Área de Biología Celular
Departamento de Biología Celular, Genética y Fisiología Facultad de Ciencias
Universidad de Málaga
Estudio de la cicatriz glial en superficies
ventriculares carentes de epéndimo en los ratones
hyh
hidrocefálicos.
Memoria presentada por Dña. Ruth Roales Buján
para optar al grado de Doctor en Biología
Departamento de Biología Celular, Genética y Fisiología
Área de Biología Celular
Campus Universitario de Teatinos, s/n 29071 Málaga.
JOSÉ MANUEL FERNÁNDEZ-FÍGARES PÉREZ, Catedrático del Departamento
de Biología Celular, Genética y Fisiología de la Universidad de Málaga, y
ANTONIO-JESÚS JIMÉNEZ LARA,Profesor Titular del Departamento de Biología
Celular, Genética y Fisiología de la Universidad de Málaga,
CERTIFICAN:
Que Dña. RUTH ROALES BUJÁN, ha realizado en el Departamento y bajo su
dirección, el trabajo experimental presentado en esta memoria para optar al grado de Doctor.
Y para que así conste, se firma el presente documento, en Málaga a diecinueve de febrero de 2009.
Yo, Ruth Roales Buján, declaro que soy la autora del presente trabajo de investigación y que lo he realizado en el Departamento de Biología Celular, Genética y Fisiología de la Universidad de Málaga, bajo la dirección de los doctores José-Manuel Fernández-Fígares Pérez y Antonio-Jesús Jiménez Lara.
Y para que así conste firmo el presente documento en Málaga a diecinueve de febrero de 2009.
Este trabajo ha sido financiado por los proyectos:
- Alteraciones del epitelio ependimario como causa de hidrocefalia y procesos neurodegenerativos. Estudio en modelos animales y casos clínicos humanos. FIS: PIO3 0756. Ministerio de Sanidad y Consumo. Investigador responsable: J. M. Fernández-Fígares.
- Pérdida del neuroepitelio del tubo neural como causa de alteraciones corticales y agenesia del cuerpo calloso. Estudio en modelos animales y en fetos humanos hidrocefálicos. Consejería de Salud, Junta de Andalucía: SAS 0162/2005. Investigador responsable: Dr. Miguel Ángel Arráez Sánchez. Servicio de Neurocirugía, Hospital Carlos Haya, Málaga.
- Evaluación de la capacidad de neurogenesis y gliogénesis postnatal en animales hidrocefálicos con vistas al desarrollo de terapias con células madres. PCI 2006- A7- 0669. Investigador responsable: Antonio J. Jiménez Lara.
- Alteraciones en la zona ventricular como causas de deficiencias en el desarrollo pre- y postnatal de la corteza. Implicaciones en la hidrocefalia congénita humana. FIS: PI06 0423. Ministerio de Sanidad y Consumo. Investigador responsable: J. M. Fernández-Fígares.
A mi madre, por su buen hacer en la cocina y a mi padre por su espíritu crítico. Gracias por enseñarme dos cualidades imprescindibles para la investigación.
AGRADECIMIENTOS
Doy las gracias a todos los que han ayudado y contribuido en la realización de esta Tesis Doctoral, y muy especialmente a:
- José Manuel por, aun sin saberlo, darme la oportunidad de conocer la biología y ayudarme desde los comienzos de mis estudios. Por guiarme y ampararme en mi formación científica. Por su ánimo y comprensión, por compartir conmigo su sabiduría vital, por tantas charlas enriquecedoras. Por ser como es.
- Antonio, por lo que me ha enseñado, por ayudarme a valorar mi trabajo y saber defenderlo. Por sus correcciones y sus críticas.
- Luis, por escucharme, enseñarme, ayudarme, aconsejarme, comprenderme, DFRPSDxDUPHFDOPDUPH«SRUVHUWDQEXHQDPLJR\FRPSDxHUR
- Patricia, por todo lo que me ha enseñado, tanto profesionalmente, sin duda mi maestra, como vitalmente.
- Alicia, por ese buen humor y esa sonrisa, por sus consejos y guía. Un gran modelo para mí.
- Belén, por esas charlas, por su apoyo, por ayudarme a reflexionar en los peores momentos.
- José Esteban, por su ayuda y confianza, laboral y vital. Por ser un buen amigo.
- Silvia, por esas meriendas y tantos desahogos.
- Antonia, por su interés, por sus consejos y su buena disposición para todo.
- Cayo, por ese primer empujón y esas buenas ideas.
- Conrad, por creer en mí y darme una oportunidad que me abrió puertas.
- Paco, por su apoyo incondicional, confianza, comprensión, cariño, consejo, fe, paciencia«JUDFLDVSRUVHU\HVWDU
- Oliver, por picarme e incitarme a mejorar durante toda mi vida.
- Rafael, por su cariño, ánimo y confianza.
- Emilia, Por su apoyo incondicional y constante, por todo su amor. Gracias por todo, por ser la mejor madre que puede haber.
- Manolo, por enseñarme y guiarme en la vida respetándome y sin criticarme. Por ser mi padre.
Índice
Índice
ÍNDICE ... 1
ÍNDICE DE ABREVIATURAS UTILIZADAS EN EL TEXTO Y EN LAS FIGURAS ... 7
INTRODUCCIÓN ... 11
1. Sistema ventricular ... 12
2. Epitelio ventricular ... 13
2.1.Neuroepitelio ... 13
2.2.Glía radial y su relación con las células neuroepiteliales ... 17
2.3.Caracterización del epitelio ventricular ... 19
3. Neurogénesis y gliogénesis ... 21
4. Migración neuronal ... 24
5. Líquido cefalorraquídeo (LCR) ... 27
5.1.Producción del LCR ... 27
5.2.Circulación y absorción ... 29
5.3.Función del LCR ... 31
6. Hidrocefalia congénita ... 32
7. Modelo experimental de hidrocefalia congénita de tipo hereditario: El ratón mutantehyh ... 37
7.1./DPXWDFLyQĮ-snap ... 37
7.2.Denudamiento de la zona ventricular ... 41
8. La respuesta glial ante daños en el SNC ... 42
HIPÓTESIS ... 46
OBJETIVOS ... 46
MATERIALES Y MÉTODOS ... 48
1. Animales de experimentación ... 49
2. Método de genotipado diseñado para los ratones hyh ... 50
2.1.Diseño de cebadores ... 50
2.2.Extracción de DNA genómico ... 54 2
Índice
2.3.PCR mutagénica ... 55
2.4.Mezcla de restricción ... 56
2.5.Control positivo para la PCR y para la restricción ... 57
2.5.1.Clonación en un vector ... 57
2.5.2. Transformación de células competentes de E. coli y selección de clones ... 58
3. Procesamiento del tejido para microscopia óptica ... 59
3.1. Fijación ... 59
3.1.1. Soluciones fijadoras ... 59
3.1.2. Procedimiento de fijación ... 59
3.2. Inclusión, cortes y montaje ... 61
3.2.1. Inclusión en parafina, obtención de cortes y montaje ... 61
3.2.2. Inclusión en agarosa y corte en vibratomo ... 61
3.2.3. Inclusión del tejido en Tissue-tek OCT®y corte en criostato ... 62
4. Tinción histológica ... 63
4.1. Hematoxilina-eosina ... 63
4.2. Histoquímica de lectinas ... 64
5. Técnicas inmunocitoquímicas ... 65
5.1. Antígenos investigados en el tejido, y anticuerpos y reveladores utilizados para su detección ... 65
5.2. Aplicación de la técnica inmunocitoquímica en el tejido ... 69
5.2.1. Protocolo general de inmunocitoquímica para muestras en portaobjeto ... 69
5.2.2. Protocolo general de inmunocitoquímica para muestras en flotación ... 71
5.2.3. Protocolo general de inmunofluorescencia ... 72
5.2.4. Particularidades de las diferentes técnicas inmunocitoquímicas ... 73
6. Inyección intracerebroventricular de peroxidasa de rábano ... 74
7. Inyección intraperitoneal de BrdU ... 77
8. Aplicación de lantano en la superficie ventricular ... 78 3
Índice
9. Procesamiento del tejido para microscopía electrónica de transmisión ... 79
10.Microscopía electrónica de barrido ... 81
ANEXOS Anexo 1: Soluciones y procedimientos utilizados en biología molecular. 1.1. Protocolos de extracción de DNA genómico ... 84
1.2. Mezcla de reacción para PCR ... 85
1.3. Mezcla de restricción ... 85
