M ATERIALES Y MÉTODOS
MATERIALES Y METODOS
Tipo de Investigación
Tomando en consideración las definiciones hechas por autores como Hernández y cols. 2006 (16) en relación a la clasificación que hace de los tipos de investigación. La presente investigación es de tipo descriptiva, ya que se describió todo lo referente a la caracterización de la resistencia de S. aureus, sus causas, asi como la determinación de sus diferentes mecanismos y su relación con su expresión fenotípica.
El diseño es no experimental, ya que no hubo manipulación de las variables y fue tomada tal y como se presentó. Fue realizado un estudio prospectivo en el que se incluyeron las cepas de S. aureus provenientes de muestras recolectadas de pacientes ingresados en los diferentes servicios del Servicio Autónomo Hospital Universitario de Maracaibo (SAHUM).
Análisis Bacteriológico
Población
De un total de 518 aislamientos de S. aureus provenientes de pacientes tanto de consulta externa como de hospitalización, se seleccionaron al azar 60 cepas de 313 aislamientos SARM, procesadas por el personal que labora en el laboratorio del Centro de Referencia Bacteriológica (CRB) del Servicio Autónomo Hospital Universitario de Maracaibo, siguiendo la metodología propia para la identificación de S. aureus durante el período de enero a julio de 2009
.
De la información suministrada por los pacientes en la boleta que acompaña a las muestras clínicas se procedió a la recolección de datos que fueron de importancia para la presente investigación: nombre completo, edad, sexo, servicio, tipo de muestra, diagnóstico y tratamiento. La detección molecular deesta investigación fue realizada en el laboratorio de biología molecular de la Escuela de Bioanálisis de la Facultad de Medicina de la Universidad del Zulia (LUZ).
Determinación fenotípica de la resistencia a la meticilina
A las cepas de S. aureus resistentes a la meticilina se les realizaron pruebas de susceptibilidad para la confirmación de resistencia a la meticilina. El antibiograma de estas cepas se realizó mediante el método de difusión del disco en agar siguiendo las recomendaciones del Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI. 2008) (9) y la concentración inhibitoria mínima (CIM) por el método automatizado Vitek. Los antibióticos que se probaron fueron la oxacilina y cefoxitina, antibióticos comparables para la predicción de resistencia mediada por el gen mecA y los antibióticos eritromicina y clindamicina para la resistencia a macrólidos y lincosamidas.
Método de difusión en disco
Para las pruebas de susceptibilidad por el método del disco se utilizó la metodología descrita por Bauer y Kirby (3), siguiendo los lineamientos del CLSI. Para ello se utilizaron placas de Mueller Hinton (MH) a los cuales se les colocó los discos de oxacilina 1 µg, cefoxitina 30 µg, previamente inoculado con un cultivo joven de 24 horas en agar sangre humana (ASH), transfiriendo con un asa bacteriológica de 3 a 4 colonias de S. aureus a un tubo con 5 ml de caldo soya tripticasa o solución salina estéril (SSF), dicha suspensión fue estandarizada espectrofotométricamente hasta alcanzar una densidad óptica entre 0,08-0,10 de absorbancia, a una longitud de onda de 625 nm, la cual es equivalente al tubo 0,5 de la escala de McFarland, que corresponde a una suspensión bacteriana de 1,5x 108 UFC/ml. Luego se inoculó a manera de césped la superficie del Agar Muller Hinton (MH). El inóculo se dejó secar de 3 -5 minutos, luego se colocaron los discos de oxacilina y cefoxitina y las placas se incubaron 24 horas a 35 ºC para realizar posteriormente la lectura de la prueba. Para el control de calidad se utilizó la cepa de S. aureus ATTC 25923. Los resultados se expresaron en las categorías de sensible (S), intermedio (I) y resistente (R), utilizando los criterios de interpretación que a continuación se presentan (3,9).
Tabla 3
Criterios de interpretación de los antibióticos utilizados
Fuente: CLSI (documento M100- S17/Vol.27,Nº1/2008)
Prueba de screening a la oxacilina
Las cepas de S. aureus que resultaron resistentes o intermedias a oxacilina (OX) por el método del disco, fueron tomadas para hacerles el descarte en agar oxacilina con NaCL, mediante el método de suspensión directa de las colonias, se preparó un inóculo estandarizado de forma similar al utilizado para las pruebas de susceptibilidad por el método de difusión del disco en agar, luego con un hisopo de algodón estéril se inoculó en un área de 10-15 mm, una placa con agar MH suplementado con 4% de NaCL (p/v 0,68mol/L) y 6µg/ml de oxacilina. Las placas se incubaron a 35˚C en condiciones de aerobiosis durante 24 horas. Conjuntamente se probaron las cepas control, S. aureus ATCC 43300 (resistente) y S. aureus ATCC 29213 (susceptible). Luego del período de incubación, cualquier crecimiento sobre las placas fue considerado resistente. A las cepas que resultaron resistentes a la oxacilina se les determinó la concentración Inhibitoria mínima (CIM).
