energía y materia. En términos generales, los poros en las membranas 12.

(19) 1.1 Mambranas biológicas. . ⃗v. Figura 1.4: Esquema de un liposoma auto-propulsado. La salida del interior acuoso promueve un cambio en el momento lineal provocando que el liposoma se desplace.. biológicas tienen diferentes orígenes y sus mecanismos de formación pueden depender de proteínas y péptidos. En la literatura, se sugiere que los poros transitorios se forman más comúnmente después de la interacción entre péptidos y las membranas de lipídicas. Sin embargo, la formación de poros también se ha estudiado en entornos prebióticos, es decir, sin péptidos y proteínas, con el objetivo de entender su papel como mecanismo de transporte en protocélulas modeladas por vesículas unilamelares. La exocitosis y endocitosis implican procesos de fusión de la membrana y la fisión dando lugar a la formación de un poro de fusión, un canal a través del cual se liberan las secreciones de la vesícula al espacio exterior. La formación del poro de fusión se produce a través de la acción de la maquinaria proteica que tiene que aplicar fuerzas mecánicas en el rango de 2 − 20 pN para la apertura del poro. Finalmente, es posible utilizar vesículas unilamelares gigantes como modelo de las membranas biológicas ya que reproducen en gran medida sus caracterísiticas físicas. Estos sistemas, en particular, son muy buenos modelos para la investigación de las características principales de la formación y el colapso de poros transitorios. De hecho, en el caso más simple, la formación y el crecimiento de los poros se generan por fuerzas físicas y no requieren la presencia de proteínas. Este proceso puede ser modelado por la ruptura de un liposoma debido a la hinchazón.. 13.

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(21) Parte I Antecedentes. 15.

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(23) Capítulo. 2. Vesículas unilamelares gigantes. E. n este capítulo se introducirán los conceptos necesarios para el desarrollo ulterior de una teoría capaz de describir la cinética de los poros transitorios formados en liposomas. La finalidad es formular un modelo cuantitativo útil en la descripción y solución de problemas biológicos que involucran formación y colapso de poros transitorios en la membrana celular. Por lo tanto, a continuación se justifica la simplificación de las membranas biológicas a liposomas de lípidos y se describen sus principales características. Más adelante, en el Capítulo 3 se explicarán las bases de la Termodinámica de No-Equilibrio del modelo. Ésta teoría es fundamental en la caracterización de los procesos que se encuentran fuera de equilibrio y, como se verá en el Capítulo 5, el problema de estudio es un ejemplo de ello.. 2.1.. Membranas biológicas modelo. Se sabe que las membranas biológicas son estructuras complejas formadas por una gran variedad de moléculas [?]. Gracias a los esfuerzos de S. J. Singer y G. Nicolson [?], estos sistemas se pueden modelar como una bicapa lipídica donde las moléculas individuales se mueven como en un líquido bidimensional. La doble capa es una mezcla de moléculas de varias especies, como fosfolípidos, glicolípidos y colesterol, entre otras; donde las proteínas de membrana se encuentran incrustadas en la bicapa lipídica, ver Fig. 2.1. La estabilidad de la bicapa se debe principalmente a dos tipos de interacciones no covalentes, las hidrofóbicas y las hidrofílicas. Las hidrofóbicas representan el conjunto de factores termodinámicos necesarios para alejar a los grupos no-polares del agua. Por el contrario, las interacciones hidrófilicas comprenden el conjunto de factores termodinámicos responsables de la preferencia de los grupos iónicos y polares por una solución acuosa. La estructura de doble capa es posible debido a la característica dual de los fosfolípidos. Cuando estas moléculas se disuelven en un solvente (agua por ejemplo), las partes hidrofóbicas tienden a asociarse para evitar el contacto él. Las proteínas que se pueden insertar en ella tienen segmentos hidrofóbicos que tampoco pueden solubilizarse en el solvente, por lo que se asocian con el centro hidrofóbico de la membrana. 17.

(24) Capítulo 2. Vesículas unilamelares gigantes. (a) Bicapa lipídica. (b) Proteínas. (c) Membrana biológica. Figura 2.1: Estructura de mosaico para las membranas biológicas propuesto en [?]. (a) Ilustración de los efectos debidos a las interacciones hidrofílicas e hidrofóbicas. (b) Las proteínas se distribuyen con la bicapa lipídica en la sección transversal de la membrana. (c) La matriz del mosaico está constituida en su mayoría por fosfolípidos.. yte. oc Disc yte atoc m o St ). Disc. 1 Figura 2.2: Secuencia te “stomatocyte-disco ocy Echin cyte-echinocyte”[?]. e ocyt . De izquierda a derecha estomatocitos, discocitos y equinocitos.. Sheetz y Singer introdujeron la hipótesis de la doble capa, como aproximación de una membrana biológica, para entender los mecanismos que causan las diferentes formas que adoptan los glóbulos rojos, ver Fig. 2.2. La explicación se basa el hecho de que las proteínas y los lípidos polares se distribuyen asimétricamente en las dos mitades de la bicapa de la membrana y responden de manera diferente a una perturbación [?]. Esto implica que cualquier diferencia en el área, ∆A0 = Aext − Aint , entre las dos capas produce una curvatura local. Por lo tanto, cualquier proceso que aumente el número de moléculas, o el área por molécula en alguna de las capas producirá un cambio positivo o negativo en ∆A0 . La hipótesis permite concluir que la secuencia llamada “stomatocyte-discocyte-echinocyte” que siguen los glóbulos rojos está controlada por un único parámetro mecánico, el cambio de área ∆A0 , que especifica el grado en que la membrana celular prefiere ser cóncava o convexa [?]. Es importante subrayar que algunas propiedades físicas (mecánicas y termodinámicas) de las membranas de fosfolípido dependen crucialmente del tipo de lípido. Esto se refleja principalmente en la denominada temperatura de transición, Tm . Por debajo de esta tempe18.

