REPUBLICA BOLIVARIANA DE VENEZUELA UNIVERSIDAD DEL ZULIA
FACULTAD DE MEDICINA
DIVISION DE ESTUDIOS PARA GRADUADOS MAESTRIA EN DIAGNOSTICO BACTERIOLOGICO
DETERMINACION FENOTIPICA Y MOLECULAR DE LA RESISTENCIA
A LA METICILINA Y MACROLIDOS EN CEPAS DE
Staphylococcus aureus
Trabajo de grado presentado ante la División de Estudios para graduados de la Facultad de Medicina para optar al título de Magíster Scientiarum en Diagnóstico Bacteriológico
Autor:
Lic. Elba L.Torres
Tutor:
Dra. Lisette Sandrea
DETERMINACION FENOTIPICA Y MOLECULAR DE LA RESISTENCIA A LA METICILINA Y MACROLIDOS EN CEPAS DE Staphylococcus aureus
Autor:
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Lic. Elba L.Torres Urdaneta CI: 3928977
Dirección: Edif. Villa Victoria- Cumbres de Maracaibo. Maracaibo- Estado Zulia
Teléfono: 0414- 6240554/ 0261-7557185 Correo electrónico: [email protected]
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EVALUACIÓN
Determinación fenotípica y molecular de la resistencia a la meticilina y macrólidos en cepas de Staphylococcus aureus. Maestría en Diagnóstico Bacteriológico. División de Estudios para Graduados. Facultad de Medicina. Universidad del Zulia. Maracaibo – Venezuela.
Lic. Elba Luisa Torres Urdaneta C.I. No. 3 928 977
Observaciones:
__________________ Coordinadora Dra. Lisette Sandrea CI: 9.974.307
___________________ Jurado
Lic. Maribel J. Castellano G CI: 7.768.616
___________________ Jurado
Lic. Sonia C. Romero A CI: 7.716.288
AGRADECIMIENTOS
A Dios por darme la oportunidad de realizar esta maestría en esta etapa de mi vida.
A mi esposo: por su apoyo incondicional durante el tiempo que duró la maestría, su ayuda en el uso de la computadora y su estímulo a seguir adelante.
A mis hijos: por su apoyo y comprensión durante todo el tiempo que le dediqué a este trabajo.
A mis padres: para quienes la educación y la superación profesional de sus hijos siempre fue su prioridad.
A mi tutora: Dra. Lisette Sandrea, por su valiosa asesoría, por el aporte de importantes conocimientos, por su tiempo y dedicación para la realización de esta investigación.
A la Lic. Nailet Arraíz: por su invalorable colaboración y dedicación y a todo el personal del laboratorio de biología molecular de la Escuela de Bioanálisis de LUZ.
Al Lic. Armindo Perozo y a la Lic. Maribel Castellano: artífices de esta maestría, por su colaboración y observaciones puntuales en la culminación de este trabajo.
A mis compañeras de maestría: con quienes compartí momentos de estudio, alegrías y también dificultades, gracias a todas ellas por el ánimo que nos dimos mutuamente.
A todo el personal del Centro de Referencia Bacteriológica del S.A.H.U.M por su valiosa colaboración, especialmente a la Dra. Xiomara Bonilla por su ayuda en la recolección de información necesaria para el desarrollo del trabajo.
A todos los profesores del post-grado por la transmisión de sus conocimientos académicos.
INDICE DE CONTENIDO Página Resumen ... 10 Abstract ... 11 INTRODUCCION ... 13 BASES TEORICAS ... 17
Historia y morfología de Staphylococcus aureus ... 17
Aspectos Bacteriológicos. Aislamiento e identificación ... 17
Epidemiología ... 18
Espectro de enfermedades. Factores de virulencia ... 18
Resistencia de S. aureus a meticilina ... 20
Resistencia de S. aureus a macrólidos ... 24
OBJETIVOS DE LA INVESTIGACION ... 28
MATERIALES Y MÉTODOS ... 30
Tipo de investigación ... 30
Análisis bacteriológico ... 30
Método de difusión del disco en agar ... 31
Prueba de screening en agar a la oxacilina ... 32
Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) a la oxacilina ... 33
Detección de PBP2a ... 34
Determinación fenotípica de la resistencia a macrólidos y lincosamidas ... 35
Prueba de D-Test ... 35
Detección de la presencia de los genes: mecA, ermA, ermB,ermC y msrA ... 36
Extracción del ADN ... 36
Amplificación del ADN ... 37
RESULTADOS Y DISCUSION ... 40
Análisis de la resistencia de S. aureus a la meticilina ... 40
Análisis de la resistencia a los macrólidos ... 43
Análisis de la expresión fenotípica de la resistencia de SARM a macrólidos ... 46
Análisis de la resistencia de S. aureus a los macrólidos por PCR ... 47
CONCLUSIONES ... 52
RECOMENDACIONES ... 53
INDICE DE TABLAS
Página Tabla 1. Mecanismos de resistencia a los antibióticos
Βetalactámicos en S. aureus ... 23
Tabla 2. Expresión genética de la resistencia de S. aureus a
eritromicina ... 26
Tabla 3. Criterios de interpretación de los antibióticos usados ... 32
Tabla 4. Porcentaje de resistencia de S. aureus aislados
en el CRB del SAHUM ... 41
Tabla 5. Métodos fenotípicos y genotípicos utilizados para la
detección de resistencia de 60 cepas SARM ... 42
Tabla 6. Porcentaje de 35 cepas SARM resistentes a eritromicina
Prueba D- test (+) ... 45
Tabla 7. Distribución de genes en los fenotipos de resistencia
MLSB y MSB en SARM ... 48
Tabla 8. Distribución de genes de resistencia en las cepas
D- Test (+) ... 49
INDICE DE GRAFICOS
Página Gráfico 1. Porcentaje de resistencia a eritromicina y clindamicina
de 60 cepas SARM………..44
Gráfico 2. Distribución fenotípica de la resistencia de SARM
resistente a eritromicina……… 46
INDICE DE FIGURAS
Página
Figura 1. Pared celular de bacterias Gram positivas………..19
Figura 2. Prueba D-Test positiva……….…….. 35
Figura 3. Detección de los genes mecA y ermB. PCR- Multiplex……….. 43
Figura 4. Detección de los genes de resistencia ermA, ermC y msrA
TORRES URDANETA, ELBA LUISA. Determinación fenotípica y molecular de la resistencia a la meticilina y macrólidos en cepas de Staphylococcus aureus. Universidad del Zulia. Maestría en Diagnóstico Bacteriológico. Facultad de Medicina. Maracaibo – Venezuela. 2009. 59 pp.
RESUMEN
Staphylococcus aureus es una bacteria que se encuentra en la piel y fosas nasales de las personas sanas, causante de una gran variedad de infecciones que pueden poner en peligro la vida, aunado al hecho de la creciente resistencia a los antibióticos observada en los últimos años. El objetivo de esta investigación fue determinar la resistencia fenotípica y molecular a la meticilina y macrólidos en cepas de Staphylococcus aureus aisladas en el Centro de Referencia Bacteriológica del Servicio Autónomo Hospital Universitario de Maracaibo. Para determinar la resistencia a meticilina y eritromicina se utilizó el método de difusión en disco, concentración inhibitoria mínima (CIM), prueba de screening de oxacilina, detección de PBP2a y detección de los genes mecA, erm, msrA, por PCR y D-test para la resistencia inducible a la clindamicina. De las 60 cepas de S. aureus seleccionadas, una cepa fue mecA negativo, aun mostrando resistencia a oxacilina (CIM: 4 ug/ml) considerándose como cepa “borderline”, 59 cepas fueron ratificadas como resistentes a meticilina (SARM), mostrando todas ellas el gen mecA. De las cepas SARM, 35 fueron resistentes a eritromicina mostrando el 71,42% de ellas el fenotipo MLSBc, el 11,42% % el fenotipo MLSBi y el 17,14 % el tipo MSB. El gen ermA fue el más frecuentemente encontrado en el fenotipo tanto constitutivo como inducible. En todas las cepas con el fenotipo MSB se detecto el gen mrsA, mientras que el gen ermB se detectó en una sola cepa combinado con otro gen ermA. El elevado porcentaje de resistencia a eritromicina encontrado en las cepas SARM, constituye un grave problema, por ser este antibiótico la elección alternativa para el tratamiento de estas cepas de S.aureus resistentes a meticilina y pacientes alérgicos a la penicilina.
