Aminoácidos y Proteínas
Aminoácidos y Proteínas
I.I.
ASPECTOS TEÓRICOS:
ASPECTOS TEÓRICOS:
Proteínas.-Proteínas.- coconsnstititutuye ye ununo o de de lolos s grgrupupos os de de cocompmpueueststos os de de mamayoyor r
importancia en los sistemas biológicos junto con los carbohidratos y los importancia en los sistemas biológicos junto con los carbohidratos y los lípidos.
lípidos. Las
Las proproteíteínas nas son son molmolécuéculas las giggigantantes es comcompupuestestas as quíquímicmicameamente nte por por polímeros naturales (sus pesos moleculares varían desde varios miles hasta polímeros naturales (sus pesos moleculares varían desde varios miles hasta muchos millones) cuyas unidades (monómeros) son los aminoácidos. Las muchos millones) cuyas unidades (monómeros) son los aminoácidos. Las proteínas son más complejas que los
proteínas son más complejas que los polisacáridos porque las unidades quepolisacáridos porque las unidades que forman las proteínas no son idénticas.
forman las proteínas no son idénticas.
La composición promedio de las proteínas es de aproximadamente 50% de La composición promedio de las proteínas es de aproximadamente 50% de carbono, 2,5% de oxígeno. 15% de nitrógeno, 8% de hidrógeno y algunas carbono, 2,5% de oxígeno. 15% de nitrógeno, 8% de hidrógeno y algunas contienen azufre o fósforo.
contienen azufre o fósforo.
Casi todas las proteínas resultan ser polímeros de los α-aminoácidos pues Casi todas las proteínas resultan ser polímeros de los α-aminoácidos pues tienen un grupo amino de naturaleza básica y otro grupo carboxilo de tienen un grupo amino de naturaleza básica y otro grupo carboxilo de naturaleza ácida. Actualmente se conocen unos 100 aminoácidos, pero los naturaleza ácida. Actualmente se conocen unos 100 aminoácidos, pero los más comúnmente encontrados son solo 20.
más comúnmente encontrados son solo 20.
Los α-aminoácidos se diferencian entre si casi siempre por la estructura del Los α-aminoácidos se diferencian entre si casi siempre por la estructura del grupo –R, que puede ser alifático, alicíclico, aromático y heterocíclico, etc. grupo –R, que puede ser alifático, alicíclico, aromático y heterocíclico, etc. Pudiendo demás haber otros grupos amino, carboxilo o diferentes.
Pudiendo demás haber otros grupos amino, carboxilo o diferentes. El carbono alfa, al ser
El carbono alfa, al ser asimétrico puede existir también en 2 configuracionesasimétrico puede existir también en 2 configuraciones diferentes, por esta razón es que
diferentes, por esta razón es que casi todos son ópticamente activos.casi todos son ópticamente activos.
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• Enlace Peptídico.-Enlace Peptídico.- Los aminoácidos se unen mediante enlace peptídico queLos aminoácidos se unen mediante enlace peptídico que
es del tipo “amida” producido entre el grupo carboxilo de una unidad, y el es del tipo “amida” producido entre el grupo carboxilo de una unidad, y el grupo amino de la otra. La unión de dos aminoácidos da lugar a un grupo amino de la otra. La unión de dos aminoácidos da lugar a un dipéptido, tres a un tripéptido. las cadenas de gran tamaño se denominan dipéptido, tres a un tripéptido. las cadenas de gran tamaño se denominan proteínas y pueden contener más de 10000 aminoácidos.
proteínas y pueden contener más de 10000 aminoácidos.
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• Carácter Anfótero.-Carácter Anfótero.- Esta propiedad se debe a la presencia de gruposEsta propiedad se debe a la presencia de grupos
ácidos (-COOH) y básicos (-NH ácidos (-COOH) y básicos (-NH22))..