(25) 2.1 Membranas biológicas modelo. Micela. Figura 2.3:. Micela invertida. Doble capa. Liposoma. Estructuras formadas con moléculas anfifílicas. Los liposomas o vesículas unilamelares son capaces de almacenar solución acuosa en su interior.. ratura, las moléculas adquieren una estructura tipo gel (sólido amorfo bidimensional). Para temperaturas mayores que Tm , la membrana es fluida. Se ha mostrado cómo Tm depende de las características químicas de los lípidos. Por ejemplo, para una cabeza polar dada (como fosfatidilcolina), Tm se incrementa conforme se incrementa el número de átomos de carbono en la cadena hidrofóbica. Esto se debe a que las cadenas de longitud grande magnifican el efecto hidrofóbico, dando como resultado mayor cohesión entre las moléculas que forman la membrana. De manera similar, la presencia de insaturaciones (dobles enlaces químicos) en las colas hidrofóbicas hacen que Tm disminuya, efecto que depende también de la posición en que se presenta la insaturación. Se ha observado también que la presencia de cierta asimetría entre las dos cadenas que forman la cola hidrofóbica de la molécula, hacen que Tm disminuya. Esto tiene como consecuencia que los fosfolípidos más utilizados para preparar modelos experimentales de membranas biológicas sean aquellos con una cadena saturada y otra insaturada, como es el caso del 1-estearoil-2-oleil-glicero 3-fosfocolina (SOPC), o de mezclas como la lecitina de soya o huevo. Esto asegura que la temperatura de transición, Tm , esté siempre por debajo de la temperatura a la cual se llevan a cabo los experimentos. Las moléculas anfifílicas no solo son capaces de formar membranas biológicas. Cuando estas moléculas (ya sean fosfolípidos o surfactantes) se disuelven en agua, su caracter dual en cuanto a la solubilidad hace que se puedan formar diferentes estructuras, como las micelas (agregados individuales que pueden ser esféricos o cilíndricos) o las bicapas. A su vez, las bicapas pueden adoptar configuraciones en forma de vesículas (agregado esférico), fase lamelar (membranas paralelas), fase cúbica (membranas en arreglo periódico) o fases esponja (bicapas desordenadas pero conectadas). La Fig. 2.3 muestra algunos dibujos representativos de estas estructuras. En particular, en este trabajo se consideran vesículas cerradas de fosfolípidos (liposomas) como sistema modelo de las membranas biológicas, ya que estos son ampliamente 19.

(26) Capítulo 2. Vesículas unilamelares gigantes. Rigidez de curvatura, κ[10−19 J]. Aspiración con micropipetas Espectroscopía. Figura 2.4: Rigidez de curvatura (κ) de. Concentración de sacarosa, [mol/l]. estearoil-fosfatidilcolina como función de la concentración de sacarosa en el bulto. Gráfica tomada de la Ref. [?].. utilizados en situaciones experimentales de nuestro interes.. 2.2.. Liposomas. Las vesículas gigantes son un complejo o conjunto de moléculas anfifílicas unidas por fuerzas físicas (ver Fig. 2.3). A consecuencia de las interacciones con el medio ambiente se ensamblan y organizan sin necesidad de un agente externo. La forma que adquieren depende directamente del tipo de molécula ensamblada y el diámetro promedio está en el rango de 10 a 100 µm [?, ?]. La formación de un agregado y su comportamiento general se puede, por lo tanto, observar mediante técnicas de microscopía óptica. En los años setenta Reeves y Dowben empezaron a fabricar vesículas gigantes en el laboratorio hidratando una película delgada de lípidos previamente depositada sobre una superficie [?]; como resultado se obtenía una población polidispersa de vesículas gigantes. Este procedimiento sigue siendo utilizado hasta nuestros días bajo el nombre de método de hidratación. El procedimiento estándar consiste en eliminar el disolvente orgánico en el que se hallan disueltos los fofolípidos, creando la película lipídica; e hidratar los lípidos con una solución de agua, glucosa y sacarosa, esto último para mejorar el contraste al observar en el microscópio óptico [?]. Como resultado se obtienen vesículas multilamelares con una amplia riqueza en formas y tamaños. Cabe señalar, sin embargo, que experimentos recientes revelan una disminución en la rigidez de curvatura (κ) de liposomas fabricados con fosfatidilcolina y embebidos en una solución de sacarosa [?]. Como se observa en la Fig. 2.4 la elasticidad de la membrana decrece con la concentración de la sacarosa. Por lo que, está en duda la influencia de los azucares en las propiedades mecánicas de los liposomas preparados mediante este método. La riqueza de las formas demuestra que la hidratación de los lípidos es un proceso dinámico; si se aísla una población de vesículas y se cambian ciertas propiedades como la presión o la temperatura las estructuras pueden evolucionar hasta alcanzar configuraciones muy distintas. Por lo tanto, una vesícula aíslada puede estudiarse como un proceso dinámico [?]. Experimentalmente, se han realizado distintos estudios con el fin de observar 20.