Concent. (µg)
Resistencia Intermedio Susceptible
Oxacilina 1µg ≤ 10 11-12 ≥13
Cefoxitina 30µg ≤ 21 >>
Concentración Inhibitoria Mínima (CIM)
A las cepas que resultaron oxacilina intermedias o resistentes se les determinó la CIM por el método automatizado VITEK, que utiliza tarjetas (GPS) adaptadas a los antibióticos que se utilizan para estafilococos. Los principios de la tarjeta GPS, se basan en la técnica de Concentración Inhibitoria Mínima (CIM) por microdilución. La tarjeta GPS 112 (bioMérieux) para cocos Gram positivos, contiene 45 pocillos. El pocillo control positivo determina como el organismo crece sin inhibición antimicrobiana. Cada uno de los demás pocillos contiene alícuotas, el equivalente de porciones previamente medidas y pesadas por separado, de un agente antimicrobiano especifico combinado con medio de cultivo; entre ellos: oxacilina, eritromicina y clindamicina.
Para preparar la suspensión del microorganismo normalizado, con un hisopo estéril, se seleccionaron suficientes colonias frescas aisladas del medio de agar sangre de carnero (ASC) para preparar una suspensión bacteriana uniforme en 1,8 ml de solución salina estéril al 0,45-0,5% , equivalente a simple vista al patrón nº 0,5 de McFarland (zona roja, 80%T a 88%T, en el Colorimeter VITEK). Posteriormente, en un tubo de ensayo con 1,8 ml de solución salina estéril al 0,45-0,5%, se transfirieron 200 µL del inóculo estandarizado. Esta dilución final se utilizó para el llenado de la tarjeta GPS. Los resultados para estafilococos se obtuvieron en un mínimo de 6 horas. Después de inocular la tarjeta y colocarla dentro del lector/incubador, la tarjeta no ameritó manipulación adicional.
El software determinó cuando un pocillo muestra crecimiento (positivo) basándose en la atenuación de la luz medida por medio del lector óptico. El crecimiento del microorganismo se expresó como un cambio de turbidez y el color en los pocillos. El software evaluó cada pocillo por separado y así, se determinó el nivel de crecimiento en cada uno, una vez por hora. Después de la incubación se procedió a imprimir el resultado de los valores de CIM para cada antimicrobiano.
Detección de PBP2a
Es una prueba rápida de aglutinación en látex basada en la detección de PBP2a disponible comercialmente como un kit. El método involucra la extracción de PBP2a a partir de suspensiones de colonias y detección por aglutinación con partículas de látex cubiertos con anticuerpos monoclonales de PBP2a. La prueba es muy sensible y específica para S. aureus. Las reacciones suelen ser más fuertes si la producción es inducida por el crecimiento en presencia de penicilina.
A partir de un crecimiento fresco de 24 horas en medio no selectivo (ASH), se tomaron 5-10 colonias de estafilococos con la ayuda de un asa bacteriológica calibrada, transfiriéndose a un tubo ependorff, al cual previamente se le agregó 4 gotas del reactivo de extracción Nº1, se homogeneizó y se llevó a un bloque térmico (mas de 90ºC) durante 3 minutos. Transcurrido este tiempo se retiró el tubo ependorff del calor, se dejó que tomara la temperatura ambiente, se le adicionó una gota del reactivo de extracción Nº2, se mezcló bien y se llevó a la centrífuga a 3000 rpm durante 5 minutos. Seguidamente se tomaron 50µl del sobrenadante tratando de no tocar el sedimento y se colocó sobre una tarjeta de reacción, posteriormente se le agregó una gota del reactivo látex (Anticuerpos monoclonales contra PBP 2) y se mezcló con un aplicador plástico estéril.
De la misma manera, se tomaron 50µl del sobrenadante y se colocó en otro círculo, correspondiente al control y se añadió una gota del control látex, mezclándose bien, se le aplicó movimientos giratorios a la tarjeta durante 3 minutos. La interpretación de la prueba fue dada por aglutinación con el reactivo látex y no con el control, considerándose entonces como positiva, mientras que la ausencia de aglutinación en 3 minutos fue considerada negativa.
Determinación fenotípica de la resistencia a macrólidos y lincosamidas.
La detección de la resistencia de SARM a eritromicina y clindamicina se realizó a través de la prueba de D- Test que se explica mas adelante y la Concentración Inhibitoria Mínima (CIM), igualmente por el método comercial Vitek usado para la oxacilina.
Prueba de D-Test
Para ello se utilizó la técnica propuesta por CLSI 2008, donde se realizó una suspensión del microorganismo en solución salina fisiológica 0,85% comparable con el tubo Nº 0,5 de McFarland. Luego fue inoculada una placa de agar de Mueller Hinton y se colocaron los discos de eritromicina y de clindamicina a una distancia entre ambos de 20 mm. En la prueba positiva se observa un achatamiento del halo de inhibición del crecimiento alrededor del disco de clindamicina, en la zona que está adyacente al disco de eritromicina indicando resistencia inducible a clindamicina, como se muestra en la figura 2.