Según el ph del medio se dará lugar a la predominancia de unas cargas Según el ph del medio se dará lugar a la predominancia de unas cargas sobre otras y esto ocasionará que se pueda comportar como ácido o como sobre otras y esto ocasionará que se pueda comportar como ácido o como base. Si no existe predominancia el aminoácido o proteína estará en su base. Si no existe predominancia el aminoácido o proteína estará en su “forma neutra”
“forma neutra”
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• Punto Isoeléctrico.-Punto Isoeléctrico.- Se le llama p.I. a aquel pH (característico para cadaSe le llama p.I. a aquel pH (característico para cada
proteína o aminoácido) en el cual la “forma neutra” se encuentra presente proteína o aminoácido) en el cual la “forma neutra” se encuentra presente en la máxima cantidad. En el p.I. los aminoácidos y proteínas son menos en la máxima cantidad. En el p.I. los aminoácidos y proteínas son menos solubles, por lo que si conocimientos es muy útil en su aislamientos y solubles, por lo que si conocimientos es muy útil en su aislamientos y purificación.
purificación.
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• PrecipitaciPrecipitación con ón con iones.-iones.- Algunos cationes de metales pesados (AgAlgunos cationes de metales pesados (Ag+2+2, Hg, Hg+2+2,,
Cu
la precipitación de las proteínas. Los cationes metálicos reaccionan con las proteínas cuando éstas se encuentran en su forma aniónica o básica (con mayor ph que su pI) dando sales con los iones carboxilato de proteína. También los aniones formarán sales con las proteínas cuando éstas se encuentren en su forma catiónica o ácida (con ph menor que su punto isoeléctrico)
• Desnaturalización de las proteínas.
-
se da cuando se modifica únicamenteel ordenamiento espacial de la cadena (estructura secundaria y terciaria) por destrucción de las fuerzas intermoleculares que mantienen esta disposición geométrica, sin alteración de los enlaces peptídicos, manteniéndose además la estructura primaria. Estas proteínas suelen ser más reactivas y mas fácilmente hidrolizadas pro las enzimas
• Reacciones de
Coloración.- Reacción con Ninhidrina.- El grupo α -amino de los aminoácidos forma complejos coloreados con la ninhidrina: violeta azuloso en la mayoría de los aminoácidos cuyo grupo amino es primario, amarillo para la prolina e hidroxiprolina y café para la asparagina que tiene un grupo amido en la cadena lateral. Esta reacción también identifica los grupos α-amino libres presentes en péptidos y proteínas.
Reacción Xantoproteica.- Esta reacción permite detectar la presencia de los grupos aromáticos de ciertos aminoácidos. El ácido nítrico en presencia de esos grupos aromáticos da lugar a la formación de derivados nitrados de color amarrillo que por alcalinización intensifican su color.
Prueba de Millón.- El anillo fenólico tiene un comportamiento característico frente a las sales de mercurio a pH. Ácido, formando complejos color rojo ladrillo o rojo salmón con el anillo fenólico de la tirosina y las proteínas que la contienen.
Pruebas para aminoácidos azufrados.- Todos los aminoácidos azufrados o las proteínas que las contienen reaccionan con el acetato de plomo en medio alcalino formándose el sulfuro de plomo, tomando una solución color marrón o gris oscuro. Esto es porque el azufre se libera e medio alcalino y a ebullición, formando una sal de plomo.
Reacción de Biuret.- Las proteínas y péptidos que contienen por lo menos 3 unidades de aminoácidos (2 enlaces peptídicos) dan una coloración violeta característica al reaccionar (en medio alcalino) con una solución de sulfato cúprico. Esta prueb es utilizada para detectar la presencia de enlaces peptídicos y también en la determinación cuantitativa de proteínas. Es negativa con los dipéptidos y con los aminoácidos libres.
II.
DISCUCIÓN DE RESULTADOS:
1.-Reacción con Ninhidrina:
presencia de aminoácidos libres
A 3 tubos de ensayo distintos se agregó 1mL de: glicina, albúmina y
muestra problema. Y luego a todos los tubos se agrego 2 gotas de solución de ninhidrina al 0,3%.