1.4. Gel de Agarosa al 3.5% con BrEt ... 86
1.5. Medios de cultivo ... 87
1.6. Clonación de fragmento en vector ... 88
1.7. Transformación de células competentes de E. coli ... 88
Anexo 2: Tampones y procedimientos para histoquímica e inmunocitoquímica 2.1. Tampón fosfato (PB) 0.2 M, pH 7.3 ... 89
2.2. Tampón fosfato salino (PBS) 0.01 M, pH 7.3 ... 89
2.3. Tampón TRIS-PBS 0.01 M, pH 7.8 ... 89
2.4. Tampón TRIS-HCL-Urea 5%, pH 9.5 ... 89
2.5. Tampón TRIS-Carragenina-Tritón (TCT) 0.01 M, pH 7.8 ... 90
2.6. Tampón citrato 0.1 M, pH 6 ... 90
2.7. Tampón borato 0.1 M, pH 8.5 ... 90
2.8. Hidratación y deshidratación ... 90
2.9. Crioprotección ... 90
Anexo 3: Soluciones fijadoras 3.1. Solución fijadora de Bouin ... 91
3.2. Solución fijadora de paraformaldehído al 4% ... 91
3.3. Solución fijadora de glutaraldehído al 4% ... 92
3.4. Solución fijadora de glutaraldehído al 2% y PFA 2% ... 92
3.5. Solución fijadora triple aldehído ... 92
Anexo 4: Preparación de portaobjetos ... 93 4
Índice
Anexo 5: Soluciones específicas de las técnicas histoquímicas e inmuno-citoquímicas
5.1. Solución desactivadora de peroxidasa endógena ... 94
5.2. Solución bloqueadora de las uniones inespecíficas ... 94
5.3. Bloqueo de biotina endógena ... 95
5.4. Intensificación con microondas en tampón TRIS-HCl-urea ... 95
5.5. Intensificación con microondas en tampón citrato 0.1 M ... 95
5.6. Intensificación con sulfato amonio de níquel ... 95
5.7. Reacción histoquímica de peroxidasa ... 95
Anexo 6: Protocolos de inmunocitoquímica 6.1. Inmunocitoquímica anti-PCNA ... 96
6.2. Inmunocitoquímica anti-aquaporina4 ... 98
6.3. Inmunocitoquímica anti-BrdU ... 99
6.4. Inmunocitoquímica anti-A2B5 y anti-RC2 ... 101
6.5. Inmunocitoquímica anti-HRP ... 103
6.6. Inmunocitoquímica anti-GFAP y anti-vimentina ... 104
6.7. Inmunocitoquímica anti-S1ȕ ... 106
6.8. Inmunocitoquímica anti-ȕ,,,WXEXOLQD ... 107
Anexo 7: Tampones y soluciones para MET 7.1. Tampón cacodilato 0.2 M ... 109
7.2. Mezcla araldita ... 109
7.3. Acetato de uranilo 0.5% ... 109
7.4. Citrato de plomo 0.1% ... 110
7.5. Osmio 1% ... 110
Anexo 8: Lista de productos y referencias comerciales ... 111
RESULTADOS ... 114
1. Método de genotipado diseñado para los ratones hyh ... 115
1.2.Amplificación de fragmentos ... 116
2.2.Restricción diferencial de los alelos ... 117 5
Índice
2. Permeabilidad diferencial de superficies ventriculares del ventrículo lateral, con epéndimo maduro e inmaduro, sin
epéndimo y con cicatriz glial ... 119
3. Etapas de la formación de la cicatriz glial ... 133
4. Distribución de la cicatriz glial en el sistema ventricular de animales hidrocefálicos ... 137
5. Estudio del IV ventrículo desde E11.5 hasta P3 ... 140
DISCUSIÓN ... 159
1. Valoración del método de genotipado diseñado ... 160
2. La cicatriz glial como nueva barrera entre el LCR y el parénquima neural en zonas ventriculares denudadas ... 165
3. Heterogeneidad de las superficies ventriculares en el ratón hidrocefálico y en el silvestre ... 173
4. ¿Denudamiento ependimario o anomalías en la migración y en la diferenciación? ... 176
CONCLUSIONES ... 183
BIBLIOGRAFÍA ... 185
PUBLICACIONES Y PATENTES ASOCIADAS A ESTA TESIS DOCTORAL ... 208
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Introducción
Introducción
1. Sistema ventricular
El sistema ventricular de mamíferos, consta de una serie de cavidades, denominadas ventrículos, interconectadas por conductos más o menos estrechos. Por estas cavidades y conductos circula el líquido cefalorraquídeo (LCR) en sentido rostro-caudal, líquido que saliendo del sistema ventricular se comunica con el LCR de los espacios subaracnoideos. Además, el LCR ventricular y el subaracnoideo están en libre comunicación con el fluido intersticial que baña el parénquima neural (Milhorat and Hammock, 1971).
En la porción más rostral del sistema ventricular de mamíferos están presentes dos ventrículos laterales, dispuestos simétricamente a los lados de la línea media, y que comunican con el III ventrículo mediante los agujeros de Monro. El III ventrículo es una cavidad impar situada por debajo del cuerpo calloso y del fórnix, entre los dos tálamos ópticos, y se comunica con el IV ventrículo a través del acueducto de Silvio. El IV ventrículo es también una cavidad impar. Tiene forma aplanada de delante a atrás, con un suelo formado por las superficies dorsales de la protuberancia y del bulbo, y un techo que corresponde al hilio del cerebelo. El IV ventrículo comunica a su vez con los espacios subaracnoideos, comprendidos entre la piamadre y la aracnoides a través de tres pequeñas aberturas, dos agujeros de Luschka y el agujero de Magendie en la línea media. Estos ponen en comunicación al IV ventrículo con un amplio espacio subaracnoideo, denominado cisterna magna. Desde los espacios subaracnoideos, el LCR fluye hacia los senos sagitales donde se vacía en la sangre venosa a través de las múltiples vellosidades aracnoideas que allí se encuentran (Davson and Segal, 1996). El IV ventrículo también se comunica, en su porción más caudal, con el canal central de la médula espinal. El cual a su vez, en su porción más distal, se dilata y forma lo que se ha denominado como ventrículo terminal oampulla cadalis(Olsson, 1958).
Introducción
2. Epitelio ventricular
Con el término genérico de epitelio ventricular nos referimos inespecíficamente al neuroepitelio, glía radial o epéndimo que, según la etapa del desarrollo y la región ventricular, recubre la superficie ventricular.
2.1. Neuroepitelio
Al final de la neurulación, durante las primeras fases del desarrollo, el tubo neural está formado por una sola capa de células que constituye el neuroepitelio germinativo. Esta primera capa de células se denomina capa germinal o zona ventricular (ZV) y presenta una disposición pseudoestratificada constituida por células que presentan una prolongación basal que conecta con la superficie pial (Fig.1) (Hollyday, 2001; Sommer and Rao, 2002; Noctor et al., 2008; Malatesta et al., 2008).
Figura 1: Esquema que representa la localización y el plano de división de las células progenitoras neuroepiteliales, en el telencéfalo dorsal durante el desarrollo cortical en el ratón. Las células de glía radial se dividen con el huso mitótico paralelo a la zona ventricular (VZ)durante el desarrollo cortical. Antes de que comience la neurogénesis la mayoría de las divisiones de las células de glía radial son simétricas, originando dos células iguales, autorrenovadoras (rojo). Al comenzar la neurogénesis las células de glía radial se dividen por divisiones asimétricas, autorrenovadoras (azul oscuro), generando neuronas o progenitores intermedios (IP). Las neuronas hijas de glía radial formarán las capas corticales más bajas (lower cortical layers). La mayoría de los IP se dividen simétricamente en la zona subventricular (SVZ) con sus husos mitóticos perpendiculares a la superficie ventricular, y producen dos neuronas por cada progenitor, las cuales formarán las capas corticales superiores (upper cortical layers). Tras la neurogénesis las células de la glía radial se desplazan de la VZ a la SVZ y producen precursores gliales (verde). CP: placa cortical;IZ: zona intermedia;MZ: zona marginal (Noctor et al., 2008).