Figura 2
Prueba D-Test positiva
Fuente: http://www.microbiology-consult.com/id5.html
Detección de la presencia de los genes: mecA, ermA, ermB, ermC y msrA
Para la detección de la presencia del gen mecA y de los genes erm y msrA, se utilizó reacción múltiple en cadena de la polimerasa (PCR). La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) detecta el gen mecA que presentan las cepas de SARM como marcador genético de resistencia. Su sensibilidad es superior a la de los métodos habituales, ya que detecta incluso las cepas que no han expresado la resistencia. Este método posee la ventaja de no estar sujeto a las condiciones de crecimiento de las cepas, pudiendo aplicarse a gran número de aislados y podría ser aconsejable en casos de duda con valores de CIM cercanas al límite. Además del gen mecA presentes en las cepas SARM, a éstas también se les detectó genes que le proporcionan resistencia a los macrólidos y lincosamidas, como son: gen ermA, gen ermB, gen ermC y el gen msrA.
Extracción del ADN
Se realizó la detección de estos genes por PCR a todas las cepas incluidas en el estudio. Mediante el siguiente protocolo estandarizado de acuerdo a condiciones en el laboratorio, se procedió a la extracción del ADN: 1) Se colocó una asada de colonias (10 aprox.) en un tubo eppendorf conteniendo 200 µl de buffer TE 5X y se agregó 10µl de lisostafina, se incubó a 37ºC por 1 hora. 2) Se agregó 20µl de SDS (detergente) al 10% y 10µl de proteinasa K y se incubó por 1 hora a 50 ºC y luego 10 minutos a 80ºC para inactivar la proteinasa. 3) Extracción con 400µl de cloroformo, centrifugar por 10 minutos y extraer la fase acuosa y pasar a un tubo eppendorf nuevo. 4) Se precipitó con etanol absoluto (el doble del volumen) toda la noche en el congelador. 5) Se centrifugó por 20 minutos, se decantó el sobrenadante y se lavó el sedimento con etanol al 70% y se volvió a centrifugar por 5 minutos. 6) Se decantó el sobrenadante y se dejó secar por 30 minutos y 7) Se resuspendió en 50µl de buffer TE y se conservó en el congelador hasta su amplificación.
Amplificación del ADN
Para la amplificación del ADN se emplearon dos mezclas de reacciones múltiples (PCR Multiplex), con el objeto de minimizar tiempo y recursos, conteniendo los “primers” descritos por Martineau y cols (24). La primera mezcla: con el “primers” del gen mecA de 174 pb: 5’-ACC AGG TGA ATT ATT AGC ACT TGT AAG-3’ y 5’- ATT GCT GTT AAT ATT TTT GTA GTT GAA- 3’, el gen ermB de 142 pb: 5’-CTA TCT GAT TGT TGA AGA AGG ATT-3’ y 5’-GTT TAC TCT TGG TTT AGG ATG AAA-3’ y un gen 16S rRNA de la región conservada como control interno de S. aureus. La segunda mezcla de reacción con pares de “primers” para el gen ermA con 139 pb: 5’-TAT CTT ATC GTT GAG AAG GGA TT-3’ y 5’-CTA CAC TTG GCT TAG GAT GAA A-3’; el gen ermC de 190 pb: 5’- CTT GTT GAT CAC GAT ATT TTC C-3’ y 5’- ATC TTT TAG CAA ACC CGT ATT C- 3’ y el gen msrA con 163 pb: 5’-TCC AAT CAT TGC ACA AAA TC-3’ y 5’-AAT TCC CTC TAT TTG GTG GT-3’. A cada uno de los estafilococos se le probó ambas mezclas con el par de “primers” complementarios de cada gen a amplificar.
La reacción de amplificación se llevó a cabo con un termociclador Peltier M.J Research- Modelo PT-100. En cada reacción se utilizaron los siguientes componentes: buffer gotaq 5 mM Tris; 2,5 µM Mgcl2; 4 µl mezcla de “primers” ; 200 µM dNTP; 1,5 U de taq ADN polimerasa ; ADN de la muestra 3 µl y agua suficiente para completar un volumen final de 25 µl.
El programa empleado para la amplificación de cada una de las dos mezclas de reacción fue el siguiente: primeramente colocar el termociclador en el programa S.aureus: desnaturalización a 96°C por 5 minutos, seguido de 30 ciclos a 95°C por 30 segundos, apareamiento de los “primers” a 55°C por 30 segundos y extensión de la ADN polimerasa a 72° C por 30 segundos, volver a la desnaturalización 35 veces y extensión final a 72ºC por 5 minutos y posterior enfriamiento a 4 ºC.
Los productos amplificados fueron analizados por electroforesis empleando geles de agarosa al 2%, corridos a 80 volts aproximadamente por 1 hora. El tamaño del amplicón
fue comparado con un marcador con fragmentos de longitud establecidos. El ADN fue visualizado utilizando un transiluminador de luz UV después de la tinción con bromuro de etidio. Para la implementación de la técnica y como controles positivo y negativo, se empleó una cepa SAMR local y la cepa ATCC de S. aureus 29213, respectivamente.
R
ESULTADOS Y
D
ISCUSIÓN