TORRES URDANETA, ELBA LUISA. Determination phenotype and molecular of the resistance to the methicilin and macrolides in Staphylococcus aureus strains. University of the Zulia. Mastery Bacteriological Diagnostic. Facultad de Medicina. Maracaibo - Venezuela. 2009. 59 pp.
ABSTRACT
Staphylococcus aureus is a bacterium that one finds in the skin and nostrils of the healthy persons, causer of a great variety of infections that can put in danger the life, united to the fact of the increasing resistance to the antibiotics observed in the last years. The objective of this research was to determine the resistance phenotype and molecular to the methicilin and macrolides in strains of Staphylococcus aureus isolated in the Center of Bacteriological Reference of the Autonomous Service University Hospital of Maracaibo. To determine the resistance to meticilina and eritromicina was used the method of diffusion on disc, inhibitory minimal concentration (CIM), test of screening of oxacilina, detection of PBP2a and detection of the genes mecA, erm, msrA, for PCR and D-test for the resistance inducible to the clindamicina. Of 60 strains of S. aureus selected, a strain one was a mecA negative, even showing resistance to oxacilina (CIM: 4 ug/ml) being considered to be a strain borderline, 59 strains were ratified like resistant to meticilina (SARM), showing all of them the gene mecA. Of the strains SARM, 35 were resistant to eritromicina showing 71,42 % of them the phenotype MLSBc, 11,42 % the phenotype MLSBi and 17,14 % the phenotype MSB. The gene ermA was more frequently found in the phenotype so much constitutivly as inducible. In all the strains with the phenotype MSB was detect the gene mrsA, whereas the gene ermB was detect in an alone strains combined with another gene ermA. The high percentage of resistance to eritromicina found in the strains SARM, constitutes a serious problem, for being this antibiotic the alternative choice for the treatment of these strains of S. aureus resistant to methicilin and patients allergic to the penicillin.
I
NTRODUCCION
Staphylococcus aureus es un patógeno primario reconocido para el hombre y es uno de los agentes bacterianos que con mayor frecuencia causa infecciones intrahospitalarias. Es parte de la flora normal del hombre, siendo el sitio de portación principal las fosas nasales, por lo que debe ser considerado como un patógeno oportunista. Puede causar una amplia variedad de infecciones: lesiones superficiales, infecciones sistémicas con riesgo de vida (endocarditis, osteomielitis, neumonía, abscesos cerebrales, meningitis y bacteriemia), y enfermedades producidas por toxinas (intoxicación alimentaria, síndrome de la piel escaldada o síndrome de shock tóxico) (4).
Este microorganismo ha demostrado un gran poder de adaptación a los agentes antimicrobianos, adquiriendo paso a paso resistencia a todos los antibióticos disponibles para el tratamiento de las infecciones que ocasiona. De hecho, las infecciones por Staphylococcus aureus constituyen un problema de salud, tanto en áreas intrahospitalarias como de consulta externa. La aparición y diseminación de cepas de Staphylococcus aureus resistentes a diversos antimicrobianos, como lo son meticilina y macrólidos, que constituyen los antibióticos de uso común para su tratamiento, ha contribuido a agravar el problema. Una proporción importante de la población puede ser portador asintomático de esta bacteria, siendo el sitio de colonización más frecuente las fosas nasales (6).
Muchos factores han sido asociados a la resistencia a los antimicrobianos, una de ellas la variabilidad de S. aureus, su adaptación frente cambios del medio ambiente, su continua adquisición de nuevos mecanismos de resistencia relacionados con genes que codifican para nuevas proteínas fijadoras de penicilina PBP, el uso indiscriminado de antibióticos, la utilización de métodos invasivos de diagnóstico y el aumento cada vez mayor de la terapia inmunosupresora (6).
De hecho, cuando se habla de la resistencia de los estafilococos es importante hacer una distinción entre infecciones adquiridas en la comunidad e infecciones adquiridas en
el hospital; casi uniformemente la tasa de resistencia de aislamientos de la comunidad son significativamente mas bajos que la tasa de aislamientos nosocomiales. El hecho de que los aislamientos de hospitales tienen una alta tasa de resistencia implica que son epidemiológicamente diferentes de los aislamientos de la comunidad y existen numerosos trabajos basados en la biología molecular que apoyan esta hipótesis. De igual modo, esto también implica que aislamientos nosocomiales representen la microflora residente en el hospital transferida a los pacientes a través de los trabajadores de la salud colonizados con esta bacteria (12).
Es por ello que la aparición de cepas de S.aureus resistente a meticilina (SARM) ha contribuido al incremento de infecciones nosocomiales y de la comunidad, constituyendo un problema creciente en nuestros hospitales, representando la mayor fuente de morbilidad y mortalidad para los pacientes que por lo general tienen un mayor riesgo de desarrollar infecciones debido a una enfermedad subyacente, tratamiento inmunosupresor o la aplicación de numerosos procedimientos que conducen a la ruptura de las barreras de protección natural del paciente (12).
Numerosos estudios han demostrado que estas infecciones son, por lo general, causadas por la propia flora del paciente. Se han descrito diferentes vías de origen de adquisición de la infección, algunos pacientes estarían colonizados al momento de su hospitalización, otros serían colonizados durante su permanencia en el hospital, sin embargo, ésto no se ha establecido con claridad (4).
Así mismo, las infecciones nosocomiales representan un aumento de la estadía en el hospital para el paciente y un encarecimiento de los recursos de salud y hospitalización tomando en cuenta la elevada dificultad de erradicación de las infecciones intrahospitalarias, dado que muchas de ellas son debidas a bacterias multirresistentes, ocasionando consecuencias negativas a la recuperación de la salud del paciente (36).
El estado de portador nasal de S. aureus, también juega un importante papel en la epidemiología y patogenia de la infección. Algunos grupos de individuos parecen estar particularmente predispuestos a su colonización. Por ejemplo los médicos, las
enfermeras y los asistentes de guardia en el hospital pueden ser portadores nasofaríngeos en un porcentaje más alto (50,70 y 90% de los casos, respectivamente) que la población general (33%) (23).
En nuestro país el estado de portador nasal de SARM en el personal de salud revela cifras que oscilan entre el 18 y 45%; Rodríguez y cols., (33) reportaron una prevalencia de 32,0% de portadores nasales de S. aureus en el personal médico del Hospital Militar Dr. Carlos Arvelo; Alviarez y cols. (1) encontraron 31,58% de portadores nasales de SARM en el personal de salud de la unidad de alto riesgo neonatal del Hospital Universitario de los Andes. También, Castellano y cols. (8) a nivel local describieron un 18,25% de portadores de S.aureus y un 18,87% de SARM, en estudio de estado de portador en personal de enfermería realizado en el Centro de Referencia Bacteriológica del Hospital Universitario de Maracaibo. A nivel de otros países Mendoza y cols., (25), en el 2002 en Perú reportaron un 44,4% de portadores de SARM en el personal que labora en un area de Neonatología, encontrando un 70% de portadores nasales de S. aureus
Uno de los factores más importantes para controlar tanto portadores como enfermos sería la detección de las cepas S. aureus mediante métodos sencillos, rápidos y fiables; sin embargo la particular expresión fenotípica de la resistencia que este microorganismo posee, hace su detección un problema técnico. Métodos más antiguos como el fenotipo de resistencia, la tipicación por bacteriófagos, la inmunoserología y la tipicación sérica por coagulasa han sido insatisfactorios. Más recientemente estos métodos han sido reemplazados por métodos genéticos, como tipificación electroforética de proteínas, electroforesis de enzimas multiloculares, análisis de DNA cromosómico con endonucleasas de restricción, que han mostrado ser muy útiles para las investigaciones epidemiológicas (23).
Debido a la elevada resistencia que se ha observado a este antibiótico, no solo en los ámbitos hospitalarios sino también en el extrahospitalario, aunado al hecho de los elevados procesos alérgicos a la penicilina que cada día van en aumento, se hace necesario el uso de antimicrobianos alternativos como son los macrólidos,
específicamente la eritromicina, así como también las lincosamidas como la clindamicina, que poseen un espectro antibacteriano similar, pero no idéntico, al de la penicilina (36).
