RESULTADOS Y DISCUSION

Análisis de la resistencia de S. aureus a la meticilina

De 60 cepas de SARM seleccionadas al azar, provenientes de muestras de cultivos varios (abscesos, heridas, etc.), aisladas en el período de estudio, se encontró un porcentaje de 60,42%. Este alto porcentaje concuerda con las cifras de resistencia de S.aureus a la meticilina, a nivel hospitalario y de la comunidad, relacionados con factores que propician este aumento como el uso indiscriminado de antibióticos, insuficiente control de portadores y falta de vigilancia permanente de los cultivos positivos con SARM.

Las cifras se observan de manera gráfica en la tabla 4 y coincide con el aumento progresivo en otros países como Chile con un 55% (14) y Colombia con un 41 % (31). De igual modo en Argentina Ferrero y cols. (11), encontraron una prevalencia de 45,8% de SARM en infecciones intrahospitalarias de piel y partes blandas; en Uruguay Prego y col. (29) reportaron un 47% de SARM del total de infecciones estafilocócicas y un 73% en las infecciones cutáneas profundas contra un 10% en las infecciones cutáneas superficiales.

Aquí en nuestro país, se han encontrado cifras altas de SARM, como el estudio realizado en el laboratorio de la policlínica metropolitana en la ciudad de Caracas, ellos reportaron 88,0% de resistencia de S. aureus a la meticilina (41). No obstante, Hurtado y cols (18), en el 2002 con cepas procedentes de centros de salud del Grupo Venezolano de Vigilancia de la Resistencia Bacteriana (GVRB) encuentran que la resistencia de antibióticos de primera línea como la oxacilina fue de 64%; sin embargo, se observó una tendencia hacia la disminución de porcentajes de resistencia calculados por ciclos de tres años, utilizando herramientas propias del análisis de series cronológicas. Los autores aportan que dicho descenso pareciera depender de las mejoras introducidas en las técnicas de determinación de la resistencia a estos antibióticos.

Tabla 4

Porcentaje de resistencia de S.aureus aislados en el CRB del SAHUM. Periodo enero – Julio 2009

Agente Antimicrobiano Número Porcentaje (%) meticilina (M) 313 60,4

eritromicina (E) 256 49,4 clindamicina (CC) 177 34,2 n = 518

Análisis de la detección fenótipica y genotípica de la resistencia de S.aureus a la meticilina

De las 60 cepas SARM seleccionadas 59 fueron ratificadas como resistentes a meticilina por los métodos fenotípicos: difusión del disco en agar, screening de oxacilina, PBP2a, CIM y por la detección de la presencia del gen mecA por PCR (figura 3). Una cepa que presentó un halo de inhibición de 12mm con el disco de oxacilina, una CIM por el método automatizado vitek de 4µg/ml, fue negativa para la prueba de PBP2a y no amplificó para el gen mecA, fue considerada una cepa “borderline” o BORSA, dado su CIM de 4µg/ml, lo que la diferenció de las demás cepas SARM que presentaron una CIM ≥ 8.

Es importante destacar que las cepas BORSA se caracterizan por ser susceptibles a antibióticos β- lactámicos asociados a inhibidores de β- lactamasas y por carecer del gen mecA debido a una hiperproducción de betalactamasas mediada por plásmidos, producen altas cantidades de enzima lo que hace que la oxacilina y meticilina sean hidrolizadas más lentamente y se cree que ésto es debido a una hiperproducción y a una nueva betalactamasa cuyo gen no se ha identificado aún (5); en este caso le fue probada la ampicilina sulbactán resultando sensible, lo cual explica su fenotipo de resistencia a la oxacilina “borderline”.