(27) 2.2 Liposomas. los cambios de la forma. Se han inducido deformaciones mecánicas, eléctricas y magnéticas; se ha modificado el ambiente acuoso donde están inmersas y la composición de la membrana [?, ?, ?]. Hoy en día se conocen ciertos métodos para obtener configuraciones particulares o para inducir procesos particulares en la membrana [?]. Las características mejor estudiadas de las vesículas gigantes son su estabilidad, la conformación perfectamente esférica que pueden adoptar y la rapidez con que lo logran. Se sabe que una vez formadas pueden permanecer estables por días y que su estabilidad mecánica permite manipularlas sin destruirlas [?, ?, ?]. El por qué y el cómo logran tal estabilidad son cuestiones bastante estudiadas pero aún sin una explicación completa. La Termodinámica explica que adquieren esta forma debido a que las estructuras esféricas tienen una energía mínima. El cómo lo hacen tiene que ver con el proceso cinético seguido durante su formación. Experimentalmente se infiere que para entender completamente a las vesículas gigantes es necesario estudiarlas desde el punto de vista físico-químico; para interpretar, por ejemplo, la relación entre la estructura química de una molécula y su disponibilidad en formar vesículas gigantes. Fabricar poblaciones de vesículas esféricas, unilamelares y gigantes hoy en día es un proceso de rutina. El protocolo es conocido como método de electro-formación y consiste en hidratar la película en presencia de un campo eléctrico típico de 10Hz entre 0.3 y 3 voltios; para obtener esferas unilamelares con radios de hasta 100 µm [?, ?]. El tamaño, la producción y la lamelaridad dependen directamente de la intensidad del campo eléctrico y del tipo de lípido usado. Aún cuando el protocolo para crear vesículas es ampliamente conocido, la explicación del mecanismo de formación a través de campos eléctricos es una pregunta abierta. Hay distintas hipótesis para explicar este fenómeno; por ejemplo, que las bicapas se ionizan al entrar en contacto con el agua y se hinchan debido a la repulsión mutua [?], que el henchimiento de la película se debe a las vibraciones electro-osmóticas del medio [?]. Se piensa, también, que éstas son responsables de las fluctuaciones en la forma de la vesícula, las cuales se manifiestan como vibraciones mecánicas en el medio [?]. La interpretación se apoya en el hecho de que el lípido más usado es fosfatidilcolina, el cual tiene asociado un momento dipolar permanente en su cabeza hidrofóbica. Por lo tanto, mientras el campo eléctrico está encendido el lípido se aleja del electrodo provocando un movimiento periódico u oscilatorio de la capa lipídica. Las oscilaciones suficientemente grandes sin duda contribuyen a la formación de la vesícula [?]. En base a esto se considera que la cinética de formación sigue un mecanismo similar al de un brote (ver sección 3.4 de este capítulo); donde el hinchamiento inicial se debe al movimiento periódico electro-osmótico del medio acuoso en la interface entre los electrodos y el agua. Debido a que las vibraciones son perpendiculares a la superficie del electrodo, las capas superiores depositadas originalmente empiezan a separarse formando una protuberancia con radios entre 10 y 20µm. Luego de esta etapa, las erupciones empiezan a tocarse y debido a las vibraciones la zona de contacto se vuelve inestable ocasionando que las capas se fusionen y formen un brote 21.

(28) Capítulo 2. Vesículas unilamelares gigantes. η̂ 6 20 0 −20 −4 −2. R1 pt pp pp pp pp pp pp R pp 2 pp p. 5 0. 0. 2. 4. −5. Figura 2.5: Radios de curvatura Ri en una superficie bidimensional y el vector normal η̂.. más grande. Para minimizar la energía se adopta una forma cada vez más esférica hasta que el cuello por el cual se une al electrodo se rompe y la vesícula se separa. El nivel de auto-ensamblaje y auto-organización es una característica fascinante de las vesículas gigantes. Desde el punto de vista teórico y experimental se han predicho las estructuras finales dependiendo de ciertos parámetros como el típo de molécula y la energía de curvatura local [?]. Los estudios realizados por Helfrich sobre las formas y ondulaciones de la bicapa [?], los de Evans sobre cómo medir las propiedades mecánicas de los liposomas [?] y las distintas teorías sobre su formación y aspecto propuestas por Helfrich [?], Svetina y Zeks [?, ?], Lipowsky y Seifert [?, ?] han permitido entender distintas propiedades físicas de las vesículas y promoverlas como modelo de las membranas biológicas.. 2.3.. Propiedades elásticas de las membranas. Las membranas biológicas poseen una combinación singular de sus propiedades elásticas, principalmente incompresibilidad y baja rigidez de curvatura. Tales propiedades pueden estudiarse desde un punto de vista unificado considerando la energía libre asociada a sus deformaciones. En particular, la noción de elasticidad de curvatura y la hipótesis de la doble capa permiten proponer mecanismos sobre la formación de ciertos agregados, la morfología estable y las distintas transformaciones que ocurren durante el proceso. Sin embargo, los resultados llevan implícitos aspectos cruciales sobre la naturaleza de la membrana; se asume, por ejemplo, que en equilibrio las vesículas adquieren una forma que minimiza su energía total. Se usa una escala de separación que contempla la diferencia entre el grosor de la membrana y el tamaño de la vesícula, permitiendo en ciertos casos modelar a la bicapa como superficie bi-dimensional. La bicapa se considera un estado fluido por lo que no existen fuerzas de corte dentro de ella. Es común suponer que el número de moléculas formando la vesícula durante un experimento se mantiene constante, esto debido a que las moléculas anfifílicas son principalmente insolubles en un medio acuoso. 22.

(29) 2.3 Propiedades elásticas de las membranas. En general la energía de una bicapa a escala suficientemente grande (sin importar el punto de vista químico o atomístico) depende de las deformaciones de curvatura. Por lo tanto, se escribe como un desarrollo en serie de la curvatura de la membrana siempre que ésta sea pequeña en comparación al inverso de su espesor. En particular, la curvatura de la membrana se puede expandir como función de la curvatura media H y la curvatura gaussiana K (información adicional sobre estos conceptos se presenta en el apéndice A y en la referencia [?]). Es decir, se puede describir a la vesícula como una superficie cerrada bidimensional embebida en el espacio tridimensional. Por eso, igual que a las superficies, la vesícula puede caracterizarse localmente por sus dos radios de curvatura R1 y R2 (la Fig. 2.5 ilustra la definición de radio de curvatura y el apéndice A contiene más información sobre ellas), los cuales determinan sus curvaturas media y gaussiana a través de las siguientes relaciones 1 H≡ 2. (. 1 1 + R1 R2. ) y. K≡. 1 . R1 R2. (2.1). Observe que los Ri tienen un signo asociado con relación al vector normal, η̂, a la superficie. Por lo tanto, ciertas superficies podrán tener curvatura media y gaussiana positiva, cero o negativa; por ejemplo, la superficie tipo silla de montar a caballo tiene curvatura media cero y curvatura gaussiana negativa. Si las deformaciones sobre la vesícula son pequeñas su energía por unidad de área se expresa en función de las curvaturas media y gaussiana como sigue [?] f1 =. κ (H − C0 )2 + κ̄K. 2. (2.2). El módulo de curvatura media, κ, es análogo a la constante de rígidez de un resorte, y puede interpretarse como una constante de rígidez (ante deformaciones de curvatura) de la membrana. Tiene un valor típico de 10−19 J para vesículas de fosfolípidos [?]. El módulo de curvatura gaussiana, κ̄, es del orden de κ y está relacionado con el cambio de ∫ topología de la bicapa; es decir, el término de la curvatura gaussiana, κ̄KdA, favorece superficies con distintas topologías dependiendo del valor de κ̄. Cuando κ̄ ≥ 0 la energía relacionada con el término gaussiano se minimiza si los radios de las curvaturas principales tienen diferente signo; en otras palabras, cuando la curvatura gaussiana es negativa, como en el caso de superficies tipo “silla de montar a caballo”. Por otra parte, cuando κ̄ ≤ 0 el término gaussiano favorece superficies de curvatura gaussiana positiva (radios de curvatura en la misma dirección), contribuyendo a la estabilidad de agregados cerrados tales como vesículas. C0 es la curvatura espontánea y caracteriza las posibles asimetrías de la membrana, lo cual puede deberse a la distinta naturaleza química de las monocapas o a la diferencia química del ambiente dentro y fuera de la vesícula. Usualmente C0 se considera lateralmente homogénea, lo cual implica que no depende de la forma local de la membrana. La curvatura espontánea C0 es la curvatura media que adquiere la bicapa 23.