No obstante, el uso de clindamicina para el tratamiento del SAMR que son resistentes a eritromicina puede determinar la aparición de resistencia a este antibiótico durante el tratamiento por mecanismos de resistencia vinculados. De hecho, diferentes autores (2,20,22); plantean la efectividad de clindamicina como tratamiento antimicrobiano pero advierten sobre el riesgo de las cepas de SAMR sensibles a clindamicina y resistentes a eritromicina por la posibilidad de resistencia inducible durante el tratamiento y la posterior falla terapéutica (22, 44).
Por lo tanto y en respuesta a lo anterior, los clínicos deben estar informados por el laboratorio de microbiología sobre las cepas de SAMR que tienen resistencia inducible, dado que si el paciente tiene una mala evolución o una recaída terapéutica, una de las explicaciones es la adquisición de resistencia durante el tratamiento (36).
La alta y creciente resistencia de Staphylococcus aureus a los antimicrobianos, conlleva al interés de la investigación sobre la resistencia de este microorganismo, haciendo uso de técnicas fenotípicas y genotípicas, con miras a conocer más sobre su comportamiento en el ámbito hospitalario y de la comunidad, donde la prevalencia de la resistencia a la meticilina y macrólidos por parte de este microorganismo implica un serio problema por haber sido hasta ahora estos antibióticos de uso común para el tratamiento (44).
Basándose en ello, se plantea la siguiente interrogante ¿Cual será la incidencia de la resistencia a la meticilina y eritromicina de las cepas de Staphylococcus aureus en estos ámbitos? y basado en la importancia que ésto representa, la presente investigación pretende determinar la resistencia a la meticilina y a los macrólidos de las cepas de Staphylococcus aureus, mediante el uso de pruebas tanto fenotípicas como moleculares.
BASES TEORICAS
Historia y morfología de Staphylococcus aureus
El término Staphylococcus deriva de la expresión griega staphyle (racimo de uvas) y fue escogida por el cirujano escocés Sir Alexander Ogdson debido a su característica y disposición microscópica en racimos. Desde el punto de vista microscópico S. aureus es un microorganismo Gram positivo caracterizado por cocos individuales con un diámetro de 0,5 a 1,7 µm. Estos cocos aparecen en forma individual, en pares o en cadenas cortas y tienen una fuerte tendencia a formar racimos debido a que la división celular que se produce en los tres planos perpendiculares no conduce a la separación total de las células hijas (23).
Actualmente basados en estudios de composición de bases de DNA, técnicas de hibridización DNA-RNA y estudios comparativos de 16S RNAr, el género Staphylococcus ha sido trasladado de la familia Micrococaccea a la familia Staphylococcaceae, perteneciente al orden Bacillales (28).
Aspectos bacteriológicos. Aislamiento e identificación
Staphylococcus aureus es una bacteria no mótil, no esporulada, catalasa positiva, anaerobio facultativo y desde el punto de vista macroscópico se caracteriza por el rápido crecimiento sobre agar sangre y otros medios sólidos no selectivos. La temperatura óptima de crecimiento es a 37˚C. Las colonias individuales están claramente definidas, lisas opacas y convexas, con un diámetro de 1 a 3 mm dentro de las 24 horas; son β- hemolíticas y poseen una pigmentación cremosa-amarillenta a dorada clásica causada por los carotenoides aumentada mediante incubación adicional a temperatura ambiente. Casi todas las cepas de S. aureus producen hemólisis dentro de las 24 a 36 horas en placas de agar sangre de caballo, oveja o humana. Cuando están encapsulados aparecen como colonias mucosas y pegajosas (23).
Epidemiología
Los estafilococos son colonizadores de diferentes superficies cutáneas y mucosas. Son flora normal de las narinas anteriores humanas, nasofaringe, región perianal y piel. Debido a que el estado de portador es frecuente en la población humana, las infecciones se adquieren con frecuencia cuando la cepa colonizante accede a un sitio normalmente estéril, como resultado de un traumatismo o abrasión de la piel y mucosas. Los estafilococos también se transmiten de persona a persona. Después de la transmisión, los microorganismos pueden establecerse como parte de la flora normal del receptor e introducirse después en sitios estériles por traumatismos o procedimientos invasivos (4).
La diseminación de estafilococos persona a persona, en particular los que han adquirido resistencia a los antimicrobianos, tiene lugar con mayor frecuencia en los hospitales y originan graves problemas en el control de infecciones. Puede transmitirse por fómites, aire, de las manos sin lavar de profesionales de la salud o a partir de una lesión cutánea infectada de estos mismos profesionales al paciente (4).
. Los brotes de infección por S. aureus pueden perpetuarse por si mismos, los pacientes infectados y quienes lo atienden se convierten a menudo en portadores, con lo que aumentan la carga total y ambiental del estafilococo causante (34).
Espectro de enfermedades y factores de virulencia
Staphylococcus aureus es la especie más virulenta de estafilococos que se conoce. Un amplio espectro de factores, no todos los cuales se conoce por completo, contribuyen a la capacidad de este microorganismo para causar infecciones y enfermedad. En su acción patógena intervienen los componentes de la pared celular y varias toxinas y enzimas mediadoras de la invasión de los tejidos y de la supervivencia en el sitio de la infección. La elaboración de estos factores es la principal causa de las diversas infecciones de piel, heridas y tejidos profundos causadas habitualmente por S. aureus (4).
Especial mención amerita la pared celular cuyo componente básico el peptidoglucano representa el 50% de su peso, el cual es un polisacárido compuesto de dos subunidades alternadas de ácido N acetilmurámico y N acetilglucosamina con propiedades biológicas como: interferir en la opsonización, activar el complemento y atraer polimorfonucleares entre otras funciones, también los ácidos teicoícos constituídos por polímeros de ribitol con fosfatos, participan en la adherencia específica de las bacterias Gram positivas a las superficies mucosas, además de conferir rigidez y elasticidad a la pared celular (21).
Igualmente la pared celular incorpora en su capa exterior de peptidoglucano varias proteínas incluidas las adhesinas y la proteína A. Por último, muchas cepas de S. aureus están revestidas por una capa externa de polisacárido que conforma una cápsula (21).
Figura 1
Pared celular de bacterias Gram-positivas
Fuente: http://www.molecularlab.it/insidemicro/?p=11
Los factores que pueden predisponer a un individuo a infecciones graves por S. aureus incluyen los siguientes:
• Defectos quimiotácticos de los leucocitos, sean congénitos o adquiridos. • Defectos de la opsonización por anticuerpos.
• Defectos en la destrucción intracelular de las bacterias después de la fagocitosis • Lesiones cutáneas
• Presencia de cuerpos extraños. • Infecciones por virus.
• Enfermedades crónicas de base.
• Administración profiláctica o terapéutica de agentes antimicrobianos (21).
Las infecciones por lo general involucran una intensa supuración y destrucción (necrosis) de tejido. En general, pueden agruparse en infecciones cutáneas localizadas, como la foliculitis, furúnculos e impétigo; infecciones de diversos tipos de heridas; infecciones profundas que se diseminan a partir de la piel para causar bacteriemia (con endocarditis y sin ella) y para comprometer, huesos, articulaciones, órganos y tejidos profundos. Enfermedades mediadas por toxinas como el síndrome del shock tóxico, síndrome de la piel escaldada e intoxicaciones alimentarias, también son producidas por este microorganismo. Estas toxinas actúan sobre las membranas celulares del huésped y producen la destrucción celular. La leucocidina media la destrucción de los fagocitos. El factor de formación de grumos, la coagulasa y la hialuronidasa, aumentan la invasión y la supervivencia en los tejidos. Entre las exotoxinas potentes se incluyen las exfoliativas, la toxina del síndrome del shock tóxico y enterotoxinas (4).