Introducción
Antes de que se inicie la fase de neurogénesis, las células germinativas neuroepiteliales aumentarán en número por medio de divisiones celulares simétricas, que se caracterizan por una orientación paralela del huso mitótico con la superficie ventricular, originando dos células hijas idénticas que entran nuevamente en el ciclo celular y así sucesivamente (Fig. 1 y 2) (Rakic, 1995; Chenn and McConell, 1995; Pinto and Götz, 2007; Noctor et al., 2008; Malatesta et al., 2008). Durante estas divisiones, y en función de la fase del ciclo celular en que estén estas células, el núcleo cambia de posición en un movimiento denominado migración nuclear intercinética (Hatten and Heintz, 1998; Yoshikawa, 2000; Sommer and Rao, 2002; Noctor et al., 2008; Malatesta et al., 2008). Ésta migración está sincronizada con el ciclo celular. Durante la mitosis el núcleo queda situado en la superficie ventricular y se va desplazando basalmente durante la fase G1, alcanzando su posición más basal durante la fase S. Posteriormente, durante G2 los núcleos migran otra vez hacia la superficie ventricular (Malatesta et al., 2008).
Figura 2: Divisiones simétricas y asimétricas de células madre y progenitoras. Una célula madre quiescente puede entrar en el ciclo celular, originar divisiones simétricas o asimétricas, entrar en apoptosis o madurar bajo la influencia de mecanismos celulares intrínsecos o por señales extrínsecas. Los precursores neuronales y neuronas se producen primero, seguidos de los precursores de oligodendrocitos (Sommer and Rao, 2002).
Introducción
A medida que progresa el desarrollo, las células del epitelio ventricular cambian su patrón de expresión génica, y por tanto sus características citológicas y su capacidad de diferenciación. En el ratón, el primer cambio fenotípico que ocurre en las células germinativas se da en E9/10, al inducirse la producción de filamentos intermedios de nestina, característicos de células madre y progenitoras (Frederiksen and McKay, 1988; Tomoyuki et al., 1995) y empiezan a ser inmunorreactivas para RC2, que es un anticuerpo específico para glía radial (Misson et al., 1988; Edwards et al., 1990; Pinto and Götz, 2007; Malatesta et al., 2008). Además, durante esta fase dejan de sintetizar las ocludinas y por ello desaparecen las uniones herméticas presentes en etapas anteriores. Así, este epitelio pierde pronto su función previa como barrera impermeable, lo cual quedó demostrado por Aaku-Saraste et al., (1996) mediante la inyección de peroxidada de rábano (HRP) en la cavidad amniótica de embriones de ratón en desarrollo. Este experimento mostró que donde hay uniones herméticas se impide el paso de HRP en los espacios intercelulares en E8, y tan pronto como estas uniones desaparecen, en E9/10, se permite el tránsito transcelular de HRP.
Una vez que se alcanza un número crítico de células madre neurales, éstas células neuroepiteliales empiezan a sufrir las mitosis asimétricas (Fig. 1 y 2) (Chenn and McConell, 1995; Sommer and Rao, 2002; Roegiers and Jan, 2004; Noctor et al., 2008). Por defecto, todas las células neuroepiteliales no diferenciadas están programadas para llegar a ser neuronas, y su diferenciación como astrocitos, oligodendrocitos o células ependimarias, requiere un inhibidor activo de la diferenciación neuronal que puede ser genético o provenir factores ambientales, como pueden ser cambios metabólicos, hipoxia, factores nutritivos o la exposición a ciertas moléculas tóxicas (Sarnat, 1998). La orientación del huso mitótico parece ser un factor importante en decidir cuál será el destino de las células hijas (Chenn and McConnell, 1995; Zhong et al., 1996; Mione et al., 1997). La gran mayoría de las mitosis del neuroepitelio ocurren en la superficie ventricular (Sarnat, 1992; Sarnat et al., 1998). Si el huso mitótico, está orientado paralelo a la superficie ventricular, las dos células hijas serán iguales a la célula madre y recibirán una cantidad igual de los productos de los genes numb y null, que son antagonistas. En este caso la división será simétrica. En cambio, en las divisiones asimétricas el huso mitótico está
Introducción
orientado perpendicular a la superficie ventricular, y las dos células hijas son desiguales. La que limita con el ventrículo recibe la mayoría o casi todo el producto del gen null y entrará de nuevo en el ciclo mitótico. La célula hija distal habrá perdido su unión a la superficie ventricular, tendrá la herencia de casi todo el gen numb y casi nada de null, y al no estar unida a la superficie ventricular se adentrará en el parénquima neural como célula postmitótica. Esta célula hija se convertirá en un progenitor intermedio, que dependiendo del momento del desarrollo originará o bien neuroblastos, que empezarán su migración por la superficie de una fibra de glía radial, o bien glioblastos en estadios más tardíos (Fig. 3) (Sauvageot and Stiles, 2002; Noctor et al., 2008; Malatesta et al., 2008).
El producto de transcripción de numbse encuentra en el lado apical (ventricular) de la célula neuroepitelial, y nullse haya en el lado basal. Numbestá relacionado con el gen Noch. Estos genes definen el destino u orientación de la célula (Chenn and McConnell, 1995; Johnson, 2003).
Figura 3:Producción de los distintos tipos celulares durante el desarrollo del SNC de rata. La misma secuencia de acontecimientos se considera que ocurren en el ratón con dos días de antelación. El pico de neurogénesis en rata es en E14 (8ª semana en humanos), de astrogénesis en P2 y oligodendrocitogénesis en P14 (Sauvageot and Stiles, 2002).
Introducción
2.2. Glía radial y su relación con las células neuroepiteliales
Poco después de la aparición de los primeros neuroblastos, las células neuroepiteliales cambian por segunda vez sus características fenotípicas y adquieren características moleculares y morfológicas propias del linaje astroglial, dando lugar a células de glía radial. Estas son un tipo celular especializado que se encuentra tapizando la superficie ventricular del sistema nervioso durante parte del desarrollo embrionario (Bentivoglio and Mazzarello, 1999).
La glía radial representa la mayor parte de la población de progenitores neurales y su progenie incluye la mayoría de los linajes celulares del SNC: neuronas, astrocitos, oligodendrocitos, ependimocitos y células madre neurales en el adulto (Malatesta et al. 2003; Merkle et al. 2004; Spassky et al. 2005). El momento exacto de la aparición de las células de glía radial aun está en controversia. Algunos autores consideran como un hecho fundamental que indicaría el momento de su origen la expresión del RNAm de la proteína ligadora de lípidos cerebrales (BLBP) y la inmunorreacción al anticuerpo RC2 que, como se indicó anteriormente, es un marcador de este tipo celular (Anthony et al., 2004). Otros consideran clave la expresión de características astrocíticas, tales como la aparición de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP), no en roedores, y la morfología típica astrocitaria (Gotz et al., 2002; Malatesta et al., 2003).
Las células de glía radial, al igual que las células germinativas neuroepiteliales, son bipolares. Presentan una larga prolongación basal que se elonga radialmente hasta alcanzar la superficie pial, y una corta prolongación apical con un único cilio corto en contacto con el LCR. A diferencia de las células neuroepiteliales, la glía radial carece de uniones herméticas (Aaku-Saraste et al., 1996) Estas células también llevan a cabo movimientos de migración intercinética, pero durante esta migración, sus somas no recorren todo el grosor del tubo neural, mientras que los de las células neuroepiteliales si lo hacen (Malatesta et al., 2008). El soma celular y los núcleos no migrantes, permanecen densamente empaquetados en la zona apical, constituyendo la zona ventricular (ZV). Una vez diferenciadas poseen características inmunocitoquímicas de células pertenecientes al linaje astroglial. Expresan GFAP, el
Introducción
transportador de glutamato específico para astrocitos (GLAST), RC2 y BLBP (Hartfuss et al., 2001; Pinto and Götz, 2007).
En el momento de aparición de la glía radial, el telencéfalo empieza a ser pluriestratificado debido a la acumulación basal, en la preplaca, de neuronas postmitóticas generadas por las primeras células neuroepiteliales, y por un incremento de progenitores basales. Estas células forman ahora una capa en el límite entre el VZ y la preplaca, conocida como la zona subventricular (SVZ) (Fig. 1) (Malatesta et al., 2008).
Inicialmente, la función principal que se le atribuía a la glía radial era la de actuar como sustrato para la migración de los neuroblastos durante el desarrollo embrionario (Rakic, 1972; Bayer et al., 1991; Hatten, 1999). Sin embargo, en los últimos años, se ha comprobado que también actúan como verdaderas células madre (Malatesta et al., 2000; Hartfuss et al., 2001; Tramontin et al., 2003; Spassky et al., 2005). Así, cada célula de la glía radial se divide produciendo un precursor neuronal o glial y otra célula glía radial, que mantiene su capacidad proliferativa (Hartfuss et al., 2001; Spassky et al., 2005; Pinto and Götz, 2007; Malatesta et al., 2008). Las células de glía radial tienen capacidad neurogénica y gliogénica mientras dura la histogénesis cortical, pero una vez que termina la generación y migración de neuronas, solamente son capaces de dar lugar a células gliales (Malatesta et al., 2000).