(30) Capítulo 2. Vesículas unilamelares gigantes. cuando está libre de tensión. Tomando en cuenta la escala de separación, la fluidez de la membrana y la insolubilidad de las moléculas se plantea una forma para la energía de curvatura de la vesícula a través de la siguiente relación [?] I I κ 2 F= (H − C0 ) dA + κ̄ KdA. (2.3) 2 Obsérvese que gracias al teorema de Gauss-Bonet [?] la segunda integral en la ecuación (2.3) es una constante si la vesícula no cambia su topología, lo cual permite ignorar este término. Por otro lado, si la membrana se forma con un solo tipo de moléculas la curvatura espontánea es cero y la energía de la vesícula no depende de su tamaño ya que la integral restante es un escalar adimensional. En particular, la energía libre de curvatura por unidad de área de una vesícula esférica, de acuerdo a la ecuación (2.3), se reduce a FB = A. κb , R2. (2.4). esto debido a que ambas curvaturas principales son idénticas e iguales al inverso del radio R de la vesícula: c1 = c2 = 1/R. Además, se consideran bicapas homogéneas; es decir, se asume que C0 = 0. Aquí, A representa el área de la membrana. En la ecuación (2.4) los módulos de curvatura media y gaussiana están contenidos en el parámetro κb definido a través de la relación κb ≡ 2κ + κ̄.. 2.3.1.. Medición de los parámetros. Los módulos de curvatura media κ y curvatura gaussiana κ̄ son los parámetros más importantes para caracterizar la flexibilidad de las membranas lipídicas a un nivel mesoscópico. Sin embargo, el último rara vez se mide solo, más bien se reporta através de la relación κ̄/κ. Los modelos experimentales más usados para medir κ comprenden vesículas unilamelares gigantes y multicapas lípidicas. Sin embargo, es claro que ambos sistemas presentan propiedades distintas; por ejemplo, en las vesículas unilamelares gigantes su membrana se hidrata completamente y sus fluctuaciones se mantienen libres de constricciones. Por el contrario, la membrana en las multicapas lipídicas presenta interacciones estéricas. Las discrepancias en los sistemas utilizados para la medición implican valores distintos del módulo de curvatura media, κ, para un mismo tipo de lípido (ver [?] y referencias ahí). Las aproximaciones para deducir el módulo de curvatura media hoy en día se pueden clasificar como sigue: (i) técnicas basadas en el análisis de las fluctuaciones térmicas de la membrana en vesículas unilamelares gigantes; (ii) métodos que miden la fuerza necesaria para doblar la membrana a través de micro-pipetas, pinzas ópticas, campos electromagnéticos y luz; (iii) aproximaciones basadas en diferentes técnicas de dispersión; y (iv) 24.

(31) 2.3 Propiedades elásticas de las membranas. simulaciones de dinámica molecular (ver [?] y referencias ahí). Aun cuando existen distintos métodos para medir κ, a la fecha existe una fuerte discusión sobre los valores obtenidos. El problema principal es que los valores reportados difieren considerablemente incluso para el mismo tipo de molécula obtenido con la misma técnica de medición. Estudios recientes muestran que los datos obtenidos dependen, además de la técnica experimental, de las condiciones ambientales. El principal factor que afecta la medición es la temperatura. El uso de moléculas como herramientas de visualización (por ejemplo, en la técnica de aspiración con micro-pipetas se utiliza una alta concentración de azúcar (ver Fig. 2.4); así como el uso de fluorescencia) es otra fuente de desacuerdo. Otra discrepancia de presenta cuando se usan aditivos e inclusiones dentro de la membrana como sales, lípidos cargados y colesterol [?, ?, ?].. 25.

(32)

(33) Capítulo. 3. Termodinámica. L. a Termodinámica estudia las leyes que regulan el intercambio de materia y energía, a nivel macroscópico, en la materia. Desde este marco, una porción de materia bien delimitada es designada con el nombre de sistema, y la evolución en el tiempo del sistema se conoce como proceso. Los estados del sistema se representan por cantidades físicas globales que pueden ser medidas a través de instrumentos y por lo tanto, tienen un valor numérico bien definido. La comprensión general del sistema y sus procesos se establecen en función de conceptos como calor, temperatura y entropía; propios de la Termodinámica. Para describir los fenómenos naturales, desde éste punto de vista, se divide el mundo en sistemas y alrededores; introduciendo para su identificación el concepto de frontera. Por simple que parezca la frontera, ésta determina la naturaleza del sistema y por lo tanto las distintas rutas de su evolución. Formalmente, los estados del sistema se caracterizan por variables de estado, equivalentes a los grados de libertad en la Mecánica Clásica. Estas variables se dividen en intensivas y extensivas. Las primeras son independientes de la masa y las dimensiones del sistema, mientras que las segundas son dependientes de éstas. En casos particulares, el conjunto de variables puede considerarse como parámetros internos y externos. El subconjunto de parámetros internos, bi , se obtiene del resto, ai , a través de una relación funcional, bi = bi [ai ]. La relación que vincula los parámetros se llama ecuación de estado. Las variaciones finitas de los parámetros externos, bi , inducen modificaciones de los parámetros internos, ai ; que se traducen en alteraciones del sistema. Estas perturbaciones se eliminan espontáneamente a través de procesos de transporte y son caracterizados como procesos fuera de equilibrio o procesos irreversibles. Por el contrario, cuando las variaciones de bi suceden a velocidades que tienden a cero los procesos se llaman procesos cuasiestáticos reversibles. Genéricamente se podría decir que el sistema realizó un proceso cuasiestático reversible cuando éste y sus alrededores pueden regresar a su estado inicial sin incrementar la entropía total. Una variable independiente de la naturaleza del sistema (y propia de la descripción termodinámica) es la temperatura, T. Ésta es una propiedad que caracteriza cualquier estado y es suficiente para reconocer si el sistema está interaccionando a través de su frontera. 27.