Resistencia de Staphylococcus aureus a la meticilina
Cuando se introdujo la penicilina en la terapéutica, después de la segunda guerra mundial, casi todas las cepas de S. aureus eran altamente susceptibles. Desde esa época, la selección de cepas preexistentes capaces de producir penicilinasa ha cambiado actualmente hasta el punto que 80 a 90% de los aislamientos actuales son resistentes a la penicilina. La penicilinasa es codificada por plásmidos y actúa rompiendo el anillo betalactámico, lo que vuelve al fármaco incapaz de fijarse en su sitio blanco. Las alteraciones del blanco betalactámico y las transpeptidasas del peptidoglicano (llamadas a menudo proteínas fijadoras de penicilina, PBP) son la explicación de la resistencia a la meticilina. Estas cepas de S. aureus resistentes a la
meticilina (SARM) también son resistentes a otras penicilinas resistentes a la penicilinasa, como la oxacilina. El mecanismo más frecuente es la adquisición de un gen para una nueva transpeptidasa, que tiene afinidad reducida por los antibióticos betalactámicos y que aun es capaz de efectuar su función enzimática de peptidoglicano de enlace cruzado (34).
Resistencia mediada por betalactamasa: en este caso, los microorganismos producen una enzima extracelular que inactiva el antibiótico mediante la apertura de su anillo betalactámico antes de que haya causado cambios irreversibles en la propia bacteria. Esta interacción mutua dependiente del tiempo implica que la presencia de un mayor número de microorganismos sobrepasa el efecto del antibiótico y acelera su destrucción. La mayor estabilidad a la betalactamasa se observa con la meticilina y la nafcilina seguida por la oxacilina, la cloxacilina y la dicloxacilina y en último lugar con la penicilina G. Las cefalosporinas muestran una estabilidad variable (23).
S. aureus probablemente tenga cuatro diferentes tipos de betalactamasas, como se ha evidenciado por estudios inmunológicos, de enfoque isoeléctrico e hidrolíticos. Las enzimas son en general inducibles y ocasionalmente constitutivas. La mayor parte de las veces se encuentran codificadas por plásmidos que transportan otros importantes genes como los que determinan la resistencia a metales pesados, a la eritromicina, asi como a otros antibióticos. Se ha publicado que unas pocas cepas de estafilococos presentan genes cromosómicos para la producción de penicilinasa (23).
La resistencia intrínseca: También llamada meticilino–resistencia, agrupa a todos los antibióticos betalactámicos, incluidas las cefalosporinas. Esta ha creado en las últimas décadas severos problemas terapéuticos, de manejo epidemiológico en todo el mundo (23).
La meticilina–resistencia se define como una concentración inhibitoria mínima (CIM) para la Oxacilina de ≥ 4 µg/litro o una CIM para la meticilina de ≥16 µg/litro. Existen varios métodos para la detección de la meticillna resistencia, los que se mejoran con la adición de un suplemento de cloruro de sodio al medio, una temperatura de 35°C, un período de incubación de 24 horas y un gran inóculo (23).
Los estafilococos normalmente presentan dos proteínas esenciales de unión a la penicilina (PBP) ligadas a la membrana citoplasmática interna; estas PBP tienen actividades enzimáticas y son responsables del cruzamiento con peptidoglucanos de la pared celular. De hecho, los estafilococos se pueden volver resistentes a todos los betalactámicos, incluídas aquellas con inhibidor de betalactamasa y todas las cefalosporinas y carbapenémicos mediante la adquisición del gen cromosómico mecA, que codifica un blanco suplementario alternativo llamado PBP2a que tiene baja afinidad por los betalactámicos. Esta PBP2a anormal continúa funcionando cuando las PBP 1,2 y 3 han sido inactivadas por los antibióticos betalactámicos y genera un peptidoglucano estable (23).
La expresión fenotípica del gen mecA varía entre los estafilococos. En algunas cepas solo una minoría de cepas expresan resistencia y son llamadas por lo tanto heterorresistentes; en otras cepas la expresión es homogénea. La expresión del gen mecA es regulada por diferentes factores auxiliares, entre ellos cinco factores fem (factor esencial para la resistencia a la meticilina). El gen mecA se localiza en un gran elemento de DNA de 30 a 40 kilobases (mec) de origen desconocido, conocido como cassette cromosomal estafolococico mec, que contiene muchos otros genes y elementos de inserción de secuencia similar que parecen haber sido adquiridos mediante transferencia genética horizontal y actúa como trampa para los determinantes genéticos de la resistencia adicional a fármacos no relacionados lo que conduce a la resistencia múltiple (23).
Tabla 1
Mecanismo de resistencia a los antibióticos β lactámicos en S. aureus
Antibiótico Blanco celular Genes de resistencia
Mecanismo de Resistencia
β lactamasa blaZ
Hidrólisis enzimática del nucleo β lactámico
β lactámicos
PBP2a mecA
Baja afinidad para β lactámicos
Existen 5 diferentes cassettes SCCmec, tipos I - V. Se ha delucidado la estructura completa de los diferentes tipos del cassette cromosomal SCCmec. El SCCmec es una isla genómica, el cual contiene el conjunto de genes mec (el gen mecA y los reguladores) y el conjunto de genes ccr, los cuales codifican recombinasas, específicas, responsables de la movilidad de SCCmec. Existen cuatros clases genéticas del complejo del gen mec (A- D). S. aureus solo se han encontrado A y B. La clase original A, contiene dos genes intactos mecI y mecRI, asi como el gen mecA (19, 42, 43).
SCCmec recuerda una isla de patogenicidad, sin embargo no contiene genes de virulencia. En ese sentido se le conoce como una isla de resistencia a los antibióticos ya que aparte de conferir resistencia a todos los antibióticos β-lactámicos, contiene genes de resistencia adicionales como consecuencia de la integración de plásmidos y transposones en el cassette cromosomal. SCCmec también confiere resistencia a eritromicina, espectinomicina, tetraciclina, kanamicina y otros (13, 17, 35).
Tolerancia a la acción bactericida de los antibióticos betalactámicos: Un cultivo de S. aureus tolerante se define como una cepa que exhibe una disociación muy marcada entre la CIM y la CBM (concentración bactericida mínima) del antibiótico betalactámico luego de la prueba estándar de dilución (23).
Staphylococcus aureus con resistencia fronteriza a la oxacilina - La resistencia a la oxacilina se ve en cepas que alojan el gen mecA y en otras cepas sin el gen mecA. Esta última resistencia se debe a la hiperproducción de betalactamasa y estos microorganismos de denominan S. aureus oxacilina-resistentes fronterizos. Esta hiperproducción de betalactamasas requiere altas concentraciones de cloruro de sodio y no induce una CIM mayor en condiciones de estudio normales (23).
En aquellas cepas resistentes a la meticilina, el uso de los macrólidos resulta ser una alternativa importante para el tratamiento de estos microorganismos.
Resistencia de Staphylococcus aureus a los macrólidos
Los macrólidos son agentes bacteriostáticos que inhiben la síntesis proteica por enlace reversible de la subunidad ribosómica del microorganismo. Esta modificación es el mecanismo mas común de la resistencia adquirida a los macrólidos, lincosamidas y streptograminas B (MLSB) en Staphylococcus aureus y confiere resistencia cruzada a los mencionados antibióticos que pueden ser de tipo constitutivo (MLSBc) o inducible (MLSBi). Cuando es inducible, la bacteria a menudo suele ser resistente a eritromicina pero susceptible a clindamicina. El uso de la clindamicina para el tratamiento del SAMR resistentes a eritromicina, puede determinar la aparición de resistencia a este antibiótico durante el tratamiento por mecanismos de resistencia vinculados. De hecho, diferentes autores (2, 15,18); plantean la efectividad de clindamicina como tratamiento antimicrobiano pero advierten sobre el riesgo de las cepas de SAMR sensibles a clindamicina y resistentes a eritromicina por la posibilidad de presentar resistencia inducible durante el tratamiento y la posterior falla terapéutica (28,44).
La clindamicina es un agente bacteriostático que inhibe la síntesis de proteínas bacterianas por la unión reversible con la subunidad 50S del ribosoma. En los estafilococos, el mecanismo más común para adquirir la resistencia a clindamicina es la modificación del sitio de acción, que se produce por la adquisición de un gen erm (erythromycin ribosome methylase), que codifica una enzima que dimetila un residuo
específico de adenina en el ARNr 23S , constituyendo el fenotipo MLSB constitutivo o inducible. Las cepas con el fenotipo MLSB constitutivo son resistentes a todos los macrólidos (con anillos de 14, 15 ó 16 átomos), a las lincosamidas, a los cetólidos y a las estreptograminas B (22).