Cuando la glía radial termina sus ciclos de división, las células pierden su prolongación basal, se hacen multiciliadas, y dan lugar a células ependimarias (Spassky et al., 2005). No obstante existen células ependimarias especializadas como pueden son los tanicitos que mantienen la prolongación basal en los animales adultos (Bruni et al., 1998). Se ha comprobado que parte de las células de la glía radial se transforman en astrocitos B1 que actúan como células madre en los nichos de neurogénesis que quedan en el adulto (Doetsch et al., 1999; Marshall et al., 2003; Bonfanti and Peretto, 2007).
Introducción
2.3. Caracterización del epitelio ventricular
Como se ha mencionado anteriormente, el epitelio ventricular está constituido por diferentes tipos celulares que, durante el desarrollo del SNC, van diferenciándose dando lugar unos a otros. La caracterización de los distintos tipos de células que lo forman se realiza atendiendo a la estratificación del tejido, a las proteínas que expresen sus células en cada momento del desarrollo, y a la presencia o no de cilios.
En etapas embrionarias el epitelio ventricular está formado por un neuroepitelio constituido por una capa pseudoestratificada de células sin cilios, con una larga prolongación basal que llega hasta la superficie pial y que expresan las proteínas S100ȕ y vimentina, pero no GFAP (Misson et al., 1988; Edwards et al., 1990; Malatesta et al., 2008) (Tabla 1). Al avanzar el desarrollo embrionario, el neuroepitelio va dando lugar a un epitelio formado por células de glía radial. Este sigue siendo pseudoestratificado y sus células mantienen la larga prolongación basal y las mismas características inmunocitoquímicas que las células neuroepiteliales, pero van desarrollando apicalmente un único cilio corto. (Marshall et al., 2003; Vives et al., 2003; Spassky et al., 2005; Bonfanti and Peretto, 2007; Malatesta et al., 2008).
En etapas perinatales, las células de glía radial van cambiando su fenotipo para dar lugar a un epéndimo inmaduro monoestratificado. Las células de glía radial se van transformando, poco a poco, en células ependimarias inmaduras que presentaran penachos de cilios en su superficie apical y mantendrán la expresión de vimentina y GFAP, pero ahora no expresaran6ȕ(Malatesta et al., 2008).
En mamíferos adultos, y conforme el epéndimo inmaduro se transforma en maduro, sus células se caracterizaran por expresar vimentina y S100, pero no GFAP (Sarnat, 1995; 1998; Bruni, 1998). El epitelio ependimario maduro presenta la particularidad, respecto al resto de los epitelios, de que sus células una vez diferenciadas, pierden su capacidad proliferativa y no se regeneran (Sarnat, 1995; 1998; Bruni, 1998; Doetsch et al., 1999; Spassky et al., 2005), por lo que una vez que se pierden o dañan estas células su daño es irreparable. Recientemente se ha mostrado que en zonas donde se han dañado pequeñas porciones de epéndimo, se ha visto una lenta regeneración puntual del epéndimo maduro a partir de astrocitos proliferativos de la ZSV. Estos astrocitos se incorporarían entre las células
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ependimarias que no se han dañado, desarrollarían uniones celulares con las células ependimarias y con el tiempo irían adquiriendo características de las células ependimarias (Luo et al., 2008).
El epéndimo que recubre las paredes ventriculares en animales adultos no está formado por una población celular homogénea. Se pueden diferenciar distintos tipos de células ependimarias recubriendo distintas regiones del sistema ventricular. Las células ependimarias multiciliadas y cúbicas son las más abundantes. Se han descrito, en rata, células ependimarias ciliadas con algunas uniones herméticas (Lippoldt et al., 2000). Los órganos circumventriculares, como los plexos coroideos, la eminencia media y el órgano subcomisural, presentan células ependimarias completamente selladas entre sí por uniones herméticas (Rodríguez et al., 1998; Lippoldt et al., 2000).
Epitelio Tipos celulares Vimentina 6ȕ GFAP
Neuroepitelio: embrionario pseudoestratificado
Germinales: sin cilios + +
-Neuroepitelio: embrionario pseudoestratificado
Germinales: sin cilios
Glía radial:uniciliado + +
-Neuroepitelio: perinatal
pseudoestratificado
Glía radial: uniciliado
Ependimarias: penachos de cilios + - +
Epéndimo inmaduro: perinatal
monoestratificado
Ependimarias: penachos de cilios + - +
Epéndimo maduro: perinatal y adulto
monoestratificado Ependimarias: penachos de cilios + +
-Tabla 1:Características morfológicas y expresión de moléculas del epitelio ventricular durante el desarrollo
El epitelio ventricular forma una barrera entre el parénquima neural y el LCR, impidiendo que las células inmunocompetentes presentes en el LCR, entren en contacto con el parénquima neural. El epéndimo maduro permite el tránsito, a través de los espacios intercelulares, de determinadas moléculas e iones entre el parénquima neural y el LCR (Sarnat, 1992; Bruni, 1998). Por esto contribuye, junto a la barrera hematoencefálica, a que el parénquima neural no haya estado nunca en contacto con 20
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las células inmunocompetentes y que sea un órgano inmunológicamente diferente. Además, el epéndimo maduro, al ser un epitelio ciliado desempeña un papel importante en la correcta circulación del LCR (Davson y Segal, 1996; Cifuentes et al., 1995).
3. Neurogénesis y gliogénesis
Durante el desarrollo del SNC se producirán todos sus elementos celulares, neuroblastos, astroblastos, oligodendroblastos y ependimoblastos, mediante una serie de procesos complejos que han de producirse simultánea y coordinadamente.
La neurogénesis y gliogénesis tienen lugar en diferentes regiones del SNC dependiendo del momento del desarrollo. En etapas tempranas el tubo neural está formado exclusivamente por células germinativas neuroepiteliales, y es a partir de estas células de las que se forman, directa o indirectamente, todas las neuronas y células gliales que componen el SNC del animal adulto (Liu et al., 2002; Alvarez-Buylla et al., 2002; Götz, 2003; Malatesta et al., 2008) (Fig. 5A).
Figura 5: Esquema que representa la zona ventricular y subventricular en las diferentes etapas de la neurogénesis.
A, Neurogénesis temprana en roedores
(Götz, 2003)
B, Neurogénesis media y tardía en roedores
(Götz, 2003)
C, Neurogénesis en VL de rata adulta
(Alvarez-Buylla et al., 2002) ZV ZV ZSV ZSV Epe PCt ZM PN ZV ZSV ZM PCt PN Epe Zona Ventricular Zona Subventricular Zona Marginal Placa Cortical Parénquima Neural Epéndimo 21
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Como ya se ha expuesto, estas células neuroepiteliales irán sufriendo divisiones simétricas con las que aumentarán en número, y posteriormente, mediante divisiones asimétricas generarán dos células hijas con distinto destino celular. Por una parte, células madre neurales y progenitores intermedios, que dependiendo del momento del desarrollo originarán neuroblastos o glioblastos (Fig. 3). La mayoría de las células neuroepiteliales son progenitores bipotentes (Williams and Price, 1995), que generan en primer lugar neuroblastos, y células gliales poco después (Fig. 3). Ya en estas etapas tempranas del desarrollo algunos progenitores dan origen exclusivamente a neuroblastos o a células gliales (Williams and Price, 1995; McCarthy et al., 2001; Pinto and Götz, 2007), lo cual implica un cierto grado de heterogeneidad en el linaje celular (Pinto and Götz, 2007). Poco después de la aparición de neuroblastos, las células neuroepiteliales adquieren las características moleculares y morfológicas propias del linaje astroglial, dando lugar a células de glía radial que irán produciendo neuronas y astrocitos como se ha explicado (Fig. 6) (Liu et al., 2002; Götz, 2003; Malatesta et al., 2003; 2008).
En etapas medias y finales del desarrollo (Fig. 5B), la neurogénesis y gliogénesis tienen lugar tanto en la ZV como en la ZSV, localizada justo por debajo de ella. La primera, en esta etapa, está constituida por glía radial en división, que darán lugar a precursores neuronales y gliales. La ZSV, está formada por una capa de precursores neuronales y gliales que se dividen a la vez que inician su migración (Hatten and Heintz, 1998; Hatten, 1999; Götz, 2003; Marshall et al., 2003; Kanatani et al., 2008). En vertebrados superiores, la ZSV está muy desarrollada.