En cuanto a los métodos utilizados para la detección de la resistencia se observó una buena correlación entre las pruebas fenotípicas y genotípicas, a pesar de algunas limitaciones de los métodos fenotípicos para diferenciar resistencia heterogénea de grado 1 y la falsa resistencia debida a la hiperproducción de betalactamasa, alteración en PBP 1, 3 y 4. No existe evidencia clínica que avale la relación de la falsa resistencia con el fracaso terapéutico. El resumen de los métodos fenotípicos y genotípicos se encuentra reflejado en la tabla 5.

Tabla 5

Métodos fenotípicos y genotípicos utilizados para la detección de la resistencia de 60 cepas SARM

N. de cepas Gen mecA Screening de oxacilina

PBP2a CIM Método del

disco

59 + + + ≥8µg/ml Resistente

1 - - - 4µg/ml 12mm

Por otro lado a pesar de ser la detección del gen mecA por PCR considerado el método gold Standard, la detección de PBP2a basado en una reacción de aglutinación, resulta ser un método bastante confiable, rápido y sensible para la detección de SARM. Igualmente el screening de oxacilina con 4% de CLNa y 6 µg/ml de oxacilina considerado el método fenotípico de referencia, como lo han sugerido Soloaga y cols(38) donde encontraron 100% de sensibilidad y especificidad entre el método PCR y los métodos fenotípicos screening de oxacilina y screen látex. Pero estos métodos sobre todo el método del disco tiene sus limitaciones en su especificidad y sensibilidad;

sin embargo, continúa teniendo su utilidad por ser sencillo, rápido y al alcance de los laboratorios de bacteriología.

Figura 3

Detección de los genes mecA y errnB PCR- Multiplex

En el gel de agarosa se observa en todos los carriles las bandas del gen mecA. El gen ermB se puede observar en el carril Nº10

Análisis de la resistencia de S. aureus a los macrólidos

Del total de las 60 cepas SARM seleccionadas, 35 (58,3%) resultaron resistentes a eritromicina y 25 (41,6%) a clindamicina (Gráfico 1), por el método del disco. La elevada resistencia tanto a eritromicina como a clindamicina coincide con otros estudios donde se reporta la elevada resistencia de SARM a estos antibióticos (28,29). Hay que señalar que por ser antibióticos alternativos en las infecciones por S.aureus resistentes a meticilina esta incidencia resulta preocupante y en el caso de la clindamicina, habría que considerar que su uso en el tratamiento de infecciones por S.aureus con resistencia inducible a clindamicina podría conducir a un fracaso terapéutico; es por

eso que el CLSI recomienda el uso de la técnica D-Test y sugiere que los aislamientos

con este tipo de resistencia deberían ser reportados como resistentes a clindamicina.

Gráfico 1

Porcentaje de resistencia a eritromicina y clindamicina de 60 cepas de SARM. Periodo enero – Julio 2009

E= 35 cepas CC= 25 cepas

Así mismo, de estas 60 cepas: 4 (14,3%) fueron positivas para la prueba D-Test (tabla 6). Estos resultados coinciden con lo reportado por otros autores, como por ejemplo: Reus- Rodríguez (32) en Brasil donde encontraron que de 27 aislamientos de S.aureus de cultivos sanguíneos de niños hospitalizados, 5 fueron positivos a la prueba

de D-Test, todos con el perfil: eritromicina resistente y clindamicina sensible. De igual modo, en Irán encuentran que de 175 cepas de S.aureus aisladas 17(9,7%) fueron D- test (+) y 11 de las cuales fueron SARM. (30).