(34) Capítulo 3. Termodinámica. 3.1.. Primera y segunda ley de la Termodinámica. La primera ley de la Termodinámica tiene como base el principio de conservación de la energía; donde se propone que la energía no se crea ni se destruye, sólo se transforma. En general se establecen tres formas de intercambio de energía que están asociados al flujo de materia, trabajo y calor. Dicha transferencia se realiza a través de la frontera y determina el tipo de sistema en cuestión. En particular, si el intercambio de energía y materia es nulo el sistema es aislado; si sólo permite intercambio de energía pero no de masa, entonces se denomina cerrado. Si intercambia masa y energía el sistema es abierto. El trabajo termodinámico se define como el producto de una fuerza por un desplazamiento, dW = XdY. A diferencia de la definición mecánica, aquí la única restricción (para X y dY) es que la combinación tenga unidades de energía y que Y sea extensiva y X intensiva. Cuando hay involucradas más de una fuerza el trabajo total se calcula como la suma de los trabajos individuales ∑ dW = Xi dYi . (3.1) i. Si el sistema gana energía se asume que el trabajo es positivo y negativo en caso contrario. Igual que en mecánica, esta cantidad es una función dependiente de la trayectoria seguida para realizar el proceso. El calor, dQ, es una forma de intercambio de energía y está asociado con las diferencias de temperatura. Esta forma de intercambio de energía es una medida de la agitación de las moléculas que forman el sistema. Al igual que el trabajo, el calor depende de la trayectoria; y cuando el sistema gana energía dQ es positivo. De manera equivalente a la Mecánica Clásica, en Termodinámica se formula también la conservación de la energía; con la restricción de que el sistema no intercambie materia con sus alrededores (para sistemas cerrados). Se establece entonces que la energía del sistema cambia a consecuencia de los intercambios de trabajo y calor a través de su frontera ∆U = W + Q. ó. dU = dW + dQ.. (3.2). La energía del sistema es una función de estado que no depende de la trayectoria; y en general, depende de los parámetros internos e independientes, ai , que lo definen, entre ellos la temperatura. Por lo tanto, se puede escribir como una función de la siguiente manera U = U [{ai } , T] .. (3.3). La relación (3.3) es fundamental en la Termodinámica y se conoce como ecuación de estado calórica. Cabe destacar que a través de ella se pueden deducir todas las propiedades termodinámicas del sistema dado. Entre las ecuaciones de estado más conocidas se encuentra la del gas ideal: PV = NkB T, donde kB es la constante de Boltzmann. Ésta describe un gas constituido por una especie 28.

(35) 3.1 Primera y segunda ley de la Termodinámica. de partículas cuya presión, P = P(V, N, T), depende del volumen ocupado, el número de partículas y la temperatura. A menudo el formalismo de la Termodinámica se restringe a los procesos cuasiestáticos reversibles. Sin embargo, algunos textos modernos formulan una hipótesis que permite incluir ambos procesos en la descripción. Ésta es conocida como hipótesis de equilibrio local y asume que las variables intensivas están bien definidas en cada volumen elemental del sistema, y las variables extensivas pueden ser caracterizadas por sus correspondientes densidades. Así, las variables termodinámicas se vuelven funciones de la posición y del tiempo. En el formalismo moderno se asume que los cambios de entropía se pueden expresar como la suma de dos partes, dS = de S + di S. (3.4) La primera, de S, considera los cambios (de entropía) debido al flujo de materia y energía a través de la frontera, como establece la ecuación de Gibbs; y la segunda, di S, contempla los cambios (de entropía) generados por los procesos irreversibles dentro del sistema. Los cambios irreversibles di S están relacionados con el flujo dY de alguna cantidad termodinámica, Y, en el intervalo de tiempo dt. Es decir, di S = XdY. (3.5). donde X es la fuerza termodinámica que genera el flujo J = dY/dt. El cambio total de entropía es la suma de ellos di S =. ∑ k. Xk dYk ≥ 0. ó. di S ∑ Xk Jk ≥ 0. = dt k. (3.6). La producción de entropía (y el ritmo de producción de entropía σ = di S/dt) generada por cada proceso irreversible, según la Eq. (3.6), es el producto de la fuerza termodinámica y el flujo que ésta genera. Observe que la desigualdad di S ≥ 0 se mantiene para cualquier tipo de sistema. Por otro lado, se asume que di S ≥ 0 mantiene su validez para todos los posibles subsistemas en que pueda dividirse el sistema original. En éstos términos, la Eq. (3.6) puede tomarse como la segunda ley de la Termodinámica. Esta formulación alternativa permite observar que el cambio total de entropía se debe al calor intercambiado con los alrededores, de S = dQ/T, más una cantidad de calor no compensado, di S, generado por los procesos irreversibles dentro del sistema. Por lo tanto, la variación de la entropía durante cualquier proceso es una consecuencia del intercambio de calor a través de la frontera más una producción interna. Por otro lado, los cambios de entropía generados a través de la frontera, de S, se expresan en función del flujo de materia y energía, los cuales dependen de la naturaleza del sistema: 29.