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Figura 6: Esquema que representa las características antigénicas y el momento de aparición de los distintos elementos celulares del SNC de ratón. Obsérvese como las células germinativas (Stem Cell) pueden generar tanto neuroblastos como glía radial, mientras que la glía radial genera neuronas maduras o astrocitos (Liu et al., 2002).
En animales adultos, la neurogénesis queda restringida a regiones concretas del SNC (Fig. 5C) como son la ZSV de la pared lateral de los ventrículos laterales y el giro dentado del hipocampo (Alvarez-Buyllaet al., 2002; Emsley et al., 2005; Bonfanti and Peretto, 2007).
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4. Migración neuronal
La migración celular es un proceso fundamental en el desarrollo del SNC, ya que tanto los precursores neuronales como los gliales se generan en sitios diferentes a aquellos donde tienen su destino y su función. Este movimiento de células dentro del SNC inmaduro se denomina migración neuronal o, mejor dicho, migración neuroblástica, pues si fuese neuronal implicaría neuronas maduras que como tales ya han perdido la capacidad de migrar (Sarnat, 1998). Se ha observado que la migración tiene lugar en circuitos perfectamente definidos (Marín and Rubenstein, 2001). Existen dos modos de migración en el SNC: la migración radial y la migración tangencial (Fig. 7) (Marín and Rubenstein, 2003; Kanatani et al., 2005). La coexistencia de las dos formas diferentes de migración celular en el desarrollo del telencéfalo, adquiere sentido cuando se comprueba que las células que migran radialmente y las que lo hacen tangencialmente provienen de células progenitoras diferentes (Mione et al., 1997; Tan et al., 1998).
El prosencéfalo, y en concreto el telencéfalo, es indiscutiblemente la región más compleja del cerebro de mamíferos, y su extraordinario grado de organización es un reflejo de la complejidad de los movimientos migratorios requeridos para generarlo. Defectos en la migración neuronal durante el desarrollo del prosencéfalo provocan, entre otras patologías, retraso mental, epilepsia y déficit severo en el aprendizaje. En el telencéfalo, la migración radial es el principal mecanismo por el cual los neuroblastos llegan a su destino final (Hatten, 1999; Nadarajah et al., 2001; Corbin et al., 2001). Este tipo de migración es llevada a cabo a través de las prolongaciones basales de la glía radial, por lo que es muy dependiente de las interacciones entre ambos tipos celulares (Fig. 7B). Los neuroblastos se deslizan pegados a la superficie externa de la fibra de la glía radial como si fuera un carril. Hay varias moléculas de adhesión que sirven a la vez de adherencia para asegurar la llegada del neuroblasto a su destino. Las moléculas también desempeñan un papel importante en la unión del neuroblasto con la célula glial, para la nutrición y el mantenimiento del neuroblasto. Estas moléculas de adhesión pueden proceder de los mismos neuroblastos, de las células del la glial radial o de la matriz extracelular (Marín and Rubenstein, 2003; Kanatani et al., 2005).
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La migración tangencial incluye diferentes tipos de movimientos celulares que divergen en el tipo de sustrato empleado por las células para migrar (Marín and Rubenstein, 2003). Así, en el caso de la migración hacia el bulbo olfatorio, los grupos de neuroblastos migran utilizándose unas a otras para promover su migración. En otros casos, los neuroblastos migran siguiendo los axones en crecimiento para llegar a su destino. Finalmente, en el caso de las células que migran desde el subpalio al palio, no se utiliza ningún sustrato específico, sino que la migración se realiza en función de señales químicas que guían a las células en diferentes direcciones (Fig. 7A) (Marín and Rubenstein, 2003; Kanatani et al., 2005).
El epéndimo también desenpeña un papel importante en la señalización de rutas de migración, ya que, como se indicará más adelante, el batido direccional de los cilios del epéndimo es uno de los factores que intervienen en la correcta circulación del LCR (Davson and Segal, 1996) y los neuroblastos producidas en la ZSV migran hacia el bulbo olfatorio siguiendo la dirección del flujo de LCR (Sawamoto et al., 2006).
Figura 7:Migración tangencial y radial en ratón.APO: área preóptica; Ctx: córtex cerebral; ELG: eminencia lateral gangliónica; EMG: eminencia media gangliónica; PD: palio dorsal; PL: palio lateral; PM: palio medial;
PV: palio ventral. Líneas azules, verdes y moradas: rutas de migración tangencial. Líneas rojas: migración radial. (Basado en Marín and Rubenstein 2001; 2003).
PD PM PV PL EMG ELG APO A B
Migración Tangencial Migración Radial
PD PM PV PL EMG ELG APO PD PM PV PL EMG ELG APO A B
Migración Tangencial Migración Radial
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Una vez que las neuronas se han generado y llegado a su lugar de destino, tienen que ir integrándose unas con otras hasta originar una unidad funcional (Doetsch and Hen, 2005). Para ello, es necesario que se produzca la elongación axonal, se establezca la red dendrítica y se generen las sinapsis adecuadas. Diferentes interacciones intercelulares y la presencia de numerosas señales químicas permiten interconectar regiones cerebrales adyacentes, así como aquellas que están muy distanciadas unas de otras. Ejemplo de esto último, es la generación de estructuras comisurales, las conexiones córtico-talámicas, o las córtico-estriatales. Para el establecimiento de estas conexiones son necesarias señales químicas y la presencia de sustratos generados, normalmente, por las prolongaciones celulares de la glía radial (Shu and Richard, 2001; Molnar et al., 2003; Kanatani et al., 2005). En general, todos éstos son procesos muy complejos de los que queda mucho por conocer.
Las migraciones neuroblásticas no siempre siguen su desarrollo normal, a causa de programas genéticos defectuosos, o a veces, por lesiones adquiridas del cerebro fetal que interrumpen o previenen el paso del neuroblasto a su destino. Los trastornos de la migración neuroblástica se pueden resumir en cuatro categorías: i) fallo total de la migración; ii) migración interrumpida o incompleta; iii) migración desviada a otro sitio en el SNC, y iv) migración que no se detiene pero que sigue más allá de los límites del SNC hasta las leptomeninges. En todos los sitios normales o anormales, los neuroblastos son capaces diferenciarse dando lugar a neuronas, pero en general no se establecen las conexiones sinápticas que se necesitan para la función normal, o incluso su supervivencia. Una neurona desplazada a un sito anormal dentro del cerebro se denomina heterotópica; y la desplazada fuera del SNC, ectópica (Sarnat, 1998).
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5. Líquido cefalorraquídeo (LCR)
5.1. Producción del LCR
5.1.1. Secreción de origen coroidal
En condiciones normales, el LCR es producido mayoritariamente por los plexos coroideos, denominándose secreción coroidal, y en menor cantidad por el parénquima neural, denominándose secreción extracoroidal. En el hombre se ha estimado que el 70-80% del LCR es secretado por los plexos coroideos (Welch, 1963) y la mayor parte en los ventrículos laterales (Davson and Segal, 1996)
Los plexos coroideos están formados por un centro vascular con tejido conectivo, recubiertos por un epitelio coroidal. Durante el desarrollo, el epéndimo y el epitelio coroidal tienen un origen común en el epitelio neural que recubre el primitivo tubo neural. El epitelio coroidal es un epitelio cúbico simple, y sus células poseen microvellosidades en la superficie apical. Muchas de las células del epitelio coroidal son ciliadas al igual que las células ependimarias. La membrana basal del epitelio coroidal es permeable a moléculas de 40.000 daltons al igual que los capilares sanguíneos. El transporte vía pinocitosis o transporte vesicular es muy frecuente. Es importante mencionar que el transporte a través de los plexos coroideos es bidireccional, pues estas células son capaces de reabsorber moléculas desde el LCR (Davson and Segal, 1996).
Los solutos de la sangre tienen dos formas de penetrar en el tejido nervioso: directamente, a través de la barrera hematoencefálica de los capilares del cerebro e indirectamente, a través de los plexos, pasando al LCR y desde aquí al parénquima. En este último caso, los capilares fenestrados producen un filtrado de plasma en el intersticio de los plexos coroideos. Estos capilares poseen cuatro veces más mitocondrias que un capilar normal, lo que demuestra la dependencia del SNC del transporte activo. El transporte de solutos y agua depende del transporte activo de iones, particularmente de sodio, desde este fluido intersticial a través del las células 27
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del epitelio coroidal, las cuales están selladas unas a otras por medio de uniones herméticas (Davson and Segal, 1996).