Este cambio conformacional producido en el ribosomapor la metilación, disminuye la afinidad a los macrólidos, fármacosquímicamente distintos pero con similar mecanismo y sitio de acción. Esta resistencia cruzada conocida como resistencia fenotípica MLSB,
se expresa en forma constitutiva, cuando la metilasa de ARNr se produce constantemente, e inducible, cuando solo se produce en presencia de un agente inductor. La resistencia se induce por la unión del macrólido (agente inductor) a la secuencia "upstream" del atenuador transcripcional, produciendo cambios en la estructura secundaria de la molécula del ARN mensajero, exponiendo el sitio de unión al ribosoma, permitiendo la traducción de la metilasa erm. La prueba de inducción a la clindamicina o D-test es realizada entonces, en cepas de Staphylococcus sp que son resistentes a eritromicina y sensibles a clindamicina, mediante la aplicación de métodos de susceptibilidad (22).
Recientemente fue descrita la resistencia mediada por bombas de eflujo codificadas por el gen msrA que confiere resistencia a macrólidos de 14 y 15 átomos y estreptograminas tipo B (fenotipo MSB), estos transportadores utilizan la hidrólisis del ATP como fuente de energía de flujo activo, incrementando el proceso de expulsión del antibiótico. Cuando la resistencia a eritromicina es mediada por msrA, la resistencia inducible a clindamicina no se produce (12). Entonces la resistencia a los macrólidos puede ocurrir principalmente por dos diferentes mecanismos como resultado de cambios fenotípicos como se muestra a continuación:
Tabla 2
Expresión genética de la resistencia de S. aureus a eritromicina Mecanismo Determinante (gen) Eritromicina Clindamicina Eflujo msrA R S Alteración ribosómica Erm R S* Alteración Ribosómica Erm R R (Constitutiva)
MsrA = macrolide streptogramin (type B) resistance; erm = erythromycin ribosome methylase; confiere resistencia inducible o constitutiva; R= resistencia; S= sensible *requiere inducción para demostrar resistencia.
OBJETIVOS
OBJETIVOS DE LA INVESTIGACION
Objetivo General:
Determinar resistencia fenotípica y molecular en cepas de Staphylococcus aureus aisladas en el Centro de Referencia Bacteriológica del Hospital Universitario de Maracaibo.
Objetivos Específicos:
• Determinar la resistencia de S. aureus a la oxacilina mediante el uso de pruebas de susceptibilidad: concentración inhibitoria mínima (CIM), técnicas de difusión en disco y Test de screening.
• Detectar la presencia del gen mecA en cepas de S. aureus meticilino - resistente mediante la técnica de PCR.
• Evaluar la presencia de PBP2a en cepas de S. aureus meticilino - resistente.
• Determinar la resistencia de S. aureus a la eritromicina mediante el uso de pruebas de susceptibilidad: técnica de difusión en disco y CIM.
• Evaluar la resistencia inducible a la clindamicina mediante el uso de la prueba del D-Test.
• Detectar la presencia de los genes: erm, y mrsA mediante el uso de técnicas moleculares (PCR).
M
ATERIALES Y
MÉTODOS
MATERIALES Y METODOS
Tipo de Investigación
Tomando en consideración las definiciones hechas por autores como Hernández y cols. 2006 (16) en relación a la clasificación que hace de los tipos de investigación. La presente investigación es de tipo descriptiva, ya que se describió todo lo referente a la caracterización de la resistencia de S. aureus, sus causas, asi como la determinación de sus diferentes mecanismos y su relación con su expresión fenotípica.
El diseño es no experimental, ya que no hubo manipulación de las variables y fue tomada tal y como se presentó. Fue realizado un estudio prospectivo en el que se incluyeron las cepas de S. aureus provenientes de muestras recolectadas de pacientes ingresados en los diferentes servicios del Servicio Autónomo Hospital Universitario de Maracaibo (SAHUM).
Análisis Bacteriológico
Población
De un total de 518 aislamientos de S. aureus provenientes de pacientes tanto de consulta externa como de hospitalización, se seleccionaron al azar 60 cepas de 313 aislamientos SARM, procesadas por el personal que labora en el laboratorio del Centro de Referencia Bacteriológica (CRB) del Servicio Autónomo Hospital Universitario de Maracaibo, siguiendo la metodología propia para la identificación de S. aureus durante el período de enero a julio de 2009
.
De la información suministrada por los pacientes en la boleta que acompaña a las muestras clínicas se procedió a la recolección de datos que fueron de importancia para la presente investigación: nombre completo, edad, sexo, servicio, tipo de muestra, diagnóstico y tratamiento. La detección molecular deesta investigación fue realizada en el laboratorio de biología molecular de la Escuela de Bioanálisis de la Facultad de Medicina de la Universidad del Zulia (LUZ).
Determinación fenotípica de la resistencia a la meticilina
A las cepas de S. aureus resistentes a la meticilina se les realizaron pruebas de susceptibilidad para la confirmación de resistencia a la meticilina. El antibiograma de estas cepas se realizó mediante el método de difusión del disco en agar siguiendo las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI. 2008) (9) y la concentración inhibitoria mínima (CIM) por el método automatizado Vitek. Los antibióticos que se probaron fueron la oxacilina y cefoxitina, antibióticos comparables para la predicción de resistencia mediada por el gen mecA y los antibióticos eritromicina y clindamicina para la resistencia a macrólidos y lincosamidas.
Método de difusión en disco
Para las pruebas de susceptibilidad por el método del disco se utilizó la metodología descrita por Bauer y Kirby (3), siguiendo los lineamientos del CLSI. Para ello se utilizaron placas de Mueller Hinton (MH) a los cuales se les colocó los discos de oxacilina 1 µg, cefoxitina 30 µg, previamente inoculado con un cultivo joven de 24 horas en agar sangre humana (ASH), transfiriendo con un asa bacteriológica de 3 a 4 colonias de S. aureus a un tubo con 5 ml de caldo soya tripticasa o solución salina estéril (SSF), dicha suspensión fue estandarizada espectrofotométricamente hasta alcanzar una densidad óptica entre 0,08-0,10 de absorbancia, a una longitud de onda de 625 nm, la cual es equivalente al tubo 0,5 de la escala de McFarland, que corresponde a una suspensión bacteriana de 1,5x 108 UFC/ml. Luego se inoculó a manera de césped la superficie del Agar Muller Hinton (MH). El inóculo se dejó secar de 3 -5 minutos, luego se colocaron los discos de oxacilina y cefoxitina y las placas se incubaron 24 horas a 35 ºC para realizar posteriormente la lectura de la prueba. Para el control de calidad se utilizó la cepa de S. aureus ATTC 25923. Los resultados se expresaron en las categorías de sensible (S), intermedio (I) y resistente (R), utilizando los criterios de interpretación que a continuación se presentan (3,9).
Tabla 3
Criterios de interpretación de los antibióticos utilizados
Fuente: CLSI (documento M100- S17/Vol.27,Nº1/2008)
Prueba de screening a la oxacilina
Las cepas de S. aureus que resultaron resistentes o intermedias a oxacilina (OX) por el método del disco, fueron tomadas para hacerles el descarte en agar oxacilina con NaCL, mediante el método de suspensión directa de las colonias, se preparó un inóculo estandarizado de forma similar al utilizado para las pruebas de susceptibilidad por el método de difusión del disco en agar, luego con un hisopo de algodón estéril se inoculó en un área de 10-15 mm, una placa con agar MH suplementado con 4% de NaCL (p/v 0,68mol/L) y 6µg/ml de oxacilina. Las placas se incubaron a 35˚C en condiciones de aerobiosis durante 24 horas. Conjuntamente se probaron las cepas control, S. aureus ATCC 43300 (resistente) y S. aureus ATCC 29213 (susceptible). Luego del período de incubación, cualquier crecimiento sobre las placas fue considerado resistente. A las cepas que resultaron resistentes a la oxacilina se les determinó la concentración Inhibitoria mínima (CIM).