Despues de calentarse los 3 tubos, 3 minutos en baño maria se observó: De los 3 tubos de ensayo solo reacciona positiva la glicina tornándose de un
color casi violeta debido a un producto de condensación entre el aminoácido y el reactivo. La muestra problema 2-b no reaccionó
2.-Reacción con Xantoproteica:
presencia de aminoácidos aromáticos
A 5 tubos de ensayo se les colocó 1mL de: tirosina, triptófano, glicina,
albúmina y muestra problema. Luego se les añadió 1 mL de ácido nítrico concentrado. Se calentaron por 3 minutos en baño maría, y por último se añade a todos los tubos 1 mL de hidróxido de sodio al 20%.
De los 5 tubos de ensayo solo reaccionan positivamente los de la tirosina, el
triptófano y la glicina, tornándose estos de color amarrillo que por alcalinización intensifican su color. La muestra problema 2-b no reaccionó
3.-Prueba de Millón:
presencia de restos fenólicos
A cada uno de los 3 tubos de ensayo se les colocó 1mL de: tirosina,
albúmina y muestra problema. A todos los tubos luego se les agregó 5 gotas de reactivo de Millón, se les calentó por 3 minutos en baño maría y se observó.
La tirosina reaccionó positivamente pues ésta indicó un color rojo salmón
intenso. La albúmina reaccionó parcialmente pues tiene restos fenólicos pero son muy pocos y entre enlaces muy alternados, por eso ésta se torno de color rosado. También se observo que la muestra problema 2-b no reaccionó
4.- Prueba de aminoácidos azufrados
En cada uno de los 3 tubos colocar 20 gotas de soluciones: cisteína,
albúmina y muestra problema (2b). Luegó se agregaron 2 gotas de NaOH al 40% y se calentó en baño maría durante 5 minutos. Después de pasado este tiempo se añadieron 5 gotas de acetato de plomo al 10% y se observó
La cisteína y la muestra problema son los únicos tubos que reaccionan
tornándose grises ambos.
A 20 gotas de solución acuosa de albúmina, se le añaden 20 gotas de
hidróxido de sodio al 10%. Luego una gota de solución de sulfato de cobre al 1% y se observa el color que se forma.
Se observa que la solución se torna violeta pues exite la presencia de por lo
menos 3 unidades de aminoácidos y 2 enlaces peptídicos. Con un aminoácido esta prueba sale negativa mientras que con la muestra problema sale negativa.
6.-Desnaturalización de albúmina
En 5 tubos de ensayo se coloca 20 gotas de solución de albúmina.
En el primer tubo se calienta, observando la temperatura de coagulación Al segundo se le adiciona 4ml de alcohol etílico
Al tercero se le adiciona unas gotas de ácido clorhídrico concentrado Al cuarto se le añade ácido nítrico concentrado
Al quinto tubo se le añade 4ml de solución concentrada de hidróxido de
sodio.
Se observa que en todos los casos la reacción es positiva , por lo tanto en
todos los casos se produce coagulación
7.-Precipitación de proteínas mediante cationes
A cada uno de los 6 tubos adicionar las siguientes soluciones. Tubo A: 3mL de agua
Tubo B: 3mL de solución de albúmina
Tubo C: 3mL de agua más 3 gotas de ácido clorhídrico 10%
Tubo D: 3mL de solución de albúmina mas 3 gotas de ácido clorhídrico al
10%
Tubo E: 3mL de agua mas 3 gotas de solución de NaOH al 10%
Tubo F: 3mL de solución de albúmina mas 3 gotas de solución de NaOH al
10%
Se adiciona a todos los tubos 20 gotas de Sulfato de Cobre al 10% y se
observa:
o Solo el tubo E precita muy positivamente.
8.-Precipitación de proteínas mediante aniones
Solo a los tubos b,d y f del ensayo anterior se les adiciona 2 gotas de solución de Ferricianuro de Potasio.
Se observa que solo el tubo F precipita muy positivamente.III. CUESTIONARIO:
1.- ¿Cuál es el grupo responsable de la reacción positiva con la prueba Xantoproteica? La Seroalbumina dará positiva la reacción?