En condiciones fisiológicas normales, el LCR se secreta constantemente con variaciones circadianas (Nilsson et al., 1992). La tasa de producción varía según la especie, así en el ratón HVGHȝOPLQ5XGLFNHWDO,HQODUDWDȝOPLQ (Davson and Segal, 1970) y en el hombre adulto HVGHȝOPLQ (500±600 ml/día) con un volumen total de 140 ml (Milhorat and Hammock., 1971; Nicholson, 1999) y con una tasa de recambio de 8 horas, lo que da una idea de la importancia que tiene su renovación (Davson and Segal, 1996).
El epitelio coroidal presenta características de un epitelio especializado, el cual permite el transporte transcelular de solutos y solventes. Los mecanismos que operan en el lado vascular del epitelio coroidal involucran innervaciones colinérgicas (Lindvall and Owman, 1981) y simpáticas (Lindvall et al., 1978) que inhiben y estimulan la formación y la secreción de LCR. Hay también mecanismos reguladores operando en el lado ventricular de las células coroidales, como receptores de monoaminas como dopamina, serotonina y malatonina, y receptores de neuropéptidos como vasopresina, hormona atrial natriuretica y angiotensina II. Estos compuestos, que están normalmente presentes en el LCR, participan en la regulación de la secreción de LCR (cf. Pérez-Fígares et al., 2001). La estenosis del acueducto de Silvio que se da en la hidrocefalia, aumenta la concertación de monoaminas y otros compuestos en el LCR (Rodríguez et al., 1999).
5.1.2. Secreción de origen extracoroidal
La carencia de uniones herméticas entre las células ependimarias maduras permite: i) la libre comunicación entre el fluido extracelular y el LCR, ii) la composición similar de los dos fluidos, y iii) la existencia de un flujo desde el parénquima al LCR. Estos datos apuntan al parénquima nervioso como principal productor del LCR de origen extracoroidal. Se estima que en el hombre adulto representa un 10-30% del la producción total de LCR (Pappenheimer et al., 1962; Pollay and Curl, 1967; Davson and Segal, 1996). En vertebrados superiores, el origen del LCR fetal es exclusivamente de origen extracoroidal, pues está presente en
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el tubo neural antes de que se formen los plexos coroideos, hecho que en humanos ocurre en el dia 44 de gestación 2¶5DKLOO\ DQG 0OOHU . Además, los vertebrados inferiores carecen de plexos coroideos y sin embargo tienen un fluido ventricular (Milhorat, 1975). El papel que desempeña el epéndimo en la producción del LCR extracoroidal aun se desconoce (McComb, 1997).
La producción de LCR en los animales hidrocefálicos no está aumentada ni disminuida, sino que es prácticamente normal (Levin et al., 1971; Lorenzo et al., 1974). Sin embargo, los plexos coroideos están muy reducidos, por lo que el LCR de origen extracoroidal debe cobrar una mayor relevancia en caso de hidrocefalia.
5.2. Circulación y absorción
La formación y circulación del LCR, su rápida renovación, su íntima relación con el líquido intersticial y las funciones que realiza, han propiciado que a la del LCR se OHKD\DOODPDGROD³WHUFHUDFLUFXODFLyQ´(Cushing, 1926).
Figura 8:Esquema representando el flujo del LCR. El liquido de origen coroidal y extracoroidal producido en los ventrículos cerebrales pasa al espacio subaracnoideo, donde es drenado por las vellosidades aracnoideas (Johanson et al., 2008).
En vertebrados superiores, el LCR circula a través de un compartimento interno (los ventrículos y los canales comunicantes) y por un compartimento externo (el espacio subaracnoideo). Además, el LCR ventricular y subaracnoideo están comunicados con el líquido intercelular del SNC (Fig. 8). Brightman (1968) demostró que al inyectar en el LCR ventricular o subaracnoideo de ratones adultos, grandes proteínas, como la ferritina (560 kDa) o la HRP (43 kDa), se podían mover 29
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libremente a través del epéndimo y las células piales para distribuirse extensamente por los espacios extracelulares del cerebro, lo cual indica que las células ependimarias no están unidas por uniones herméticas.
La circulación del LCR tiene una dirección rostro-caudal (Fig. 9). Fluye desde los ventrículos laterales al III y IV ventrículo, desde donde pasa al espacio subaracnoideo y es drenado a través de las vellosidades aracnoideas. Finalmente, una pequeña cantidad de LCR pasa al canal central de la médula espinal (Cifuentes et al., 1992; Davson y Segal, 1996; Nicholson, 1999; Pérez-Fígares et al., 2001; Wagner et al., 2003).
Figura 9:Esquema de una sección sagital de un encéfalo de rata mostrando la dirección de la circulación del LCR. Se produce mayoritariamente en los plexos coroideos (CP)de los ventrículos laterales, pasan por el III ventrículo y llega al IV ventrículo a través del acueducto de Silvio. Desde el IV ventrículo pasa, a través del foramen de Luschko-Magendie (F), al espacio subaragnoideo para ser drenado por las vellosidades aracnoideas
(VA)y al canal central de la médula espinal (Pérez-Fígares et al., 2001).
El mecanismo por el que se produce la circulación del LCR no se conoce completamente, pero se ha postulado que intervienen los siguientes factores: i) la diferencia hidrostática entre la producción y el drenaje; ii) las pulsaciones del árbol arterial del cerebro y iii) el batido direccional de los cilios del epéndimo (Davson and Segal, 1996). Nuestro grupo ha propuesto además que el ácido siálico que tapiza la membrana plasmática del polo apical de las células ependimarias, por las abundantes cargas negativas que presenta, también debe favorecer la circulación por la fluidez debida al manto de hidratación que se forma en su superficie. Además, se ha propuesto que el ácido siálico desempeña un papel esencial en evitar la estenosis de los conductos cerebrales estrechos, tales como el acueducto de Silvio y el canal
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central de la médula espinal, por las repulsiones electrostáticas de las cargas negativas del ácido siálico (Pérez-Fígares et al., 2001). El acueducto cerebral o de Silvio, por su pequeño diámetro, menor de 1 mm en el hombre adulto, es el lugar en el que con más frecuencia se estenosa causando una interrupción de la circulación del LCR, lo que provoca a su vez una hidrocefalia no comunicante. En el sistema ventricular el ácido siálico debe desempeñar una función similar a la que tiene en la circulación sanguínea (Pérez-Fígares et al., 2001; Wagnet et al., 2003), dado que las células endoteliales y los eritrocitos (Kelm and Schauer, 1997), al igual que las células ependimarias son muy ricas en ácido siálico.