(36) Capítulo 3. Termodinámica. En sistemas aislados, donde no hay intercambio de energía ni materia, de S = 0. y. di S ≥ 0.. (3.7). Es interesante mencionar que la producción de entropía, di S, cuantifica la energía que se transforma en trabajo disipativo; el necesario para restablecer las alteraciones del sistema a través de los procesos de transporte, activados o saltos de barrera. Observe que el crecimiento de la entropía total, dS = de S + di S, a consecuencia de los procesos irreversibles, se mantiene hasta alcanzar un valor máximo, que corresponde al estado de equilibrio termodinámico del sistema. Para sistemas cerrados, donde sólo hay intercambio de energía, de S =. dQ dU − dW = T T. di S ≥ 0;. y. (3.8). la primera ley establece que dU = dQ + dW. Por lo tanto, para de S se mantiene la ecuación de Gibbs o ecuación fundamental de la Termodinámica. Además, note que dQ es el calor intercambiado por el sistema en el intervalo de tiempo dt y la entropía puede escribirse como función de la energía del sistema más el conjunto de variables de las cuales depende el trabajo, W = W[{Y}]; es decir, S = S[U, {Y}]. En particular, en ausencia de procesos irreversibles, di S = 0, el cambio en la entropía se debe al flujo de calor a través de la frontera. Por lo tanto, sólo en este caso se mantiene la igualdad dU = TdS + dW. (3.9) En caso contrario, la relación que se mantiene es dU = TdS + dW − Tdi S.. (3.10). Cuando el sistema es abierto hay intercambio de energía y materia, y no se cumple la relación dQ = dU − dW. Por lo tanto de S =. dU − dW + (de S)materia T. y. di S ≥ 0,. (3.11). donde (de S)materia representa el intercambio de entropía asociado al flujo de materia entre el sistema y sus alrededores. Finalmente, es importante darse cuenta que la entropía definida a través de la Eq. (3.4) sólo permite obtener cambios y no valores absolutos [?, ?]. Sin embargo, según el teorema de Nerst [?], un valor absoluto de entropía es posible cuando la temperatura del sistema alcanza el cero absoluto. Es decir, S −→ 0 30. cuando. T −→ 0.. (3.12).

(37) 3.1 Primera y segunda ley de la Termodinámica. 3.1.1.. Principios extremales. La relación di S ≥ 0 también se conoce como el principio extremal de la entropía. El principio establece que todos los sistemas aislados evolucionan al estado de equilibrio donde la entropía alcanza su valor máximo. Por ejemplo, en los sistemas a presión y temperatura constantes el cambio positivo de la entropía se debe a los procesos irreversibles dentro del sistema, di S; los cuales se pueden expresar como la evolución de ciertas funciones termodinámicas a sus valores extremos. Tales funciones son los potenciales termodinámicos. Explícitamente, el principio del extremo de entropía establece que a medida que la entropía se maximiza el sistema evoluciona a un estado con mínima energía. Por ejemplo, cuando la entropía, S, y el volumen, V, son constantes el cambio de energía satisface dU = dQ − pdV y la transferencia de calor está dada por dQ = Tde S. Por lo tanto, la variación puede escribirse en función de la producción de − Tdi S − p en la energía, dU = T dS dV, entropía dU = −Tdi S ≤ 0. (3.13) La desigualdad (3.13) establece un mínimo para la energía. Ésta disminución generalmente es consecuencia de la transformación irreversible de energía mecánica en calor. Como un ejemplo particular del principio de minimización de la energía a continuación se analiza la energía libre de Hemholtz. Mínimo de la energía libre de Helmholtz Para un sistema que se mantiene a temperatura, T, y volumen, V, constante se define la energía libre de Helmholtz como sigue F = U − TS;. (3.14). Cuando el sistema es cerrado el cambio en la energía por lo tanto, dF = dU − TdS − S dT. del sistema satisface dU = dQ + dW, y el intercambio de calor se escribe como función de la entropía, dQ = Tde S. Además, para el trabajo mecánico se mantiene la relación − dW = −pdV. En consecuencia, el diferencial de energía libre de Helmholtz, dF = dQ − Td p dV e S − Tdi S, se escribe de la siguiente manera. dF = −Tdi S ≤ 0.. (3.15). Es decir, un sistema cerrado mantenido a temperatura y volumen constante evoluciona de modo que minimiza su energía libre de Helmholtz. Es posible demostrar que F es una función de estado. Una forma simple de hacerlo es suponer que todos los posibles cambios irreversibles que suceden dentro de un sistema abierto son provocados por reacciones químicas; por lo tanto, la producción de entropía 31.

(38) Capítulo 3. Termodinámica. ∑ debe satisfacer Tdi S = − K µk di NK ; que representa el trabajo asociado al cambio del número de partículas de cada especie, NK , en el sistema. La entropía total del sistema, entonces, tiene la siguiente forma funcional TdS = dU + pdV −. ∑. µ k de N K −. ∑. K. µk di NK .. (3.16). K. Observe que los primeros tres términos del lado derecho en la Eq. (3.16) consideran el flujo de materia y energía a través de la frontera (por ser un sistema abierto), mientras que el último se debe a los procesos internos. Si definimos el cambio total de las partículas como dNK = de NK + di NK , el diferencial de la energía libre de Helmholtz se puede escribir así: dF = −pdV − SdT +. ∑. µk dNK. (3.17). K. y obtenemos que ésta es una función de estado dependiente de las variables termodinámicas T, V y NK . Por otro lado, como F = F(T, V, NK ) su diferencial también satisface ( dF =. ∂F ∂V. ). ( dV +. T,NK. ∂F ∂T. ). ( dT + V,NK. ∂F ∂NK. ) dNK. (3.18). T,V. y al comparar con la Eq. (3.17) se obtienen las siguientes equivalencias (. ∂F ∂V. (. ) = −p; T,NK. ∂F ∂T. (. ) = −S V,NK. y. ∂F ∂NK. ) = µK .. (3.19). T,V. Esta relaciones permiten calcular la presión, la entropía y el potencial químico a partir del cambio de la energía libre de Hemholtz (cuando se conoce su forma funcional) como función del volumen, la temperatura y el número de partículas. En caso contrario, cuando la forma funcional de p, S y µK también son conocidas, es posible calcular el volumen y la temperatura del sistema; así como el número de partículas que lo forman.. 3.2.. Termodinámica Irreversible Lineal. Cuando los sistemas se encuentran fuera de equilibrio las leyes de la Termodinámica discutidas en la sección anterior deben complementarse con el principio de conservación de masa y momento para describir la evolución espacial y temporal del sistema [?]. Es importante mencionar que estos principios deben satisfacerse de manera local en cada elemento de volumen y las variables termodinámicas, por lo tanto, se vuelven campos continuos de la posición y el tiempo. En particular, el ritmo de producción de entropía generado por los procesos irreversi32.