Concent. (µg)
Resistencia Intermedio Susceptible
Oxacilina 1µg ≤ 10 11-12 ≥13
Cefoxitina 30µg ≤ 21 >>
Concentración Inhibitoria Mínima (CIM)
A las cepas que resultaron oxacilina intermedias o resistentes se les determinó la CIM por el método automatizado VITEK, que utiliza tarjetas (GPS) adaptadas a los antibióticos que se utilizan para estafilococos. Los principios de la tarjeta GPS, se basan en la técnica de Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) por microdilución. La tarjeta GPS 112 (bioMérieux) para cocos Gram positivos, contiene 45 pocillos. El pocillo control positivo determina como el organismo crece sin inhibición antimicrobiana. Cada uno de los demás pocillos contiene alícuotas, el equivalente de porciones previamente medidas y pesadas por separado, de un agente antimicrobiano especifico combinado con medio de cultivo; entre ellos: oxacilina, eritromicina y clindamicina.
Para preparar la suspensión del microorganismo normalizado, con un hisopo estéril, se seleccionaron suficientes colonias frescas aisladas del medio de agar sangre de carnero (ASC) para preparar una suspensión bacteriana uniforme en 1,8 ml de solución salina estéril al 0,45-0,5% , equivalente a simple vista al patrón nº 0,5 de McFarland (zona roja, 80%T a 88%T, en el Colorimeter VITEK). Posteriormente, en un tubo de ensayo con 1,8 ml de solución salina estéril al 0,45-0,5%, se transfirieron 200 µL del inóculo estandarizado. Esta dilución final se utilizó para el llenado de la tarjeta GPS. Los resultados para estafilococos se obtuvieron en un mínimo de 6 horas. Después de inocular la tarjeta y colocarla dentro del lector/incubador, la tarjeta no ameritó manipulación adicional.
El software determinó cuando un pocillo muestra crecimiento (positivo) basándose en la atenuación de la luz medida por medio del lector óptico. El crecimiento del microorganismo se expresó como un cambio de turbidez y el color en los pocillos. El software evaluó cada pocillo por separado y así, se determinó el nivel de crecimiento en cada uno, una vez por hora. Después de la incubación se procedió a imprimir el resultado de los valores de CIM para cada antimicrobiano.
Detección de PBP2a
Es una prueba rápida de aglutinación en látex basada en la detección de PBP2a disponible comercialmente como un kit. El método involucra la extracción de PBP2a a partir de suspensiones de colonias y detección por aglutinación con partículas de látex cubiertos con anticuerpos monoclonales de PBP2a. La prueba es muy sensible y específica para S. aureus. Las reacciones suelen ser más fuertes si la producción es inducida por el crecimiento en presencia de penicilina.
A partir de un crecimiento fresco de 24 horas en medio no selectivo (ASH), se tomaron 5-10 colonias de estafilococos con la ayuda de un asa bacteriológica calibrada, transfiriéndose a un tubo ependorff, al cual previamente se le agregó 4 gotas del reactivo de extracción Nº1, se homogeneizó y se llevó a un bloque térmico (mas de 90ºC) durante 3 minutos. Transcurrido este tiempo se retiró el tubo ependorff del calor, se dejó que tomara la temperatura ambiente, se le adicionó una gota del reactivo de extracción Nº2, se mezcló bien y se llevó a la centrífuga a 3000 rpm durante 5 minutos. Seguidamente se tomaron 50µl del sobrenadante tratando de no tocar el sedimento y se colocó sobre una tarjeta de reacción, posteriormente se le agregó una gota del reactivo látex (Anticuerpos monoclonales contra PBP 2) y se mezcló con un aplicador plástico estéril.
De la misma manera, se tomaron 50µl del sobrenadante y se colocó en otro círculo, correspondiente al control y se añadió una gota del control látex, mezclándose bien, se le aplicó movimientos giratorios a la tarjeta durante 3 minutos. La interpretación de la prueba fue dada por aglutinación con el reactivo látex y no con el control, considerándose entonces como positiva, mientras que la ausencia de aglutinación en 3 minutos fue considerada negativa.
Determinación fenotípica de la resistencia a macrólidos y lincosamidas.
La detección de la resistencia de SARM a eritromicina y clindamicina se realizó a través de la prueba de D- Test que se explica mas adelante y la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM), igualmente por el método comercial Vitek usado para la oxacilina.
Prueba de D-Test
Para ello se utilizó la técnica propuesta por CLSI 2008, donde se realizó una suspensión del microorganismo en solución salina fisiológica 0,85% comparable con el tubo Nº 0,5 de McFarland. Luego fue inoculada una placa de agar de Mueller Hinton y se colocaron los discos de eritromicina y de clindamicina a una distancia entre ambos de 20 mm. En la prueba positiva se observa un achatamiento del halo de inhibición del crecimiento alrededor del disco de clindamicina, en la zona que está adyacente al disco de eritromicina indicando resistencia inducible a clindamicina, como se muestra en la figura 2.
Figura 2
Prueba D-Test positiva
Fuente: http://www.microbiology-consult.com/id5.html
Detección de la presencia de los genes: mecA, ermA, ermB, ermC y msrA
Para la detección de la presencia del gen mecA y de los genes erm y msrA, se utilizó reacción múltiple en cadena de la polimerasa (PCR). La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) detecta el gen mecA que presentan las cepas de SARM como marcador genético de resistencia. Su sensibilidad es superior a la de los métodos habituales, ya que detecta incluso las cepas que no han expresado la resistencia. Este método posee la ventaja de no estar sujeto a las condiciones de crecimiento de las cepas, pudiendo aplicarse a gran número de aislados y podría ser aconsejable en casos de duda con valores de CIM cercanas al límite. Además del gen mecA presentes en las cepas SARM, a éstas también se les detectó genes que le proporcionan resistencia a los macrólidos y lincosamidas, como son: gen ermA, gen ermB, gen ermC y el gen msrA.
Extracción del ADN
Se realizó la detección de estos genes por PCR a todas las cepas incluidas en el estudio. Mediante el siguiente protocolo estandarizado de acuerdo a condiciones en el laboratorio, se procedió a la extracción del ADN: 1) Se colocó una asada de colonias (10 aprox.) en un tubo eppendorf conteniendo 200 µl de buffer TE 5X y se agregó 10µl de lisostafina, se incubó a 37ºC por 1 hora. 2) Se agregó 20µl de SDS (detergente) al 10% y 10µl de proteinasa K y se incubó por 1 hora a 50 ºC y luego 10 minutos a 80ºC para inactivar la proteinasa. 3) Extracción con 400µl de cloroformo, centrifugar por 10 minutos y extraer la fase acuosa y pasar a un tubo eppendorf nuevo. 4) Se precipitó con etanol absoluto (el doble del volumen) toda la noche en el congelador. 5) Se centrifugó por 20 minutos, se decantó el sobrenadante y se lavó el sedimento con etanol al 70% y se volvió a centrifugar por 5 minutos. 6) Se decantó el sobrenadante y se dejó secar por 30 minutos y 7) Se resuspendió en 50µl de buffer TE y se conservó en el congelador hasta su amplificación.
Amplificación del ADN
Para la amplificación del ADN se emplearon dos mezclas de reacciones múltiples (PCR Multiplex), con el objeto de minimizar tiempo y recursos, conteniendo los “primers” descritos por Martineau y cols (24). La primera mezcla: con el “primers” del gen mecA de 174 pb: 5’-ACC AGG TGA ATT ATT AGC ACT TGT AAG-3’ y 5’- ATT GCT GTT AAT ATT TTT GTA GTT GAA- 3’, el gen ermB de 142 pb: 5’-CTA TCT GAT TGT TGA AGA AGG ATT-3’ y 5’-GTT TAC TCT TGG TTT AGG ATG AAA-3’ y un gen 16S rRNA de la región conservada como control interno de S. aureus. La segunda mezcla de reacción con pares de “primers” para el gen ermA con 139 pb: 5’-TAT CTT ATC GTT GAG AAG GGA TT-3’ y 5’-CTA CAC TTG GCT TAG GAT GAA A-3’; el gen ermC de 190 pb: 5’- CTT GTT GAT CAC GAT ATT TTC C-3’ y 5’- ATC TTT TAG CAA ACC CGT ATT C- 3’ y el gen msrA con 163 pb: 5’-TCC AAT CAT TGC ACA AAA TC-3’ y 5’-AAT TCC CTC TAT TTG GTG GT-3’. A cada uno de los estafilococos se le probó ambas mezclas con el par de “primers” complementarios de cada gen a amplificar.