En nuestro país, en el Centro Clínico La Trinidad en Caracas detectaron que un 14,86% de las cepas aisladas de S. aureus mostraron resistencia constitutiva y solo el 4,05% presentó resistencia inducible, los autores concluyen que a pesar de haber encontrado una baja incidencia, se debe incluir la prueba de D-Test en todas las pruebas de sensibilidad de los antibióticos de estafilococos. (10)

Otras investigaciones reportan incidencias más elevadas, tal es el caso de Silberry y cols (37), quienes plantearon un caso de infección causada por S. aureus resistente a meticilina y a eritromicina, pero que siendo sensible a clindamicina no respondió al tratamiento. Para evaluar la resistencia una de las pruebas utilizadas fue el D–Test, confirmando in vitro una elevada proporción (56%) de S. aureus con resistencia a macrólidos, lincosamidas y estreptograminas B (MLSBi). También, en Chile encontraron cifras más altas, del total de 32 (20,6%) cepas SARM informadas como sensibles a clindamicina, 43,8% presentó resistencia inducible a clindamicina. (27)

Tabla 6

Porcentaje de 35 cepas de SARM resistentes a eritromicina. Prueba de D- Test positivo. Período enero – Julio 2009

Prueba D-Test Nº de casos Porcentaje (%)

Positivo 4 11,43

Negativo 31 88,57

Análisis de la expresión fenotípica de resistencia de SARM a macrólidos

El resultado del análisis de la expresión fenotípica de resistencia de SARM a macrólidos fue el siguiente: de 35 cepas resistentes a eritromicina, 25 (71,42%) fueron con el fenotipo MLSBc, 4 (11,42%) con el fenotipo MLSBi y 6 (17,14%) con el fenotipo MSB. Como se puede observar (Gráfico 2) el fenotipo MLSBc fue el de mayor proporción (71.42%); este porcentaje alto de resistencia constitutiva con perfil de resistencia a eritromicina y clindamicina está en concordancia con la procedencia de las cepas, la mayoría de pacientes hospitalizados y todas resistentes a meticilina y una de la características de estas cepas es la resistencia a otros antimicrobianos incluyendo la eritromicina y clindamicina.

Gráfico 2

Porcentaje de fenotipos de resistencia en cepas SARM resistentes a eritromicina. Período de enero a julio de 2009. n= 35 cepas

71,42% 11,42% 17,14% Fenotipo MLSBc Fenotipo MLSBi Fenotipo MSB Esta incidencia de resistencia fenotípica a eritromicina parece variar ampliamente entre distintos hospitales y areas geográficas: por ejemplo Merino y col.(26) en España encontraron el fenotipo MSB (11.2%) más común; en Colombia Cárdenas y cols.(7) en

su estudio determinación de fenotipos y genotipos de resistencia a macrólidos reportan el fenotipo MLSBi (35%) como el más frecuente en cepas SARM de la comunidad; en nuestro país Fernández y cols.(10) encontraron el fenotipo MLSBc (14.8%) más común en el total de cepas de S.aureus aisladas, en el período de estudio.

Análisis de la resistencia de S. aureus a los macrólidos por PCR Multiplex

En cuanto a la distribución de genes en lo fenotipos de resistencia MLSB y MSB, como puede observarse en la tabla 7, la incidencia del gen ermA fue mayor en cepas SARM resistentes a eritromicina, lo que indica que en nuestro medio es el gen de resistencia predominante. De 29 cepas con el fenotipo MLSB, se detectaron a través del sistema PCR- multiplex (Figura 4), 24 cepas con el gen ermA (68.57%), esta proporción coincide con el estudio de Cárdenas y cols. (7), en Colombia que encontraron 78% de cepas con el gen ermA; también Thakker- Varia y cols. (40), reportaron una alta incidencia del gen ermA, ellos encontraron que 31% cepas de S.aureus portaban el gen ermA; Martineau y col. (24) en su estudio detectaron 21% de incidencia del gen ermA en S. aureus

Figura 4

Amplificación de los genes de resistencia: ermA, ermC y MsrA PCR- Multiplex

El gen ermC se detectó en una sola cepa, a diferencia de varias investigaciones donde este gen fue el predominante para S. aureus (69%), (40,44).