(39) 3.3 Termodinámica Mesoscópica de No Equilibrio. bles se obtiene a través de la relación (3.6): σ=. ∑. Xk Jk ≥ 0,. (3.20). K. donde Jk = dYk /dt es el flujo asociado a la fuerza termodinámica Xk , como se estableció en la sección anterior. Cuando el sistema se encuentra cerca del equilibrio los flujos termodinámicos dependen de forma lineal de las fuerzas y por lo tanto, se asume la siguiente relación funcional ∑ Jk = Lkj Xj . (3.21) j. La Ec. (3.21) es uno de los principios de la Termodinámica Irreversible Lineal. Ésta es importante porque permite calcular de manera explicita las ecuaciones que determinan la evolución temporal de las variables de estado Jk =. dζk ∑ = Lkj Xj . dt j. (3.22). Donde {ζk } representa el conjunto de variables termodinámicas que describen al sistema ⃗ y por lo tanto, cuando la fuerza, Xj , es conservativa se cumple la relación X = −∇U[{ζ k }]. Es decir, el conjunto de ecuaciones dinámicas que describen al sistema se obtiene de la evolución de la energía correspondiente, U, respecto a las variables de estado {ζk } ∑ dF dζk =− Lkj . dt dζj j. (3.23). Los coeficientes Lkj que aparecen en las Ecs. (3.21-3.23) son coeficientes fenomenológicos que obedecen las relaciones de reciprocidad de Onsager Lkj = Ljk [?]. Los términos Ljk que aparecen fuera de la diagonal satisfacen condiciones de tipo Lkk Ljj ≥ 14 (Lkj + Ljk )2 . Los coeficientes fenomenológicos contienen información sobre el acoplamiento entre las distintas variables de estado. Como se verá en los siguientes capítulos, los coeficientes Ljk pueden o no ser constantes. En particular, los coeficientes que describen correctamente el colapso de poros transitorios en vesículas esféricas son funciones que dependen de las variables termodinámicas.. 3.3.. Termodinámica Mesoscópica de No Equilibrio. Existen formas alternativas de analizar los sistemas termodinámicos a nivel macroscópico. Sin embargo, todas consideran como punto de partida la hipótesis de equilibrio local; y la diferencia entre ellas se establece en la forma de plantear la hipótesis. Una de las metodologías más recientes es la Termodinámica Mesoscópica de No Equilibrio. En 33.

(40) Capítulo 3. Termodinámica. ella la hipótesis de equilibrio local se plantea desde el punto de vista estadístico y establece que un estado del sistema a nivel mesoscópico queda bien caracterizado por la densidad de probabilidad, ρ[γ, t], de encontrar al sistema en el estado γ en el intervalo (γ, γ + δγ) al tiempo t, donde γ ≡ [{γi }] representa los grados de libertad del sistema en el espacio fase. En este formalismo, la entropía del sistema se define a través del postulado de la entropía de Gibbs [?, ?] ∫ S[γ, t] = Seq − kB. ρ[γ, t] ln. ρ[γ, t] dγ ρeq [γ]. (3.24). donde S[γ, t] y ρ[γ, t] representan la entropía y la distribución de probabilidad en el instante t. En el límite cuando t → ∞ ambas cantidades se aproximan a su valor de referencia ρ[γ, t] → ρeq y S[γ, t] → Seq . En otras palabras, los valores de referencia Seq y ρeq se alcanzan cuando el sistema llega al equilibrio termodinámico. En caso contrario, existe una contribución a la entropía que viene de la desviación de la densidad de probabilidad ρ[γ, t] respecto a su valor de equilibrio ρeq [γ] dada por [?, ?] ( ρeq [γ] ∼ exp. −∆E kB T. ). ( exp. ) ∆S . kB. (3.25). La teoría se complementa con dos ideas fundamentales. La primera plantea que la densidad de probabilidad y el potencial químico son variables conjugadas, y la otra asume la validez en el espacio fase (donde el estado del sistema se escribe en función de promedios estadísticos) de las relaciones fenomenológicas lineales. En general, el objetivo es deducir ecuaciones tipo Fokker-Planck para la densidad de probabilidad a partir de la segunda ley de la Termodinámica (en su formulación local). Como su nombre lo indica, la formulación, permite analizar al sistema a una escala intermedia entre la longitud característica de las moléculas y el tamaño del sistema. Por lo tanto, es posible incorporar las fluctuaciones de las variables termodinámicas en la descripción. La producción de entropía (asociada a los procesos irreversibles) se obtiene de la evolución temporal de la función de densidad de probabilidad, ρ[γ, t], y la condición de normalización. Para ésto note primero que la variación de la Ec. (3.24) es ∫ δ∆S = −kB. ∫ *1 ρ[γ, t] δρ[γ, t] ln dγ − kB δρ[γ, t]dγ, ρeq [γ] . (3.26). donde ∆S ≡ S[γ, t] − Seq ; y la segunda integral representa la condición de normalización. Por otro lado, la evolución de la probabilidad en el espacio γ está gobernada por la ecuación de continuidad ∂ρ[γ, t] ∂ ⃗ =− · Jγ , (3.27) ∂t ∂γ 34.