La reacción de amplificación se llevó a cabo con un termociclador Peltier M.J Research- Modelo PT-100. En cada reacción se utilizaron los siguientes componentes: buffer gotaq 5 mM Tris; 2,5 µM Mgcl2; 4 µl mezcla de “primers” ; 200 µM dNTP; 1,5 U de taq ADN polimerasa ; ADN de la muestra 3 µl y agua suficiente para completar un volumen final de 25 µl.
El programa empleado para la amplificación de cada una de las dos mezclas de reacción fue el siguiente: primeramente colocar el termociclador en el programa S.aureus: desnaturalización a 96°C por 5 minutos, seguido de 30 ciclos a 95°C por 30 segundos, apareamiento de los “primers” a 55°C por 30 segundos y extensión de la ADN polimerasa a 72° C por 30 segundos, volver a la desnaturalización 35 veces y extensión final a 72ºC por 5 minutos y posterior enfriamiento a 4 ºC.
Los productos amplificados fueron analizados por electroforesis empleando geles de agarosa al 2%, corridos a 80 volts aproximadamente por 1 hora. El tamaño del amplicón
fue comparado con un marcador con fragmentos de longitud establecidos. El ADN fue visualizado utilizando un transiluminador de luz UV después de la tinción con bromuro de etidio. Para la implementación de la técnica y como controles positivo y negativo, se empleó una cepa SAMR local y la cepa ATCC de S. aureus 29213, respectivamente.
R
ESULTADOS Y
D
ISCUSIÓN
RESULTADOS Y DISCUSION
Análisis de la resistencia de S. aureus a la meticilina
De 60 cepas de SARM seleccionadas al azar, provenientes de muestras de cultivos varios (abscesos, heridas, etc.), aisladas en el período de estudio, se encontró un porcentaje de 60,42%. Este alto porcentaje concuerda con las cifras de resistencia de S.aureus a la meticilina, a nivel hospitalario y de la comunidad, relacionados con factores que propician este aumento como el uso indiscriminado de antibióticos, insuficiente control de portadores y falta de vigilancia permanente de los cultivos positivos con SARM.
Las cifras se observan de manera gráfica en la tabla 4 y coincide con el aumento progresivo en otros países como Chile con un 55% (14) y Colombia con un 41 % (31). De igual modo en Argentina Ferrero y cols. (11), encontraron una prevalencia de 45,8% de SARM en infecciones intrahospitalarias de piel y partes blandas; en Uruguay Prego y col. (29) reportaron un 47% de SARM del total de infecciones estafilocócicas y un 73% en las infecciones cutáneas profundas contra un 10% en las infecciones cutáneas superficiales.
Aquí en nuestro país, se han encontrado cifras altas de SARM, como el estudio realizado en el laboratorio de la policlínica metropolitana en la ciudad de Caracas, ellos reportaron 88,0% de resistencia de S. aureus a la meticilina (41). No obstante, Hurtado y cols (18), en el 2002 con cepas procedentes de centros de salud del Grupo Venezolano de Vigilancia de la Resistencia Bacteriana (GVRB) encuentran que la resistencia de antibióticos de primera línea como la oxacilina fue de 64%; sin embargo, se observó una tendencia hacia la disminución de porcentajes de resistencia calculados por ciclos de tres años, utilizando herramientas propias del análisis de series cronológicas. Los autores aportan que dicho descenso pareciera depender de las mejoras introducidas en las técnicas de determinación de la resistencia a estos antibióticos.
Tabla 4
Porcentaje de resistencia de S.aureus aislados en el CRB del SAHUM. Periodo enero – Julio 2009
Agente Antimicrobiano Número Porcentaje (%) meticilina (M) 313 60,4
eritromicina (E) 256 49,4 clindamicina (CC) 177 34,2 n = 518
Análisis de la detección fenótipica y genotípica de la resistencia de S.aureus a la meticilina
De las 60 cepas SARM seleccionadas 59 fueron ratificadas como resistentes a meticilina por los métodos fenotípicos: difusión del disco en agar, screening de oxacilina, PBP2a, CIM y por la detección de la presencia del gen mecA por PCR (figura 3). Una cepa que presentó un halo de inhibición de 12mm con el disco de oxacilina, una CIM por el método automatizado vitek de 4µg/ml, fue negativa para la prueba de PBP2a y no amplificó para el gen mecA, fue considerada una cepa “borderline” o BORSA, dado su CIM de 4µg/ml, lo que la diferenció de las demás cepas SARM que presentaron una CIM ≥ 8.
Es importante destacar que las cepas BORSA se caracterizan por ser susceptibles a antibióticos β- lactámicos asociados a inhibidores de β- lactamasas y por carecer del gen mecA debido a una hiperproducción de betalactamasas mediada por plásmidos, producen altas cantidades de enzima lo que hace que la oxacilina y meticilina sean hidrolizadas más lentamente y se cree que ésto es debido a una hiperproducción y a una nueva betalactamasa cuyo gen no se ha identificado aún (5); en este caso le fue probada la ampicilina sulbactán resultando sensible, lo cual explica su fenotipo de resistencia a la oxacilina “borderline”.
En cuanto a los métodos utilizados para la detección de la resistencia se observó una buena correlación entre las pruebas fenotípicas y genotípicas, a pesar de algunas limitaciones de los métodos fenotípicos para diferenciar resistencia heterogénea de grado 1 y la falsa resistencia debida a la hiperproducción de betalactamasa, alteración en PBP 1, 3 y 4. No existe evidencia clínica que avale la relación de la falsa resistencia con el fracaso terapéutico. El resumen de los métodos fenotípicos y genotípicos se encuentra reflejado en la tabla 5.
Tabla 5
Métodos fenotípicos y genotípicos utilizados para la detección de la resistencia de 60 cepas SARM
N. de cepas Gen mecA Screening de oxacilina
PBP2a CIM Método del
disco
59 + + + ≥8µg/ml Resistente
1 - - - 4µg/ml 12mm
Por otro lado a pesar de ser la detección del gen mecA por PCR considerado el método gold Standard, la detección de PBP2a basado en una reacción de aglutinación, resulta ser un método bastante confiable, rápido y sensible para la detección de SARM. Igualmente el screening de oxacilina con 4% de CLNa y 6 µg/ml de oxacilina considerado el método fenotípico de referencia, como lo han sugerido Soloaga y cols(38) donde encontraron 100% de sensibilidad y especificidad entre el método PCR y los métodos fenotípicos screening de oxacilina y screen látex. Pero estos métodos sobre todo el método del disco tiene sus limitaciones en su especificidad y sensibilidad;
sin embargo, continúa teniendo su utilidad por ser sencillo, rápido y al alcance de los laboratorios de bacteriología.
Figura 3
Detección de los genes mecA y errnB PCR- Multiplex
En el gel de agarosa se observa en todos los carriles las bandas del gen mecA. El gen ermB se puede observar en el carril Nº10
Análisis de la resistencia de S. aureus a los macrólidos
Del total de las 60 cepas SARM seleccionadas, 35 (58,3%) resultaron resistentes a eritromicina y 25 (41,6%) a clindamicina (Gráfico 1), por el método del disco. La elevada resistencia tanto a eritromicina como a clindamicina coincide con otros estudios donde se reporta la elevada resistencia de SARM a estos antibióticos (28,29). Hay que señalar que por ser antibióticos alternativos en las infecciones por S.aureus resistentes a meticilina esta incidencia resulta preocupante y en el caso de la clindamicina, habría que considerar que su uso en el tratamiento de infecciones por S.aureus con resistencia inducible a clindamicina podría conducir a un fracaso terapéutico; es por
eso que el CLSI recomienda el uso de la técnica D-Test y sugiere que los aislamientos
con este tipo de resistencia deberían ser reportados como resistentes a clindamicina.
Gráfico 1
Porcentaje de resistencia a eritromicina y clindamicina de 60 cepas de SARM. Periodo enero – Julio 2009
E= 35 cepas CC= 25 cepas
Así mismo, de estas 60 cepas: 4 (14,3%) fueron positivas para la prueba D-Test (tabla 6). Estos resultados coinciden con lo reportado por otros autores, como por ejemplo: Reus- Rodríguez (32) en Brasil donde encontraron que de 27 aislamientos de S.aureus de cultivos sanguíneos de niños hospitalizados, 5 fueron positivos a la prueba
de D-Test, todos con el perfil: eritromicina resistente y clindamicina sensible. De igual modo, en Irán encuentran que de 175 cepas de S.aureus aisladas 17(9,7%) fueron D- test (+) y 11 de las cuales fueron SARM. (30).