En un solo aislamiento se detectó el gen ermB (figura 3) junto con el gen ermA, lo cual coincide con la literatura que afirma que el gen ermB ha sido aislado en un pequeño número y es casi exclusivamente de procedencia animal (24). En dos aislamientos se detectaron dos genes también a la vez: ermA y msrA. En todos los casos con fenotipo MSB, con perfil de resistencia a eritromicina y sensibilidad a clindamicina se encontró el gen msrA.

Tabla 7

Distribución de genes en los fenotipos de resistencia MLSB y MSB en SARM PCR- Multiplex Nº de cepas resistentes a eritromicina Fenotipo de resistencia Nº de genes % Genes de resistencia 24 68,57 ermA 1 2,85 ermA ermB 1 2,85 ermC 2 5,71 ermA msrA 29 MLSB 1 2,85 Desconocido 6 MSB 6 17,14 msrA Total= 35 35 100

De los cuatro aislamientos con la prueba D- Test (+), uno poseía el gen ermC y tres el gen ermA (tabla 8) coincidiendo esta incidencia con lo reportado por Jenssen y cols., (20) ellos encontraron que el 16% de cepas de S. aureus con fenotipo MLSBi portaban el gen ermA; Steward y cols. (39) encontraron que en 21,6% de S. aureus resistentes a eritromicina el gen ermA era predominante. No asi, Merino y cols. (26) ellos encontraron que de 40 cepas con fenotipo MLSBi: 36 portaban el gen ermC, 1 el gen ermA+ el gen msrA y 1 desconocido.

. Tabla 8

Distribución de los genes de resistencia en las cepas D- Test (+) PCR Multiplex Genes de Resistencia Nº de cepas D- Test + Fenotipo Número Genes 3 ermA 4 MLSBi 1 ermC

En una sola cepa resistente a eritromicina no se detectó gen de resistencia lo que podría deberse a la implicación de otro mecanismo de resistencia presente.

C

ONCLUSIONES

CONCLUSIONES

™ Hubo buena concordancia entre los métodos fenotípicos y genotípicos para detectar resistencia a meticilina en S. aureus

™ Las cifras altas de resistencia a meticilina y macrólidos en S. aureus se corresponden con los niveles de resistencia y multirresistencia encontrados en el SAHUM

™ La ausencia del gen mecA en un solo aislamiento se correspondió con el resultado de las pruebas fenotípicas en esa cepa, a excepción de la prueba del disco en agar, dicha cepa fue considerada “borderline”

™ Los valores de CIM de todas las cepas mecA (+) fueron mayores de 8 µg/ml lo que indica una resistencia homogenea

™ La presencia de las PBP2a en todos los aislamientos mecA (+) ratifica el mecanismo de resistencia intrínsico a la oxacilina

™ El fenotipo de resistencia a eritromicina mas común encontrado entre los aislamientos SARM fue MLSBc (71,42%)

™ Entre los genes de resistencia a macrólidos el gen ermA fue el mas frecuentemente aislado

™ El gen ermB solo se detectó en un solo aislamiento coincidiendo con la mayoría de los estudios

™ El fenotipo MSB el segundo en frecuencia, en los 6 aislamientos se encontró el gen msrA

™ El porcentaje de resistencia inducible a clindamicina (D- Test +) fue bajo (6,66%) y en las 4 cepas positivas también fue el gen ermA el mas frecuente

RECOMENDACIONES

™ Dar a conocer las altas cifras de resistencia a la meticilina y a los macrólidos encontrados debido a que son antibióticos utilizados para tratar infecciones por S. aureus y de esta manera llamar a la reflexión en la vigilancia y control de la resistencia bacteriana y en el uso racional de la antibioticoterapia

™ Promover en el personal del Bioanálisis la importancia de aplicar las normas recomendadas por el CLSI en relación al método de difusión en agar que a pesar de su baja reproducibilidad es el más usado en los laboratorios de bacteriología.

™ Ratificar la realización de la prueba D-Test en todos los antibiogramas de S. aureus, para detectar resistencia inducible a clindamicina y evitar fracasos en el tratamiento.