La reacción nos permite detectar la presencia de grupos aromáticos por lo tanto éste sería el grupo responsable para que la reacción xantoproteica se lleve a cabo de forma positiva. La manera de detectar esto será por la formación de derivados nitrados de color amarillo que por la alcalinización intensifican su color a través del uso de ácido nítrico.
Las albúminas más importantes son: Seroalbúmina (sangre), ovoalbúmina (huevo), lactoalbúmina (leche). La seroalbúmina es la proteína más importante del plasma de la sangre. Las concentraciones bajas de esta sustancia se presentan en las personas que padecen de malnutrición, inflamación y enfermedades graves del hígado y el riñón.
La albúmina sérica, o seroalbúmina, se encarga de transportar sustancias de naturaleza química muy diversa, como ácidos grasos, aminoácidos, esteroides, metales (como el calcio), y numerosos fármacos, facilitando la transferencia de muchas de ellas desde la circulación sanguínea a órganos como el hígado, el riñón, el intestino y el cerebro. Por este motivo existen receptores de superficie para albúmina en las células de estos órganos. Su principal función es regular la presión coloidosmótica de la sangre, y presenta una gran afinidad por pequeñas moléculas hidrofóbicas cargadas negativamente. La seroalbúmina está formada por 585 aminoácidos. Por lo tanto, al ser un tipo de albúmina no reacciona positivamente en la reacción xantoproteica.
2.- ¿La albúmina de huevo contiene aminoácidos azufrados?
La albúmina de huevo contiene aminoácidos azufrados en su composición, ya que al realizar la prueba para encontrar aminoácidos azufrados y a las proteínas que la contienen; esta dio positivo.
La prueba se realizo añadiendo 20 gotas de albúmina en un tubo de ensayo. Luego, agregar 8 gotas de NaOH al 40% y calentar. Finalmente, añadir 5 gotas de acetato de plomo al 10% y observamos el cambio de color.
La reacción nos da una solución que cambio a un color marrón. La reacción es positiva, por lo que se entiende que la albúmina presenta aminoácidos azufrados.
Esta prueba fue efectiva, pues la albúmina o clara tiene una glucoproteina llamada ovomucoide (12% de su composición) que contiene aminoácidos azufrados.
3.- ¿Cuál o cuáles de los siguientes aminoácidos dan positiva con el reactivo de Millón?
-triptofano -tirosina
-fenilalanina
Ya que en su estructura presentan restos fenólicos. Los cuales presentan una coloración rojo-salmón al reaccionar con el reactivo de millón (mezcla de mercurio y acido nítrico).
4.- ¿Con qué prueba reconocería Ud. Los enlaces peptídicos de una proteína?
Con la reacción de Biuret, ya que las proteínas y péptidos dan una coloración violeta característica la reaccionar con una solución sulfato cúprico
.
5.- Si se tiene una solución neutra de proteína y se le añade algunos mL de soda al 10%. Indicar si precipita la proteína al añadir unos mL. de:
a).- Ferricianuro de potasio b).- Sulfato de cobre (II)
La soda vuelve a la proteína a su forma básica o aniónica en la cual forma precipitados sólo con cationes.
Entonces sólo con el Sulfato de cobre (metal pesado-cationes) se forma precipitado y no con el ferricianuro de potasio (aniones).
6.- Explique a qué se debe el fenómeno de la desnaturalización de las proteínas.
Las atracciones intermoleculares débiles conservan con delicadeza la estructura terciaria de una molécula globular. Con frecuencia un ligero cambio en la temperatura o en el pH la estructura terciaria y causa que la proteína se desnaturalice. La desnaturalización ocurre en condiciones tan suaves que la estructura primaria permanece intacta, pero la estructura terciaria se desdobla de una forma globular específica a una cadena enrollada al azar.
7.- ¿Por qué el ácido nítrico produce una coloración amarrilla cuando se pone en contacto con un pedazo de cabello o piel?