En nuestro país, en el Centro Clínico La Trinidad en Caracas detectaron que un 14,86% de las cepas aisladas de S. aureus mostraron resistencia constitutiva y solo el 4,05% presentó resistencia inducible, los autores concluyen que a pesar de haber encontrado una baja incidencia, se debe incluir la prueba de D-Test en todas las pruebas de sensibilidad de los antibióticos de estafilococos. (10)
Otras investigaciones reportan incidencias más elevadas, tal es el caso de Silberry y cols (37), quienes plantearon un caso de infección causada por S. aureus resistente a meticilina y a eritromicina, pero que siendo sensible a clindamicina no respondió al tratamiento. Para evaluar la resistencia una de las pruebas utilizadas fue el D–Test, confirmando in vitro una elevada proporción (56%) de S. aureus con resistencia a macrólidos, lincosamidas y estreptograminas B (MLSBi). También, en Chile encontraron cifras más altas, del total de 32 (20,6%) cepas SARM informadas como sensibles a clindamicina, 43,8% presentó resistencia inducible a clindamicina. (27)
Tabla 6
Porcentaje de 35 cepas de SARM resistentes a eritromicina. Prueba de D- Test positivo. Período enero – Julio 2009
Prueba D-Test Nº de casos Porcentaje (%)
Positivo 4 11,43
Negativo 31 88,57
Análisis de la expresión fenotípica de resistencia de SARM a macrólidos
El resultado del análisis de la expresión fenotípica de resistencia de SARM a macrólidos fue el siguiente: de 35 cepas resistentes a eritromicina, 25 (71,42%) fueron con el fenotipo MLSBc, 4 (11,42%) con el fenotipo MLSBi y 6 (17,14%) con el fenotipo MSB. Como se puede observar (Gráfico 2) el fenotipo MLSBc fue el de mayor proporción (71.42%); este porcentaje alto de resistencia constitutiva con perfil de resistencia a eritromicina y clindamicina está en concordancia con la procedencia de las cepas, la mayoría de pacientes hospitalizados y todas resistentes a meticilina y una de la características de estas cepas es la resistencia a otros antimicrobianos incluyendo la eritromicina y clindamicina.
Gráfico 2
Porcentaje de fenotipos de resistencia en cepas SARM resistentes a eritromicina. Período de enero a julio de 2009. n= 35 cepas
71,42% 11,42% 17,14% Fenotipo MLSBc Fenotipo MLSBi Fenotipo MSB Esta incidencia de resistencia fenotípica a eritromicina parece variar ampliamente entre distintos hospitales y areas geográficas: por ejemplo Merino y col.(26) en España encontraron el fenotipo MSB (11.2%) más común; en Colombia Cárdenas y cols.(7) en
su estudio determinación de fenotipos y genotipos de resistencia a macrólidos reportan el fenotipo MLSBi (35%) como el más frecuente en cepas SARM de la comunidad; en nuestro país Fernández y cols.(10) encontraron el fenotipo MLSBc (14.8%) más común en el total de cepas de S.aureus aisladas, en el período de estudio.
Análisis de la resistencia de S. aureus a los macrólidos por PCR Multiplex
En cuanto a la distribución de genes en lo fenotipos de resistencia MLSB y MSB, como puede observarse en la tabla 7, la incidencia del gen ermA fue mayor en cepas SARM resistentes a eritromicina, lo que indica que en nuestro medio es el gen de resistencia predominante. De 29 cepas con el fenotipo MLSB, se detectaron a través del sistema PCR- multiplex (Figura 4), 24 cepas con el gen ermA (68.57%), esta proporción coincide con el estudio de Cárdenas y cols. (7), en Colombia que encontraron 78% de cepas con el gen ermA; también Thakker- Varia y cols. (40), reportaron una alta incidencia del gen ermA, ellos encontraron que 31% cepas de S.aureus portaban el gen ermA; Martineau y col. (24) en su estudio detectaron 21% de incidencia del gen ermA en S. aureus
Figura 4
Amplificación de los genes de resistencia: ermA, ermC y MsrA PCR- Multiplex
El gen ermC se detectó en una sola cepa, a diferencia de varias investigaciones donde este gen fue el predominante para S. aureus (69%), (40,44).
En un solo aislamiento se detectó el gen ermB (figura 3) junto con el gen ermA, lo cual coincide con la literatura que afirma que el gen ermB ha sido aislado en un pequeño número y es casi exclusivamente de procedencia animal (24). En dos aislamientos se detectaron dos genes también a la vez: ermA y msrA. En todos los casos con fenotipo MSB, con perfil de resistencia a eritromicina y sensibilidad a clindamicina se encontró el gen msrA.
Tabla 7
Distribución de genes en los fenotipos de resistencia MLSB y MSB en SARM PCR- Multiplex Nº de cepas resistentes a eritromicina Fenotipo de resistencia Nº de genes % Genes de resistencia 24 68,57 ermA 1 2,85 ermA ermB 1 2,85 ermC 2 5,71 ermA msrA 29 MLSB 1 2,85 Desconocido 6 MSB 6 17,14 msrA Total= 35 35 100
De los cuatro aislamientos con la prueba D- Test (+), uno poseía el gen ermC y tres el gen ermA (tabla 8) coincidiendo esta incidencia con lo reportado por Jenssen y cols., (20) ellos encontraron que el 16% de cepas de S. aureus con fenotipo MLSBi portaban el gen ermA; Steward y cols. (39) encontraron que en 21,6% de S. aureus resistentes a eritromicina el gen ermA era predominante. No asi, Merino y cols. (26) ellos encontraron que de 40 cepas con fenotipo MLSBi: 36 portaban el gen ermC, 1 el gen ermA+ el gen msrA y 1 desconocido.
. Tabla 8
Distribución de los genes de resistencia en las cepas D- Test (+) PCR Multiplex Genes de Resistencia Nº de cepas D- Test + Fenotipo Número Genes 3 ermA 4 MLSBi 1 ermC
En una sola cepa resistente a eritromicina no se detectó gen de resistencia lo que podría deberse a la implicación de otro mecanismo de resistencia presente.
C
ONCLUSIONES
CONCLUSIONES
Hubo buena concordancia entre los métodos fenotípicos y genotípicos para detectar resistencia a meticilina en S. aureus
Las cifras altas de resistencia a meticilina y macrólidos en S. aureus se corresponden con los niveles de resistencia y multirresistencia encontrados en el SAHUM
La ausencia del gen mecA en un solo aislamiento se correspondió con el resultado de las pruebas fenotípicas en esa cepa, a excepción de la prueba del disco en agar, dicha cepa fue considerada “borderline”
Los valores de CIM de todas las cepas mecA (+) fueron mayores de 8 µg/ml lo que indica una resistencia homogenea
La presencia de las PBP2a en todos los aislamientos mecA (+) ratifica el mecanismo de resistencia intrínsico a la oxacilina
El fenotipo de resistencia a eritromicina mas común encontrado entre los aislamientos SARM fue MLSBc (71,42%)
Entre los genes de resistencia a macrólidos el gen ermA fue el mas frecuentemente aislado
El gen ermB solo se detectó en un solo aislamiento coincidiendo con la mayoría de los estudios
El fenotipo MSB el segundo en frecuencia, en los 6 aislamientos se encontró el gen msrA
El porcentaje de resistencia inducible a clindamicina (D- Test +) fue bajo (6,66%) y en las 4 cepas positivas también fue el gen ermA el mas frecuente
RECOMENDACIONES
Dar a conocer las altas cifras de resistencia a la meticilina y a los macrólidos encontrados debido a que son antibióticos utilizados para tratar infecciones por S. aureus y de esta manera llamar a la reflexión en la vigilancia y control de la resistencia bacteriana y en el uso racional de la antibioticoterapia
Promover en el personal del Bioanálisis la importancia de aplicar las normas recomendadas por el CLSI en relación al método de difusión en agar que a pesar de su baja reproducibilidad es el más usado en los laboratorios de bacteriología.
Ratificar la realización de la prueba D-Test en todos los antibiogramas de S. aureus, para detectar resistencia inducible a clindamicina y evitar fracasos en el tratamiento.