5.3. Función del LCR
Al LCR se le han atribuido numerosas funciones. Entre éstas destacan: i) Función de protección mecánica y soporte físico del encéfalo. En condiciones normales un cerebro humano que pesa unos 1500JFXDQGR³IORWD´HQHO/&5su peso se reduce a 50g. EVWD IXQFLyQ GH ³DPRUWLJXDFLyQ´ WDPELpQ es importante tras los cambios de presión registrados con el paso del decúbito al ortostatismo, el ejercicio físico y las variaciones en la presión arterial y el pulso; ii) Función excretora: El SNC carece de vasos linfáticos por lo que los productos del metabolismo cerebral, sólo pueden se evacuados por dos vías; a través de los capilares o por el LCR. La circulación sanguinea es la vía más importante, pero la vía LCR (por ejemplo la excreción de lactato tras una convulsión) parece también muy importante; iii) Función de ³sumidero´ \ UHJXODFLyQ GH XQ FRUUHFWR DPELHQWHquímico para la función neural: esta propiedad se debe a su continuidad con el líquido intersticial del parénquima neural. Este concepto se basa en la demostración de que el LCR posee concentraciones de algunos solutos hidrófilos polares, como el tiocianato o la sacarosa, en cantidades inferiores al líquido intersticial. Este hecho permite un flujo lento pero continuo de dichos solutos hacia el LCR, ya que estos se mueven libremente entre el espacio intersticial cerebral y los ventrículos y espacio subaracnoideo; y iv) Transporte intracerebral de sustancias y mantenimiento de la homeostasis del ambiente químico del encéfalo. Hay datos concluyentes que demuestran que el LCR contribuye al transporte en el encéfalo de determinadas
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sustancias, como por ejemplo la TRH y LRH, desde su origen hipotalámico hacia la eminencia media a través del III ventrículo (Davson y Segal, 1996; Pérez-Fígares et al., 2001). El flujo y composición del LCR son muy importantes para el metabolismo del cerebro, ya que proporciona micronutrientes y péptidos a la red neuronal, y recoge gran parte de los catabólicos resultantes de la actividad cerebral (Johanson et al., 2008). Por ello, anomalías en la composición o la circulación del LCR interfieren tanto en el metabolismo perinatal (Miyan et al., 2003) como en etapas adultas (Pratico et al., 2004). Todo esto apoya que Cushing (1926) considerara al LCR como OD³WHUFHUDFLUFXODFLyQ´WDO\FRPRVHKDH[SXHVWRPiVDUULED
6. Hidrocefalia congénita
La hidrocefalia es una patología del SNC que se caracteriza por una acumulación neta de LCR en los ventrículos cerebrales y la consiguiente ventriculomegalia. Se conocen muchos mecanismos por los que se puede desarrollar hidrocefalia. En general, cualquier factor que altere la producción, circulación o absorción del LCR puede generar esta patología. Salvo las hidrocefalias debidas a una sobreproducción de LCR, que son muy poco frecuentes y se deben a papilomas de los plexos coroideos, el resto de las hidrocefalias se pueden clasificar como no comunicantes o comunicantes. En las primeras el impedimento a la circulación del LCR está en el sistema ventricular, mientras que en las segundas el problema está en el espacio subaracnoideo. Las hidrocefalias no comunicantes se deben a múltiples factores, como pueden ser oclusiones de conductos estrechos, hemorragias o infecciones y a tumores próximos a la superficie ventricular. Las obstrucciones más frecuentes ocurren en el acueducto de Silvio debido a su relativa longitud y a su pequeño diámetro (1 mm en humanos) (Mc Comb, 1997). En cuanto a su origen, las hidrocefalias pueden ser: i) congénitas, si se producen antes del nacimiento; ii) postnatales, si es después del nacimiento; iii) genéticas, si se deben a un factor genético; y iv) adquiridas, si se deben a un factor externo. Tanto las hidrocefalias de tipo congénito como postnatal pueden ser de origen genético o adquirido (Mori, 2000). Numerosos autores han relacionado la hidrocefalia no comunicante, ya sea 32
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espontánea o experimental, con disfunciones o malformaciones del epéndimo (Jonhson and Jonhson, 1968; Margolis and Kilham, 1969; Nielssen and Gauger, 1974; Yamada et al., 1992; Grondona et al., 1996; Jimenez et al., 2001; Domínguez-Pinos et al., 2005).
Wong et al. (1995) postularon que la estenosis del acueducto de Silvio es un efecto secundario como resultado de la hidrocefalia, pero no su causa. El mecanismo por el cual se produce la estenosis ha sido objeto de amplia discusión, exceptuando las hidrocefalias debidas a tumores que presionen el acueducto de Silvio o por obstrucciones debidas a hemorragias. En la mayoría de los tipos de hidrocefalia congénita en anima humanos, se ha detectado la pérdida progresiva del epitelio ventricular, fenómeno que se ha denominado denudamiento ependimario (cf. Jiménez et al., 2001; Domínguez-Pinos et al., 2005). Se ha propuesto que la estenosis acueductal se debe a la pérdida o a la alteración del epéndimo tanto en hidrocefalias adquiridas en ratas adultas (Grondona et al., 1996) como en hidrocefalias congénitas en ratones (Pérez-Fígares et al., 1998; 2001; Jiménez et al., 2001; Wagner et al., 2003).
Figura 10: A) Corte histológico del epéndimo de una rata normal teñidos con hematoxilina-eosina. B)Corte histológico teñido con la lectina LFA, que pone de manifiesto el ácido siálico (flechas), tanto en la superficie del epéndimo, como en las células endoteliales de los capilares sanguíneos (Pérez-Martín, 2000).
Como se ha expuesto anteriormente, el epéndimo presenta en su glucocálix una gran cantidad de ácido siálico como azúcar terminal, que por ser muy rico en cargas negativas pueden ser las responsables de que originen fuerzas de repulsión entre las paredes del acueducto de Silvio en condiciones no patológicas (Fig. 10)
Epe
A. B.
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contribuyendo a que permanezca abierto a pesar de su pequeño diámetro (Pérez-Fígares et al., 2001). Kelm y Schauer (1997) postularon que el ácido siálico que recubre la superficie celular de los eritrocitos y de las células endoteliales, produce un efecto antiadhesivo debido a las repulsiones electrostáticas que tienen lugar entre las abundantes cargas negativas del ácido siálico. Este mecanismo podría operar también en las células ependimarias previniendo el cierre de los conductos cerebrales estrechos, tales como el acueducto de Silvio y el canal central de la médula espinal, que está estenosado en el 90% de los humanos adulto. El acueducto de Silvio humano tiene 15 mm de longitud y un diámetro de tan solo 1 mm. En ausencia del epéndimo, las cargas negativas del ácido siálico también están ausentes, por lo cual, el acueducto de Silvio se sellaría en aquellos tramos que por presentar un menor diámetro sus superficies ventriculares están muy próximas (Fig. 11) (Pérez-Fígares et al., 2001 y Wagner et al., 2003). La eliminación del ácido siálico, con una sola inyección de neuroanimidasa en el ventrículo lateral del cerebro de rata, produce denudación ependimaria, obliteración del acueducto de Silvio e hidrocefalia no comunicante (Grondona et al., 1996). Al sellarse el acueducto de Silvio aumenta la presión generada por el LCR en el III ventrículo y en los ventrículos laterales. Como consecuencia del denudamiento efendimario en las cavidades ventriculares se alterará también la circulación del LCR debido a la ausencia de cilios en las zonas denudadas. En la hidrocefalia los plexos coroideos están reducidos y se cree que la producción parenquimal de LCR está aumentada por la pérdida del epitelio ependimario (Fig. 11) (Pérez-Fígares et al., 2001).
La incidencia de la hidrocefalia congénita en humanos es de 1 a 3 de cada 1000 niños nacidos vivos. La mayoría de los casos corresponden a hidrocefalia no comunicante con estenosis y obliteración del acueducto de Silvio (Verhagen et al., 1998). Se sospecha que algunas infecciones víricas, por reproducirse los virus específicamente en células ciliadas, inducen daño en el epéndimo y estenosis en el acueducto de Silvio, dando lugar a una hidrocefalia no comunicante (Margolis and Kilham, 1969; Tarieu and Weiner, 1982; Takano et al., 1993).
Mutaciones del gen que codifica para la molécula de adhesión neural N-CAM L1, localizado en el cromosoma X, generan hidrocefalia con estenosis en el acueducto de Silvio (Wong et al., 1995; Weller and Gärtener, 2001). Esta 34
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hidrocefalia relacionada con el cromosoma X, es el único tipo de hidrocefalia humana caracterizada a nivel genético, y se estima que constituye del 2 al 5% de todos los casos de hidrocefalia (Verhagen et al., 1998; Schrander-Stumpel and Fryhs, 1998; Haverkamp et al., 1999).
Figura 11: A)Esquema simplificado representando la circulación del LCR a través del acueducto de Silvio en un animal normal con abundante cantidad de ácido siálico recubriendo su epéndimo. Las abundantes cargas negativas del ácido siálico serían las responsables de que el acueducto de Silvio no se cierre por las repulsiones electroestáticas de estas cargas. B)En el animal hidrocefálico que presenta pérdida de epitelio ependimario, por estar ausente el ácido siálico se pierden las fuerzas de repulsión debidas a sus cargas negativas. Esto provocaría que los parénquimas neurales que rodean a los conductos estrechos se fusionen (flechas), estenosándose el conducto y produciéndose ventriculomegalia (doble flecha). Signos de interrogación: posible aumento de la producción extracoroidal de LCR en superficies denudadas;PC:plexos coroideos;VA:vellosidades aracnoideas.
Los cambios en la circulación del LCR que se dan en la hidrocefalia están asociados a alteraciones en estructuras periventriculares, como plexos coroideos, epéndimo secretor y ciliado, y en el tejido neuronal subependimario (Del Bigio, 1993). Los problemas en la correcta circulación y renovación del LCR también suponen la acumulación de metabolitos resultantes de la actividad cerebral (Wagner et al., 2003; Johanson et al., 2008), lo cual puede generar demencias seniles
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A
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(Rubenstein, 1998). Se ha demostrado que en ratas HTx con hidrocefalia genética no comunicante la concentración de algunas monoaminas está aumentada en el LCR (Rodríguez et al., 1999; Wagner et al., 2003).