El acido nítrico concentrado, al reaccionar con proteínas hace que los anillos aromáticos presentes en algunos aminoácidos forme un compuesto aromático nitrado de color amarillo o anaranjado, cuando las proteínas son tratadas con ácido nítrico concentrado. La prueba da resultado positivo en aquellas proteínas con aminoácidos portadores de grupos bencénicos, tirosina, fenilananina, y triptófano; especialmente en presencia de tirosina. Si una vez realizada la prueba se neutraliza con un álcali vira a un color anaranjado oscuro.
Tanto el cabello como la piel se componen de queratina que es una pro la cual a su vez esta compuesta de aminoácidos azufrados los cuales reaccionan con acido nítrico produciéndose la coloración amarilla por la reacción antes mencionada.
8.- ¿Cómo separaría Ud. Una mezcla de aminoácidos?
La separación de aminoácidos se puede llevar a cabo por cromatografía en capa fina empleando diversos tipos de fases estacionarias en la modalidad de cromatografía de adsorción. El gel de sílice es la fase estacionaria con la que mejores resultados se obtienen.
Introducir la fase móvil en la cámara de desarrollo, de forma que alcance un nivel de 1 cm aproximadamente, y tapar para que toda la atmósfera interior se sature del eluyente. Cortar una placa cromatográfica, con unas dimensiones aproximadas de 5x10 cm.
Con ayuda de una regla y un lápiz, trazar muy suavemente sobre la placa, señalar 2 puntos equidistantes de los bordes y entre si, 1 cm del borde inferior. Depositar de forma espaciada entre 5 y 10 µ L de cada una de las disoluciones
patrón de aminoácidos, así como la del problema, sobre los puntos anteriores Se deberá evitar que las manchas se extiendan excesivamente (no más de 0.5 cm de diámetro).
Dejar secar la placa entre 15 y 20 minutos.
Introducir la placa en la cámara de desarrollo, cerrar la cubeta y esperar hasta que el líquido eluyente (fase móvil) suba hasta las proximidades del borde superior (aprox. 90-120 minutos). Sacar la placa y marcar con cuidado la posición que ha alcanzado el frente de disolvente. Secar la placa durante unos 10 minutos. A continuación, pulverizar sobre ella la disolución de ninhidrina, y secar de nuevo durante otros 10 minutos. Al cabo de ese tiempo, deberán hacerse claramente visibles las manchas correspondientes a cada uno de los aminoácidos.
Medir los valores de Rf de cada uno de los aminoácidos e identificar los que
están presentes en la disolución problema.
9.- Haga la ecuación de la reacción entre Nihidrina y un aminoácido. Aplicaciones de esta reacción
Esta técnica se utiliza para detectar concentraciones bajas de aminoácidos, utilizándose para revelar su presencia en cromatogramas y fracciones procedentes de otras técnicas de separación. La presencia de aldehídos resultantes de la degradación de la ninhidrina por reacción con los aminoácidos modifica, bajo ciertas condiciones, el color formado, lo que sirve para identificar el tipo de aminoácido.
La ninhidrina (hidrato de tricetohidrindeno) reacciona con aminoácidos
que tengan el grupo amino libre, dando lugar a la formación de amoniaco y anhídrido carbónico, con reducción del reactivo (ninhidrina) a hidrindantina . La hidrindantina reacciona a su vez con el amoniaco y otra molécula de ninhidrina para dar un compuesto de adición doble que presenta una coloración azul-púrpura. Las aminas primarias (R-CH2-NH2) dan también positiva la prueba de la ninhidrina, aunque en este caso no se libera CO2.
IV. BIBLIOGRAFÍA:
Murray, R. (1997): BIOQUIMICA DE HARPER; Editorial El Manual Moderno.
México.
Bibliografía: Raymond Chang. Sexta edición. Editorial Thomson 2004.
Pág. 1016.
http://www.utadeo.edu.co/comunidades/estudiantes/ciencias_basicas/or
ganica/guia_9_aminoacidos.pdf