(41) 3.3 Termodinámica Mesoscópica de No Equilibrio. donde ⃗J(γ, t) es la corriente o densidad de flujo de probabilidad en el espacio γ. Por lo tanto, al tomar a la Ec. (3.26) como una variación temporal y sustituir la ecuación de continuidad, ] ∫ [ ρ[γ, t] ∂ ∂ ⃗ ∆S = kB dγ, · Jγ ln ∂t ∂γ ρeq [γ] e integrar por partes se obtiene la producción de entropía en términos de la función de densidad de probabilidad ∂ ∆S = kB ∂t. ∫. [ ] ∫ ρ[γ, t] ρ[γ, t] ∂ ∂ ⃗ · Jγ ln dγ − kB ⃗Jγ · ln dγ. ∂γ ρeq [γ] ∂γ ρeq [γ]. (3.28). En las fronteras ⃗Jγ es nulo y, por lo tanto, el primer término es igual a cero. Es decir, la producción de entropía tiene la siguiente forma ∫ σ = −kB. ρ[γ, t] ⃗Jγ · ∂ ln dγ. ∂γ ρeq [γ]. (3.29). Es claro que las Ecs. (3.6) y (3.29) representan la misma cantidad. Por lo tanto, la producción de entropía en el espacio γ debe ser positiva para satisfacer la segunda ley de la Termodinámica.. 3.3.1.. Fokker-Planck equation. En este esquema, las fuerzas termodinámicas pueden identificarse como el gradiente (en el espacio γ) del logaritmo de la razón entre la función de densidad de probabilidad al tiempo t, y su valor de equilibrio. Si, además, el sistema está cerca del equilibrio, entonces existe una dependencia lineal entre los flujos y las fuerzas termodinámicas (como se discutió en la sección anterior). Por lo tanto, la densidad de flujo de probabilidad está dado por la siguiente relación ρ[γ, t] ⃗Jγ = −kB L[γ, ρ(γ)] ∂ ln , ∂γ ρeq (γ). (3.30). donde L[γ, ρ(γ)] son los coeficientes fenomenológicos. Al combinar las Ecs. (3.27) y (3.30) se obtiene la evolución temporal de la función de densidad de probabilidad { } ∂ρ[γ, t] ρ[γ, t] ∂ ∂ = kB · L[γ, ρ(γ)] ln . ∂t ∂γ ∂γ ρeq (γ) La cual puede escribirse como sigue (al considerar la ecuación (3.25)) { [ ]} ∂ρ[γ, t] ∂ 1 ∂ρ[γ, t] 1 ∂∆E = · kB L[γ, ρ(γ)] + . ∂t ∂γ ρ[γ, t] ∂γ kB T ∂γ 35.

(42) Capítulo 3. Termodinámica. 3. AK A R A. 2. 1 2. 2πL. Figura 3.1: Formación de una vesícula a partir de un brote. El dominio en el estado 1 minimiza la longitud de su contorno. En el estado 2 aparece un brote con el fin de minimizar la energía. Finalmente, se alcanza la mínima energía formando una vesícula esférica.. Finalmente, si se define el coeficiente de difusión generalizado D≡ se obtiene. kB L[γ, ρ(γ)] ρ[γ, t]. { } ∂ρ Dρ ∂ ∂ρ ∂ · D + ∆E . = ∂t ∂γ ∂γ kB T ∂γ. (3.31). (3.32). La Ec. (3.32) es la ecuación tipo Fokker-Planck para la evolución de la función de densidad de probabilidad en el espacio γ. A partir de ésta es posible construir las ecuaciones de movimiento del sistema calculando el promedio de las variables dγ D ∂ dD =− ∆E + . dt kB T ∂γ ∂γ. (3.33). En la siguiente sección se discute, desde el punto de vista termodinámico, el problema de la formación de las vesículas esféricas a partir de membranas planas. Esta discusión pretende ilustrar la utilidad de los conceptos termodinámicos discutidos a lo largo de este capítulo.. 3.4.. Formación espontánea de liposomas. Los distintos modelos formulados para entender la formación, morfología y transformaciones de las vesículas (discutidos en el capítulo anterior) están basados en la noción de elasticidad de curvatura y la hipótesis de la doble capa. En particular, la ruta de formación que siguen las vesículas observada en la mayoría de las técnicas experimentales se pueden describir a través del mecanismo que imita a un brote. Para ilustrar la idea considere una 36.

(43) 3.4 Formación espontánea de liposomas. Formación espontánea. -. θ r. Membrana plana. Vesícula esférica. Figura 3.2: Esquema de la formación espontánea de una vesícula a partir de una membrana plana.. membrana plana que tiene un pequeño dominio, como se muestra en la Fig. 3.1. Con el fin de minimizar la longitud de borde el dominio buscará adquirir una forma circular. Cuando adquiera un radio L tendrá una energía dada por la siguiente ecuación Fl ≡ 2πγL,. (3.34). donde γ es la tensión lineal. Sin embargo, la forma circular no representa el estado de mínima energía porque la longitud del borde puede reducirse aún más si el dominio forma una protuberancia o brote, como se ilustra en la Fig. 3.1. Para lograr que la membrana se doble fuera del plano es necesario que la energía de borde (Fl ) sobrepase a la de curvatura (FB ). Por lo tanto, durante el proceso existirá una competencia de energías que puede entenderse considerando a la membrana completamente plana con una protuberancia esférica de radio R. Un marco teórico reciente que describe la formación de las vesículas esféricas a partir de membranas planas es el modelo de tazón [?]. El modelo asume que durante el proceso la membrana adopta la forma de un tazón esférico con área, A, constate; como se muestra en la Fig. 3.2. Se establece que la formación depende de la competencia entre dos energías: una (FB dada por la ecuación 2.4) asociada con la curvatura que favorece a las membranas planas y otra (Fl = γl, donde γ es la tensión del borde y l la longitud del contorno) debida al contorno de la membrana que favorece a las vesículas esféricas. El esquema está restringido a bicapas homogéneas; es decir, se asume que c0 = 0. Además, al ser una vesícula esférica ambas curvaturas principales son idénticas. Por lo tanto, la energía total (F = FB + Fl ) se puede escribir en términos de un solo parámetro (en este caso el ángulo θ ilustrado en la Fig. 3.2) debido a que el área del tazón es A = 2πR2 (1+cos θ) y la longitud del contorno está dada por l = 2πR sin θ [?] F F̃ = = 2πκb. {. ( )} θ 1 + cos θ + δ sin 2. (3.35). donde κb = 2κ + κ̄ y el parámetro δ está definido a través de la siguiente relación √ δ=. Aγ . π κb. (3.36) 37.