Tradicionalmente, se han relacionado, como consecuencia de la hidrocefalia, numerosos procesos degenerativos como la estenosis del acueducto cerebral, la pérdida de epéndimo, la astrogliosis y la disminución del grosor de la corteza. Sin embargo, se ha comprobado que existen evidencias de que la hidrocefalia no es causa sino consecuencia de la ausencia del epitelio ventricular en un modelo animal (Jiménez et al., 2001; Batiz et al.; 2005; Paez et al., 2007), y en humanos (Domínguez-Pinos et al., 2005).
Además de la hidrocefalia congénita humana, hay otros muchos casos de hidrocefalia en especies de mamíferos de laboratorio (Bruni, 1998). Hay varios modelos animales de hidrocefalia congénita (Zhang et al., 2006) generadas por mutaciones genéticas espontáneas (Raimondi et al., 1973; Kohn et al., 1981; Sasaki et al., 1983; Bronson and Lane, 1990), por mutación genética inducida (cepas transgénicas) (Dahme et al., 1997; Estivill-Torrus et al., 2002; Blackshear et al., 2003), por sobre-expresión de genes (Galbreath et al., 1995) o por inmunoneutralización de la fibra de Reissner (Vio et al., 2000). En éstos animales, la estenosis del acueducto de Silvio precede y dispara la hidrocefalia (Bruni et al., 1988; Jones y Bucknall, 1988; Wagner et al., 2003).
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7. Modelo experimental de hidrocefalia congénita de tipo hereditario:
El ratón mutante
hyh
7.1. La mutación
Į
-SNAP
La mutación que presentan los ratones hyh (hydrocephalus with hop gait) corresponde a una mutación puntual en el gen Į-snap, también llamado napa, localizado en el cromosoma 7, que origina una sustitución de una guanina (G) por una adenina (A), la cual produce una sustitución de la metionina en la posición 105 por una isoleuciQD 0, HQ OD SURWHtQD Į-SNAP (Soluble N-ethylmaleimide sensitive factor Attachment Protein) (Chae et al., 2004; Hong et al., 2004). Ésta es una posición altamente conservada a lo largo de la evolución en las distintas especies de mamíferos, de lo que se deduce su importancia.
La proteína Į-SNAP regula la fusión de membranas en el tráfico celular mediado por vesículas, en la que interviene, además de la proteína SNAP, el factor sensible a la N-etilmaleimida (NSF) y el complejo SNARE, formado por la vesícula con la proteína v-SNARE (vesicular-SNARE) en su membrana y la proteína t-SNARE (target-SNARE) localizada en la membrana diana. El factor NSF se une a la proteína SNAP cuando ésta está unida al complejo SNARE y su actividad ATP-asa posibilita la fusión de la vesícula de transporte con la membrana de la diana (Fig. 12), (Bennett, 1995 /D SURWHtQD Į-SNAP desempeña un papel muy importante en el tráfico intercompartimental de proteínas por vesículas de transporte, incluyendo el transporte de proteínas hacia la membrana plasmática (Clary et al., 1990; Stenbeck, 1998), por lo que su mutación puede ocasionar problemas en el transporte de proteínas de adhesión y/o proteínas funcionales de la membrana plasmática de las células neuroepiteliales y ependimarias.
En los ratones hyh KLGURFHIiOLFRV OD FDQWLGDG GH SURWHtQD Į-SNAP es un 40% menor que en los animales silvestres. No se descarta que la funcionalidad de la proteína también esté alterada, pero según estudios del espectro de la proteína, la mutación no provoca ningún cambio sustancial en su estructura tridimensional. Chae
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et al. (2004) establecen que la mutación afecta a la estabilidad del RNAm, lo que provocaría la disminución en la concentración de la proteína.
Existen 3 tipos de proteínas SNAPĮ-61$3ȕ-61$3\Ȗ-61$3Į-61$3\ȕ-61$3 SUHVHQWDQ XQD VLPLOLWXG HQ VXV VHFXHQFLDV GHO \ DXQTXH Ȗ-SNAP tiene
PHQRVVLPLOLWXGHQVXVHFXHQFLDVLWLHQHXQDHVWUXFWXUDHVSDFLDOVLPLODUĮ-SNAP y
ȕ-SNAP tienen una alta expresión en el SNC. La primera se expresa tanto en el
HPEULyQFRPRHQHODGXOWR\ODVHJXQGDVyORHQDGXOWRVȕ-SNAP puede desempeñar
XQSDSHOFRPSHQVDWRULRHQFDVRGHDXVHQFLDGHĮ-SNAP. Durante la embriogénesis,
Į-SNAP está implicada en la diferenciación y morfogénesis, ya que juega un papel
muy importante en la determinación de la polaridad celular. Al no expresarse el gen ȕ-snapHQHVWDGLRVHPEULRQDULRVQRSRGUiFRPSHQVDUODPHQRUFDQWLGDGGHĮ-SNAP que existe en estos períodos en los ratones hidrocefálicos hyh(Hong et al., 2004).
Figura 12:Esquema que representa HO SRVLEOH SDSHO GH OD SURWHtQD Į-SNAP en el tráfico vesicular (Bennett, 1995).
/D SURWHtQD Į-SNAP mutada altera la localización de algunas proteínas de
superficie, como E-FDGKHULQDV \ȕ-cateninas en las células neuroepiteliales y en las células madre neuronales (Chae et al., 2004). Además, al alterar la fusión de
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membranas, la mutación afecta a la polaridad celular. Esto tiene unas consecuencias drásticas sobre las células madres en el desarrollo embrionario (Fig. 13). La alteración de la polaridad celular puede provocar una pérdida de células progenitoras de dos modos distintos: uno, por el desprendimiento de las células al alterarse las uniones celulares; y otro, por un fallo en la división celular consistente en la generación de divisiones simétricas de forma temprana, hecho que agotaría las células progenitoras. Chae et al., (2004) han descrito que en los ratones hyh hidrocefálicos hay menor cantidad de células progenitoras y precursores tardíos a partir de E16, lo que parece indicar que la más probable es la segunda opción. Probablemente también se producirá el desprendimiento de las células al alterarse las uniones celulares y esto influya en pérdida de células progenitoras.
Figura 13:Esquema que representa como se afecta la polaridad celular en la diferenciaciónFRQODPXWDFLyQĮ -SNAP. a) En condiciones no patológicas, las células progenitoras acumulan, en su membrana apical, ciertas proteínas y marcadores celulares necesarios para generar divisiones, en las que se mantiene o multiplica el número de células progenitoras.b) En el ratón hyh,estas proteínas no se disponen en la membrana apical, lo cual afecta a la polaridad celular. En estos casos no se producen divisiones autorrenovadoras, sino que las dos células hijas se diferencian originando neuronas y el número de células progenitoras disminuyen precozmente (Bajjalieh, 2004).
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Con lo que se conoce hasta ahora de los efectos de esta mutación, seguimos sin entender la relación entre esta mutación puntual, la hidrocefalia y demás alteraciones neuropatológicas que presentan estos ratones hidrocefálicos, aunque a alguna ya si se les está encontrando respuesta.
Hasta los descubrimientos de Hong et al., (2004) y Chae et al., (2004) sobre la mutación en la proteínaĮ-SNAP en los ratones hyh, no se podía ni siquiera pensar en otro modo de distinguir los animales hidrocefálicos, de los no hidrocefálicos para la mutación, más que por los rasgos fenotípicos. Esto dificultaba mucho el estudio en edades embrionarias tempranas, en las que los rasgos fenotípicos de hidrocefalia no son aparentes y en las que empiezan los primeros signos de la enfermedad. Por esta razón se ha tenido que realizar todo el proceso histológico hasta conseguir observar la presencia o ausencia del epitelio ependimario y poder asegurar así si el embrión iba a sufrir o no la enfermedad. Además, imposibilitaba el estudio en edades embrionarias anteriores a la aparición de los primeros signos de denudamiento del epéndimo, hecho que ocurre en E12.
Una vez que se conoce donde se localiza la mutación en el genoma de los animales hyh se está en condiciones de desarrollar un método de genotipado que permita diferenciar, dentro de una misma camada, los animales hidrocefálicos o los que van a desarrollar esta patología, de sus hermanos silvestres o heterocigotos, por medio de sus características genéticas y no fenotípicas, de forma que se pueda saber incluso en periodos embrionarios muy tempranos si un animal va a padecer o no hidrocefalia y abrir así muchas investigaciones futuras.
